CN115105491B - 丝氨酸在制备抑制猪链球菌药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了丝氨酸在制备抑制猪链球菌药物中的用途。本发明在体外试验中通过外源添加L‑丝氨酸可显著提高亚抑菌浓度大环内酯类抗菌素药物对猪链球菌耐药株的抑菌作用；通过结晶紫染色试验发现，L‑丝氨酸可以干预猪链球菌耐药菌株生物被膜的形成；体内试验结果表明，L‑丝氨酸与泰乐菌素联合治疗能够显著降低小鼠大腿感染模型中肌肉组织的载菌量，并且提高了大蜡螟的存活率。本发明通过体外和体内试验结果证明丝氨酸可以增强大环内酯类药物对猪链球菌的体内外抑菌作用，并且丝氨酸单独使用可抑制猪链球菌生物被膜的形成，在制备增强猪链球菌对于大环内酯类抗菌素药物的敏感性以及干预或抑制猪链球菌生物被膜形成的药物等方面具有应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及丝氨酸的新药理用途，尤其涉及丝氨酸在制备抑制猪链球菌药物中的用途，属于丝氨酸的新药理用途领域。
背景技术
猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)是一种重要的人畜共患病原菌(Scherrer S,Rosato G,Spoerry Serrano N,et al.Population structure,geneticdiversity and pathotypes of Streptococcus suis isolated during the last13years from diseased pigs in Switzerland[J].Vet Res,2020,51(1):85.)，可以引起猪全身感染性疾病，是仔猪发病和死亡的主要原因(Arenas J,Zomer A,Harders-Westerveen J,et al.Identification of conditionally essential genes forStreptococcus suis infection in pigs[J].Virulence,2020,11(1):446-464.)，多重耐药菌株的出现，使细菌性疾病的防控和治疗变得更加困难，并且严重威胁食品健康和公共卫生。
在目前确定的35种猪链球菌血清型中，2型猪链球菌是最常见的血清型(Wisselink H J,Veldman K T,Van Den Eede C,et al.Quantitative susceptibilityof Streptococcus suis strains isolated from diseased pigs in seven Europeancountries to antimicrobial agents licensed in veterinary medicine[J].VetMicrobiol,2006,113(1-2):73-82.)。临床上，母猪携带2型猪链球菌后，会传播给哺乳期和断奶期的仔猪，进而感染养殖人员，引起较高的患病率。由于缺乏有效的疫苗和精准的诊断方法，如今常用抗菌药物对猪链球菌引起的疾病进行治疗。但畜牧生产中抗菌药物的不规范使用，导致世界范围内猪链球菌耐药性(Antimicrobial Resistance，AMR)日趋加重，由于临床分离猪链球菌的耐药性的增加，导致常用抗菌药物治疗猪链球菌病效果不佳。
大环内酯药物的母核结构是12、14、15或16个碳原子组成的内酯环，由脱氧核糖或氨基糖残基组成，是一种具有广谱活性的蛋白质合成抑制剂(Miklasinska-MajdanikM.Mechanisms of Resistance to Macrolide Antibiotics among Staphylococcusaureus[J].Antibiotics(Basel),2021,10(11).)。世界卫生组织已经将大环内酯类药物归类为“最重要的抗菌药物”。然而，近年来临床分离猪链球菌对大环内酯类药物的耐药率较高且呈现逐年上升趋势。
目前，新型抗菌药物的开发相对缓慢，为了缓解细菌耐药性的问题，需要新的策略提高现有抗菌药物的疗效。随着系统生物学等技术的发展，研究人员发现，细菌耐药性的出现与其生理代谢途径的变化相关(Cohen A,Bont L,Engelhard D,et al.A multifaceted'omics'approach for addressing the challenge of antimicrobial resistance[J].Future Microbiol,2015,10(3):365-76.张骏梁,钱鎏佳,徐颖,等.细菌的生理代谢与耐药及其对抗菌药物研发的启示[J].药学进展,2018,42(06):404-410.)，细菌代谢途径中某些产物的改变，可能会促进细菌耐药性的发展(Kuang S F,Chen Y T,Chen J J,etal.Synergy of alanine and gentamicin to reduce nitric oxide for elevatingkilling efficacy to antibiotic-resistant Vibrio alginolyticus[J].Virulence,2021,12(1):1737-1753.)，甚至形成持留菌或促进生物被膜的形成。许多研究表明，内源性代谢物，如吲哚、NO、H2S和氨基酸等，均与细菌耐药性产生相关(Lee H H,Molla M N,Cantor C R,et al.Bacterial charity work leads to population-wide resistance[J].Nature,2010,467(7311):82-5.Gusarov I,Shatalin K,Starodubtseva M,etal.Endogenous nitric oxide protects bacteria against a wide spectrum ofantibiotics[J].Science,2009,325(5946):1380-4.)，这些研究均证实了当细菌产生耐药性时，其生理代谢状态会发生明显的改变，并且，外源添加代谢物后，可以影响代谢途径改变细菌耐药性。因此，代谢产物与抗菌药物联合使用是提高现有抗菌药物治疗效果的一种新方法。但是，L-丝氨酸对大环内酯类药物耐药猪链球菌的抗菌作用尚未见任何报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供丝氨酸在制备抑制耐药猪链球菌药物中的用途；
本发明的目的之二是提供一种抑制猪链球菌的药物组合物；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明通过体外试验和体内试验发现了L-丝氨酸显著增强了大环内酯类抗菌素药物耐药猪链球菌的抗菌作用，此外，本发明还发现在猪链球菌耐药菌株中添加L-丝氨酸后能够显著干预或抑制猪链球菌生物被膜的形成。
由此，本发明提供了丝氨酸在制备干预或抑制猪链球菌药物中的用途，包括：(1)将丝氨酸单独制备成干预或抑制猪链球菌生物被膜形成的药物；或者(2)将丝氨酸与大环内酯类抗菌素药物联合使用制备成抑制猪链球菌的药物组合物。
本发明中所述的大环内酯类抗菌素药物包括但不限于泰乐菌素、替米考星、泰万菌素、交沙霉素、竹桃霉素、北里霉素、螺旋霉素Ⅰ、红霉素、罗红霉素或阿奇霉素中的任何一种，优选为泰乐菌素、替米考星和泰万菌素中的任何一种。
本发明还公开了一种抑制猪链球菌的药物组合物，包括：预防或治疗上有效量的活性成分和药学上可接受的辅料或载体，其中所述的活性成分是丝氨酸或者是由丝氨酸与大环内酯类抗菌素药物复配得到的组合物。
本发明进一步公开了一种干预或抑制猪链球菌生物被膜的药物组合物，包括:预防或治疗上有效量的活性成分和药学上可接受的辅料或载体，其中所述的活性成分是丝氨酸。
所述的干预或抑制猪链球菌生物被膜包括抑制猪链球菌生物被膜的形成或杀灭成熟的猪链球菌生物被膜内的细菌。
本发明中所述的载体或辅料是指药剂学领域常规的载体或辅料，这类载体包括但并不限于稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂或/和表面活性剂中的任何一种或多种；例如：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、乳糖、淀粉、微晶纤维素粉剂及上述组合。另外，还可以在组合物中加入其它辅助剂如香味剂和甜味剂；药物制剂应与给药方式相匹配。
所述稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分；常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等。其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素；所述崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)、海藻酸(与总重量比为2-5％)、微晶纤维素(与总重量比为5-15％)中之一种或几种混合物，其中以交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-7％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)为佳，最佳为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)。
所述的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙，聚乙二醇，滑石粉，氢化植物油中的一种或几种混合物，其中以硬脂酸镁最为适宜，所述润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10-1％，一般用量为0.25-0.75％，最佳用量为0.5-0.7％。
所述的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀粉浆(10-30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(2-5％，与粘合剂总重量比)，聚乙烯吡咯烷酮(2-20％，与粘合剂总重量比)，以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳，最佳为聚乙烯吡咯烷酮的50％乙醇水溶液。
所述助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。
所述表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分。常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2-6％，与总重量比)。
本发明中所述药物组合物的剂型包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊、丸剂、注射剂或口服液。
所述药物组合物可通过常规的方式施用于所需的对象。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射、雾化吸入等。
所述药物组合物中和厚朴酚或其药学上可接受盐安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约5毫克/千克体重，较佳地该剂量是约5微克/千克体重-约1毫克/千克体重。
本发明在体外试验中通过外源添加L-丝氨酸，发现添加L-丝氨酸后可显著提高亚抑菌浓度大环内酯类抗菌素药物对猪链球菌耐药株的抑菌作用；通过结晶紫染色试验发现，L-丝氨酸可以干预猪链球菌耐药菌株生物被膜的形成。同时体内试验结果表明，L-丝氨酸与泰乐菌素联合治疗后，显著降低小鼠大腿感染模型中肌肉组织的载菌量，并且提高了大蜡螟的存活率。本发明通过体外和体内试验结果证明L-丝氨酸可以增强大环内酯类药物对猪链球菌的体内外抑菌作用。
附图说明
图1 L-丝氨酸对猪链球菌存活影响的体外试验结果；注：*p<0.05，**p<0.01。
图2不同浓度L-丝氨酸与泰乐菌素联用对猪链球菌影响的体外试验结果；注：*p<0.05，**p<0.01。
图3添加L-丝氨酸后不同大环内酯类抗菌素药物对猪链球菌存活率的体外抑制情况；注：*p<0.05，**p<0.01。
图4添加L-丝氨酸对猪链球菌生物被膜形成影响的体外试验结果：*p<0.05，**p<0.01。
图5小鼠大腿感染模型评估L-丝氨酸和泰乐菌素联合使用对猪链球菌的治疗作用：*p<0.05，**p<0.01。
图6大蜡螟急性感染模型评估L-丝氨酸和泰乐菌素联合使用对猪链球菌的治疗作用试验结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验例1L-丝氨酸或L-丝氨酸与大环内酯类抗菌素药物联合使用在体外或体内对猪链球菌或生物被膜影响的试验
1试验材料
1.1菌株及试剂
猪链球菌ATCC700794菌株购自美国菌种保藏中心。大环内酯类药物耐药猪链球菌和大环内酯类药物耐药猪链球菌的cysM基因缺失菌株由本发明人实验室前期对猪链球菌ATCC700794诱导及构建得到，命名为ΔcysM。泰乐菌素(74610-55-2)购自Sigma公司。替米考星(108050-54-0)、泰万菌素(63428-13-7)、L-丝氨酸(56-45-1)和环磷酰胺(6055-19-2)购自上海源叶生物有限公司。
1.2实验动物
无特定病原体(SPF)6-8周龄的雌性(18～22g)ICR小鼠，购自哈尔滨医科大学第二附属医院的实验动物中心。小鼠在室温条件下，全价饲料饲养，自由饮水。大蜡螟幼虫(0.2～0.3g)购自天津惠裕德生物科技有限公司。并在15℃的黑暗环境中饲养。所有的动物实验都符合动物研究的伦理原则，并得到了东北农业大学机构动物护理和使用委员会的批准(编号：NEAUEC20)。
1.3菌种复苏、传代
将猪链球菌ATCC700404复苏后接种到THB培养基中，放入37℃恒温培养箱中培养16h。以相同接种方法对猪链球菌进行传代纯化培养后，即可备用。
2试验方法
2.1大环内酯类药物对猪链球菌的体外抑菌作用
以大环内酯类耐药猪链球菌和ATCC700494敏感菌株为受试对象，根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)规定的方法，进行最小抑菌浓度(MIC)测定。具体操作如下，将猪链球菌接种到培养基中，在37℃恒温下，震荡培养24h。使用MH培养基将细菌浓度调整至1.0×106CFU/mL后，在无菌条件下加入96孔板中。在第一列孔中加入180μL菌液，余下的11列孔加入100μL菌液。接着在第一列孔中，加入配置好的初始浓度为5120μg/mL的药液20μL混匀后，取出100μL细菌混悬液加入第二列孔中混匀，以此类推倍比稀释，至第十二列孔；从第十二列孔中吸取100μL细菌混悬液弃去；以100μL菌液作为阳性对照孔，以100μL单独MH培养基作为阴性对照孔。37℃下静置孵育24h，以肉眼观察无菌生长的最低药物浓度为MIC。通过上述的实验方法测定药物泰乐菌素、替米考星和泰万菌素的MIC。
2.2添加L-丝氨酸对猪链球菌存活率的影响
猪链球菌在THB培养基中37℃震荡培养16h，得到的细菌培养物在5mL无菌的THB培养基中以1：1000稀释，将敏感和耐药菌株的菌液浓度均调整为1.0×106CFU/mL后，加入50mM L-丝氨酸。在37℃培养24h后分别取出100μL，进行倍比稀释后，接种到THB琼脂平板上。将琼脂平板在37℃下培养24h，进行猪链球菌的菌落计数。
浓度为1.0×106CFU/mL的耐药菌株的菌液中，分别加入浓度为1/2和1/4MIC的泰乐菌素、泰万菌素和替米考星。将L-丝氨酸以0、15、25和50mM的浓度与抗菌药物同时加入培养基中孵育；同时以不加任何药物培养的猪链球菌作为对照组。在37℃培养24h后分别取出100μL，进行倍比稀释后，接种到THB琼脂平板上。将琼脂平板在37℃下培养24h，进行猪链球菌的菌落计数。通过加药组与对照组间的比值计算细菌存活率。
2.3添加L-丝氨酸对猪链球菌生物被膜形成的影响
取猪链球菌敏感菌株、耐药菌株和添加50mM L-丝氨酸的耐药菌株为受试对象，将细菌培养24h后，取细菌培养物在无菌的THB培养基中以1：100稀释，得到终浓度为106CFU/mL的菌液，接种于96孔板中，测定生物被膜的形成。将菌液静置培养72h后弃去，PBS进行冲洗，使用99％甲醇固定30min，弃掉冲洗液晾干，用0.1％结晶紫染色30min，冲洗晾干，33％冰醋酸溶解生物被膜30min。最后使用酶标仪测定OD590的值。所有样品设置三个平行，重复三次。
2.4 L-丝氨酸联合泰乐菌素在体内猪链球菌感染模型中的治疗作用
2.4.1小鼠大腿感染模型实验
(1)小鼠中性粒细胞减少症模型建立
小鼠连续腹腔注射150mg/kg/day剂量的环磷酰胺4天，第五天以100mg/kg的剂量腹腔注射环磷酰胺。然后从小鼠后眼眶静脉丛穿刺采血，通过血常规分析小鼠血液，若中性粒细胞数<100mm3时，即判定小鼠为中性粒细胞减少症，处于免疫抑制状态，可进行下一步实验。
(2)小鼠大腿感染模型及治疗实验
将25只上述免疫缺陷小鼠随机分为5组(n＝5)，分为空白对照组、模型组、L-丝氨酸治疗组、泰乐菌素治疗组、联合给药治疗组。取100μL1.0×107CFU/mL的耐药菌株菌液注射到小鼠大腿肌肉中。感染2h后，使用肌肉注射的方法，分别以泰乐菌素(10mg/kg)、L-丝氨酸(1g/kg)单独治疗，及泰乐菌素和L-丝氨酸联合(10mg/kg+1g/kg)治疗小鼠。空白对照组的小鼠于感染2h后注射无菌PBS。药物治疗22h后，将小鼠安乐死。将小鼠大腿肌肉分离，使用无菌生理盐水进行匀浆，匀浆后进行适当稀释，涂于THB琼脂培养基上进行菌落计数。
2.4.2大蜡螟模型感染实验
将60只大蜡螟幼虫随机分为6组(每组n＝10)，分为无操作空白对照组、未感染空白对照组、模型组、L-丝氨酸治疗组、泰乐菌素治疗组和联合给药治疗组。模型组和治疗组均通过大蜡螟右后足注射10μL1×107CFU/mL的耐药菌株菌液。感染2h后，治疗组通过左后足分别注射L-丝氨酸(1g/kg)、泰乐菌素(10mg/kg)、泰乐菌素与L-丝氨酸的组合(10mg/kg+1g/kg)。试验中包括两个阴性对照组，其中无操作空白对照组无任何处理以控制幼虫自身对死亡率的影响；另一组未感染空白对照组仅注射无菌的PBS以控制物理创伤对死亡的影响。注射后，幼虫在37℃和5％CO2的条件下，保存120h，每24h检查一次存活数量；如用手触碰后，幼虫没有移动，则被视为死亡。连续5天记录大蜡螟幼虫的存活情况。
2.5数据计算及统计分析
应用SPSS 26.0软件对本研究中的数据进行统计学分析，采用t检验对两组数据进行比较。其中，p<0.05表示两组间数值具有显著性差异，而p<0.01表示两组间数值具有极显著性差异。
3试验结果
3.1大环内酯类药物对猪链球菌MIC值的测定
根据美国CLSI中微量肉汤稀释法，测定泰乐菌素，替米考星和泰万菌素对猪链球菌的MIC值，结果如表1所示。
表1本试验中对猪链球菌的MIC(μg/mL)
3.2不同浓度L-丝氨酸与泰乐菌素联合使用对猪链球菌存活的影响
外源添加50mM L-丝氨酸对猪链球菌存活的影响的试验结果如图1所示，添加50mML-丝氨酸后，猪链球菌的耐药和敏感菌株的存活数量均无显著影响。
外源添加0、15、25和50mM的L-丝氨酸，分别与1/2MIC泰乐菌素共同作用耐药菌株，测定存活率。试验结果如图2所示，与泰乐菌素相比，25mM的L-丝氨酸与泰乐菌素联合作用后，耐药猪链球菌的存活率显著下降(p<0.05)；50mM的L-丝氨酸与泰乐菌素联合作用后，极显著降低了猪链球菌的存活率(p<0.01)。因此，L-丝氨酸增强猪链球菌对泰乐菌素的敏感性，呈现剂量依赖性。
3.3 L-丝氨酸与大环内酯类药物联用对猪链球菌存活的影响
在猪链球菌中，分别加入50mM L-丝氨酸、1/2或1/4MIC的泰乐菌素、泰万霉素和替米考星培养后，测定细菌的存活率。测定结果如图3所示，与泰乐菌素对照组相比，1/2(64μg/mL)和1/4MIC(32μg/mL)的泰乐菌素与L-丝氨酸联合使用后，耐药菌株的存活率极显著下降(p<0.01)。同样，与替米考星对照组相比，1/2(16μg/mL)和1/4MIC(8μg/mL)的替米考星与L-丝氨酸联合使用后，耐药菌株存活率极显著下降(p<0.01)。与泰万菌素对照组相比，1/2(128μg/mL)和1/4MIC(64μg/mL)的泰万菌素与L-丝氨酸联合使用后，耐药菌株的存活率极显著下降(p<0.01)。
3.4 L-丝氨酸对大环内酯类耐药猪链球菌生物被膜形成的影响
通过结晶紫染色法，在50mM L-丝氨酸的作用下，分析其对耐药菌株生物被膜形成的影响，试验结果如图4所示，当猪链球菌对大环内酯类药物产生耐药性后，生物被膜的形成极显著增强(p<0.01)。在耐药菌株中添加L-丝氨酸后，显著干预了其生物被膜的形成(p<0.01)。
3.5 L-丝氨酸联合泰乐菌素在体内感染模型中的治疗作用
3.5.1 L-丝氨酸联合泰乐菌素在小鼠大腿感染模型中的治疗作用
通过小鼠大腿感染模型，评估L-丝氨酸和泰乐菌素对猪链球菌大环内酯类耐药菌株的治疗作用。试验如图5结果所示，与模型组和单独用药组相比，L-丝氨酸和泰乐菌素联用治疗后，极显著减少了小鼠大腿组织中的载菌量(p<0.01)。
3.5.2 L-丝氨酸联合泰乐菌素在大蜡螟感染模型中的治疗作用
通过大蜡螟急性感染模型，评估L-丝氨酸和泰乐菌素联合应用后，对耐药菌株的治疗作用。如图6所示，L-丝氨酸和泰乐菌素联合治疗后，感染耐药菌株的幼虫存活率为80％。单独使用泰乐菌素或L-丝氨酸治疗后，幼虫的存活率分别为40％和20％。这些结果表明，L-丝氨酸能增强泰乐菌素对耐药菌株感染后的治疗作用。
Claims (2)
1.丝氨酸在制备干预或抑制猪链球菌生物被膜形成的药物中的用途。
2.丝氨酸在制备抑制猪链球菌药物中的用途；其中，将25mM的L-丝氨酸与1/2MIC的泰乐菌素进行联合使用，将50mM的L-丝氨酸与1/2MIC或1/4MIC的泰乐菌素进行联合使用；或者将50mM的L-丝氨酸分别与1/2MIC或1/4MIC的泰万霉素或替米考星进行联合使用。
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