CN114532292B - 5-氟尿嘧啶在构建鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了5‑氟尿嘧啶在构建鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型中的应用，属于生物技术领域。本发明发现5‑氟尿嘧啶可以提高小鼠细菌载量，降低小鼠体重和小鼠骨髓细胞的数量，有利于构建鲍曼不动杆菌重症感染的小鼠模型。本发明提供了鲍曼不动杆菌重症感染的小鼠模型的构建方法，所述方法操作简单，造模时间短，构建成功率高，可以很好的模拟鲍曼不动杆菌感染疾病的发生过程，用于鲍曼不动杆菌重症感染疾病发病机制和治疗药物的研究。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及5-氟尿嘧啶在构建鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型中的应用。
背景技术
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是临床重症监护病房里分离数量最多的一种条件致病菌，常引起免疫力低下病人的脓毒症和败血症，造成严重的院内感染。随着抗菌类药物的不断使用，鲍曼不动杆菌对头孢类、碳青霉烯类抗生素耐药性的不断增强，严重威胁着医院病人的健康(Perez F,HujerAM,Hujer KM,Decker BK,Rather PN,BonomoRA.Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.AntimicrobAgents Chemother.2007；51(10))。但是，流行病学调查发现，鲍曼不动杆菌对正常健康的人的感染性极低，通常不会引起健康人的感染。(Bergogne-Bérézin E,TownerKJ.Acinetobacter spp.as nosocomial pathogens:microbiological,clinical,and epidemiological features.Clin Microbiol Rev.1996；9(2):148-165.)。因此，解析生理及病理条件下鲍曼不动杆菌感染的关键调节靶点及调控机制，不仅有助于深入揭示机体的抗感染机制，更为控制细菌感染的发生提供有效的干预靶点和临床治疗依据。
与流行病学调查一致的是，鲍曼不动杆菌感染正常小鼠不会影响小鼠的存活，免疫缺陷型小鼠会增强对鲍曼不动杆菌感染的易感性，并会造成免疫缺陷型小鼠的死亡(Lonergan ZR,Nairn BL,Wang J,et al.An Acinetobacter baumannii,Zinc-RegulatedPeptidase Maintains Cell Wall Integrity during Immune-MediatedNutrientSequestration.Cell Rep.2019；26(8):2009-2018.e6.)。细菌感染的发生机制复杂且异质性较大，研究难点以及治疗性药物开发的关键在于寻找到正确靶点。传统上，通过对动物模型的研究来确定可能存在的药物靶点或新的治疗方式，进而推向临床实验。经常使用的细菌感染的动物模型包括内毒素的腹腔刺激、盲肠结扎和穿刺的腹腔感染、肺部或其他身体部位的干扰。虽然当前细菌感染以及脓毒症的动物模型帮助科学家们寻找到了许多的药物治疗靶点，但是依然没有充分反映细菌感染患者完整的病理生理周期(Rittirsch D,Hoesel LM,Ward PA.The disconnect between animal models ofsepsis andhumansepsis.J Leukoc Biol.2007；81(1):137-143.)，现存的动物模型难以模拟动物感染前治疗或感染后治疗，比如人类感染发生前的化疗处理等原发疾病治疗，以及感染发生后的支持治疗如抗生素、血管升压药、机械通气、体液恢复等研究，同样也不能反应特定病原菌感染导致的脓毒症特点，比如鲍曼不动杆菌等条件致病菌(an derPoll T,van de VeerdonkFL,Scicluna BP,Netea MG.The immunopathology of sepsis and potentialtherapeutic targets.Nat Rev Immunol.2017；17(7))。因此，寻找新的动物模型有助于开发潜在的药物治疗性靶点。
在癌症患者中，肿瘤细胞破坏免疫系统，导致患者的免疫力低下。在接受化疗药物治疗时，药物在杀伤肿瘤细胞的同时也会杀伤患者体内复制较快的免疫细胞，比如巨噬细胞和白细胞等。这些都使得癌症患者免疫力降低，容易感染病原菌，尤其是鲍曼不动杆菌，金黄色葡萄球菌等条件致病菌。而模拟临床癌症化疗病人感染条件致病菌重症感染的动物模型的建立还未见报道。
5-氟尿嘧啶，又名氟尿嘧啶，化学式为C4H3FN2O2，是一种嘧啶类似物，属于抗代谢药，主要用于肿瘤的化疗治疗，结构如下：
5-氟尿嘧啶在体内先经过一系列生化反应变成氟尿嘧啶脱氧核苷酸，然后影响DNA合成，也可以在体内转化为氟尿嘧啶核苷掺入RNA，从而干扰蛋白质合成。5-氟尿嘧啶在构建条件致病菌重症感染的动物模型中的应用未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供5-氟尿嘧啶在构建鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型中的应用，5-氟尿嘧啶可以提高小鼠细菌载量，降低小鼠体重和骨髓细胞的数量，提高鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型的构建成功率。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了5-氟尿嘧啶在构建鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型中的应用。
优选的，所述小鼠模型包括小鼠脓毒症模型和小鼠败血症模型。
优选的，所述5-氟尿嘧啶提高小鼠细菌载量，降低小鼠体重和小鼠骨髓细胞的数量。
本发明还提供了一种鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型的构建方法，包括：采用5-氟尿嘧啶溶液处理正常小鼠，然后以鲍曼不动杆菌感染小鼠，即得小鼠模型。
优选的，所述5-氟尿嘧啶溶液的处理方法包括腹腔注射。
优选的，所述5-氟尿嘧啶溶液浓度为8～12mg/mL。
优选的，所述5-氟尿嘧啶溶液用量为6～10μL/g体重。
本发明还提供了上述方法构建得到的鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型在鲍曼不动杆菌感染的关键调节靶点和调控机制研究中的应用。
本发明还提供了上述方法构建得到的鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型在开发或筛选预防和/或治疗细菌重症感染产品中的应用。
本发明还提供了上述方法构建得到的鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型在模拟临床癌症化疗病人感染条件致病菌重症研究中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明发现5-氟尿嘧啶可以提高小鼠细菌载量，降低小鼠体重和小鼠骨髓细胞的数量，利于构建鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型。
本发明所述方法构建动物模型操作简单，造模时间短，构建成功率高，并能很好的模拟鲍曼不动杆菌感染疾病的发生过程，有效填补了鲍曼不动杆菌感染动物模型的空白。
本发明还提供上述方法构建获得的小鼠模型在鲍曼不动杆菌重症感染疾病发病机制和治疗药物研究中的应用。
附图说明
图1为5-氟尿嘧啶和二甲基亚砜处理后小鼠的体重和骨髓细胞数量变化；
图2为鲍曼不动杆菌感染后小鼠的体重和细菌载量变化；
图3为鲍曼不动杆菌感染后小鼠的生存曲线。
具体实施方式
本发明提供了5-氟尿嘧啶在构建鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型中的应用，所述小鼠模型包括小鼠脓毒症模型和小鼠败血症模型。
本发明发现，采用5-氟尿嘧啶处理小鼠后，可以破坏小鼠的免疫系统，提高小鼠对鲍曼不动杆菌的载量，同时降低小鼠体重和骨髓细胞的数量，提高鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型的构建成功率。
本发明提供了一种鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型的构建方法，采用5-氟尿嘧啶溶液处理正常小鼠，然后以鲍曼不动杆菌感染小鼠，即得小鼠模型。作为一种可选的实施方式，本发明采用5-氟尿嘧啶溶液处理正常小鼠，处理后的小鼠正常饲养4～5天，然后感染鲍曼不动杆菌，即得小鼠模型。
在本发明中，所述5-氟尿嘧啶溶液的处理方法包括腹腔注射；所述5-氟尿嘧啶溶液浓度为8～12mg/mL，优选为9.2～11.3mg/mL，更优选为10～10.6mg/mL；所述5-氟尿嘧啶溶液用量为6～10μL/g体重，优选为6.8～9μL/g体重，更优选为7.2～8μL/g体重。
在本发明中，所述小鼠优选为采用滴鼻方式感染鲍曼不动杆菌，所述鲍曼不动杆菌感染量优选为2～8×108cfu，更优选为3.2～4×108cfu。
本发明构建的鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型，鲍曼不动杆菌能在小鼠体内快速增殖，不容易被小鼠清除，并最终导致小鼠重症疾病和死亡发生，进而可以作为鲍曼不动杆菌感染小鼠的脓毒症和败血症模型使用。
本发明构建得到的鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型可应用于鲍曼不动杆菌感染的关键调节靶点和调控机制的研究，进而用于开发或筛选预防和/或治疗细菌重症感染的产品。
本发明构建得到的鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型可用于模拟研究临床癌症化疗病人感染条件致病菌重症，进而用于开发或筛选预防和/或治疗癌症化疗病人感染条件致病菌重症的相关药品。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中动物为健康雄性C57/BL小鼠，由山东大学实验动物中心提供[实验动物许可证号：ECSBMSSDU2021-2-171]。
实施例1
本实施例探究了5-氟尿嘧啶对小鼠体重和骨髓细胞数量的影响。
(1)5-氟尿嘧啶用二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为50mg/mL的储存液，-20℃冰箱保存，处理小鼠前用1×PBS稀释成10mg/mL的工作浓度，用于实验组处理；
选用20％DMSO处理小鼠，作为对照组。
(2)将正常饲养的小鼠随机分成两组，每组5只，小鼠体重为20～30g之间。分别将200μL工作浓度的5-氟尿嘧啶和20％DMSO通过腹腔注射到的小鼠体内。
(3)处理后观察小鼠每日体重，并进行统计，每组计算小鼠体重平均值变化，见图1。分别在5-氟尿嘧啶处理后第3、5、7、9天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠肱骨和股骨，1mL注射器冲洗骨髓腔，使用红细胞裂解液去除红细胞后，用0.04％的台盼蓝对所得细胞进行计数，取平均值，小鼠骨髓细胞的数量变化见图1。
由图1可知，和20％DMSO注射的小鼠相比，5-氟尿嘧啶腹腔注射小鼠后其体重下降，在注射后第二天下降了体重的10％至最低点，之后小鼠体重开始恢复上升，约在5-氟尿嘧啶处理后的7～9天恢复到正常体重。不仅如此，计数发现，注射5-氟尿嘧啶后小鼠骨髓细胞数量显著下降，在注射第五天，骨髓总细胞数量下降到了正常小鼠的4.2％。这表示，5-氟尿嘧啶可以显著的降低小鼠的体重和骨髓细胞的数量。
实施例2
本实施例探究了鲍曼不动杆菌在5-氟尿嘧啶处理小鼠肺组织内细菌载量的变化。
(1)临床分离出具有可致病性的鲍曼不动杆菌，在脑心浸液培养基(Brian HeartInfusion；BHI)中培养，备用。
(2)将正常饲养的小鼠随机分成两组，每组8只，小鼠体重为20～30g之间。实验组按照实施例1步骤(2)所述方法，采用5-氟尿嘧啶处理小鼠；对照组小鼠不作处理。在5-氟尿嘧啶处理后的第五天，实验组和对照组小鼠分别通过滴鼻的方式感染4×108cfu的鲍曼不动杆菌。
(3)感染一天后，颈椎脱臼法处死小鼠，取小鼠肺组织，称重记录并研磨肺组织，1×PBS重悬，5倍梯度稀释后滴到LB固体培养基，置于37℃恒温箱内培养，第二天查菌落数量并记录，然后按照每g肺组织内含有的细菌载量计算鲍曼不动杆菌的CFU，结果见图2。
由图2可知，腹腔注射5-氟尿嘧啶的小鼠肺组织中鲍曼不动杆菌的细菌载量约是没有腹腔注射5-氟尿嘧啶小鼠肺组织中的106倍。表明：5-氟尿嘧啶处理后的小鼠在感染鲍曼不动杆菌后，可以提高小鼠细菌载量，鲍曼不动杆菌会在小鼠肺组织内增殖，引起小鼠的重症感染。
实施例3
本实施例探究了鲍曼不动杆菌对5-氟尿嘧啶处理后的小鼠生存的影响。
(1)将正常饲养的小鼠随机分成三组，每组10只，小鼠体重为20～30g之间。
(2)实验组1按照实施例1步骤(2)所述方法，采用5-氟尿嘧啶处理小鼠；
实验组2按照实施例2步骤(2)所述实验组方法，使正常饲养的小鼠感染鲍曼不动杆菌；
实验组3按照实施例2步骤(2)所述对照组方法，使5-氟尿嘧啶处理后的小鼠感染鲍曼不动杆菌。
(3)观察每组小鼠的体重变化并记录死亡时间，见图3。
由图3可知，5-氟尿嘧啶处理后的小鼠在感染鲍曼不动杆菌后的2天，小鼠开始死亡，感染后第三天，小鼠全部死亡。但是只用鲍曼不动杆菌感染的正常小鼠以及只用5-氟尿嘧啶处理的小鼠均不会死亡。表明，鲍曼不动杆菌感染5-氟尿嘧啶处理的小鼠，会引起小鼠的重症感染，最终导致小鼠死亡。
实施例4
本实施例构建了鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型。
(1)5-氟尿嘧啶用二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为50mg/mL的储存液，-20℃冰箱保存，处理小鼠前用1×PBS稀释成10mg/mL的工作浓度。
(2)选择正常饲养的小鼠，小鼠体重为24g。将200μL工作浓度的5-氟尿嘧啶通过腹腔注射到的小鼠体内，处理后的小鼠继续正常饲养。
(3)5-氟尿嘧啶处理后的小鼠正常饲养5天后，通过滴鼻的方式感染4×108cfu的鲍曼不动杆菌，即得小鼠模型。
实施例5
本实施例与实施例4的区别在于，步骤(1)中5-氟尿嘧啶溶液用1×PBS稀释成9.2mg/mL的工作浓度。
实施例6
本实施例与实施例4的区别在于，步骤(2)中小鼠体重为25.4g，5-氟尿嘧啶溶液用量为210μL。
实施例7
本实施例与实施例4的区别在于，5-氟尿嘧啶处理后的小鼠正常饲养4天后感染鲍曼不动杆菌。
实施例8
本实施例与实施例4的区别在于，步骤(3)中鲍曼不动杆菌感染量为4.5×108cfu。
对实施例4～实施例8构建的小鼠模型观察发现：5-氟尿嘧啶处理后对小鼠的活动状态没有影响，但体重出现下降现象，感染鲍曼不动杆菌后，鲍曼不动杆菌能在小鼠体内快速增殖，不容易被小鼠自身清除，并最终导致小鼠重症疾病和死亡发生，可以作为鲍曼不动杆菌感染小鼠的脓毒症和败血症模型使用，并且能够模拟免疫力低下的临床化疗病人感染医院里最常见条件致病—菌鲍曼不动杆菌的完整周期。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.5-氟尿嘧啶在构建鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型中的应用，其特征在于，采用5-氟尿嘧啶溶液对小鼠进行腹腔注射，所述5-氟尿嘧啶溶液浓度为8～12mg/mL，所述5-氟尿嘧啶溶液用量为6～10μL/g体重；所述5-氟尿嘧啶提高小鼠细菌载量，降低小鼠体重和小鼠骨髓细胞的数量。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小鼠模型包括小鼠脓毒症模型和小鼠败血症模型。
3.一种鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型的构建方法，其特征在于，采用5-氟尿嘧啶溶液处理正常小鼠，然后以鲍曼不动杆菌感染小鼠，即得小鼠模型；所述5-氟尿嘧啶溶液的处理方法包括腹腔注射，所述5-氟尿嘧啶溶液浓度为8～12mg/mL，所述5-氟尿嘧啶溶液用量为6～10μL/g体重。
4.权利要求3所述方法构建得到的鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型在鲍曼不动杆菌感染的关键调节靶点和调控机制研究中的应用。
5.权利要求3所述方法构建得到的鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型在开发或筛选预防和/或治疗细菌重症感染产品中的应用。
6.权利要求3所述方法构建得到的鲍曼不动杆菌感染的小鼠模型在模拟临床癌症化疗病人感染条件致病菌重症研究中的应用。
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