CN106138109B - 一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法 - Google Patents

一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法，包括如下步骤：(1)构建免疫抑制的新西兰兔；(2)配置鲍曼氏不动杆菌菌液；(3)感染动物，构建模型。本发明通过构建一种简单、快速、高效的鲍曼氏不动杆菌感染肺炎动物模型，以帮助人们研究鲍曼氏不动杆菌细菌耐药的产生、发展过程及其耐药的有关机制，为延缓细菌耐药，更好的治疗鲍曼氏不动杆菌感染提供帮助，以减少患者相关治疗的支出，促进人类健康。

Description

一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法
技术领域
本发明涉及医学动物模型技术领域，具体为一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法。
背景技术
近年来，国内外关于鲍曼不动杆菌的报道逐渐增多。Keen及Robinson的报道显示，鲍曼不动杆菌的检出率居于首位，高达53％。Mendes等的研究表明，近年来不动杆菌属的检出率呈逐年上升趋势，由鲍曼不动杆菌引起的感染占不动杆菌属的80％-90％。2013年中国CHINET细菌耐药性监测显示鲍曼不动杆菌院内检出率达(11.97％)，居于所有革兰阴性菌检出率第三位，并呈现出高耐药、多重耐药的趋势，对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为62.8％和59.4％，且泛耐药(XDR)菌株的检出率居高不下，明显高于泛耐药铜绿假单胞菌及泛耐药肺炎克雷伯菌的检出率。
基于人类伦理学的限制，不能在人体构建模型对细菌耐药性的产生、预防及相关耐药机制机理研究。因此，构建相关动物模型研究疾病的发生发展凸显得尤为重要，通过相关模型的建立、治疗，获取相关数据，为临床治疗此类疾病提供重要的实验依据，预防细菌耐药突变的发生。目前国内外关于肺炎的动物模型的建立，大部分是使用小鼠构建肺炎模型。但是，小鼠的机体代谢与人类差别较大，临床表现难以进行观察，实验取材也不方便，同时，模型建立之后，维持的时间很短，无法进行后续的临床治疗方案模拟。
目前，有金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌等细菌的动物模型有报道，但未有鲍曼不动杆菌肺炎新西兰兔模型报道，关于动物细菌感染的模型建立主要有以下几种方法：直接暴露感染法、密闭容器雾化吸入法、经支气管或经口插管接种法、经鼻腔滴注法等，其方法、优缺点如下：
1)直接暴露法是使未感染动物与已感染动物同处，已感染动物通过咳嗽等方式导出致病菌，未感染动物吸入其呼出气体或通过身体接触，从而使未感染动物达到感染目的。其缺点是无法控制感染物接种剂量、感染时间，个体差异较大。
2)密闭容器雾化吸入法是指将未感染动物的全身或者鼻子暴露在雾化器中，动物吸入含有致病微生物的雾化气体后造成气管支气管感染。其优点是可调控雾化吸入器中接种物的浓度，且可以同时大批量处理动物，达到省时的目的；缺点是某些细菌菌悬液状态性质不稳定，不能确定吸入细菌数，不能保证接种绝对成功，需要取分泌物行定量分析，个体差异大，且容易造成环境污染，危害实验人员人身安全。
3)经气管或经口插管接种法是指麻醉动物后，行气管切开或经口插管，将细菌菌悬液直接滴注入气管中。优点是剂量准确，个体差异小，感染成功率高，缺点是需要先麻醉动物，费时且增加工作量；经气管接种需要切开颈部皮肤，对实验动物造成额外创伤，增加了外源感染机会；经口插管可能会将一些口咽部定植菌带入下呼吸道，干扰实验结果。
4)经鼻腔滴注法是指麻醉动物后，将细菌菌悬液滴入动物鼻腔，菌悬液可随呼吸进入下呼吸道，造成肺部感染。优点是方法简单容易操作，缺点是呼吸道部分寄生菌可能会随之进入下呼吸道，对实验结果造成干扰；滴鼻容易引起动物喷嚏反射，喷出菌悬液不易于细菌定量，造成个体差异；且经鼻滴注菌液浓度高，对气道粘膜的刺激较雾化吸入法大。
因此，很有必要设计一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法，从而解决上述背景技术中的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建免疫抑制的新西兰兔；
(2)配置鲍曼氏不动杆菌菌液；
(3)感染动物，构建模型。
需要说明的是：本发明在于提供一种动物模型的构建方法，不直接得到疾病的诊断结果，同时也不是外科手术方法，具有可重复操作性以及工业实用性。
本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤(1)中，构建免疫抑制的新西兰兔详细步骤为：
取健康新西兰兔，经胸片检查确认无肺部感染，前六天每日经耳缘静脉注射阿糖胞苷440mg/m2，第6日后隔日1次，得到免疫抑制的新西兰兔；所述免疫抑制的新西兰兔特征均有：毛发杂乱、无光泽及轻度脱毛现象，饮水、进食及活动减少，体温稍下降，体重未见明显增加，血细胞计数较免疫抑制剂使用前有明显下降(下降30％以上)。
健康新西兰兔为清洁级健康新西兰兔，体重1.5-2.5kg，全部单笼饲养，标准饲料喂养，自由进食、饮水，实验前经X线检查确定健康、无肺部感染。并保持温度在20-24℃，湿度保持在50％-70％，定期紫外线消毒的动物实验室内喂养7天后再构建免疫抑制的新西兰兔。
本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤(2)中，配置鲍曼氏不动杆菌菌液详细步骤为：
取新鲜鲍曼氏不动杆菌培养液，配制成麦氏浓度为1-4(细菌量3×108-12×108cfu/ml)的菌液，取菌液1毫升，加入无菌脱脂牛奶液1毫升，500转/分钟振动器混匀2分钟，得到鲍曼氏不动杆菌菌液(麦氏浓度为0.5-2)。
鲍曼不动杆菌标准菌株(ATCC19606)采用上海北诺生物科技有限公司提供的菌株，经细菌室鉴定后于负80度低温冰箱冷冻保存。
所述鲍曼不动杆菌标准菌株接种培养时，用2μl无菌接种环挑取1环Ab，三区划线接种于血平板，置于CO2孵箱37℃培养24h，每24h转种1次，以保证菌株的活性；选经典单菌落转种于M-H肉汤，于37℃条件下恒温孵育18h，得到鲍曼氏不动杆菌培养液。
M-H肉汤中含有15wt％的甘油。
本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤(3)中，首先对手术环境消毒；然后麻醉新西兰兔；最后将鲍曼氏不动杆菌菌液感染麻醉后的新西兰兔。
本发明中，作为一种优选的技术方案，对手术环境消毒时，利用紫外灯对空气消毒，将动物接种手术操作台用0.5wt％的84消毒液擦拭消毒。
本发明中，作为一种优选的技术方案，麻醉药的配置如下：取戊巴比妥钠，用无菌生理盐水配置成浓度为3wt％的溶液，现配现用。
本发明中，作为一种优选的技术方案，麻醉新西兰兔的详细步骤为：取免疫抑制第7天的免疫抑制的新西兰兔，经耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠30mg/kg以进行麻醉。
本发明中，作为一种优选的技术方案，感染的过程如下：将麻醉后的动物以仰卧位固定于手术操作台上，将兔头后仰并固定，剪去咽喉部毛发以暴露环甲软骨，术者手消毒，常规消毒穿刺部位，以左手拇指与食指固定气管并撑开皮肤，右手持注射器在环甲膜部位行气管穿刺，垂直进针，成功穿刺后有落空感，回抽注射器可见气体冒出，迅速注入已配置好的菌液1ml，立即将新西兰兔取头高脚低位，使菌悬液易于进入下呼吸道。
由于采用了以上技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明通过构建一种简单、快速、高效的鲍曼氏不动杆菌感染肺炎动物模型，以帮助人们研究鲍曼氏不动杆菌细菌耐药的产生、发展过程及其耐药的有关机制，为延缓细菌耐药，更好的治疗鲍曼氏不动杆菌感染提供帮助，以减少患者相关治疗的支出，促进人类健康。
附图说明
图1为实施例免疫抑制组中各组新西兰兔接种后体温变化图；
图2为实施例非免疫抑制组中各组新西兰兔接种后体温变化图；
图3为接种后各组白细胞计数变化图；
图4至图19为免疫抑制组新西兰兔的肺部影像学检查结果图；
图20至图35非免疫抑制组新西兰兔的肺部影像学检查结果图；
图36至图39为免疫抑制组新西兰兔的病理学检查结果图；
图40至图43为非免疫抑制组新西兰兔的病理学检查结果图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建免疫抑制的新西兰兔；
详细步骤为：取健康新西兰兔，经胸片检查确认无肺部感染，前六天每日经耳缘静脉注射阿糖胞苷440mg/m2，第6日后隔日1次，得到免疫抑制的新西兰兔；所述免疫抑制的新西兰兔特征均有：毛发杂乱、无光泽及轻度脱毛现象，饮水、进食及活动减少，体温稍下降，体重未见明显增加，血细胞计数较免疫抑制剂使用前有明显下降(下降30％以上)；健康新西兰兔为清洁级健康新西兰兔，体重1.5-2.5kg，全部单笼饲养，标准饲料喂养，自由进食、饮水，实验前经X线检查确定健康、无肺部感染。并保持温度在20-24℃，湿度保持在50％-70％，定期紫外线消毒的动物实验室内喂养7天后再构建免疫抑制的新西兰兔；
(2)配置鲍曼氏不动杆菌菌液；
鲍曼不动杆菌标准菌株(ATCC19606)采用上海北诺生物科技有限公司提供的菌株，经细菌室鉴定后于负80度低温冰箱冷冻保存；
所述鲍曼不动杆菌标准菌株接种培养时，用2μl无菌接种环挑取1环Ab，三区划线接种于血平板，置于CO2孵箱37℃培养24h，每24h转种1次，以保证菌株的活性；选经典单菌落转种于M-H肉汤，M-H肉汤中含有15wt％的甘油，于37℃条件下恒温孵育18h，得到鲍曼氏不动杆菌培养液；
取新鲜鲍曼氏不动杆菌培养液，配制成麦氏浓度为1-4(细菌量3×108-12×108cfu/ml)的菌液，取菌液1毫升，加入无菌脱脂牛奶液1毫升，500转/分钟振动器混匀2分钟，得到鲍曼氏不动杆菌菌液；
(3)感染动物，构建模型
首先对手术环境消毒；对手术环境消毒时，利用紫外灯对空气消毒，将动物接种手术操作台用0.5wt％的84消毒液擦拭消毒；
然后麻醉新西兰兔；麻醉药的配置如下：取戊巴比妥钠，用无菌生理盐水配置成浓度为3wt％的溶液，现配现用，免疫抑制第7天，经耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠30mg/kg以麻醉新西兰兔；
最后将鲍曼氏不动杆菌菌液感染麻醉后的新西兰兔；将麻醉后的动物以仰卧位固定于手术操作台上，将兔头后仰并固定，剪去咽喉部毛发以暴露环甲软骨，术者手消毒，常规消毒穿刺部位，以左手拇指与食指固定气管并撑开皮肤，右手持注射器在环甲膜部位行气管穿刺，垂直进针，成功穿刺后有落空感，回抽注射器可见气体冒出，迅速注入已配置好的菌液1ml，立即将新西兰兔取头高脚低位，使菌悬液易于进入下呼吸道。
以上实施例中，所用的设备如下：
以上实施例中，所用的耗材和试剂如下：
本实施例同时设置了对照实验组：
以上为加入牛奶稀释后的浓度。
发明人按照如下的标准实现指标检测与观察。
1.一般情况
免疫抑制前、接种前及接种后每日测量体温、体重，观察动物的活动度、精神状态、呼吸、毛发及进食饮水等情况。
2.血常规检查
免疫抑制组于免疫抑制前、免疫抑制第6天(接种前1天)及接种后第2、4、7天耳缘静脉采血，非免疫抑制组于接种前1天及接种后第2、4、7天耳缘静脉采血，按标准实验室方法行外周血白细胞计数。
3.肺部影像学检查
为观察肺脏的炎症变化及判断感染效果，接种前及接种后第3、5、7天行胸部X线检查。
4.细菌学检查
接种后第3、7天，经耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠30mg/kg以麻醉新西兰兔。将麻醉后的动物固定于手术操作台上，用无菌棉签蘸无菌生理盐水清洁新西兰兔口腔，将兔头后仰并固定，暴露咽喉部，将兔舌从口腔一侧轻轻拉出，取无菌红色吸痰管从兔口腔另一侧轻轻插入，观察兔咽喉部可见有物体通过，插入12cm后将吸痰管另一端放入盛有无菌生理盐水的消毒容器中，可见吸痰管内有液体随呼吸波动，可证明气管内插管成功。抽吸吸痰管后拔出，取吸痰管内分泌物立即送检行细菌培养。
各组接种前及接种第2、4、7天静脉采血行血培养。根据CLSI血培养的原则和操作程序推荐(Proposed)指南，先行采血部位备皮，拔除穿刺部位周围5cm毛发；准备血培养瓶，分需氧、厌氧两种，检查确认血培养瓶在保质期内且无破损；操作者洗手或手消毒；消毒采血瓶，用75％酒精消毒血培养瓶瓶塞，酒精作用60秒，待干；采用3步消毒法消毒穿刺部位，范围为穿刺部位周围5cm，由中央向周围画圈，即75％酒精消毒(作用30秒，待干)→碘酊或碘伏消毒(碘酊作用30秒，碘伏作用1.5-2分钟，待干)→75％酒精消毒(作用60秒，待干)；持穿刺针按常规方法刺入静脉，另一头刺入血培养瓶中，利用其真空抽吸血液2ml，或直接用注射器抽吸血液，再注入血培养瓶；在不同解剖位置，连续采血两到三套行血培养；血液注入培养瓶后轻轻摇晃培养瓶以防血液凝固；采血后立即送检，不得超过2小时；标本上血培养仪行培养分析。
接种第8天，予以处死新西兰兔，皮肤消毒后划开胸部皮肤，暴露胸腔，剪断胸骨，沿胸骨上缘剪断气管，钝性分离心肺组织，留取左肺和右肺，取左肺肺组织行组织匀浆液培养。用无菌纱布吸尽左肺组织表面血液，加入9倍质量生理盐水，用低温匀浆器匀浆后，低温离心15min，留取上清液。左肺匀浆于普通琼脂培养基37℃培养24h，经VITEX微生物自动分析仪行微生物学检查。
5.病理学检查
于接种后第8天，处死新西兰兔后取右肺肺组织行病理学检查。先肉眼观肺组织变化，再将其固定、包埋、切片、染色，镜下观察肺组织的病理改变及炎症反应，并进行肺组织病理半定量评分。评分标准见表。
肺组织病理半定量评分表
6.数据处理
采用SPSS18.0统计软件建立数据库，并对数据进行统计分析。剂量资料采用进行描述；重复测量资料采用重复测量设计资料的方差分析法进行统计分析；完全随机设计资料多组间均数的比较采用完全随机设计资料的方差分析方法；两独立样本资料之间均数的比较采用两独立样本t检验；P＜0.05，表示差异有统计学意义。
最终得到的结果如下：
1.1 免疫抑制组新西兰兔的一般情况
免疫抑制组中各实验组新西兰兔接种第1天内症状较轻，接种后第2天起精神状态下降，活动明显减少，进食和饮水减少，体重持续下降，毛发皱乱粗糙，呼吸时可听到喘息声加重，体温上升，各种症状逐渐加重。其中，实验组I均于第4天精神状态不同程度的恢复，进食饮水正常，各症状减轻。实验组Ⅲ两只兔分别于2、4天死亡，取其肺组织细菌培养及定量分析。对照组接种后较接种前无明显异常表现。体温变化见图1。由图1可见：与对照组相比，实验组体温均从接种第2天明显上升；实验组I至第4天体温缓慢下降；实验组Ⅱ、Ⅲ体温上升幅度大于I组，且发热维持一周。
1.2 非免疫抑制组新西兰兔的一般情况
非免疫抑制组中各实验组新西兰兔接种第1天未见明显异常，接种后第2天精神状态稍下降，进食和饮水稍减少，体重未见明显增加，体温不同程度上升。其中，实验组A均于第3天精神状态不同程度恢复，进食饮水好转，各症状减轻。实验组B、C于第5天体温不同程度下降，精神状态逐渐恢复，进食饮水好转，各症状逐渐减轻。对照组接种前后均无明显异常。体温变化参见图2。由图2可见：与对照组相比，实验组体温均从接种第2天逐渐上升；实验组A至第3天体温缓慢下降；实验组B、C体温上升幅度大于A组，但均于第5天不同程度下降，不能维持发热状态。
实验组A为试验I组接种后的实验组，对照组α对应对照组β，其余组别同样对应关系。
2.1 免疫抑制组新西兰兔的血常规检查情况
免疫抑制组于免疫抑制前、免疫第6天(接种前)、接种第2天、接种第4天、接种第7天，抽取各组新西兰兔耳缘静脉血查血常规，结果显示：各组标本血常规有不同变化，具体数值参见表。由表可见：新西兰兔经免疫抑制后外周血白细胞较免疫抑制前有明显下降，且四组之间白细胞计数差异无统计学意义(P＝0.533>0.05)。由表可见：接种Ab或生理盐水后，各组白细胞计数均有变化，各实验组相对于对照组白细胞上升明显，且实验组II、III白细胞上升幅度比实验组I大。对照组白细胞计数变化不大，上升后缓慢下降。
统计学分析使用球对称检验：卡方值＝12.890，P＝0.025＜0.05，不满足使用协方差矩阵球对称的条件，故以下分析采用Greenhouse-Geisser法对统计结果值进行校正；不同用药时相：F＝987.271，P＝0.000＜0.05，说明不同时相之间白细胞计数存在差别；不同剂量分组：F＝415.172，P＝0.000＜0.05，说明不同剂量组之间白细胞计数存在差别；交互作用：F＝139.521，P＝0.000＜0.05，说明剂量与时相之间存在交互作用；不同剂量组间两两比较：PαⅠ＝0.00＜0.05，PαⅡ＝0.000＜0.05，PαⅢ＝0.000＜0.05，PⅠⅡ＝0.000＜0.05，PⅠⅢ＝0.000＜0.05，PⅡⅢ＝0.000＜0.05，说明不同剂量组白细胞计数存在差异，实验组Ⅲ＞实验组Ⅱ＞实验组Ⅰ＞对照组α，差异有统计学意义。
表 免疫抑制组免疫抑制前及免疫抑制后的外周血白细胞计数变化(×109/L)
表 免疫抑制组新西兰兔接种前后血白细胞计数变化(×109/L)
2.2 非免疫抑制组新西兰兔的血常规检查情况
非免疫抑制组于接种前、接种第2天、接种第4天、接种第7天，抽取各组新西兰兔耳缘静脉血查血常规，结果显示：各组标本血常规有不同变化，具体数值参见表。由表可见：接种Ab或生理盐水后，各组白细胞计数均有变化，各实验组相对于对照组白细胞均上升，实验组B、C白细胞上升幅度比A组大，且均于实验第7天不同程度下降。对照组白细胞计数变化不大，上升后缓慢下降。
统计学分析使用球对称检验：卡方值＝8.039，P＝0.154﹥0.05，满足协方差矩阵球对称的条件；不同用药时相：F＝111.897，P＝0.000<0.05，说明不同时相之间白细胞计数存在差别；不同剂量分组：F＝28.988，P＝0.000<0.05，说明不同剂量之间白细胞计数存在差别；交互作用：F＝16.558，P＝0.000<0.05，说明剂量与时相之间存在交互作用；不同剂量组间两两比较：PβА＝0.137﹥0.05，PβВ＝0.000<0.05，PβС＝0.000<0.05，PАВ＝0.004<0.05，PАС＝0.000<0.05，PВС＝0.001<0.05，说明白细胞数量实验组C>实验组B>实验组A，实验组C>实验组B>对照组β，差异有统计学意义；对照组β、实验组A两组白细胞数量差异无统计学意义。
表 非免疫抑制组新西兰兔接种前后血白细胞计数变化(×109/L)
免疫抑制组与非免疫抑制组新西兰兔白细胞计数比较，见表。统计分析使用球对称检验：卡方值＝115.961，P＝0.000<0.05，不满足使用协方差矩阵球对称的条件，故以下分析采用Greenhouse-Geisser法对统计结果值进行校正；不同用药时相：F＝85.423，P＝0.000<0.05，说明不同时相之间白细胞计数存在差别；不同处理组：F＝42.147，P＝0.000<0.05，说明免疫抑制与非免疫抑制组之间白细胞计数存在差别；交互作用：F＝29.413，P＝0.000<0.05，说明不同处理分组与时相之间存在交互作用。
表 免疫抑制组与非免疫抑制组新西兰兔白细胞计数变化(×109/L)
由图3可见：接种前，免疫抑制组经免疫抑制后，白细胞计数较非免疫抑制组明显降低；接种后，各组白细胞均不同程度上升，免疫抑制组中实验I、II、III均明显上升，幅度大，其中组III＞组II＞组I，且能维持一周；非免疫抑制组中实验组A、B、C初始时也呈上升趋势，上升幅度组C＞组B＞组A，但于4天后都不同程度降低，不能维持一周；两组中对照组α与对照组β白细胞较接种前稍上升，但幅度不大，且较快恢复到初始水平。
3.1 免疫抑制组新西兰兔的肺部影像学检查
实验开始前经胸片检查，确认各组新西兰兔健康、无肺部感染，于接种后第3、5、7天行胸部X线检查。各组新西兰兔胸片结果见图4至图19：对照组α、实验组I接种前后胸片未见明显改变；实验组II接种第5天起可见少量渗出、肺纹理稍增粗，第7天可见明显絮状渗出及高密度阴影；实验组III第5天开始肺纹理增粗，可见明显絮状渗出，第7天渗出更加明显。
3.2 非免疫抑制组新西兰兔的肺部影像学检查
实验开始前经胸片检查，确认各组新西兰兔健康、无肺部感染，于接种后第3、5、7天行胸部X线检查。各组新西兰兔胸片结果见图20至图35：对照组β、实验组A接种前后胸片未见明显改变；实验组B接种第5天起可见少量渗出，第7天渗出较前明显；实验组C第5天开始肺纹理增粗，可见明显絮状渗出，第7天渗出较前明显。但各组改变均不及相对的免疫抑制组明显。
4.1 免疫抑制组新西兰兔的细菌学检查
接种后第3、7天，取免疫抑制组各组新西兰兔肺部分泌物行细菌培养并定量，结果如下：①接种第3天，细菌培养鉴定结果提示各实验组均有鲍曼不动杆菌生长，且鲍曼不动杆菌定量≥107cfu/ml；②第7天，实验组I鲍曼不动杆菌定量<104cfu/ml，实验组II和III培养鲍曼不动杆菌定量≥107cfu/ml；③死亡的2只兔肺组织内鲍曼不动杆菌定量≥107cfu/ml；④对照组α未培养出细菌。
接种前及接种第2、4、7天静脉采血行血培养，结果示：血培养未见细菌生长。
4.2 非免疫抑制组新西兰兔的细菌学检查
接种后第3、7天，取非免疫抑制组各组新西兰兔肺部分泌物行细菌培养并定量，结果如下：①接种第3天，细菌培养鉴定结果提示各实验组均有鲍曼不动杆菌生长，且鲍曼不动杆菌定量≥107cfu/ml；②第7天，实验组A鲍曼不动杆菌定量均<104cfu/ml；实验组B和C鲍曼不动杆菌定量部分<104cfu/ml；③对照组β未培养出细菌。
接种前及接种第2、4、7天静脉采血行血培养，结果示：血培养未见细菌生长。
5.1 免疫抑制组新西兰兔的病理学检查
免疫抑制组于接种后第8天处死新西兰兔，取右肺肺组织行肉眼观察及病理学检查，病理学检查结果如图36至图39所示。对照组α肺组织肉眼观察呈粉红色、柔软光滑，镜下见肺泡结构清晰完整，肺泡间隔正常，肺泡腔偶见水肿渗出液；实验组I肺组织肉眼观察呈粉红色、柔软光滑，镜下肺泡结构清晰完整，肺泡间隔稍增宽，少量水肿液渗出；实验组II肺组织肉眼观察色泽较暗红，肺表面偶可见小脓疱及散在出血点，切面可见少量淡黄色液体渗出，镜下部分肺泡结构被破坏，肺泡间隔增宽，中性粒细胞浸润，水肿液渗出，管腔内可见红细胞瘀滞；实验组III肺组织肉眼观察色泽暗红，表面可见小脓疱及片状出血点，其切面可见淡黄色液体溢出，镜下见肺泡组织毁损，肺泡腔内水肿液渗出，大量中性粒细胞浸润，毛细血管充血，气道上皮粘膜部分坏死脱落。
病理半定量评分统计学分析见表。方差齐性检验：Levene统计值＝1.242，P＝0.313>0.10，满足方差齐性条件；方差分析：F值＝449.53，P＝0.000<0.05，表示不同实验组间比较，病理评分不同，差异有统计学意义；组间两两比较：PαⅠ＝0.000<0.05，PαⅡ＝0.000<0.05，PαⅢ＝0.000<0.05，PⅠⅡ＝0.000<0.05，PⅠⅢ＝0.000<0.05，PⅡⅢ＝0.000<0.05，说明病理半定量评分实验组Ⅲ＞实验组Ⅱ＞实验组Ⅰ＞对照组а，差异有统计学意义。
表 免疫抑制组病理半定量评分
5.2 非免疫抑制组新西兰兔的病理学检查
非免疫抑制组于接种后第8天处死新西兰兔，取右肺肺组织行肉眼观察及病理切片检查，病理学检查结果如图40至图43所示。非免疫抑制组中对照组β肺组织肉眼观察呈粉红色、柔软光滑，镜下见肺泡结构清晰完整，肺泡间隔正常，肺泡腔偶见水肿渗出液；实验组A肺组织肉眼观察呈粉红色、柔软光滑，镜下肺泡结构清晰完整，肺泡间隔稍增宽，少量水肿液渗出；实验组B肺组织色泽较暗，表面可见散在出血点，切面偶见少量淡黄色液体渗出，镜下部分肺泡结构被破坏，肺泡间隔增宽，少量水肿液渗出，中性粒细胞渗出，管腔内可见红细胞；实验组C肺组织色泽较暗红，表面可见点状出血点，偶见小脓疱，切面可见淡黄色液体溢出，镜下见肺泡组织毁损，肺泡间隔增宽，肺泡腔内水肿液渗出，大量中性粒细胞浸润，红细胞渗出，气道上皮粘膜部分坏死脱落。
病理半定量评分统计学分析见表。方差齐性检验：Levene统计值＝0.769，P＝0.521>0.10，满足方差齐性条件；方差分析：F值＝194.218，P＝0.000<0.05，表示不同实验组间比较，病理评分不同，差异有统计学意义；组间两两比较：PβА＝0.000<0.05，PβВ＝0.000<0.05，PβС＝0.000<0.05，PАВ＝0.000<0.05，PАС＝0.000<0.05，PВС＝0.000<0.05，说明病理评分实验组C＞实验组B＞实验组A＞对照组β，差异有统计学意义。
表 非免疫抑制组病理半定量评分
结合上表，比较免疫抑制组与非免疫抑制组的病理半定量评分。对照组α与对照组β比较，P＝1.000＞0.05，病理评分无统计学差异，说明两对照组结果无明显差异；实验组A与实验组Ⅰ比较，病理评分实验组Ⅰ＞实验组A，P＝0.000＜0.05，差异有统计学差异，说明实验组Ⅰ病理改变较实验组A明显；实验组B与实验组Ⅱ比较，病理评分实验组Ⅱ＞实验组B，P＝0.000＜0.05，差异有统计学差异，说明实验组Ⅱ病理改变较实验组B明显；实验组C与实验组Ⅲ比较，病理评分实验组Ⅲ＞实验组C，P＝0.000＜0.05，差异有统计学差异，说明实验组Ⅲ病理改变较实验组C明显；非免疫抑制组与免疫抑制组比较，病理评分免疫抑制组＞非免疫抑制组，P＝0.024＜0.05，差异有统计学差异，说明总体上来说，免疫抑制组的病理改变较非免疫抑制组明显。
表 免疫抑制组与非免疫抑制组病理半定量评分比较
结果分析如下：
1、免疫抑制组经免疫抑制处理后均有毛发杂乱无光泽及轻度脱毛现象，进食、饮水及活动稍减少，体温稍下降，体重未见明显增加，说明免疫抑制对新西兰兔造成了一定的影响；接种后免疫抑制组中实验组Ⅱ、Ⅲ体温上升幅度大，且发热维持一周，实验组I体温上升后逐渐下降，说明实验组I症状逐渐减轻，不能维持发热状态，而实验组Ⅱ、Ⅲ能维持稳定的感染状态；非免疫抑制组接种后各实验组均不能维持发热状态，说明非免疫抑制组感染时间窗太短，不利于后续研究。
2、白细胞计数变化是炎症改变的一个重要指标。比较非免疫抑制组与免疫抑制组白细胞变化可见：两对照组接种生理盐水后，白细胞均稍有上升，但幅度不大，且之后缓慢下降，可能是由于生理盐水进入肺部后机体应激反应导致白细胞上升，但很快机体予以清除后白细胞下降；非免疫抑制组新西兰兔接种后初始时白细胞亦不同程度上升，但均于第4天后不同程度下降，观察时间窗太短，不利于后续研究；免疫抑制组中新西兰兔接种细菌后白细胞变化较非免疫抑制组明显(P＝0.000<0.05)，且能维持一周；其中，实验组II、III变化幅度大于实验组I(P＝0.000<0.05)，但实验组III中有两只兔分别于实验第2、4天死亡，说明实验组III接种细菌数量(6×108cfu/ml)过大，容易造成实验动物死亡，实验结果不稳定，不利于后续研究；实验组I与对照组α白细胞改变差异不大，可能与接种细菌数量较小有关(1.5×108cfu/ml)。
3、肺部影像学改变是确诊肺炎的关键。影像学改变一般较临床表现(如体温、咳嗽咳痰、呼吸音改变等)及白细胞改变稍晚，且在临床症状好转及白细胞计数降低后才逐渐恢复正常。本实验在实验开始前，对所有新西兰兔行影像学检查，确认实验前无肺部感染。从实验结果中可见：对照组接种生理盐水后肺部影像学未见明显改变，可能是因为生理盐水进入肺部后很快被清除，并未引起病变；免疫抑制组中实验组II、III均出现不同程度肺纹理增粗、絮状渗出等影响学改变，而实验组I与对照组α差异不明显，可能与实验组I接种细菌数量较小有关(1.5×108cfu/ml)；非免疫抑制组中各组改变较相对的免疫抑制组轻，可能与新西兰兔未经免疫抑制处理，自身免疫力较强有关。
4、细菌学检查是确诊细菌感染的必不可少的检查。通过取气道分泌物及行肺组织匀浆液培养可判断是否成功接种。从实验结果可见：免疫抑制组接种第3天，细菌培养鉴定结果提示各实验组均有鲍曼不动杆菌生长，且鲍曼不动杆菌定量≥107cfu/ml，说明鲍曼不动杆菌是致病菌，已成功定植呼吸道；实验组I第7天鲍曼不动杆菌定量<104cfu/ml，说明实验组I兔体内鲍曼氏不动杆菌逐渐被清除，可能与实验组I接种细菌数量较小有关(1.5×108cfu/ml)；实验组II、III第7天培养鲍曼不动杆菌定量≥107cfu/ml，说明实验组II、III兔呼吸道仍有大量的鲍曼不动杆菌定植，能保证模型的持久稳定；死亡的2只兔肺组织内鲍曼不动杆菌定量≥107cfu/ml，说明兔死亡时鲍曼不动杆菌已成功定植，提示实验组III接种细菌数量(6×108cfu/ml)过大，易导致动物死亡；非免疫抑制组接种第3天，细菌培养鉴定结果提示各实验组均有鲍曼不动杆菌生长，且鲍曼不动杆菌定量≥107cfu/ml，说明鲍曼不动杆菌是致病菌，已成功定植呼吸道；实验组A第7天鲍曼不动杆菌定量均<104cfu/ml，说明A组兔体内鲍曼氏不动杆菌逐渐被清除，实验组B、C鲍曼不动杆菌定量部分<104cfu/ml，说明B和C组兔体内鲍曼氏不动杆菌逐渐被清除，可能与新西兰兔未经免疫抑制处理，自身免疫力较强有关。值得一提的是对照组α及β均未发现鲍曼不动杆菌，说明在本实验操作下，经皮气管穿刺法并未增加肺部感染几率。
5、血培养是检测菌血症的最简单、最常用、最准确的方法，是确认机体血流感染的病原学基础。其对菌血症、感染性心内膜炎、肺炎、临床不明原因感染等有重要的诊断意义。有文献报道，血培养组合的累积检出率随采样数量增加而增加，采血一套做血培养准确率仅为73.2％，连续采血两套做血培养准确率可达93.9％，连续采血三套做血培养准确率高达96.9％，本实验根据CLSI血培养的原则和操作程序推荐(Approved)指南，从不同解剖学位置连续采血两到三套行血培养，以提高准确率及可靠性。采血分需氧瓶和厌氧瓶，有报道称如果只做需氧瓶培养而不做厌氧瓶培养，将漏检约19％的菌株，并有约5％的血培养阳性结果报告将被推迟，所以每套包含需氧瓶和厌氧瓶，不仅能保证避免严格厌氧菌及兼性厌氧菌的漏检，保证阳性结果报告时间，且能降低因血量过少导致的检查结果的误差。细菌性肺炎可通过血液传播到全身各处，引起全身性感染，本实验通过血培养检测，确保鲍曼不动杆菌定植肺部后未入血引起全身性感染，避免实验干扰。为提高准备率，本实验采血两到三套行血培养，尽量避免漏检。值得一提的是，污染瓶约占检验总数的2％，且污染瓶只见于第一套瓶，故本实验中采血两到三套行血培养亦可降低污染瓶的出现，避免实验干扰；污染瓶的出现与采血操作息息相关，所以要求采血是必须严格无菌操作，尽量避免污染瓶的出现。从实验结果中可见；免疫抑制组与非免疫抑制组血液中均未见细菌生长，可基本排除细菌入血引起全身感染对实验结果造成干扰的可能性。
6、肺部病理学切片是肺部病变最直观的检查，病理学半定量评分能反应病理改变的程度以及估计预后。本实验通过肺部病理学检查与半定量评分分析各组肺组织病理改变程度。从实验结果可见：免疫抑制组与非免疫抑制组中实验组镜下可见肺泡组织结构不同程度毁损，肺泡腔内水肿液渗出，中性粒细胞渗出，毛细血管充血，气道上皮粘膜部分坏死脱落，说明鲍曼不动杆菌定植后对肺组织结构造成了病理学破坏；且病理半定量评分实验组Ⅲ＞实验组Ⅱ＞实验组Ⅰ＞对照组а(P＝0.000<0.05)，实验组C＞实验组B＞实验组A＞对照组β(P＝0.000<0.05)，说明随细菌接种量的增大，肺组织病理改变越明显；比较非免疫抑制组与免疫抑制组的病理评分，实验组Ⅰ＞实验组A(P＝0.000<0.05)、实验组Ⅱ＞实验组B(P＝0.000<0.05)、实验组Ⅲ＞实验组C(P＝0.000<0.05)，说明在相同处理条件下，经免疫抑制后接种鲍曼不动杆菌对肺组织损伤更大，病理变化更明显；对照组α与对照组β比较差异无统计学意义(P＝1.000＞0.05)，可能与接种物为生理盐水，易被体内清除，对肺组织损伤小有关；免疫抑制组＞非免疫抑制组(P＝0.024＜0.05)，说明总体上来说，免疫抑制组的病理改变较非免疫抑制组明显。
综上所述，免疫低下能增加感染的易感性，尤其采用麦氏浓度为1菌液效果最佳。本实验通过构建免疫抑制模型，对比在其他实验因素相同的情况下，免疫抑制状态下与非免疫抑制状态下新西兰兔各实验结果的差异。从实验结果中得知：在相同实验条件下，免疫抑制组新西兰兔体温、白细胞变化较非免疫抑制组明显；胸片检查显示在相同实验条件下，免疫抑制组的肺部影像学改变较非免疫抑制组更明显；细菌学检查显示在相同实验条件下，免疫抑制组新西兰兔肺部定植细菌量较非免疫抑制组大，不易清除；肺组织病理学半定量评分示免疫抑制组较非免疫抑制组高，组间差异大。以上结果均说明在免疫抑制状态下，接种鲍曼不动杆菌后，新西兰兔有更明显的临床表现及白细胞计数、影像学、细菌学、病理学改变，能为鲍曼不动杆菌肺炎模型的构建提供一个高效的、稳定的条件。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)构建免疫抑制的新西兰兔；构建免疫抑制的新西兰兔详细步骤为：
取健康新西兰兔，经胸片检查确认无肺部感染，前六天每日经耳缘静脉注射阿糖胞苷440mg/m2，第6日后隔日1次，得到免疫抑制的新西兰兔；所述免疫抑制的新西兰兔特征均有：毛发杂乱、无光泽及轻度脱毛现象，饮水、进食及活动减少，体温稍下降，体重未见明显增加，血细胞计数较免疫抑制剂使用前有明显下降；
(2)配置鲍曼氏不动杆菌菌液；配置鲍曼氏不动杆菌菌液详细步骤为：
取新鲜鲍曼氏不动杆菌培养液，配制成麦氏浓度为1-4的菌液，取菌液1毫升，加入无菌脱脂牛奶液1毫升，500转/分钟振动器混匀2分钟，得到鲍曼氏不动杆菌菌液；
(3)感染动物，构建模型，详细步骤为：首先对手术环境消毒；然后麻醉新西兰兔；最后将鲍曼氏不动杆菌菌液感染麻醉后的新西兰兔；其感染的过程如下：将麻醉后的动物以仰卧位固定于手术操作台上，将兔头后仰并固定，剪去咽喉部毛发以暴露环甲软骨，术者手消毒，常规消毒穿刺部位，以左手拇指与食指固定气管并撑开皮肤，右手持注射器在环甲膜部位行气管穿刺，垂直进针，成功穿刺后有落空感，回抽注射器可见气体冒出，迅速注入已配置好的鲍曼氏不动杆菌菌液1ml，立即将新西兰兔取头高脚低位，使菌悬液易于进入下呼吸道。
2.根据权利要求1所述的一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法，其特征在于：健康新西兰兔为清洁级健康新西兰兔，体重1.5-2.5kg，全部单笼饲养，标准饲料喂养，自由进食、饮水，实验前经X线检查确定健康、无肺部感染；并保持温度在20-24℃，湿度保持在50％-70％，定期紫外线消毒的动物实验室内喂养7天后再构建免疫抑制的新西兰兔。
3.根据权利要求1所述的一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法，其特征在于：鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC19606采用上海北诺生物科技有限公司提供的菌株，经细菌室鉴定后于负80度低温冰箱冷冻保存。
4.根据权利要求3所述的一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法，其特征在于：所述鲍曼不动杆菌标准菌株接种培养时，用2μL无菌接种环挑取1环鲍曼不动杆菌标准菌株，三区划线接种于血平板，置于CO2孵箱37℃培养24h，每24h转种1次，以保证菌株的活性；选经典单菌落转种于M-H肉汤，于37℃条件下恒温孵育18h，得到鲍曼氏不动杆菌培养液。
5.根据权利要求4所述的一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法，其特征在于：M-H肉汤中含有15wt％的甘油。
6.根据权利要求1所述的一种鲍曼氏不动杆菌肺炎动物模型的构建方法，其特征在于：对手术环境消毒时，利用紫外灯对空气消毒，将动物接种手术操作台用0.5wt％的84消毒液擦拭消毒；麻醉药的配置如下：取戊巴比妥钠，用无菌生理盐水配置成浓度为3wt％的溶液，现配现用，麻醉新西兰兔的详细步骤为：取免疫抑制第7天的免疫抑制的新西兰兔，经耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠30mg/kg以进行麻醉。
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