CN109833333A - 一种制备肺炎大鼠模型的方法及模型评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备肺炎大鼠模型的方法及模型评价方法，属于生物技术领域，本发明的建立肺炎大鼠模型的方法，对大鼠无创安全，在整个过程中不会损伤大鼠其它器官，有效避免大鼠死亡。且操作简单，成功率高。利用本发明建立的肺炎大鼠模型，肺泡灌洗液中铜绿假单胞菌显著增加，炎症因子IL‑4、TNF‑α显著升高，粘附因子IFN‑γ的水平明显降低，且白细胞数目显著增加，同时肺指数也显著增加，表明模型建立较好。

Description

一种制备肺炎大鼠模型的方法及模型评价方法

技术领域

本发明的属于生物技术领域，具体地，涉及一种制备肺炎大鼠模型的方法及模型评价方法。

背景技术

耐药菌所致肺炎的防治是国际医学界面临的难题。近年，我国因临床多耐药菌株和泛耐药菌株频现，致使其防治工作面临前所未有的挑战。新型有效防治手段的研发时不我待，尤其基于耐药机制的基础研究迫在眉睫，稳定可靠的耐药菌致肺炎模型是其必备的首要环节。

由于考虑成本和可操作性的问题，目前国内外多采用啮齿动物(小鼠、大鼠)作为肺炎模型动物。于柏峰等(于柏峰等，重庆医学杂志，2011，40(2)，129-132)将6～8周龄雄性昆明小鼠，气管切开，用富含铜绿假单胞菌PA01(BAA-47 TM)的琼脂糖珠灌注小鼠，立即竖起小鼠，保持2min，使菌液流下进入肺内；又如鄢洁等(鄢洁等，世界最新医学信息文摘，2015，15(27)，8-10)将6-8周龄、体重25～30g的清洁级健康雄性昆明小鼠以氯胺酮麻醉小鼠后固定，常规消毒铺巾，严格无菌操作，切开颈部皮肤，钝性分离至皮下组织，暴露上段气管，经气管内穿刺注入铜绿假单胞菌PA01。以上方法均可以构建肺炎模型。但是这些方法依然存在很大的问题，主要体现在以下方面：1、切开气管的方法虽然可以保证感染剂量，但作为一种有创的方法，在操作过程中容易造成动物器官损伤甚至导致实验动物死亡；2、操作复杂，每只小鼠都要进行手术，很难大批量开展实验；3、已经报道的感染模型所使用的铜绿假单胞菌菌株是来自美国的标准株PA01，不能代表国内流行PA菌株的流行情况。

另一方面，建立模型后需要对动物模型进行适当评价，然而，目前尚缺乏有效的评价方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，发明人通过建立不同感染途径的耐药菌致大鼠肺炎模型。并对优选出的滴鼻途径模型进行进一步评价，尤其对肺部疾病特异性标本——肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)进行针对性评价，取得了意想不到的效果，从而完成本发明。

本发明的目的是提供一种制备肺炎大鼠模型的方法及模型评价方法。为此，本发明的一方面提供一种一种制备肺炎大鼠模型的方法，包括以下步骤：

(1)采用戊巴比妥钠麻醉大鼠；

(2)将大鼠鼻孔向上倾斜，利用微量加样器将含有铜绿假单胞菌的菌液滴入大鼠鼻腔；

(3)改变大鼠体位，使其保持直立30s～3min。

在本发明的一些实施方案中，在步骤(2)中，将大鼠鼻孔向上倾斜45度。

在本发明的一些实施方案中，所述菌液的浊度值为0.8-1.2。在本发明的一些具体实施方案中，所述菌液的浊度值为1。

在本发明的一些实施方案中，滴入鼻腔的菌液体积为0.5-0.8mL。在本发明的一些具体实施方案中，滴入鼻腔的菌液体积为0.6mL。

在本发明的实施方案中，所述大鼠为6-8周龄SD雄性大鼠。

本发明的第二方面提供一种评价利用本发明第一方面所述的方法制备的肺炎大鼠模型的方法，包括以下步骤：

(1)对所述肺炎大鼠进行开胸，结扎左主支气管；

(2)对右肺进行肺泡灌洗，吸取肺泡灌洗液，并检测肺泡灌洗液中的炎症因子IL-4、TNF-α和粘附因子IFN-γ的水平，

其中，当炎症因子IL-4和TNF-α的水平升高，和/或粘附因子IFN-γ水平降低，表明模型建立较好。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤(2)中肺泡灌洗液的制备方法为：以一次性输液器插入主支气管约3-4cm，固定，将3mL生理盐水注入气管内，轻翻肺组织，抽回再灌注，反复抽注5次，最后抽出肺泡灌洗液。

在本发明的一些实施方案中，进一步包括对肺泡灌洗液中的白细胞进行计数的步骤，其中，白细胞数目增加表明模型建立较好。

在本发明的一些实施方案中，在获取肺泡灌洗液后，进一步将大鼠的左右叶全肺组织均切下，称重记录，并根据下面公式计算肺指数：

肺指数＝肺质量/体质量×100％

其中，肺指数增加，表明模型建立较好。

在本发明的一些实施方案中，进一步利用培养的方法获得肺泡灌洗液中铜绿假单胞菌的数目，其中，数目增加表明模型建立较好。

本发明的有益效果

本发明的建立肺炎大鼠模型的方法，对大鼠无创安全，在整个过程中不会损伤大鼠其它器官，有效避免大鼠死亡。本发明的方法操作简单，成功率高。

本发明的评价肺炎大鼠模型的方法，对肺炎大鼠模型进行全方面的评价，包括检测肺泡灌洗液中炎症因子IL-4、TNF-α和粘附因子IFN-γ的水平。

附图说明

图1示出了各亚组大鼠肺指数变化情况。

图2示出了大鼠肺泡灌洗液中白细胞的结果。

图3示出了大鼠肺泡灌洗液中IL-4的浓度结果。

图4示出了大鼠肺泡灌洗液中TNF-α的浓度结果。

图5示出了大鼠肺泡灌洗液中IFN-γ的浓度结果。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

实施例

1材料与方法

1.1实验菌种和动物

1.1.1铜绿假单胞菌耐药株

编号PA-R003，储备于中医感染性疾病基础研究北京市重点实验室。此菌经由北京中医药大学东直门医院、首都医科大学附属北京朝阳医院和首都医科大学附属北京中医医院三家三甲医院互证鉴定。开展实验时，以常规方法复苏培养，获取新鲜菌液使用。

1.1.2实验动物及分组

SD雄性大鼠，6-8周龄，160±10g，24只(北京维通利华实验动物技术有限公司)；随机分为对照组(Control，C)和模型组(Model，M)，每组12只。干预当天设为0天，干预后第5、10和15天分别监测的设为各组的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚组。实验过程中如有死亡自动舍弃。

模型干预前适应饲喂3天。实验过程中分笼饲养，每笼4只。

饲养条件是恒温20±4℃，光照及黑暗12小时交替，自由进食并饮水。

1.2主要试剂与仪器

本实验所及仪器均为实验室常规仪器；IFN-γ、TNF-α和IL-4的ELISA试剂盒均为上海依科赛生物制品有限公司产品。

31.3干预方法及样本采集

1.3.1造模干预

分别称重各亚组大鼠，以戊巴比妥钠常规实施麻醉，将大鼠鼻孔处于45度向上倾斜，以0.6mL浊度值为1的菌液，用微量加样器滴入鼻腔，随后改变大鼠体位，使其保持直立体位，大约1min，以确保菌液进入气道。对照组则用0.6mL生理盐水按上述方法滴鼻，记为0天。

在造模过程中，有两大重要关键因素，其一是浊度精准的新鲜菌液；其二是大鼠体位及维持时间。

1.3.2采集0天样本

(1)BALF：实施造模干预后2小时，将实验组和对照组0天亚组大鼠分别无菌开胸，结扎左主支气管，行右肺的肺泡灌洗。

BALF的制备：以一次性输液器插入主支气管约3-4cm，固定，将3mL生理盐水注入气管内，轻翻肺组织，抽回再灌注，反复抽注5次，最后抽出肺泡灌洗液。按上述操作，再次以3mL生理盐水灌洗，收集灌洗液，混匀后计数白细胞；另取1mL进行常规接种培养；剩余则以1000rpm离心10min，收获上清备检。

(2)肺组织：分别于造模干预并获取BALF后，将实验组和对照组0天亚组大鼠的左右叶全肺组织均切下，称重记录。

1.3.3采集5、10和15天时的样本

(1)BALF：分别于造模干预后第5、10和15天，将各亚组大鼠称重后麻醉，待麻醉稳定后，按前述方法收集BALF并进行相同处理，备用。

(2)肺组织：分别于造模干预后第5、10和15天，将各亚组大鼠进行肺泡灌洗后，切取左右叶全肺组织，称重记录。

1.4各指标检测

1.4.1肺指数：麻醉前称量各大鼠的体质量，肺泡灌洗后再称量切取的总肺组织的质量，据如下公式计算各肺指数：

肺指数＝肺质量/体质量×100％

1.4.2白细胞数：对肺泡灌洗液中的白细胞行常规计数，四个大方格白细胞总数为N，按如下公式换算出原始体积肺泡灌洗液中的白细胞数量。

白细胞数(10⁹/L)＝(N×10×20/4)×10⁶

1.4.3炎症因子浓度：严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测BALF中炎症因子IL-4、TNF-α和粘附因子IFN-γ的OD₄₅₀吸光度值，根据标准品的浓度-吸光度值曲线得出相应浓度。

1.4.4病原菌数：以1mL BALF进行常规接种培养，24h后计数目的菌落，得出BALF的总病原菌数量。

1.5统计学方法

以SPSS 19.0进行统计学处理，各组数据在分析前进行正态分布分析及方差齐性检验，正态分布以均数±标准差(mean±SD)表示，非正态分布则以中位数表示。两组比较采用t检验，多组比较以单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1肺指数结果

各亚组大鼠肺指数结果如图1示。很显然，造模干预后实验组大鼠的肺指数较对照组逐渐增加。在0-10天，随时间延长实验组肺指数逐渐增大；10与15天间则无统计意义的差别。

2.2肺泡灌洗液中的白细胞计数结果

各亚组大鼠肺泡灌洗液中白细胞结果如图2示。造模干预后实验组大鼠肺泡灌洗液中白细胞较对照组明显增多；但自5天起，随时间延长白细胞数量变化不大，5、10与15天各实验组的亚组间无统计意义的差别。

2.3肺泡灌洗液中炎症因子的浓度结果

各亚组大鼠肺泡灌洗液中IL-4、TNF-α和IFN-γ结果如图3、4和5示。造模干预后实验组大鼠肺泡灌洗液中IL-4和TNF-α浓度较对照组均明显升高。其中，IL-4在造模干预后两小时至15天，整个监测期内随时间延长逐渐增加；TNF-α也随时间延长总体呈增加趋势，但10天时一度略降；IFN-γ则随时间延长总体呈下降趋势，在0-5天下降明显，5-15天间则趋于稳定。

2.4肺灌洗液的细菌计数结果

以常规平板菌落计数法，换算后获得各亚组肺泡灌洗液的菌落数，如表1示。干预当天实验组与对照组即有差异，但差别无统计意义；随时间延长实验组病原菌数增多，各亚组均与同时间点的对照亚组有统计意义的差别，但不同个体间差异较大，即组内差异较大。

表1大鼠肺泡灌洗液中PA的数目检测结果

肺泡灌洗液菌数	对照组C	实验组E	P值
				0D	278±293	172±123	＞0.05
5D	293±402	34653±40852	＜0.05
				10D	410±430	13175±7189	＜0.05
15D	353±390	180475±255487	＜0.05

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备肺炎大鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用戊巴比妥钠麻醉大鼠；

(2)将大鼠鼻孔向上倾斜，利用微量加样器将含有铜绿假单胞菌的菌液滴入大鼠鼻腔；

(3)改变大鼠体位，使其保持直立30s～3min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，将大鼠鼻孔向上倾斜45度。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述菌液的浊度值为0.8-1.2。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，滴入鼻腔的菌液体积为0.5-0.8mL。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述大鼠为6-8周龄SD雄性大鼠。

6.一种评价利用权利要求1所述的方法制备的肺炎大鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对所述肺炎大鼠进行开胸，结扎左主支气管；

(2)对右肺进行肺泡灌洗，吸取肺泡灌洗液，并检测肺泡灌洗液中的炎症因子IL-4、TNF-α和粘附因子IFN-γ的水平，

其中，当炎症因子IL-4和TNF-α的水平升高，和/或粘附因子IFN-γ水平降低，表明模型建立成功。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中肺泡灌洗液的制备方法为：以一次性输液器插入主支气管约3-4cm，固定，将3mL生理盐水注入气管内，轻翻肺组织，抽回再灌注，反复抽注5次，最后抽出肺泡灌洗液。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，进一步包括对肺泡灌洗液中的白细胞进行计数的步骤，其中，白细胞数目增加表明模型建立成功。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在获取肺泡灌洗液后，进一步将大鼠的左右叶全肺组织均切下，称重记录，并根据下面公式计算肺指数：

肺指数＝肺质量/体质量×100％

其中，肺指数增加，表明模型建立成功。

10.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，进一步利用培养的方法获得肺泡灌洗液中铜绿假单胞菌的数目，其中，数目增加表明模型建立成功。