CN112219794B - 全氟辛酸建立支气管肺发育不良动物模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及支气管肺发育不良疾病动物模型领域，提供的全氟辛酸在用于建立支气管肺发育不良动物模型中的应用，在孕12‑18天暴露于全氟辛酸，各日龄的新生大鼠的血管内皮生长因子A(VEGFA)的水平明显下调，结合肺组织中肺泡表面活性蛋白‑B(SP‑B)表达的变化及肺组织病理切片HE染色的结果，进一步证实了全氟辛酸暴露对肺血管发育和肺泡发育有抑制作用。以上结果均支持妊娠期全氟辛酸暴露可引起子代鼠发生支气管肺发育不良，综上，本发明选择环境中广泛存在的全氟辛酸(PFOA)作为诱导剂，相比于目前应用较多的脂多糖，采用全氟辛酸造模允许从多方面多角度研究支气管肺发育不良的发病机制。
Description
技术领域
本发明涉及支气管肺发育不良疾病动物模型领域，具体涉及全氟辛酸在建立支气管肺发育不良动物模型中的应用。
背景技术
支气管肺发育不良(BPD)是导致早产儿死亡的最常见原因之一。我国学者通过多中心研究统计发现，我国28-37周龄的早产儿发生支气管肺发育不良的概率为1.26％，除高发病率之外，支气管肺发育不良还易合并其他肺部相关疾病或心血管相关疾病，对患儿的后期成长也有很大影响。因此，研究支气管肺发育不良的发生机制并寻找其有效治疗方法至关重要。目前没有统一的支气管肺发育不良造模方法，实验动物也并不统一。
目前使用较多的实验动物支气管肺发育不良造模方法：在孕期通过脂多糖暴露，导致宫内感染，引起子代支气管肺发育不良(如:Pan JR,Zhan CY,Yuan TM,et al.Effectsand molecular mechanisms of intrauterine infection/inflammation on lungdevelopment[J].Respir Res,2018,19(1):93.)。然而，上述由脂多糖构建的支气管肺发育不良动物模型，存在如下缺陷：一方面，支气管肺发育不良的发病机制是多样的，而目前的脂多糖诱导法是其中一种方法，只能局限于研究感染和炎症反应引起支气管肺发育不良。若想要研究其他原因引起的支气管肺发育不良并针对其病因进行治疗方法探究，单纯使用脂多糖造模不能满足多病因研究；另一方面，脂多糖诱导造模，需要通过腹腔注射，腹腔注射可能引起额外的感染或炎症应激反应，不利于控制混杂因素。
为此，本发明提供了一种以全氟辛酸作为诱导剂进行支气管肺发育不良造模，相比于目前应用较多的脂多糖，全氟辛酸的致病机制不仅包括炎症反应，其可能通过影响血管生成、细胞增殖分化等多方面影响胎儿发育。采用全氟辛酸造模允许从多方面多角度研究支气管肺发育不良的发病机制。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的支气管肺发育不良造模发病机制单一，不能满足多病因研究的缺陷，从而提供全氟辛酸在建立支气管肺发育不良动物模型中的应用及其构建方法，构建的支气管肺发育不良模型，致病机制不止包括炎症反应，其可能通过影响血管生成、细胞增殖分化等多方面影响胎儿发育，允许从多方面多角度研究支气管肺发育不良的发病机制。
本发明提供了全氟辛酸在制备用于调控肺发育异常相关蛋白血管内皮生长因子A(VEGFA)和/或肺泡表面活性蛋白-B(SP-B)中的至少一种中的药物的应用。
所述的应用，所述调控为下调血管内皮生长因子A(VEGFA)和/或肺泡表面活性蛋白-B(SP-B)的蛋白的表达，或下调血管内皮生长因子A(VEGFA)和/或肺泡表面活性蛋白-B(SP-B)的mRNA的含量。
本发明提供了全氟辛酸在制备用于建立支气管肺发育不良动物模型中的药物的应用。
本发明提供了一种建立支气管肺发育不良动物模型的方法，包括用全氟辛酸诱导来建立所述支气管肺发育不良动物模型。
所述的方法，所述支气管肺发育不良的病理表现为肺部炎症、肺发育异常和肺损伤中的至少一种；
优选地，所述肺部炎症的病理表现为炎症细胞浸润；
优选地，所述肺发育异常的病理表现为肺泡发育异常和/或肺血管发育异常。
优选地，肺泡发育异常的病理表现为肺泡大小降低、肺泡数目降低、肺泡结构简化、肺泡间隔增厚、肺泡肺透明膜形成、肺泡性肺气肿和肺泡性肺不张中的至少一种；
优选地，所述肺损伤的病理表现为肺水肿、肺泡炎性细胞浸润、间质炎性细胞浸润、肺泡出血、间质出血、肺不张中的至少一种。
所述的方法，所述动物为哺乳动物；
优选地，所述动物为啮齿目(Rodentia)动物中的至少一种；
优选地，所述动物为鼠科(Muridae)中的至少一种；
优选地，所述动物为大鼠属(Rattus norregicus)中的至少一种，和/或小鼠属(Mus musculus)中的至少一种；
优选地，所述动物为SD大鼠(Rattus norregicus)。
所述的方法，向处于妊娠期的亲代施用全氟辛酸，以获得支气管肺发育不良动物模型。
所述的方法，在所述子代处于假腺期时，向孕育其的亲代施用所述全氟辛酸；
优选地，在所述亲代妊娠第1-21天连续施用所述全氟辛酸；
优选地，在所述亲代妊娠第12-18天连续施用所述全氟辛酸；
优选地，在施用所述全氟辛酸期间内，每天施用所述全氟辛酸；
优选地，所述全氟辛酸的施用剂量为0.1-100mg/kg.d；
优选地，所述全氟辛酸的施用剂量为5-25mg/kg.d。
所述的方法，施用所述全氟辛酸的方式包括灌胃、滴鼻和雾化中的至少一种。
本发明提供了一种通过如所述的方法建立得到的所述支气管肺发育不良动物模型在筛选治疗所述支气管肺发育不良的药物和/治疗方式中的用途。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的全氟辛酸在制备支气管肺发育不良动物模型中的用途，本发明研究发现，全氟辛酸暴露组的子代鼠在出生的1、3、7、14天，肺组织HE染色均显示肺发育不良和炎症浸润，具体表现为：全氟辛酸暴露组的肺泡间隔较厚，肺泡大小和数量也较低，尤其是全氟辛酸高剂量组更明显。而新支气管肺发育不良的特点是持续性气道炎症、肺泡结构简化、肺泡腔增大、间质纤维化加重、肺血管发育异常。本发明发现妊娠期暴露于全氟辛酸后，子代鼠肺组织的病理表现与新支气管肺发育不良的病理变化非常相似，包括明显的炎症浸润和肺泡结构及肺血管发育异常。此外，在本实验模型中发现，妊娠期全氟辛酸暴露使各日龄的新生大鼠血管内皮生长因子A(VEGFA)水平明显下调；结合肺组织中肺泡表面活性蛋白-B(SP-B)表达的变化及肺组织病理切片HE染色的结果，进一步证实了全氟辛酸暴露对肺血管发育和肺泡发育有抑制作用。以上结果均支持妊娠期全氟辛酸暴露可引起子代鼠发生支气管肺发育不良，综上，本发明选择环境中广泛存在的全氟辛酸(PFOA)作为诱导剂，相比于目前广泛应用的脂多糖，全氟辛酸的致病机制不仅包括炎症反应，其可能通过影响血管生成、细胞增殖分化等多方面影响胎儿发育，采用全氟辛酸造模允许从多方面多角度研究支气管肺发育不良的发病机制。
2.本发明提供的一种肺发育性疾病动物模型的构建方法，选择处于妊娠期的用于构建动物模型的动物施用全氟辛酸，新生儿支气管肺发育不良有很大一部分部分原因是母体因素造成的，因此本发明择孕期暴露来模拟支气管肺发育不良的发生，为研究围生期因素导致新生儿支气管肺发育不良提供新的思路。
3.本发明提供的一种肺发育性疾病动物模型的构建方法，所述动物为假腺期的动物；优选地，所述动物在妊娠第12-18天施用全氟辛酸。人和大鼠的肺发育共分为5个时期：(1)胚胎期：原始肺芽形成，主要气道分支出现，叶状和节段性分支组成中心血管和气道结构；(2)假腺期：原始气道上皮开始生长，并由近端到远端分化，终末支气管基本形成，血管发育基本完成；(3)小管期：肺泡Ⅰ、Ⅱ型细胞分化，空气-血液屏障形成，毛细血管网形成；(4)囊泡期：原始肺泡形成，肺泡PS分泌，空气-血液屏障进一步发育成熟，为胎儿出生后进行独立的气体交换做好准备；(5)肺泡期，肺泡导管分化为成熟肺泡和肺血管，肺泡PS的合成与分泌进一步增加，以最大限度增加了肺气体交换面积。因此本发明选择对支气管发育以及血管形成有重要意义的假腺期这一时间段作为研究点，使怀孕第12-18日的母鼠暴露于全氟辛酸来建立妊娠期全氟辛酸暴露模型。
4.本发明提供的一种肺发育性疾病动物模型的构建方法，施用方式为灌胃、滴鼻或雾化，全氟辛酸广泛存在于环境大气和水体中，人类可以从呼吸道和消化道接触到全氟辛酸。且近年来，随着水体污染的日渐严重和含氟化合物的广泛应用，人们更多的是从消化道接触到全氟辛酸等环境污染物。因此，本发明选择灌胃方式更贴近现实，更好的模拟了人类接触全氟辛酸的途径。
5.本发明提供的一种肺发育性疾病动物模型的构建方法，大鼠的肺发育周期与人类一样，分为5个时期，且子代大鼠出生时肺发育处于囊泡期，相当于我们人类的早产儿，更贴近支气管肺发育不良的生理机制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中对子代新生大鼠肺组织HE染色结果(×200)；图中1d-对照组、3d-对照组、7d-对照组、14d-对照组分别代表1日龄、3日龄、7日龄和14日龄对照组的子代新生大鼠；1d-PFOA低剂量组、3d-PFOA低剂量组、7d-PFOA低剂量组、14d-PFOA低剂量组分别代表1日龄、3日龄、7日龄和14日龄的全氟辛酸低剂量组的子代新生大鼠；1d-PFOA高剂量组、3d-PFOA高剂量组、7d-PFOA高剂量组、14d-PFOA高剂量组分别代表1日龄、3日龄、7日龄和14日龄的全氟辛酸高剂量组的子代新生大鼠；
图2是本发明实施例1中子代新生大鼠肺组织中肺泡表面活性蛋白-B(SP-B)的表达；图中PFOA低剂量组代表全氟辛酸低剂量组；PFOA高剂量组代表全氟辛酸高剂量组；P1、P3、P7、P14分别代表1日龄、3日龄、7日龄和14日龄；a，b分别表示与对照组相比p<0.05，p<0.01；
图3是本发明实施例1中子代新生大鼠肺组织中血管内皮生长因子A(VEGF-A)的表达；图中PFOA低剂量组代表全氟辛酸低剂量组；PFOA高剂量组代表全氟辛酸高剂量组；P1、P3、P7、P14分别代表1日龄、3日龄、7日龄和14日龄；a，b，d分别表示与对照组相比p<0.05，p<0.01，p<0.001。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1支气管肺发育不良动物模型的构建及验证
1.材料和方法
1.1化学品和试剂
全氟辛酸，Trizol和逆转录酶试剂盒从Sigma购买。SYBR Green qPCR试剂盒和BCA蛋白检测试剂盒从Takara购买。HE染色试剂盒购自北京索来宝科技有限公司。ELISA试剂盒购自上海西塘生物技术有限公司。
1.2支气管肺发育不良动物模型的构建
成年SD大鼠(体重250-300克)。雌雄鼠以1：2进行交配。研究过程中保证充足的水和食物供应，环境温度保持在23±2℃。
全氟辛酸配制：全氟辛酸高剂量混悬液(25mg/kg·d)：300mg全氟辛酸溶解于40mlPBS缓冲液中，调整至每1ml PBS缓冲液含有7.5mg全氟辛酸。全氟辛酸低剂量混悬液(5mg/kg·d)：5mg全氟辛酸高剂量混悬液(25mg/kg·d)溶解于20ml PBS缓冲液中，调整至每1mlPBS缓冲液含有1.5mg全氟辛酸。混悬液配好后进行高温高压灭菌处理，使用前采用超声处理使其充分混匀。
观察到阴栓标记为妊娠第0天(E0)，将获得的孕鼠随机分为3组(每组8只)单独喂养，于孕12～18天灌胃不同剂量的全氟辛酸(0、5、25mg/kg BW/day)。对照组(0mg/kg)灌胃给予等量溶媒(PBS)。在分娩后第1、3、7、14天(P1、P3、P7、P14)，从每窝取2只(每组16只)子代鼠进行实验。取子代鼠的右肺中叶在4％多聚甲醛浸泡固定，随后进行HE染色及免疫组化研究。剩下的肺组织保存在-80℃下，用于细胞因子水平和基因及蛋白质表达的分析。
1.3验证
观察子代鼠的一般情况，并在子代鼠出生的第1、3、7、14天分别取子代鼠的肺组织进行HE染色，观察其病理学形态变化，并通过ELISA法检测血管内皮生长因子A(VEGFA)和肺泡表面活性蛋白-B(SP-B)含量来评估肺发育情况。
1.4统计学分析
所有数据均以平均值±标准误(SEM)表示。统计显著性分析采用单因素方差分析，随后采用Dunnett's多重比较检验。使用GraphPad Prism 6进行统计分析，P<0.05、0.01、0.001和0.0001被认为具有不同置信度的统计显著性。
2结果
2.1肺组织HE染色结果
新生大鼠的肺组织病理切片HE染色结果如图1显示，1、3、7、14日龄的对照组正常新生大鼠的肺气管和血管发育完整，周围无或仅有少量炎症细胞浸润，肺泡大小均匀，组织结构完整。1、3日龄的全氟辛酸低剂量组(5mg/kg.d)的新生大鼠气管及血管周围有较明显的炎症反应，气管壁轻度增厚，管腔轻微变形，血管壁轻度增厚变形，肺泡隔增厚，肺间质细胞增加，肺泡数目减少，肺泡腔变大；而7、14日龄的全氟辛酸低剂量组新生大鼠与1、3日龄的全氟辛酸低剂量组新生大鼠相比，其气管和血管周围的炎症反应减弱，气管及血管增厚不明显，肺泡数目增多，肺泡膈稍有增厚。1、3、7日龄的全氟辛酸高剂量组(25mg/kg.d)的新生大鼠气管及血管周围大量炎症细胞浸润，气管壁和血管壁明显增厚，气管内柱状上皮明显增生，气道明显变形甚至狭窄，与对照组相比可见肺组织内肺泡膈增厚，肺间质细胞明显增多，肺泡大小不均，数目减少，肺泡融合，肺泡腔扩大，肺泡结构不完整；而与1、3、7日龄的全氟辛酸高剂量组新生大鼠相比，14日龄全氟辛酸高剂量组新生大鼠气道及血管周围的炎症细胞明显减少，气道壁增厚减少，但仍有柱状上皮增生，管腔轻微变形，肺组织内肺泡数目增多，肺泡部分扩大，但肺泡大小仍不均匀，肺泡结构仍不完整(图1)。
2.2ELISA法检测血管内皮生长因子A(VEGFA)和肺泡表面活性蛋白-B(SP-B)的含量
新生大鼠的肺组织ELISA的肺泡表面活性蛋白-B(SP-B)的检测结果如图2显示，与对照组相比，1、3日龄的全氟辛酸低剂量组(5mg/kg.d)的新生大鼠肺组织中肺泡表面活性蛋白-B(SP-B)含量降低(p＜0.05)，但7、14日龄肺泡表面活性蛋白-B(SP-B)的含量仅稍有下降；而全氟辛酸高剂量组(25mg/kg.d)的新生大鼠在1、3、14日龄时肺组织中肺泡表面活性蛋白-B(SP-B)含量均显著降低(p＜0.01)，且在7日龄时SP-B含量也明显下降(p＜0.05)(图2)。
新生大鼠的肺组织ELISA的血管内皮生长因子A(VEGFA)的检测结果显示，与对照组正常新生大鼠相比，全氟辛酸低剂量组(5mg/kg.d)的新生大鼠肺组织中血管内皮生长因子A(VEGFA)含量在1日龄时明显下降(p＜0.05)，且在3日龄时血管内皮生长因子A(VEGFA)含量降低最为显著(p＜0.0001)，而血管内皮生长因子A(VEGFA)量在7日龄时也明显减少(p＜0.01)，在14日龄时稍有降低；而1日龄的全氟辛酸高剂量组(25mg/kg.d)的新生大鼠血管内皮生长因子A(VEGFA)含量明显减少(p＜0.01)，尤其在3日龄时降低程度最为显著(p＜0.0001)，且血管内皮生长因子A(VEGFA)含量在7日龄时明显减少(p＜0.01)，在14日龄时降低程度明显减轻(p＜0.05)(图3)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (22)
1.全氟辛酸在制备用于调控肺发育异常相关蛋白血管内皮生长因子A和/或肺泡表面活性蛋白-B中的至少一种中的药物的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控为下调血管内皮生长因子A和/或肺泡表面活性蛋白-B的蛋白的表达，或下调血管内皮生长因子A和/或肺泡表面活性蛋白-B的mRNA的含量。
3.全氟辛酸在制备用于建立支气管肺发育不良动物模型的药物中的应用。
4.一种建立支气管肺发育不良动物模型的方法，其特征在于，包括向处于妊娠期的亲代施用全氟辛酸，以获得子代支气管肺发育不良动物模型。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述支气管肺发育不良的病理表现为肺部炎症、肺发育异常和肺损伤中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肺部炎症的病理表现为炎症细胞浸润。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肺发育异常的病理表现为肺泡发育异常和/或肺血管发育异常。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述肺泡发育异常的病理表现为肺泡大小降低、肺泡数目降低、肺泡结构简化、肺泡间隔增厚、肺泡肺透明膜形成、肺泡性肺气肿和肺泡性肺不张中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肺损伤的病理表现为肺水肿、肺泡炎性细胞浸润、间质炎性细胞浸润、肺泡出血、间质出血和肺不张中的至少一种。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述动物为哺乳动物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述动物为啮齿目动物中的至少一种。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述动物为鼠科动物中的至少一种。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述动物为大鼠属动物中的至少一种，和/或小鼠属动物中的至少一种。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述动物为大鼠。
15.根据权利要求4-9或11-14任一项所述的方法，其特征在于，在所述子代处于假腺期时，向孕育其的亲代施用所述全氟辛酸。
16.根据权利要求4-9或11-14任一项所述的方法，其特征在于，在所述亲代妊娠第1-21天连续施用所述全氟辛酸。
17.根据权利要求4-9或11-14任一项所述的方法，其特征在于，在所述亲代妊娠第12-18天连续施用所述全氟辛酸。
18.根据权利要求4-9或11-14任一项所述的方法，其特征在于，在施用所述全氟辛酸期间内，每天施用所述全氟辛酸。
19.根据权利要求4-9或11-14任一项所述的方法，其特征在于，所述全氟辛酸的施用剂量为0.1-100mg/kg.d。
20.根据权利要求4-9或11-14任一项所述的方法，其特征在于，所述全氟辛酸的施用剂量为5-25mg/kg.d。
21.根据权利要求4-9或11-14任一项所述的方法，其特征在于，施用所述全氟辛酸的方式包括灌胃、滴鼻和雾化中的至少一种。
22.一种通过如权利要求4-21任一项所述的方法建立得到的所述支气管肺发育不良动物模型在筛选治疗所述支气管肺发育不良的药物和/治疗方式中的用途。
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