JPH11505248A - 豚ミステリー病に関与するウイルス物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 米国および欧州の型の疾患に対して効果的に豚を免疫する豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）に対する実質的に病原性のないワクチンと、併せてｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルス物質を増殖させる方法と、ワクチン調製のためにウイルスを中和する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 豚ミステリー病に関与するウイルス物質発明の背景 １． 発明の分野 本発明は、免疫学ならびにウイルス学の分野に関するものであり、より詳細 には、単離した病原性ウイルスから誘導したワクチンに関するものである。さら に詳細には、激甚な被害を与えている新しい豚の病気に対して使用するべく、病 原性形態のウイルスを、ワクチン製造法にのっとって無毒性の形態に改変、すな わち弱毒化することに関するものである。 ２． 先行技術の記載 「豚ミステリー病」、「豚不妊・呼吸障害症候群」、「青耳病」、あるいは 「豚繁殖・呼吸傷害症候群」（豚生殖器・呼吸器症候群、porcine reproductive and respiratory syndrome、ＰＲＲＳ）など各種の名称で称される新たな豚の 病気が、米国ならびにカナダの繁殖群に壊滅的な損害をもたらしている。同様の 病気は、欧州の多くの地域でも出現している。この病気は、２つの病態、すなわ ち、繁殖傷害を生じる病態と、若齢の豚に呼吸障害を生ずる病態で発現する。こ の病気の繁殖傷害型の病態については、ケフバー（K.K．Keffber）、「病因不明 の繁殖傷害（Reproductive Failure of Unknown Etiology）」全米養豚者協会ニ ュースレター（American Association of Swine Practitioner Newsletter）1:1 09(1989)に記載されている。 繁殖傷害型のこの病気の場合、臨床徴候としてもっともはっきりしているの は、妊娠後期の自然流産、早産（全出産の２０−３０％にものぼることがあ る）、ミイラ化した胎仔の分娩、死産、あるいは虚弱子である。通常、こうした 臨床徴候は、４−１６週齢、場合によってはもっと加齢した豚群で観察される。 感染豚舎の死産仔は、早期のミイラ化を示すことが多く、この場合、皮膚が茶褐 色〜茶色に変色し、死後自己溶解を生じている。場合によっては、胎仔の頭蓋が ドーム型の形成不全を示すこともある。成熟雌豚の場合、感染がそれとわからな い場合もあり、全身状態の不調が２、３日続くこともある。たとえば、成熟雌豚 は、食欲をなくし、体温が平熱より上がったり、下がったりする。雌豚が分娩期 にある場合、鬱状態、嗜眠、フィレクシア（phyrexia）を示し、ときどき嘔吐す る可能性がある。感染群によっては、全子豚の７５％が失われることもあり、こ の病気によってもたらされる経済的損失にははかりしれないものがある。 呼吸傷害型のこの病気の場合、臨床徴候は、３−８週齢の子豚でもっとも顕 著であるものの、感染群の全ての豚で老若を問わず傷害が生じることが報告され ている。罹病豚は発育が遅く、毛皮が荒れ、呼吸困難（「不整痙攣性呼吸」）に 陥り、死亡率が上昇する（離乳前死亡率が約８０％にのぼることもある）。 呼吸傷害型のこの病気に罹患した子豚の病変部を全体的に、あるいは顕微鏡 で予備的に調べたところ、肺病変部の顕微鏡所見が、この病気の臨床上の重要な 特徴となることがわかった。病気の呼吸上の徴候がはっきりしているわりには、 二次的な細菌感染合併症の所見のない肺は、総じて正常であるか、肺表面が茶褐 色〜灰色に中程度かつ散発的に変色しているかのいずれかである。とはいえ、Ｐ ＲＲＳに罹病した子豚の肺組織を顕微鏡で観察すると、間質性肺炎に特徴的なパ ターンがみられる（コリンズ（J.E．Collins）ら、「繁殖傷害症候群罹患豚群に おける呼吸器疾患（Respiratory Disease in a Swine Herd Experiencing a Reproductive Failure Syndrome）」、獣医師のためのミネソタ豚会議紀要（P roceedings，Minnesota Swine Conference for Veterinarians）、２５４ページ 、ミネソタ州セントポール（１９９０年９月１０−１８日）。 このように、当業界では、ＰＲＲＳの影響を除去、あるいは少なくとも軽減 しうる有効なワクチンが真に必要とされているのである。発明の開示 本発明は、ＰＲＲＳウイルスによって生じる豚の疾病を効果的に軽減あるい は防止するワクチンを提供することによって、上述の問題を解決する。 略述すると、本発明は、ＰＲＲＳウイルスおよびその全変異体の生物学的あ るいはウイルス的に純粋な培養、ならびにこれらのビリオンの製造および使用方 法を包含するものである。野生型ウイルスは、豚でＰＲＲＳを生じうるが、この ウイルスの改変型、すなわちこのウイルスの非病原性変異体は、この病気に対す る有効なワクチンとなる。ワクチンは、改変型ウイルス、すなわち無毒化ウイル スと、製剤学的に有効な賦形剤とを含有するのが好ましい。この改変型ウイルス は、株化したサルの腎細胞中で増殖させ、維持するのが好ましく、この株化細胞 は、アフリカミドリザルの腎細胞を２０代以上にわたって継代したものであるＭ Ａ１０４とするのが特に好ましい。 病原性のウイルス物質は、感染豚の組織ホモジネートから回収し、数多くの 子豚ならびに妊娠豚でＰＲＲＳを罹病させることによって確認した。単離したウ イルス物質は、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクション（American Type Culture Collection）に１９９１年７月１８日付 けで寄託し、受託番号はATCC-VR2332であった。このウイルス物質は、選好性(fa stidious)、非凝集性で、エンベロープに包まれたＲＮＡウイルスであった。 野生型ウイルスは、適切な生育培養液中、血清の存在下で、サル細胞のびっ しり生育した細胞シートあるいは部分的に生育した細胞シートにウイルスを接種 し、接種した細胞シートを約３５℃−約３７℃の温度で細胞傷害作用が観察され るまでインキュベートし、維持培養液中で、血清の存在下、適切な継代条件で、 サル株化細胞に繰り返しウイルスを継代することによって、実質的に無毒性のか たちに改変することが好ましい。 ワクチンは、賦形剤、たとえばしょ糖とゼラチン安定剤を含有しており、こ のものは、上述のようにして生成させた生改変ウイルスと混合されている。この ワクチンは、ワクチン接種の局所的（上方粘膜）経路あるいは経腸的経路で接種 して豚を免疫感作することによって、ＰＲＲＳの予防に使用するのが好ましい。 通常、免疫感作した豚は、野生型ウイルスとの接触後も、病気の徴候を示さない 。 ワクチンは、サル株化細胞の増殖培養（expansion cultures）を調製し、こ の増殖培養に弱毒化ウイルスを感染させることによって生産培養を調製し、生産 培養を回収し、ウイルスを安定化させ凍結乾燥させる工程を含む方法によって商 業的な量を生成することができる。図面の簡単な説明 図１は、商業的な量のＰＲＲＳワクチンを製造する際のプロセス概念図であ る。好適実施態様の詳細な説明 以下の実施例は、本発明を実施する際に使用する好適な方法ならびに材料を 説明するものであるが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 実施例１ ＰＲＲＳウイルスの単離、同定、弱毒化、ならびに改変した生ワクチンの製造 Ａ． 単離ならびに同定 ＰＲＲＳ感染群の子豚から、組織ホモジネートを調製した。このホモジネー トを無菌の子豚ならびに妊娠豚に経鼻的に接種したところ、呼吸障害型ならびに 繁殖傷害型のＰＲＲＳが定常的に再生産された。このようにして未濾過あるいは 濾過済み（０．４５、０．２２ならびに０．１μｍ）の接種材料の接種を受けた 無菌子豚は、食欲不振となり、その肺病変部を顕微鏡で観察したところ、ＰＲＲ Ｓ感染群で見られるのと似た病変が生じていた。この同じ接種材料からは、ＰＲ ＲＳ感染群で見られるのと同一の繁殖傷害も生じた。 ウイルスの単離に使用した組織ホモジネートは、肺組織（グループ１）、な らびに脳−脾臓−肝臓−腎臓組織混合物（グループ２）を含むものであった。そ れぞれのホモジネート群を、４０００Ｘｇでそれぞれ２５分間遠心した。得られ た上清を集め、０．４５ミクロンの滅菌シリンジフィルターを使用して濾過した 。次に、濾過した上清を混合した。混合濾過上清１mlを、接種材料として使用し て、後述の株化細胞のそれぞれを感染させた。 濾過上清を、後述の株化細胞、改良イーグル培養液（「ＭＥＭ」）（ＪＲＨ バイオサイエンス(JRH Biosciences)）、１００μg/mlのゲンタマイシンを含む 生育培養液に加えた。 ７５mlのプラスチック製ボトルを使用して、各株化細胞について、２種の試 験を実施した。試験番号１では、濾過上清を、後述の各株化細胞のびっしりと生 えたシートの入った２本のボトルにそれぞれ接種した。このうち最初のボトルに は、さらに約２．５mgのトリプシンを加えた。他の条件は、いずれも、各培養ボ トルに関して同一とした。 試験番号２では、混合組織ホモジネート材料を、試験番号１で使用したのと 同じ株化細胞の入ったボトルに接種し、その際、細胞シートは、接種時に２０− ４０％の密集度にとどまるものとした。培養液には、試験１の培養液には加えな かった約１０％のウシ胎仔血清をさらに加えた。この場合も、接種材料は約１ml の量を加え、約３４℃で約７日間培養をインキュベートした。 ボトルは、いずれも、約３４℃で約７日間にわたってインキュベートした。 約７日の終わりに、結果を記録した。凍結、解凍の後、同一株化細胞の２度目の 継代用にサンプルを採取した。残りの材料は、液体窒素中で凍結し、約−６０℃ で貯蔵した。試験番号１ならびに試験番号２の結果を、下記の表１にまとめる。 試験番号１では、調べたどの株化細胞でも、細胞変性作用は観察されなかっ た。しかし、試験番号２では、MA-104細胞の小さな塊が膨潤して、ボトルの縁部 に沿って単層に「弱い穴」を形成しはじめた。ボトルから流体を分離し、MA-104 細胞の入った新しいボトル（この場合も、密集度２０−４０％の細胞シート）に 移し、さらに、３代目の継代を行った。このみかけ上の細胞変性作用は、継代を 重ねるごとに強くなり、３代目の継代培養でもそのビルレンスは保持されていた 。この継代培養を、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャ ー・コレクション（American Type Culture Collection）に寄託した。受託番号 はATCC-VR2332であった。 ATCC-VR2332ウイルスは、無菌ブタで、ＰＲＲＳの臨床徴候である肺の病変 を定常的に生じ、ＩｍＦの結果も陽性となる。したがって、ATCC-VR2332ウイル スは、トガヴィリデー科（Trogaviridae）の未特定の属である可能性もある。AT CC-VR2332ウイルスは、いくつかのブタでは一般的なウイルス病原物質に対して 特異的な抗血清によって、ウイルスが中和されことも、感染細胞の抗原が検出さ れることもなかったことからすると、ブタの既知の病原物質ではない。 ATCC-VR2332ウイルスは、選好性、非凝集性で、エンベロープに包まれたＲ ＮＡウイルスである。ATCC-VR2332ウイルスは、確立された株化細胞、特に、MA- 104細胞をはじめとするサルの株化細胞で生育する。ATCC-VR2332ウイルスは、市 販の株化細胞であるMA-104で、高い力価（１０⁷ＴＣＩＤ₅₀／１ml）となるまで 生育する。 ATCC-VR2332ウイルスは、脂質エンベロープを有しており、このことは、ク ロロホルムで処理すると感染性が失われることによっても示される。脂質エンベ ロープは、空の粒子をかこむ電子透過性の環として可視化することができる。Ｐ ＲＲＳウイルスの形態は、直接電子顕微鏡（DEM）による観察でははっきりせず 、細胞片を含む調製物の場合、同定は極端に難しい。勾配精製したATCC-VR2332 粒子の形態と、６２nmという平均直径は、ウマ動脈炎ウイルスならびに乳酸デヒ ドロゲナーゼウイルスと極めて似ている。 ウマ動脈炎ウイルスの報告されているサイズは、５０−７３nmの範囲であり 、これは、ATCC-VR2332ウイルスの４８−８４nmのサイズと似ている。いくつか のATCC-VR2332粒子で、３０−３５nmのコアが観察されており、このコアは、ウ マ動脈炎ウイルスについて記載されているヌクレオキャプシドコアに似ている。 このように、ATCC-VR2332は、形態からすると、動脈炎ウイルスのグループに最 もよく似ている。 ATCC-VR2332中にＲＮＡゲノムが存在することは、このウイルスが、５−ブ ロモ−２デオキシウリジンならびにマイトマイシンＣの存在下で複製し続けるこ とによって確認された。５−ブロモ−２デオキシウリジンならびにマイトマイシ ンＣは、ＤＮＡウイルスならびにＲＮＡウイルスの１つの科（レトロウイルス科 ）の複製を阻害するものの、他のＲＮＡウイルスの複製は阻害しないことが知ら れている。ともあれ、ATCC-VR2332をＲＮＡウイルスであるとする暫定的な分類 は、このウイルスが細胞の細胞質で複製するという、ＩｍＦによって検出される ウイルス抗原の存在によって示される観察結果とも合致する。また、ＤＮＡ依存 性のＲＮＡトランジションを妨害するアクチノマイシンＤも、ATCC-VR2332ウイ ルスの複製には何ら影響を及ぼさない。こうした結果からは、ATCC-VR2332が、 複製に際して核の機能を必要としていないことが示唆される。 要約すると、サイズ、形態、ＲＮＡゲノムの存在をはじめとする各種の特徴 からして、ATCC-VR2332ウイルスは、暫定的にはトガヴィリデー科に位置するこ とになる。しかし、ATCC-VR2332ウイルスは、この科の既知の属のいずれかに、 断定的に位置させることはできなかった。ATCC-VR2332ウイルスは、形態学的に こそ動脈炎ウイルスに極めてよく似ているものの、ＲＮＡならびにタンパク質の 構造についてのさらなる情報がはっきりするまでは、特定の属に位置させるべき ではない。 Ｂ．弱毒化 VR2332の３代目の継代培養からの回収物を、以下に詳述するようにして、さ らに２代継代し、５代目の継代培養からの回収物を、研究施設の外部に送って精 製を依頼した。具体的には、１，１，２−トリクロロートリフルオロエタンで抽 出してからＣｓＣｌ勾配（２００，０００Ｘｇで遠心）で精製した後に、ATCC-V R2332ビリオンが同定された。精製ビリオンは、抗ATCC-VR2332超免疫血清ならび に金複合体を使用して、イムノ−ゴールド（immuno-gold）キットで標識した。 ＣｓＣｌ勾配中のATCC-VR2332ビリオンの浮上密度は、１．１８−１．１９g/ml であった。しょ糖勾配を使用すると、ウイルスの力価が常に失われたので、精製 に際して用いるのに適切な勾配ではないとして使用をやめた。 精製した５代目の継代培養回収物を、以下に詳述するようにして、さらに６ ５代にわたって継代培養した。７０代目の継代培養から得られた回収物を弱毒化 し、マスター・シード培養と称した。この無毒性のマスター・シード培養は、メ リーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クション（American Type Culture Collection）に寄託し、受託番号はATCC-VR2 495であった。最後に、さらに５代継代してATCC-VR2332継代培養75を得た（必要 に応じて、さらに継代することもできる）。 ATCC-VR2332ウイルスの４代目から７５代目までの継代培養は、市販されて いるミドリザル腎臓株化細胞であるMA-104の宿主組織培養ストックで実施した。 この組織培養ストックは、以下のようにして調製した。すなわち、生育培養液は 、イーグル最小培養液（「ＭＥＭ」）（ＪＲＨバイオサイエンス(JRH Bioscienc es)、カタログ番号２００−２０４１）、ならびに１０％のウシ胎仔血清（ＪＲ Ｈバイオサイエンス）を含むよう調製した。約１mlのATCC-VR2332接種材料を、 ５０mlのこの生育培養液の入った７５ｃｃのボトルに加えた。このボトルを約７ 日おき、約３５−約３７℃の温度でインキュベートした。 組織培養ストックボトルの調製は、得られたインキュベート済み培養物を増 殖することによって行い、培養は、以下のようにして１：４に分割した。容量約 ５０mlの生育培養液をデカンテーションした。１０mlのトリプシン−バーセン１ Ｘを加えることによって細胞シートを取り出し、３７℃で５−１０分間インキュ ベートした。その後、ボトルから細胞を取り出し、２７０Ｘｇで５−１０分間遠 心した。上清をデカンテーションし、ペレットを、上述したのと同様にして、１ ０％ウシ胎仔血清を含むＭＥＭ培養液５−１０mlに再懸濁した。２００mlの生育 培養液に細胞を加え、この培養液を、７０mlのボトルに５０ml／ボトルずつ分け 、１：４に分割した。 得られた培養を、３５−３７℃で、使用可能となるまでインキュベートした 。３ないし４日間インキュベートしたところ、ボトルには細胞のびっしりつ まったシートのコーティングが生育し、使用の準備が整った。 ＰＲＲＳウイルスであるATCC-VR2332を、上述のようにして調製した確立さ れた株化細胞であるMA-104の培養中で増殖させた。培養液のｐＨを７．２に調製 し、約３５℃−約３７℃の範囲の温度で培養をインキュベートした。上述の継代 培養からの約１mlの凍結接種材料を生育培養液に加えることによって、ウイルス をMA-104細胞に接種した。ウイルスは、約２４時間かけて、細胞に吸収させた。 ATCC-VR2332ウイルスを接種した約２４時間後、生育培養液をデカンテーシ ョンし、生育培養液ではウシ胎仔血清の含量が１０％であったのを４％とした維 持培養液５０mlをフラスコに再度充填した。維持培養液のｐＨは、７．６とした 。この培養液交換の後、３５−３７℃の温度で培養をインキュベートした。ウイ ルスは、培養中のMA-104細胞シートの約５０−６０％がウイルスによって破壊さ れるまで生育させた。次に、サンプルを液体窒素中で凍結させ、また別のフラス コのMA-104細胞での継代に備えた。 ３−７０代目の継代培養が交差反応性を有することも示された。ＰＲＲＳウ イルスVR2332の３代目の継代培養のウイルスを使用して、ブタ、ウサギ、ヤギを 免疫感作して、ＰＲＲＳに対する抗血清を作製した。この血清を使用して、３代 目から７０代目までの各種継代レベルのＰＲＲＳウイルスを中和した。また、VR 2332のＰＲＲＳウイルスで免疫感作したネズミ由来の脾臓リンパ球を使用して、 ２種のモノクローナル抗体（SDOW-12およびSDOW-17）を調製した。これらのモノ クローナル抗体は、１９９２年１２月に単離された米国ならびに欧州のＰＲＲＳ のいずれとも反応することが示された。このモノクローナル抗体を、ＰＲＲＳウ イルスの３−７０代目の継代培養の特定あるいは検出に使用した。 Ｃ．改変生ワクチンの製造 マスター・シード培養（ATCC-VR2332の７０代目の継代培養からの回収物） 、ならびにATCC-VR2332の７５代目の継代培養からの回収物をそれぞれ含む２種 のワクチン調製物を処方した。マスター・シード培養のウイルスも、７５代目の 継代培養のウイルスも、実質的に無毒性であり、すなわち、ＰＲＲＳと接触しや すいブタや他の動物にワクチンを接種した場合にも、ＰＲＲＳ疾患の臨床徴候を 生じることがないものの、病原性型のＰＲＲＳウイルスに対してその動物を免疫 感作するような免疫応答を誘導することができた。ワクチンは、通常の方法で作 製し、標準的な安定剤ならびに賦形剤を加えてから凍結乾燥した。 実施例２ ウイルス単離物のin vivoでの試験 実施例１のATCC-VR2332ウイルスの毒性を有する３代目の継代培養からの回 収物を使用して、２匹の生後３日の子豚に接種を行った。双方の子ブタとも、接 種は経鼻的に行い、片方には１mlを、もう片方には２mlを接種した。これらのブ タは、７日間にわたって臨床状態を観察してから安楽死させ、剖検した。 各子ブタから組織サンプルを取り出し、組織病理学的検討を加え、またウイ ルス物質を回収した。報告された組織病理学的性状からは、感染した子ブタの肺 の病変部が、ＰＲＲＳに罹患していることが既知の子ブタの肺病変部と同一であ ることが確認された。組織サンプルは、実施例１と同様に処置してから、ウシ胎 仔血清を含むMA-104株化細胞の２０−４０％ならびに１００％単層培養で培養し た。この場合も、ウイルス物質を回収した。 ３代目の継代培養からのウイルス回収物は、この病気の繁殖への影響が再現 され、確認できるかどうかを検証するために、成熟メスブタへの接種にも使用し た。２匹の経産ブタに、妊娠９３日目に、経鼻的に接種を行った。このブタは、 妊娠の１１２日目ならびに１１４日目にそれぞれ出産し、５０％の子ブタが死産 であった（死仔／生仔：８／１３ならびに６／１４）。死産の子ブタのうち７匹 は、部分的にミイラ化しており、生きて生まれた子ブタも虚弱で、生育が著しく 困難であった。実施例１の手順にしたがって調べたところ、死産の子ブタの組織 からは、ウイルス物質が回収された。 ウイルス物質は、ＰＲＲＳに罹患していることがわかっている３つの群から 回収した。ATCC-VR2332物質に対する抗体力価が、この同じ群について特定され ている。 実施例３ この実施例の目的は、改変生ウイルスワクチンとしての使用すべく選択した ＰＲＲＳウイルス（ATCC-VR2332の７５代目の継代培養）の最小保護用量を測定 することである。この測定は、選択した２種の用量（４．０±０．５log／接種 単位、ならびに２．０±０．５log／接種単位）のワクチンが、毒性のＰＲＲＳ ウイルス（VR2332の７５代目の継代培養、３．５±０．５log／接種単位）の投 与後に異常状態の発現を制御しうる程度を調べ、ワクチン接種済みの免疫原投与 ブタを、ワクチン非接種の免疫原投与ブタならびにワクチン非接種で免疫原非投 与の（正常）ブタと比較することによって実施した。改変生ワクチンは、７５代 目の継代培養のウイルスを上述のようにして使用することによって製造した。 試験に使用する目的で、６２匹の血清が陰性の子ブタを供給農場から選び、 第１、２、３および４群の４つの試験群に分けた。第１群の２１匹の子ブタに、 ２．０mlのＰＲＲＳワクチンＬ−４を筋内注射によって接種した（４．０log／ 接種単位）。第２群の２１匹の子ブタに、２０mlのＰＲＲＳワクチンＬ−２を筋 内注射によって接種した（２．０log／接種単位）。第３群の１０匹の子ブタと 第４群の１０匹の子ブタには、ワクチンを接種しなかった。対照である第３なら びに４群の子ブタは、離れた施設に収容して、病原投与を行うウイルスへの感受 性を確実に維持した。第１、２、３群には、VR2332の３代目の継代培養を、試験 の２８日目に経鼻的に接種した。第４群の子ブタには、病原投与を行わなかった 。試験群のブタは、すべて、病原投与前の３１日間ならびに病原投与後の２１日 間、定期的に観察し、監視した。試験の評価に使用したパラメータは、臨床徴候 、体重、体（直腸）温、白血球数、ウイルスの単離、ならびに血清学的性状であ る。ワクチンが効力を有することは、病原投与後に、ワクチン接種ブタの血液中 にウイルスが存在している日数が低減すること、白血球数の減少ならびに発熱が 防止されること、そして正常な生育速度が維持されることによって実証された。 体（直腸）温は、ワクチンの接種前、ならびに接種後に測定した。第１群の 群平均温度は、ワクチン接種後２日および３日に上昇し、第２群の群平均温度は 、ワクチン接種後３日に上昇した。温度上昇期間は、いずれの群についても短期 間で、第１群については２日間、第２群については１日間であった。 ワクチン接種群は、いずれも、処置後に白血球数が低減することはなかった 。これまでの研究では、病原性のＰＲＲＳウイルスを接触した場合には、接触後 ７２時間以内に白血球数の減少が生じることが示されている。 ワクチン接種後の期間の体重増加の測定結果からは、この処置によって、ワ クチン接種ブタの生育に悪影響の及ぶことはないことが示された。ワクチン接種 後の２９日間について、ワクチン接種を行った２群の体重増加と、第３ならびに ４群の体重増加との間には、信頼レベル０．０５で有意な差が認められなかった 。 臨床状態の観察結果については、便および鼻孔以外の大半のカテゴリーでは 、正常状態からの逸脱は観察されなかった。両側ｔ検定を使用して、ワクチン接 種を行った群の便のスコアを、混合対照群（第３および４群）のスコアと比べる と、信頼レベル０．０５で有意な差が認められなかった。第１群と混合対照群の 間のｐ値は０．４７で、第２群と混合対照群の間のｐ値は０．８７であった。第 １群と混合対照群の間で鼻孔のスコアを比較すると、ｐ値は０．４１であった。 第２群２１匹のブタのうち２匹のみが、鼻孔のスコアを有しているのが観察され た。第１および２群の全個体の臨床スコアと、混合群のスコアをｔ検定で調べた ところ、ｐ値は、それぞれ０．５３ならびに０．７４であった。こうした比較に よって、双方の用量のワクチン接種を行った動物と、ワクチン接種を行っていな い対照との間に、差がないことが例証された。 血液からのウイルスの単離結果からは、第１群の１００％（２１匹中２１匹 ）が陽性となったのに対し、第２群では、調べたうちの９０％（２１匹中１９匹 ）が陽性となった。ワクチン接種後の期間を通じて、対照である第３なら びに４群は陰性のままであった。ＩＰＴ検定（免疫ペルオキシダーゼ検定）の結 果からも同様の傾向が明らかとなり、第１群の１００％が血清学上陽性となり、 第２群も９０％が陽性となった。双方の群とも、ワクチン接種後２１日までは、 血清中和抗体に関して陰性のままであった。ワクチン接種後２９日に、中和抗体 は双方の群で検出された（病原投与後０日、病原投与後の結果を参照のこと）。 対照群は、病原投与の時点でも、双方の試験方法で陰性のままであった。 ワクチン接種後の観察結果をみる限りでは、本実施例で使用したようなワク チン用量での処置によって悪影響が生じることはないものと思われる。ともあれ 、高めの用量では、すべてのブタが血清学的に陽性となり（２１匹中２１匹）、 低めの用量では、２１匹のブタ中１９匹（９０％）が陽性となった。 病原性のＰＲＲＳウイルスを用いた病原投与を行ったところ、ワクチン接種 を行い、かつ病原投与を行った群、ならびにワクチン非接種で、病原投与を行っ た群について監視を行った種々の臨床パラメータによって、調べた２種の用量の ワクチンが保護効果を生じていることが例証された。ワクチンを用いた際の効果 は、血液中のウイルスについて調べた結果から、はっきりと例証された。ワクチ ン非接種群（第３群）では、病原投与後３、５、７日に血液中にウイルスが１０ ０％存在していたのに対し、第１群（３．６５log／接種単位）ならびに第２群 （１．８５log／接種単位）での同じ観察日については、血液中にウイルスが存 在している率は、それぞれ１０％、３０％、ならびに３０％、２０％、１５％で あった。また、第１群の血液サンプルからは、病原投与後９日以降にウイルスが 回収されることがなく、第２群の血液サンプルからは、病原投与後１３日以 降にウイルスが回収されることがなかったのに対し、第３群の３０％は、病原投 与後１９日が経過しても陽性であった。 体（直腸）温の監視結果からも、ワクチンの有効性が実証された。２１日の 観察期間のうち、第３群では平均体温が１０４°Ｆを越える日が５日あったのに 対し、第２ならびに３群の平均体温は１０４°Ｆを越えることはなかった。また 、第３群の平均体温は、２日間、すなわち病原投与後２、６日に、１０４．５° Ｆを越えた。 病原投与後の白血球数の測定結果からは、第３群で白血球数の減少が生じて おり、病原投与後５日には、白血球数が１６％減少していたのに対し、ワクチン 接種群は、観察期間を通じて６％以上の減少を示すことがないことが示された。 病原投与後２１日間の各種処置群の体重増加の観察結果からは、ワクチン接 種群は、いずれの用量レベルの群も、正常な発育速度が維持されることが示され た。ワクチンを接種した２つの群、すなわち第１群と第２群の平均体重増加率は 、それぞれ７４ならびに７３であった。正常対照動物である第４群の群平均体重 増加は７５％であった。これとは対照的に、第３群、すなわちワクチン非接種− 病原投与群の群平均体重増加率は６９％で、第１、２、および４群とは有意に異 なっており、両側ｔ検定を信頼レベル０．５を使用すると、Ｐ＝０．００９であ った。 各種臨床試験の結果は、ワクチンの効力をさほど明瞭に実証するものではな いかもしれないが、それでもなお、ワクチンの有用性が示されている。免疫原の 投与後、第１、２、３群では、呼吸器系症状の発生率が有意に上昇した。第１、 ２、３群についての個々の動物のスコアの日平均は、それぞれ０．３９、０．６ ４、０．５３であった。この結果からは、低めの用量（１．８５log／接種単位 ）あるいはワクチン非接種の場合に比べて、高めの用量（３．６５log／接種単 位）を用いるのが有利なことがわかる。病原投与後の便の観察結果は劇的であっ たが、ワクチン接種後ならびに病原投与前の観察結果と有意な差はなかった（信 頼レベル０．０５を使用した場合）。つまり、この実験では、病原性のＰＲＲＳ 病原投与は、胃腸管下部に影響を及ぼしていないようであった。それ以外の臨床 状態の観察結果については、病原投与によって有意な変化が生じることは総じて ないようであった。第１群の鼻孔および口腔のパラメータについては、１匹のブ タが、この群の鼻孔についての合計スコアの２５％を占めており、別のブタが、 この群の口腔の合計スコアの９４％を占めていた。同様に、第２群では、１匹の ブタが、この群の鼻孔についての合計スコアの２２％を占めており、別のブタが 、この群の口腔の合計スコアの４３％を占めていた。これら２種のパラメータに ついては、病原投与後の臨床状態の観察結果と、ワクチン接種後の臨床状態の観 察結果との間に有意な差はないようであった。これらの２種の臨床パラメータに 関しては、第３群についても同様の結論が得られた。第４群は、からだ全体に関 して、相対的に正常であった。 観察期間の終わりにすべてのブタを安楽死させ、肺の病理状態を肉眼で観察 した。第３群の６０％（１０匹のうちの６匹）で、それとわかる病態が観察され た。一方、それとわかる病態が観察されたのは、第１群では１０％、第２群では １９％であった。正常な対照である第４群との比較については、第１群の８０％ 、第２群の８１％、第３群の３０％が、ちがいが観察されないとして記載 された。 肺組織からのウイルスの単離を行ったところ、第１群のブタの肺組織からは 、ウイルスは単離されなかった。第２群の２１匹のブタのうち１サンプルがウイ ルスに関して陽性であった。第３群のブタについては、１０サンプルのうち３サ ンプルからウイルスが単離された。第４群では、ウイルスの単離されたサンプル はなかった。 こうした結果からは、VR-2332の７５代目の継代培養を含有するＰＲＲＳウ イルス改変生ワクチンは、いずれの用量レベル（３．６５log／接種単位、１． ８５log／接種単位）に関しても、ワクチン接種後２９日目に病原性のＰＲＲＳ 病原投与を行った３−５週齢のブタの呼吸器疾患に対して効力を有していたとい う結論が導かれる。 本実施例では、好適な最低保護用量が３．６５log／２ml接種単位であるこ とが示唆された。ワクチンの用量の効力を評価するにあたって使用したパラメー タのいくつか、たとえば、血液中のウイルスの存在、呼吸器の臨床徴候、肺の病 理状態、肺組織からのウイルスの単離状況に関しては、ワクチンの接種量が高か った動物の方が、保護の程度が高かった。また、３．６５log／２ml用量のワク チンを接種したブタ２１匹のうちの２１匹が、ワクチン接種後２１日までに、血 清が陽性となった。それに対し、ワクチン接種量を低めとしたブタ２１匹の方は 、ワクチン接種後２９日（病原投与後０日）の時点でも、血清が陽性となったの は１９匹のみであった。 実施例４ この実施例では、実施例１および３に記載したＰＲＲＳの７５第目の継代培 養を含む改変生ワクチンを使用した場合の免疫存続期間を調べた。肥育ブタは、 通常、生後６カ月で屠殺重量に達する。この実施例では、生後約１カ月（４−５ 週齢）でブタにワクチンを接種し、ワクチン接種の１１０日後に病原投与を行っ た。この免疫期間は、正常な肥育ブタで想定される寿命をほとんどカバーするは ずである。 ６２匹の血清が陰性の子ブタを入手し、第１、２、３、４群の４つの試験群 に分けた。第１群の２１匹のブタには、ＰＲＲＳ−ＭＬＶの７５第目の継代培養 のワクチン（３．３２log／接種単位のもの）を２．０ml接種した。第２群の２ １匹のブタには、このワクチン（１．６４log／接種単位のもの）を２．０ml接 種した。第３群ならびに第４群の１０匹のブタは、ワクチンの接種を行わず、別 の施設に収容して血清が陰性の状態を保った。実施例３に記載した試験の最後に 、この実施例分の第２群のブタを試験から外し、安楽死させた。これは、最低保 護用量が、１．８７log／接種単位でなく、３．６８log／接種単位であるとの結 論が出たからである。第１群および第３群は、ワクチン接種後１１０ 日（ＤＰ Ｖ）に、VR-2332の３代目の継代培養（３．９log／接種単位）を使用して経鼻的 に病原投与を行った。第４群のブタは、病原投与を行わなかった。ブタは、病原 投与後（ＤＰＣ）２１日間にわたって、臨床徴候、体重変化、体（直 腸）温、 白血球数、ウイルス血症、血清学的性状を監視した。ワクチン接種 後１１０日 に保護免疫が成立していることは、血液中にウイルスが存在せず、白血球減少と 発熱が防止され、免疫原を投与したワクチン非接種ブタと比較して体重増 加が良好であることによって実証された。 ワクチンの接種後、ワクチンに対する副作用が出ないかどうか、ワクチン接 種ブタを監視した。監視対象パラメータは、体（直腸）温、白血球数、体重増加 、臨床徴候、血清学的性状、血液中のウイルスとした。 体（直腸）温は、ワクチン接種の前日からワクチン接種後４日まで、毎日監 視した。各群の平均を分析したところ、処置群の体温が、ワクチン接種の結果と して有意に上昇することはなかった。第１群のワクチン接種ブタは、ワクチン接 種前の平均と比べて、最大で０．２°Ｆの体温上昇を示した。 白血球数は、ワクチン接種前ならびにワクチン接種後に随時測定した。第１ 群は、ワクチン接種後４日に、ワクチン接種前の平均と比べて１４％の減少を示 した。他の測定日の第１群の白血球数は、いずれも９％以内の減少幅にとどまっ ていた。残りの群（第３群、第４群）は、ワクチン接種後の観察期間を通じて、 白血球数が１１％以上減少することはなかった。 ワクチン接種後０日から２８日までの体重増加の結果は、第１群の重量変化 が第４群と有意に異なる（Ｐ＝０．０２）という点で矛盾を含むものであった。 監視を行った他のパラメータはいずれも第１群と第４群の間でさしたる差を示さ なかったことからしても、この差異は説明不能である。 ワクチン接種後の臨床スコアを統計学的に分析したところ、ワクチン接種群 とワクチン非接種対照群との間に差はみられなかった。便のスコアが記録される ことが最も多かったものの、第１群と、第３、４群との間には有意な差はなく、 それぞれ、Ｐ＝０．７５、Ｐ＝０．５９であった。同様に、鼻孔の臨床状態に関 するスコアも有意ではなかった。第１群と第３群を比較したところ、Ｐの値 は０．８以上であった。第１群と第４群の比較では、Ｐの値は０．２２で、第４ 群の方が発生率が高かった。他の臨床パラメータは、いずれも、有意な発生率を 示さなかった。 ワクチン接種後の血清学的性状を調べた結果からは、処置動物が、ワクチン の接種によって首尾よく免疫されたことが示された。ワクチン接種後１４日に、 第１群の４８％は、ＩＰＴ検定で調べた試験結果が陽性であった。その７日後の ワクチン接種後２１日には、処置群の１００％が、ＩＰＴ検定で調べて陽性とな った。第１群は、ワクチン接種後２８日まで、血清中和（ＳＮ）抗体に関しては 陰性のままであった。第１群のブタは、ワクチン接種後１１０日の時点まで、い ずれの方法で調べても、すべて血清学的に陽性のままであった。第３群ならびに 第４群のブタは、ワクチン接種後の全期間を通じて血清学的に陰性のままであっ た。 ワクチン接種後のウイルス単離結果により、処置群の１００％がうまく接種さ れたことが示された。これにより前記の血清学的データが支持された。コントロ ール群３と４の両者はワクチン接種後の観察期間の間陰性のままだった。 ワクチン接種後の観察により、処置が処置動物に重篤な望ましくない影響を与 えず、コントロール動物はＰＲＲＳウイルスに未感染であることが示された。 毒性のあるＰＲＲＳウイルスの投与に引き続いて、様々な臨床上のパラメータ ーがワクチン治療の利点を評価するために観察された。ワクチンを接種した群（ グループ１）はワクチンを接種していない病原投与群（グループ３）とワクチン を接種せず病原も投与していない群（グループ４）と比較された。 病原投与後の血清学的結果により、その病原の濃度で、うまくグループ３の免 疫応答が刺激されたことが示された。グループ１は病原性のウイルス投与の後に 記憶性の抗体応答を起こさなかった。血清学的結果により、グループ４が２１日 間の観察期間を通して陰性のままであったことが示された。 最も顕著な発見はウイルスの単離結果であった。グループ３の１００％が３、 ５、および７ＤＰＣで陽性で、２１ＤＰＣでも、この群の２０％が検査で陽性だ った。グループ１は０ＤＰＣで陰性で、２１日間の観察期間を通して陰性のまま であった。予想外の結果はグループ４の血液サンプルからのＰＲＲＳウイルスの 陽性単離であった。グループ４からの最初の陽性のウイルスの単離は１５ＤＰＣ に起こった。この観察は、後に議論される他のパラメーターと相関した。たとえ グループ４がＰＲＲＳウイルスと接触したとしても、明らかな感染は観察期間の 終わりから３日目に起こって、重要な初期の潜伏期間は１ＤＰＣ〜１１ＤＰＣで あるので、集められたデータは妥当であると考えられる。グループ１とグループ ３の間の比較の大部分がなされたのはこの期間の間である。最も重要な結果は、 ワクチンで処置した群でウイルスが単離されなかったことより示されるように、 感染を明らかに予防できたことである。 病原投与後の臨床スコアの重要性はワクチン治療の効果を評価する際には限ら れるようだ。臨床上の呼吸徴候がグループ１と３で観察されたが、徴候は均等に は分布していなかった。グループ１の場合、２匹の豚がグループの全スコアの８ ８％を占めた。同様にグループ３の２匹の豚が該グループの総スコア４９の７１ ％を占めた。他のグループと比較すると、グループ１のトータルの便のスコアは 顕著である。しかしながら２１匹中９匹の豚だけがこのカテゴリーで 何らかの臨床上の徴候を示したことが観察され、この９匹中３匹の豚がこのグル ープの総スコアの５５％以上を占めた。便のスコアはグループ３に貢献せず、グ ループ４では１匹の豚だけが、臨床上の便の徴候を示すことが観察された。鼻孔 と口腔に関する臨床上のスコアは呼吸のような他のパラメーターと関係せず、限 られた重要性を有するようである。鼻孔の発症の観察はスコアを有するそれぞれ のグループの５０％未満を有するグループ１と３に限られた。口腔の観察のスコ アのグループ３で９０％でグループ１で７６％で高い発症率を有した。口腔の臨 床上のスコア、Ｐ＝０．４５、に関し、これら２つのグループには顕著な差はな かった。他の臨床上のパラメーターは全て異常がないことが観察された。 病原投与後の観察期間の間、グループ１は平均４２．６２ポンド増加した。グ ループ３の平均体重増加は３６．５ポンドで、グループ４は平均３７．１ポンド 増加した。グループ３と４の間には、Ｐ＝０．９で、顕著な差はなく、これはグ ループ４が偶然ＰＲＲＳに接触した結果である。しかし、これによりグループ１ と３のデータを比較する意味が低減したわけではない、なぜなら両者の間には統 計的に顕著な差があるからである。一定時間にわたる豚の行動の評価が、これら の豚の全体にわたりよく評価する優れた道具となる。このデータを他のパラメー ターと結合することにより、試験的に病原を投与する面でテストされたワクチン の利点が示される。 病原投与後の体温により、試験的な病原投与の面でワクチン治療の利点が示さ れた。病原投与群、グループ３は病原投与前の平均に比べて８日間で平均体温が １°Ｆ上がった。グループ１は１°Ｆのグループの平均体温の上昇は全くな かった。グループ４はＰＲＲＳウイルスで汚染されたけれど、グループの平均体 温は上昇しなかった。これは、試験的病原投与に比較して全体的に包囲されない で、ウイルスが徐々にグループ内で拡がったためであった。しかし、１５ＤＰＣ から２１ＤＰＣの間の個々の豚の体温の分析により、グループ４の豚はＰＲＲＳ ウイルスに接触後体温が上昇したことが示された。グループ１と３の個々の豚の 体温の分析によりワクチン利用の利点が強調された。グループ３の豚１０匹中１ ０匹が２日以上連続して１°Ｆ上昇した。これに対し、グループ１の豚には相当 する結果がなかった。 病原投与後のＷＢＣカウントの結果より、ワクチンの効果のさらなる証拠が示 された。グループ１の平均ＷＢＣカウントは病原投与後に減った。病原投与後の １、３、５、７、および９日目に、それぞれ、１４％、１９％、１４％、２１％ 、および１３％の減少が起こった。同じ試験日に、グループ３は平均が１５％、 ３７％、４３％、３１％、および２８％減少した。病原を投与しなかったコント ロール群のグループ４には、同じ時間の経過で、１１％から１７％への減少がお こった。個々の豚のカウントの分析により、ワクチン治療により付与された抵抗 力の効果がさらにはっきりする。グループ３の１０匹の豚のうち１０匹が２日以 上連続してＷＢＣカウントが２５％以上減少した。グループ１は２１匹中２匹が 連続して２日以上２５％以上の白血球が減少した。グループ４の感染した豚はグ ループ３の結果と似たような結果を示した。白血球減少の発症はウイルスの拡散 がグループ中に進むに従って明らかになった。１５ＤＰＣと２１ＤＰＣの間、グ ループの５０％が、試験日の間連続して、ＷＢＣカウントが２５％減少した。こ の結果により、ワクチン投与した豚には、ワクチン投与しな かった豚に発症した白血球減少が起こらなかったことが示された。 ２１ＤＰＣの肺の全体（顕微鏡）観察の分析は柔組織と胸膜に分けられ、それ から結合させて全肺スコアとした。観察の分析は、偶然病原を投与しないコント ロールグループがＰＲＲＳウイルスに接触したために、より難しくなった、陰性 のベースラインが観察できなかったからである。両方のグループが同時に同じウ イルス病原に接触したため、グループ１と３の比較に限定することが必要である 。グループ３の柔組織のスコアは、それぞれ２００のスコアを持っている１０匹 の豚のうち４匹で、重篤であった。グループ１の最高スコアは１００であった。 処置群のパーセンテージと柔組織障害の重度の両方は、ワクチン投与により減少 した。同様に、ワクチン投与は胸膜障害の発症率と重度を減少した。グループ１ では２４％（２１匹中５匹）が胸膜で1００のスコアを示し、一方、グループ３ では５０％（１０匹中５匹）が胸膜のスコアで１００を示した。グループ１では 多数の豚が（２１匹中９匹）福次的な胸膜のスコアが１５以下であった。肺のス コアと呼吸障害の相関は存在しなかった。例えばグループ３の１匹の豚は臨床上 の呼吸スコアが２３で総肺スコアが２８７．５であり、一方グループ３の他の豚 は臨床上の呼吸スコアが０で総肺スコアが３００であった。肺のスコアと臨床上 の呼吸のスコアで相関がない他の例がいくつかある。顕微鏡の観察がワクチンの 有利な効果を分析するのに妥当であってもなくても、処置群グループ１は障害が 発生した動物がほとんどおらず、これらの障害の重度は減少した。 結果的に、ワクチン投与後１１０日で試験的に病原を投与した面でワクチンの 効果を評価するのに使われた多くのパラメーターが互いによく相関した。 ウイルス血症がもっとも顕著な３〜９ＤＰＣの間、著しい白血球減少と体温上昇 が起こった。病原投与の際、豚はおよそ２０週齢か実施例３で病原を投与された 豚より１２週齢上であった。この研究で気づいた臨床上の症状の多くはより重症 であった。例えば、体温（直腸）の上昇は免疫原性試験における５日に比べてこ の研究では８日間上がった。この研究におけるワクチンを投与しないで病原投与 したコントロール群（グループ３）での白血球減少の重度は免疫原性試験におけ る病原投与コントロール群よりずっと顕著であった。前の研究でコントロール群 はＷＢＣカウントで４３％から２７％に減少した（３−９ＤＰＣ）。免疫原性試 験では、病原投与コントロール群は２〜９ＤＰＣで１５〜２１％減少した。免疫 原性試験でワクチン投与され病原を投与されたグループに病原投与後の期間（１ 〜１４ＤＰＣ）の間でウイルス血症が検出された日数は、可能な１１０日のうち ０日であるのに対して、本研究の病原投与コントロール群では１１０日のうち４ ５日であった。このように、臨床上の徴候の重度の増加はウイルス血症の継続期 間の増加によるばかりではなかった。 この研究の病原投与後の結果により、投与濃度３．３２ｌｏｇｓ／２．０ｍｌ でのＰＲＲＳ−ＭＶＬワクチンによる予防接種はワクチン接種後１１０日の病原 性のあるＰＲＲＳウイルスの投与に対して予防効果が示された。それらは、（１ ）ワクチン投与した動物は病原投与後の観察期間２１日でウイルス血症に対して 皆陰性であった、（２）呼吸、便、鼻孔、鼻孔と口腔の臨床上の徴候も全くなく 、ワクチン接種された豚は臨床上の徴候に異常なかった、（３）ワクチン接種さ れた豚の体重増加はワクチン接種されないで病原を投与された豚よりはるかに顕 著であった、（４）ワクチン接種された豚では顕著な体温上昇は確認されな かった。（５）ワクチン接種された豚ではＷＢＣカウントで著しい減少は起こら なかった。（６）ワクチン接種された豚では柔組織と胸膜の障害の発症と重度は 軽かった。 実施例５ この実施例では、実施例１と３に記載したＰＲＲＳ−ＭＶＳ７５継代ワクチン が免疫の始まりを確認するために試験された。試験開始の７日前に、３５匹の豚 が免疫ペルオキシダーゼ検定（ＩＰＴ）を用いてＰＲＲＳ抗体と、ＭＡ１０４細 胞でウイルスを単離することにより血流中のＰＲＲＳウイルスの存在が調べられ た。試験０日目にグループ１の１０匹の豚が筋肉にＰＲＲＳ−ＭＶＳ７５継代ワ クチンを接種された。グループ１の１０匹の豚が試験７日に同様にワクチン接種 された。グループ３の１０匹の豚とグループ４の５匹の豚が別々の施設にいれら れ、しかし同じような環境条件で、ワクチン接種していない経時コントロールと して供された。グループ１、２、および３の豚には試験１４日目に病原が投与さ れた。病原性のあるＰＲＲＳウイルス（ＶＲ−２３３２，３代目の継代培養、３ ．７ｌｏｇｓ₁₀ウイルス／１０ｍｌ）の病原接種は、経鼻的に投与された（２ｍ ｌ／豚）。グループ４の豚は病原を投与されなかった。全ての豚は１０日間呼吸 器疾患の臨床上の徴候をモニターされた。全ての豚は研究の最後に肺障害を評価 するために安楽死させられた。 病原投与時にグループ１の豚はＩＰＴ検定で血清学的に陽性であったが、血清 中和活性は陽性でなかった。これに対し、グループ２の豚を含む他の全ての豚は 両方の方法で陰性であった。グループ２の豚の５０％がＩＰＴ検定で７ＤＰＣに 陽性で、１０ＤＰＣでは１００％陽性であった。グループ３の豚はＩＰＴ検定で １０ＤＰＣに試験結果が陽性とされた。グループ１と２のそれぞれから１匹の豚 が１０ＤＰＣと７ＤＰＣのそれぞれにＳＮ活性にかけられた。ＳＮの結果はｐ＝ ０．０５であまり差がなかった。この研究の結果は、病原投与時に豚が血清学的 に陰性であるか血清中和活性がなくても処置の結果として、抵抗力が発現するこ とが示された。抵抗力は直接にはヒトの免疫には結びつかない。修飾された生ワ クチン接種の応答における細胞性免疫が毒性の病原投与に対する抵抗で重要な役 割を果たす。 実施例４では、病原投与に続いてウイルス血症がおこらないことがワクチン投 与による抵抗力を示す重要な基準であった。しかし、ワクチン接種と病原投与の 間の短期間、本研究では、ワクチン接種された動物がワクチン接種後のウイルス 血症を解決しなかった。また、病原投与が類似する病原投与であったため、病原 投与ウイルスがワクチンウイルスから区別され得なかった。グループ１の４匹の 豚とグループ２の１匹の豚が３ＤＰＣから９ＤＰＣの少なくとも１の試験の時点 でウイルス血症に陰性であることが検査された。グループ３の１００％が同じ期 間でウイルス血症に陽性であることが検査された。 別の前の実施例で、この研究で著しい臨床上の徴候の発現が検出された。１日 以上呼吸困難をおこした１０匹のうち９匹がグループ３であった（平均日数は３ ．６であった）。グループ１と２で１日以上呼吸困難をおこした動物の数は、そ れぞれ１と０であった（ｐ＜０．００１）。鼻孔における臨床の徴候の発症は呼 吸の徴候と似ている。１日以上鼻孔に臨床上の徴候が起こった１０匹のうち８匹 はグループ３であった。臨床上の徴候の平均継続期間は３．１日で あった。これに対し、グループ１と２は平均継続期間がそれぞれ１．３と０．１ 日（ｐ＜０．００１）で非常に異なっていた。残りの臨床上のパラメーターの発 現は重大ではない。 両方のワクチン接種グループは病原投与コントロールグループより体重が増加 した。１０日の観察期間でグループ３が７．８ポンド増加であるのに対しグルー プ２は、平均１０．６ポンド（ｐ＝０．０１）増えた。グループ１での平均増加 分は９．６ポンドでグループ３に比べてあまり変わらない。このグループには最 も小さい豚が２匹いて、試験０日と６日で、それぞれ７ポンドと１２．５ポンド であり、病原投与時にそれぞれ１２ポンドであった。２匹の小さい豚を除いたグ ループの平均増加分は１２．３ポンドで、グループ３（Ｐ＜０．００１）とかな り異なっていた。２匹の豚の増殖速度の遅さはグループの大きな豚と競争できな かったことよると思われる。これらの豚はまた、病原投与後の観察期間に下痢を 起こした。グループ４の豚は１０日の間に平均１５．２ポンド体重が増加した。 この年齢の豚では一日の平均体重増加分は１．０から１．５ポンドであると予想 される。この結果により、病原投与に先立って７日目と１４日目にワクチン接種 処理をしたことにより防護を付与され、予想通りに成長できたことが示された。 病原投与に続いて、グループ３の豚は平均４．６日間病原投与前平均より１° Ｆ体温が上がったままであった。グループ１とグループ２の豚が同様に体温が上 がった平均日数は、それぞれ０．５日と1.1日であった（ｐ＜0.001）。２０匹の ワクチン接種した豚のなかで１匹だけが、２日以上継続して１°Ｆ上がったが、 これに対し、グループ３では１０匹中８匹であった。ワクチン接種 したものとコントロールの間の統計的な相違はｐ＜０．００１であった。これら の結果よりグループ１と２のワクチン接種した豚は、毒性のあるＰＲＲＳウイル スに接触させた結果としての発熱を防げたことが示された。 グループ３の豚は３．５〜７ＤＰＣで白血球の数が劇的に減少した。これらの 結果は同じ期間にこれらの動物に起こった体温上昇と緊密に相関した。ワクチン 接種したグループの豚は、抗体投与前の値に戻る前の１〜２日連続して穏やかに 白血球数が減少した。ワクチン接種した豚の値は病原投与コントロールと非常に 異なった（ｐ＜０．００１）。これらの結果より、病原投与前の７日か１４日に ワクチン治療することによる抵抗力の程度が白血球減少の程度と継続期間を減ら すことにより増強されることが示された。 病原投与前７日目か１４日目のワクチン処置は肺障害の重度を低減する。ワク チン接種した両方の群は病原投与コントロール群とは非常に相違した（Ｐ＝０． ０１）。ワクチン接種した群のスコアは正常なコントロール群であるグループ４ のスコアと似ていた。グループ３の平均の肺のスコアは９７．１であり、これに 対してグループ１と２はそれぞれ９．３と７であった。後者の２グループで観察 された障害は正常で、健康で普通に生育された豚で予想される事項と考えられる 。 本研究の結果より、防御的免疫は修飾された生ウイルスワクチンを接種した７ 日以内に刺激されることが示された。ワクチン接種した豚における、体温応答、 体重増加、白血球減少、肺障害、およびワクチン接種した豚における試験的病原 投与に続く臨床徴候で、ワクチンを接種せず、病原を投与した豚と比較して顕著 な違いが観察された。 実施例６ 本実施例ではＰＲＲＳ陽性の群れから生まれた１００匹の３週齢の離乳した豚 の２つのグループ（ＡとＢ）に実施例１のＰＲＲＳ−ＭＬＶ７０継代ワクチンか 偽薬（滅菌水）のいずれかを接種した。それぞれの処置群から３０匹の豚が体温 、体重増加、および注射箇所の反応をモニターすることによる有害な副作用の観 察がされた。これらの豚とそれぞれの処置群の残りの７０匹の豚はまた処置後２ ８日間、全般的な健康状態の徴候を観察された。この研究の結果より本ワクチン がいかなる副作用も引き起こさず、ＰＲＲＳ陽性の群れに適当に使用すれば安全 であることが示された。 ワクチン接種前の（−２ ＤＰＶ）直腸の体温により、この試験に使用された 豚は通常の健康な豚ではなかったことが示された。グループＡの体温は、−２日 目と−１日目でグループＢより際立って高かった（Ｐ＜０．０５）。試験０，１ ，２，および３日目では、２つのグループに目立った違いはなかった（Ｐ＜０． ０５）。これらの結果より修飾された生ＰＲＲＳワクチンによるワクチン接種は 体温上昇を起こす状態を悪化させないことが示された。 いずれのグループの豚も接種箇所にいかなる処置後の反応も起こらなかった。 さらに、これらの結果より、許可された方法で投与された場合のワクチンの安全 性が示された。 −２日目から２７日目までの２９日の試験期間に、グループＡの３０匹の豚の 体重増加は平均２１．０２ポンドで、グループＢの２９匹の豚の体重増加は平均 １８．１８であった。差はＰ＜０．０５で顕著であった。本試験は活性なＰＲＲ Ｓ感染の面で行なわれたので、結果により、効果と同様に安全性が 示される。 臨床面の観察の結果により、ワクチン接種がいくつかの臨床上のパラメーター の発症を著しく減らすことが示された。減ったパラメーターには、外観が６２か ら６へ、便が４８から２４へ、目が１６２から８９へ、鼻孔が３０から０へ、口 腔が３０から０へ、食欲が９１から１３へ、治療が３７から１４へ、死亡が５か ら０へ、が含まれる。グループＢと比較してグループ１により受けられた処置数 が減ったのは顕著である（Ｐ＜０．０５）。臨床上の徴候の減少により、さらに 、修飾された生ＰＲＲＳワクチンはＰＲＲＳウイルスに関連した症状の発現した 群れに使用しても安全であることが示された。 結論として、ＰＲＲＳ感染に関連した疾患が発症した群れに適当に使用した場 合、本ワクチンは安全であることが示された。ワクチンは、ＰＲＲＳウイルスに 関連するか、または豚の操作(operation)に存在することが知られている第２の 病原体に関連するかにかかわらず、臨床上の症状を強めなかった。この試験場が 置かれている状況で、これらの結果により、また、ワクチンを接種したグループ に有益な効果が示された。 実施例７ 本実施例では、特定の病原がなく、両性まざった、ダッチランドレース種の５ 週齢の子豚のＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２ ７５代目の継代培養（ＡＴＣＣ ＶＲ −２４９５）低用量の２０匹のワクチン接種効果が、レリスタッドウイルス（Ｌ Ｖ）を拡散して、測定された。野生種のＬＶは、豚に二次呼吸感染させやすくし 、悪化させ、高い死亡率を引き起こすのに重要であると考えられている。本実施 例は、欧州抗原性型ＬＶウイルスの伝搬へのワクチンの効果に関するデータ を提供する。 豚は１０匹づつ、１つの実験グループと、１つのコントロールグループの２つ のグループに分けられた。実験グループの豚は、それぞれおよそ１０³ＴＣＩＤ_{5 0} のＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２ ７５継代ワクチンを含む希釈されたワクチン２ ｍｌを筋肉に接種された。６週後、それぞれのグループから５匹の動物に欧州種 のＬＶ（コードＣＤＩ−ＮＬ−２．９１，Ｔｅｒ Ｈｕｕｒｎｅ、継代培養５代 目の豚歯槽マクロファージ）を用量１０^5.3ＴＣＩＤ₅₀／２mlで、経鼻的な接種 で投与した。１日後、投与された豚は自分の豚舎へ戻された。 本実験は、いつどのようにワクチン接種され、またはされない豚が病気を発現 するか、またウイルス血症になるか、また接触投与された同じ檻の仲間がＬＶに 感染するかどうか、または何匹くらい感染するかを調べた。ワクチン接種された グループとコントロールグループの感染が数量化されて、ワクチン接種されたグ ループとコントロールグループでのＬＶの伝搬速度が計算された。ワクチン接種 は成功したので、ワクチン接種したグループでのウイルス血症の病気の重さと継 続期間と、伝搬速度は、コントロールグループより小さいに違いない。 本実験は、ワクチンが低用量で、異種の病原投与の厳しい条件下で行なわれた ので、ワクチンの防御価値が示された。 ワクチン接種は病原投与後の疾患の臨床上の徴候を減らした、病原投与後の直 腸中間の体温は著しく下がり、病原投与した豚がウイルス血症にかかる日数も著 しく減り、病原投与後の豚のウイルス血症の重度も下がった。さらに、ワクチン 接種したグループとワクチン接種しないグループの両方で直接病原を投与した群 から接触により病原を投与された豚への伝搬はワクチン接種したグループと ワクチン接種しないグループの両方の全ての豚で起こったが、ワクチン接種した グループとワクチン接種しないグループで、野生型ＬＶの伝搬に目立った差が生 じた。米国抗原性型ＰＲＲＳワクチン ＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２ ７５継代の 低用量によるワクチン接種は、欧州抗原性野生型レリスタッドウイルスの投与に 対して抵抗力を付与し、それゆえ、効果的であった。 実施例８ 商業規模のワクチン生産 図１は、実施例１由来の生きた修飾マスター・シード培養ウイルスの商業的規 模の生産に使用するためのプロセスの該要図を示したものである。プロセスＰ１ ０は全ての容器を滅菌するステップＰ１２から始まる。滅菌は照射により行なわ れるのが好ましいが、熱によるか、化学的におこなわれてもよい。容器の種類に は、例えば、７５から１５０ｍｌ、５Ｌのフラスコなどの接種用のフラスコや、 回転培養容器や、金属製通気攪拌バイオリアクター容器も含まれる。 ステップＰ１４には宿主ＭＡ−１０４細胞の増殖培養物の調製も含まれる。５ ８継代目のＭＡ−１０４細胞株のストックが液体窒素中に保存され、７８継代ま で、ウイルス培養のための宿主細胞を供給するのに使用される。ストックされた ＭＡ−１０４培養は、５０〜１５０ｍｌの培地を含む７５ｍｌから１５０ｍｌの 容量の範囲のフラスコで増殖させる。培地は１０％の牛または牛胎児の血清とお よそ３０μｇ／ｍｌのネオマイシンとを混ぜたＭＥＭを含むのが好ましい。滅菌 されたフラスコと培地に約１ｍｌの前の代のＭＡ−１０４を接種し、３５℃から ３７℃で３〜７日間インキュベーションするのが好ましい。 細胞のストックカルチャーの増殖は、比が１：５（体積比）になるよう １５０ｍｌのフラスコから４００−６００ｍｌの培地で行なうのが好ましい。約 ３５〜３７℃で４〜７日インキュベーションした後、この４００〜６００ｍｌの 培地は、培地で満たされた５Ｌのフラスコで植継培養される。または、接種原は 約６７０〜８５０ｃｍ²の増殖空間と１５０ｍｌの培地の回転培養に、１：３． ４の比で供され、それから他の回転培養容器で、１：９から１：１１の比で植継 培養される。植継培養は３５〜３７℃で４〜７日インキュベーションされる。 ステップ１６には、ウイルス感染したＭＡ−１０４細胞の生産培養物の調製が 含まれる。ステップＰ１４の増殖培養物は、通常、体積比で１：３から１：５へ 、さらに大きな容量のバイオリアクター容器で増殖させる。生産容器には、例え ば、増殖培養の５Ｌフラスコ、またはエアーリフト攪拌機、温度コントロール、 およびｐＨコントロールが備わった４０Ｌのステンレス製の培養容器が含まれる 。容器は適当な量の増殖培地で満たされており、ＭＡ−１０４細胞を接種し、３ ５℃で４〜７日インキュベーションし、実施例１のマスター・シード培養ウイル スで感染させる。このウイルスは少なくともＣＰＥで約１０⁶ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ の力価を持ち、少なくとも１００ｍｌの培地に対して０．１〜１０ｍｌの比で生 産容器培養物に加えるのが好ましい。弱毒化したウイルスで感染させた後、生産 培養物は３５℃から３７℃で、２から３日インキュベーションする。 ステップＰ１８には、感染後のインキュベーション期間の後で、ステップＰ１ ６の生産培養物を回収することが含まれる。大量回収に適当な時間が１０％顕微 鏡下での変化（丸い細胞と細胞シートの崩壊）か１０％ｐＨ変化により 示されるＣＰＥの観察で決定される。ステップＰ１６の生産培養物は、薄層フロ ーフード(lamimar flow hood)下で滅菌した容器に注ぐことによってか、陽圧下 で密閉回収システムにより回収される。大量回収されたウイルスは凍結され、− ４０℃から−７０℃の温度で保存される。 品質調整測定のために必要に従い小分けしたものが得られる。それぞれの大量 回収物のサンプルがチオグリコレート、大豆カゼイン濃縮培地中で試験され、そ れぞれ約３６℃と２０℃で、それぞれの温度で１４日間イキュベートされる。こ の種ウイルスは、もし試験で少なくともＣＰＥで１０⁵ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌの力価 を示したら、大量生産の次の培養に用いられる。不満足な材料は５％次亜塩素酸 ナトリウムで２４時間か、オートクレーブで滅菌する。 ステップＰ２０には、ステップ１８で得られた大量の凍結ウイルスを安定化し 、凍結乾燥することが含まれる。大量の凍結ウイルスは解かされ、好ましくは、 約３部の解けたマスター・シード培養物に対して１部の安定化剤の比で、通常用 いられるしよ糖ゼラチン安定化剤のような薬理学的に許容される安定化剤と混ぜ られる。最終的なウイルスの濃度を調整するために生理食塩水が加えられる。 混合物はそれからそれぞれの用量が、用量あたり約０.２０ｍｌのＰＲＲＳ培 養物を用量あたり１０^4.9ＴＣＩＤ₅₀の最小力価を含むように、液体約０．２８ ｍｌの用量に小分けされる。ここで、Ｐ１６、Ｐ１８，およびＰ２０により得ら れる安定化した製品培養物の好ましい量は安定化された服用単位１５０，０００ 〜５００，０００回分を生産するのに十分であることに注意する。実施例によれ ば、２５投与分がおよそ７．０ｍｌ量に含まれる。これらの 小分けされたものは、好ましくは、液体窒素中で栓をして凍らされる。乾燥チャ ンバーが温度を最大約３０℃まで上げる一方吸引しながら稼働され、小分けされ たものは最大１８時間でサンプル中の水分を昇華させる。 ステップＰ２２には、ステップＰ２０により得られるワクチン製品の継続した 観察が含まれる。最終サンプルの容器や一連のＰＲＲＳワクチンの単一のバッチ は抜き出しチェックされ、水分量が５％以下であることが確認される。水分含量 が４％を超えるか１％未満のものは６ヶ月間ごとに品質をテストする。安全性測 定として、ギニア豚に１０投与分と同じ質量のワクチンを注射し、臨床上の反応 の不都合な徴候を２１日にわたり観察する。 ＶＲ−２３３２ウイルスにも実施例１で述べた中和物と平行して低温適応が行 なわれた。これは感染した動物によるウイルスの流出を防ぐワクチン種を開発す るために行なわれた。このような低温適応は３１〜３５℃の連続継代培養により 行なわれる。得られた種もまた免疫応答を刺激する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/08 Ｃ１２Ｎ 7/08 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 コルシカ デビッド イー. アメリカ合衆国 64506 ミズーリ州 エ スティ．ジョゼフ，エレファント トレイ ル 2408 (72)発明者 ハリス ルイス エル. アメリカ合衆国 65653 ミズーリ州 フ ォーサイス，ピー．オー．ボックス 177

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．豚繁殖・呼吸障害症候群に罹患した豚に感染できる豚繁殖・呼吸障害症候群 ウイルスのウイルスの純粋な培養物。 ２．前記ウイルスにＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２とその病原性変異体とが含まれる請 求項１に記載の培養物。 ３．修飾され、実質的に無毒の生豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスを含むワクチ ン組成物。 ４．前記ウイルスにＡＴＣＣ−ＶＲ２４９５が含まれる請求項３に記載の組成物 。 ５．さらに前記ウイルスが薬理学的に許容しうる担体試薬と混ぜられている請求 項４に記載の組成物。 ６．前記担体試薬にしょ糖ゼラチン安定化剤が含まれる請求項５に記載の組成物 。 ７．豚に修飾され実質的に無毒の形態の生きた豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス ＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２を含むワクチン組成物を投与する工程を含む豚を豚繁殖 ・呼吸障害症候群に対して免疫する方法。 ８．血清の存在下で適当な増殖培地中でウイルスをシミアン細胞に接種し、接種 した細胞をインキュベートする工程を含む豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルスの形 態を増殖し、単離する方法。 ９．前記シミアン細胞株がＭＡ−１０４である請求項８に記載の方法。 １０．以下の工程を含むＰＲＲＳワクチンを商業的規模で生産する方法。 ・実質的に無毒な形態のＡＴＣＣ−ＶＲ２３３２ウイルスの生産培養物の 調製。 ・ウイルス培養物の回収。 ・ウイルス培養物への安定化試薬の添加、およびウイルス培養物の凍結乾燥。 １１．調製工程が前記ウイルスでシミアン細胞株を感染させ、得られた培養物を ３５℃から３７℃でインキュベートすることを含む請求項１０に記載の方法。 １２．回収工程がウイルス培養物を凍結させることを含む請求項１０に記載の方 法。 １３．添加工程がしょ糖ゼラチン安定化剤約１部とウイルス培養物約３部を混合 することを含む請求項１０に記載の方法。 １４．凍結乾燥工程がウイルス培養物の凍結サンプルから水分を昇華させること を含む請求項１０に記載の方法。 １５．前記培養物が１回投与分０．２８ｍｌの１５０,０００から５００,０００ 回投与分の連続した量を含む請求項１０に記載の方法。 １６．さらに凍結乾燥工程に先立ち、連続量を小分けにすることを含む請求項１ ５に記載の方法。 １７．前記実質的に無害なウイルスがＡＴＣＣ ２４９５である請求項１０に記 載の方法。 １８．請求項１０に記載の方法に従って製造したワクチン。