BR9608535B1 - composição de vacina e processo de produção de quantidades comerciais de vacina prrs. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de invenção para "COMPOSI- ÇÃO DE VACINA E PROCESSO DE PRODUÇÃO DE QUANTIDADES COMERCIAIS DE VACINA PRRS".

Fundamentos da Invenção

1. Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito ao campo de imunologia e vi- rologia e, mais particularmente, a uma vacina derivada de um isolado viru- lento patogênico. Mais especificamente, a forma patogênica do vírus é mo- dificada ou atenuada a uma forma avirulenta, de acordo com os processos de produção da vacina para uso contra uma nova doença de suínos devastadora.

2. Descrição da Técnica Anterior

Uma nova doença de suínos, diversamente referida como "do- ença de suínos ignorada", "infertilidade e síndrome respiratória de suínos", "doença do olho azul" ou "síndrome reprodutiva e respiratória de suínos" (PRRS) está provocando pesadas perdas na reprodução de rebanhos dos Estados Unidos e do Canadá. Uma doença similar também apareceu em grande parte da Europa. A doença é manifestada em duas formas, uma pro- vocando falha reprodutiva e a outra produzindo dor respiratória em porcos novos. A forma reprodutiva da doença é descrita por Keffaber, K. K., "Re- productive Failure of Unknown Etiology", American Association of Swine Practitioners Newsletter, 1 : 109 (1989).

Os sintomas clínicos mais pró-eminentes da forma reprodutiva da doença são os abortos de longa duração espontâneos, nascimentos prematuros (que podem ser tão altos quanto 20-30% de todos os nasci- mentos) e a parição de fetos mumificados, partos de natimortos ou porqui- nhos doentes. Esses sintomas clínicos serão tipicamente observados em um rebanho de 4-16 semanas, ou ainda em um período maior. Os fetos nati- mortos em locais de criação afetados são encontrados nos estágios anterio- res à mumificação, como evidenciado pela descoloração marrom-amarelada da pele e da autólose pós-morte. As deformações na forma de domo de cé- rebros fetais são algumas vezes observadas. A infecção de porcas pode progredir sem indício, ou pode-se manifestar por si mesmo por uma condi- ção geral prejudicada que dura até uns poucos dias. Por exemplo, as porcas podem rejeitar a alimentação e experimentarem temperaturas do corpo acima ou abaixo da normal. Na fase de parição, as porcas podem apresen- tar depressão, letargia, pirexia e, ocasionalmente, vômito. Em alguns reba- nhos afetados, até 75% de todos os porquinhos podem ser perdidos. Con- seqüentemente, os resultados econômicos da doença são devastadores.

A forma respiratória da doença apresenta sinais clínicos que são mais pronunciados em porquinhos de 3-8 semanas de idade, mas são registrados como ocorrendo em porcos de todas as idades em rebanhos infectados. Os porquinhos doentes crescem lentamente, têm revestimentos de cabelos grosseiros, dor respiratória ("latejante") e uma maior mortalidade (até cerca de 80% de mortalidade pré-desmame).

As verificações nos estudos preliminares de lesões grosseiras e microscópicas de porquinhos afetados com a forma respiratória da doença sugerem que as lesões microscópicas de pulmão são uma característica clínica importante dessa doença. A despeito de pronunciados sintomas res- piratórios da doença, os pulmões que não parecem complicados pela infec- ção bacteriana secundária são ou grosseiramente normais ou têm uma des- coloração cinza-amarelada difundida branda da superfície do pulmão. To- davia, um exame microscópico do tecido do pulmão dos porquinhos acome- tidos da doença PRRS revela um modelo característico de pneumonites in- testinais, por Collins, J. E. et al., "Respiratory Disease in a Swine Herd Ex- periencing a Reproductive Failure Syndrome", Proceedings, Minnesota Swi- ne Conference of Veterinarians1 pág. 254, St. Paul, MN (10-18 de setembro de 1990).

Conseqüentemente, há uma real necessidade na técnica para uma vacina eficaz, que pode eliminar ou pelo menos atenuar os efeitos da PRRS.

Sumário da Invenção

A presente invenção supera os problemas descritos acima, pro- porcionando uma vacina que reduz ou evita, eficazmente, a doença provo- cada pelo vírus da PRRS em suínos. De uma maneira geral, a invenção inclui uma cultura biológica ou virulentamente pura de vírus PRRS1 juntamente com todos os seus mu- tantes e os processos de produção e uso desses vírus. O vírus do tipo natu- ral é capaz de provocar PRRS em suínos, mas as formas modificadas do vírus, ou os seus mutantes não-patogênicos, proporcionam uma vacina efi- caz contra essa doença. A vacina inclui, de preferência, um vírus modificado ou atenuado vivo e um agente portador farmaceuticamente eficaz. O vírus modificado é, de preferência, propagado e mantido em uma linhagem de células de rim de macaco e essa linhagem de células é, particularmente, MA-104, que é as células de Rim de Macaco-Verde da África passadas vinte vezes ou mais.

Um agente virulento patogênico foi recuperado do tecido do material homogêneo de um porco infectado e confirmado por provocar a doença de PRRS em inúmeros porquinhos e porcas grávidas. Um depósito do agente virulento isolado foi feito em 18 de julho de 1991 com a Coleção de Cultura do Tipo Americano em Rockville, Maryland sob o número de acesso ATCC-VR2332. O agente virulento é um vírus RNA envelopado não- hemaglutinante, fastidioso.

O vírus do tipo natural é, de preferência, modificado em uma forma substancialmente avirulenta, por inoculação do vírus em uma camda integral ou parcial de células de macacos na presença de soro em um meio de crescimento adequado; incubação da camada de células inoculada a uma temperatura de cerca de 35°C a cerca de 37°C até que se observe um efeito citopático, e passando repetidamente o vírus através da linhagem de células de macaco em um meio de manutenção, na presença de soro e sob condições de passagem apropriadas.

A vacina inclui um agente portador, tal como um estabilizador de gelatina de sacarose, que é misturado com um vírus modificado vivo, que é produzido como descrito acima. A vacina é, de preferência, usada para evi- tar PRRS por imunização dos suínos via uma rota local (mucosa superior) ou rota parenteral de vacinação. O suíno imunizado permanece, tipicamen- te, isento dos sintomas da doença subseqüente ao ser confrontado com o vírus do tipo natural.

A vacina pode ser produzida em quantidades comerciais por um processo incluindo as etapas de preparação das culturas de expansão de uma linhagem de célula de macaco; preparação das culturas de produção por infecção das culturas de expansão com um vírus atenuado; colheita das culturas de produção; estabilização e liofilização do vírus. Breve Descrição do Desenho

A Figura 1 é um diagrama esquemático do processo para uso na produção de quantidades comerciais da vacina PRRS. Descrição Detalhada da Concretização Preferida

Os seguintes exemplos não-limitantes apresentam os processos e os materiais preferidos para uso na prática da presente invenção. Exemplo 1

Isolamento. Identificação e Atenuação do Vírus PRRS e Produção de uma Vacina Viva Modificada

A. Isolamento e Identificação

Um material homogêneo de tecido foi obtido de porquinhos de rebanhos infectados por PRRS. O material homogêneo reproduziu consis- tentemente as formas respiratória e reprodutiva de PRRS, quando inoculado intranasalmente em porquinhos gnotobióticos e porcas grávidas. Os porqui- nhos gnotobióticos, com inóculo filtrado (0,45, 0,22 ou 0,1 μm) ou não- filtrado, se tornaram anoréticos e desenvolveram lesões do pulmão similares às lesões observadas nos rebanhos afetados por PRRS. O mesmo inóculo também provocou falhas reprodutivas idênticas àquelas observadas nos rebanhos infectados por PRRS.

Os materiais homogêneos de tecido dos quais o vírus foi isolado incluíam tecido do pulmão (Grupo 1) e tecidos combinados do cérebro-baço- fígado-rim (Grupo 2) obtidos de um porquinho infectado em um rebanho in- fectado por PRRS. Cada um dos grupos de materiais homogêneos separa- dos foi centrifugado a 4.000 Xg por 25 minutos. O sobrenadante resultante foi recolhido e filtrado usando um filtro de seringa estéril de 0,45 mícron. Os sobrenadantes filtrados foram depois combinados. Um ml do sobrenadante filtrado combinado foi usado como o inóculo para infectar cada uma das respectivas linhagens de células, como descrito abaixo.

O sobrenadante filtrado foi adicionado a meios de crescimento, incluindo uma linhagem de células, como o meio de Eagle modificado ("MEM") a JRH Biosciences, e gentamicina a cerca de 100 μg por ml, des- critos abaixo.

Foram conduzidos dois testes para cada linhagem de células, usando-se garrafas plásticas de 75 ml. No Teste Número 1, o sobrenadante filtrado foi inoculado em duas garrafas, tendo cada uma camada de células cheia de cada uma das linhagens de células listadas abaixo. Adicionalmen- te, cerca de 2,5 mg de tripsina foram adicionados à primeira garrafa. Todas as outras condições remanescentes eram as mesmas para cada garrafa de cultura.

No Teste Número 2, o material homogêneo do tecido combinado foi inoculado nas garrafas contendo as mesmas linhagens de células usa- das no Teste Número 1; embora, as camadas de células eram apenas 20- 40% confluentes na ocasião da inoculação. Os meios continham adicional- mente cerca de 10% de soro fetal de bezerro, que não estava presente nos meios do Teste 1. O inóculo foi de novo administrado em uma quantidade de cerca de 1 ml e as culturas foram incubadas a cerca de 34°C por aproxi- madamente sete dias.

Todas as garrafas foram incubadas por cerca de sete dias a aproximadamente 34°C. Os resultados foram registrados ao final de cerca de sete dias. Após congelamento e descongelamento, foi tirada uma amos- tra para uma segunda passagem na mesma linhagem de células. O material remanescente foi congelado em nitrogênio líquido e armazenado a cerca de -60°C. Os resultados de ambos o Teste Número 1 e o Teste Número 2 estão resumidos abaixo na Tabela 1: Tabela 1

Teste de Linhagens de Células para um Hospedeiro Virulento

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Nenhum efeito citopático ("CPE") foi observado no Teste Núme- ro 1 em quaisquer das linhas de células avaliadas. No Teste Número 2, no entanto, pequenas massas de células MA-104 começaram a inchar e formar "buracos fracos" na monocamada em torno das bordas da garrafa. O fluido foi separado da garrafa e passado para uma nova garrafa de células MA- 104 (de novo 20-40% de folha de células) e depois subseqüentemente pas- sadas uma terceira vez. Esse CPE aparente ficou mais forte a cada passa- gem. A passagem 3 manteve a sua virulência. Essa passagem foi deposita- da com a Coleção de Cultura do Tipo Americano em Rockville, Maryland sob o número de acesso ATCC-VR2332. O vírus ATCC-VR2332 provoca, consistentemente, simptomolo- gia, lesões pulmonares de PRRS em porquinhos gnotobióticos e resultados de ImF positivos. Desse modo, o vírus ATCC-VR2332 pode representar um gênero não-identifiçado de Togaviridae. O vírus ATCC-VR2332 também não é um agente patogênico conhecido de suínos, porque os anti-soros especí- ficos em muitos agentes patogênicos virulentos comuns de suínos falharam em neutralizar o vírus ou detectar os antígenos em células infectadas.

O vírus ATCC-VR2332 é um vírus RNA envelopado não- hemaglutinante fastidioso. O vírus ATCC-VR2332 cresce em uma linhagem de células contínua, especificamente, MA-104 e outras linhagens de células de macacos. O vírus ATCC-VR2332 cresce aos mais altos títulos (107 TCID50/1 ml) na linha de células comercial MA-104.

O vírus ATCC-VR2332 contém um envelope de lipídios, como indicado pela perda de capacidade de infecção seguinte ao tratamento com clorofórmio. Um envelope de lipídios também poderia ser visualizado como um anel translúcido eletrônico circundando as partículas vazias. A morfolo- gia do vírus PRRS não é distinta por microscopia eletrônica direta (DEM) e seria extremamente difícil identificar nos fragmentos celulares contendo as preparações. A morfologia das partículas de ATCC-VR2332 purificadas em gradiente e o diâmetro médio de 62 nm são muito similares aos vírus Arte- rite eqüino e vírus de deidrogenase láctica.

O vírus Arterite eqüino tem uma faixa de tamanhos registrada de 50-73 nm, que é similar ao tamanho de 48-84 nm para o vírus ATCC- VR2332. Núcleos de 30-35 nm em muitas partículas de ATCC-VR2332 fo- ram observados, cujos núcleos lembram os núcleos de nucleocapsídios descritos para o vírus Arterite eqüino. Desse modo, morfologicamente, o ATCC-VR2332 lembra mais estreitamente o grupo de vírus Arterite.

A presença de um genoma RNA no ATCC-VR2332 foi confirma- da pela capacidade desse vírus continuar a replicar na presença de 5- bromo-2 desoxiuridina e mitomicina C, que são conhecidas por inibir a repli- cação de DNA e de uma família de vírus RNA (Retroviridae), mas não outros vírus RNA. Todavia, a classificação profissional do vírus ATCC-VR2332 como um vírus RNA está de acordo com a observação de que essas répli- cas de vírus no citoplasma da célula, como indicado pela presença dos an- tígenos de vírus detectados por ImF. Também, Actinomicina D, que interfere com a transição de RNA dependente de DNA, não tem qualquer efeito na replicação do vírus ATCC-VR2332. Esses resultados indicam que o vírus ATCC-VR2332 não requer funções nucleares para replicação.

Em síntese, o tamanho, a morfologia, a presença de genoma RNA e outras propriedades biológicas colocam tentativamente o vírus ATCC-VR2332 na família Togaviridae. O ATCC-VR2332, no entanto, não poderia ser definidamente colocado em um gênero conhecido dessa família. Embora, morfologicamente, o vírus ATCC-VR2332 lembre bastante os arte- rivírus, o vírus não deve ser colocado em um gênero definido até que este- jam disponíveis informações adicionais sobre a estrutura do RNA e da pro- teína.

B. Atenuação

A colheita da passagem VR2332 3 foi submetida a duas passa- gens adicionais descritas em detalhes abaixo e a colheita da passagem 5 foi enviada a um laboratório externo para purificação. Especificamente, os vírus ATCC-VR2332 foram identificados após purificação em gradientes de CsCI (centrifugados a 200.000 Xg) seguinte à extração com 1,1,2-tricloro- trifluoretano. Os vírus purificados foram marcados com um kit de ouro imunológico utilizando-se soros hiperimunos anti-ATCC-VR e conjugado de ouro. A densidade do flutuante dos vírus ATCC-VR2332 nos gradientes de CsCl era de 1,18-1,19 g/cm. Os gradientes de sacarose resultaram consis- tentemente em perda de título de vírus e foram abandonados como um gra- diente adequado para purificação.

A colheita da passagem purificada 5 foi depois submetida a mais 65 passagens, como detalhado abaixo. A colheita resultante da passa- gem 70 foi atenuada e foi designada como a Cultura de Semente Mestre. Essa Cultura de Semente Mestre foi depositada com a Coleção de Cultura do Tipo Americano sob o número de acesso ATCC VR-2495. Finalmente, foram conduzidas mais 5 passagens para obter a passagem ATCC VR-2332 75 (passagens adicionais também poderiam ser conduzidas se desejado).

As passagens 4-75 do vírus ATCC-VR2332 foram conduzidas em uma carga de cultura de tecido hospedeiro da linhagem de célula de rim de Macaco Verde MA-104 comercialmente disponível. Essa carga de cultura de tecido foi preparada da seguinte forma. Um meio de crescimento foi pre- parado para incluir uma mistura de Meio Essencial Mínimo Eagles ("MEM") da JRH Biosciences (catálogo #200-2041) e 10% de soro fetal de bezerro da JRH Biosciences. Cerca de 1 ml de inóculo ATCC-VR2332 foi adicionado a uma garrafa de 75 centímetros cúbicos contendo 50 ml desse meio de crescimento. A garrafa foi mantida por cerca de 7 dias e incubada a uma temperatura variando de cerca de 35°C a cerca de 37°C..

As garrafas de carga de cultura foram preparadas por expansão da cultura incubada resultante, que foi dividida 1 : 4 da seguinte maneira. Os meios de crescimento, que tinham um volume de cerca de 50 ml, foram decantados. A camada de células foi removida por adição de 10 ml de trip- sina - verseno 1012 CÉLULAS/ML e por incubação a 37°C por 5-10 minutos. Subseqüentemente, as células foram removidas da garrafa e centrifugadas a 270 Xg por 5-10 minutos. O sobrenadante foi decantado e o pellet foi res- suspenso em 5-10 ml de meios MEM incluindo 10% de soro fetal de bezer- ro, como antes. As células foram colocadas em 200 ml de meios de cresci- mento, que foram depois subdivididos em porções em quatro garrafas de 75 ml a 50 ml por garrafa, obtendo-se assim uma divisão de 1 : 4.

As culturas resultantes foram mantidas a uma temperatura vari- ando entre 35-37°C até que elas pudessem ser usadas. Após cerca de 3 a 4 dias de incubação, as garrafas tinham desenvolvido um completo revesti- mento célula-folha e estavam prontas para uso.

O vírus PRRS ATCC-2332 foi propagado nas culturas de linha- gem de células contínua MA-104, que foram produzidas como descrito aci- ma. O pH dos meios de cultura foi ajustado a 7,2 e as culturas foram incu- badas a uma temperatura variando de cerca de 35°C a 37°C. O vírus foi inoculado sobre as células MA-104 por adição de cerca de 1 ml de um inó- culo congelado da passagem anterior para os meios de crescimento fluidos. O vírus foi deixado absorver sobre as células por 24 horas.

Os meios de crescimento foram decantados aproximadamente 24 horas após inoculação com o vírus ATCC-VR2332 e o frasco foi reenchi- do com 50 ml de um meio de manutenção, substituindo 4% de soro fetal de bezerro pelo teor de 10% de soro fetal de bezerro dos meios de crescimen- to. Os meios de manutenção tinham um pH de 7,6. Subseqüente a essa mudança de meios, a cultura foi incubada a uma temperatura entre 35-37°C. O vírus foi deixado crescer até que cerca de 50-60% da camada de célula MA-104 fossem destruídos pelo vírus. O amostra foi depois congelada em nitrogênio líquido e preparada para passagem sobre outro frasco de células MA-104.

A reatividade cruzada das passagens 3-70 também foi demons- trada. O vírus da passagem 3 PRRS VR-2332 foi usado para imunizar os suínos, coelhos e as cabras para produzir os anti-soros para PRRS. O soro foi usado para neutralizar o vírus PRRS em vários níveis de passagem da passagem 3 à passagem 70. Além disso, dois anticorpos monoclonais (SDOW-12 e SDOW-17) foram preparados usando-se linfócitos de depres- são nervosa de camundongos imunizados com vírus PRRS VR2332. Os an- ticorpos monoclonais foram mostrados como reagindo contra todos os isola- dos americanos e europeus de PRRS como os de dezembro de 1992. Os anticorpos monoclonais foram usados para identificar ou detectar as passa- gens do vírus PRRS 3-70.

C. Produção de Vacina Viva Modificada

Duas preparações de vacina foram formuladas incorporando, respectivamente, a Cultura de Semente Mestre (a colheita da passagem de ATCC-VR2332 70) e a colheita da passagem ATCC-VR2332 75. O vírus da Cultura de Semente Mestre e o vírus da passagem 75 são substancialmente avirulentos, isto é, as vacinas quando administradas em suínos ou outros mamíferos propensos a contato com PRRS falha por provocar sinais clínicos de doença PRRS, mas é capaz de induzir uma imunorresposta que imuniza o animal contra as formas patogênicas do vírus PRRS. A vacina foi produzi- da por meios convencionais. Os estabilizadores e os veículos normais foram adicionados antes da liofilização.

Exemplo 2

Teste in vivo do Isolado Virulento

A colheita da terceira passagem virulenta do vírus ATCC- VR2332 do Exemplo 1 foi usada para inocular dois porquinhos gnotobióticos de três dias de idade. Ambos os porquinhos foram expostos intranasalmen- te, um com 1 ml e o outro com 2 ml. Os porquinhos foram clinicamente ob- servados por sete dias, depois foram submetidos à eutanásia e à necrópsia.

As amostras de tecido foram coletadas de cada porquínho para histopatia e para recuperação do agente virulento. O relatório de histopato- logia confirmou que as lesões do pulmão nos porquinhos infectados eram idênticas às lesões do pulmão dos porquinhos conhecidos por terem PRRS. As amostras de tecido foram processadas como no Exemplo 1 e depois cul- tivadas em 20-40% e 100% de monocamada da linhagem de células MA- 104 com soro fetal bovino. O agente virulento foi de novo recuperado.

A colheita virulenta da terceira passagem também foi usada para inocular as porcas para verificar que os efeitos reprodutivos da doença podiam ser duplicados e confirmados. Duas porcas multíparas foram inocu- ladas intranasalmente a cerca de 93 dias da gestação. As porcas geraram crias com 50% de porquinhos natimortos (8/13 e 6/14 natimortos/vivos) nos dias 112 e 114 de gestação, respectivamente. Sete dos porquinhos nati- mortos eram múmias parciais e os porquinhos vivos eram fracos e falharam em serem amamentados vigorosamente. O agente virulento foi recuperado dos tecidos dos porquinhos natimortos da maneira do Exemplo 1.

O agente virulento foi recuperado dos três rebanhos conhecidos por terem PRRS. Os títulos dos anticorpos para o agente ATCC-VR2332 foram identificados nesses mesmos rebanhos.

Exemplo 3

A finalidade desse estudo foi o de determinar a dose protetora mínima do vírus PRRS (passagem VR-2332 75), selecionada para uso como uma vacina de vírus vivo modificado. Isso foi feito por análise do grau que as duas dosagens de vacina selecionadas (4,0 ± 0,5 log/dose e 2,0 ± 0,5 log/dose) foram capazes de controlar o aparecimento de condições anor- mais seguintes ao confronto com o vírus PRRS virulento (passagem VR- 2332 3, 3,5 ± 0,5 log/dose) e comparando os porcos confrontados vacinados com porcos confrontados não-vacinados e não-confrontados (normais). A vacina viva modificada foi produzida usando o vírus da passagem 75, como explicado anteriormente.

Sessenta e dois porquinhos soronegativos foram selecionados para uso, a partir da fazenda de origem e distribuídos em quatro grupos de estudo, designados grupos 1, 2, 3 e 4. Vinte e dois porquinhos no grupo 1 foram vacinados com 2,0 ml de vacina PRRS L-4 intramuscularmente (4,0 log/dose). Vinte e dois porquinhos no grupo 2 foram vacinados com 20 ml de vacina PRRS L-2 (20 log/dose). Dez porquinhos no grupo 3 e dez por- quinhos no grupo 4 não foram vacinados. Os porquinhos nos grupos de controle 3 e 4 foram alojados em instalações separadas para garantir sus- cetibilidade ao vírus de confronto. Os grupos 1, 2 e 3 foram confrontados com 2,0 ml da passagem de VR-2332 do vírus PRRS 3 intranasalmente no dia do teste 28. Os porquinhos do grupo 4 não foram confrontados. Os por- cos em todos os quatro grupos de estudo foram observados e monitorados regularmente durante o período pré-confronto de 31 dias e o período pós- confronto de 21 dias. Os parâmetros usados para avaliar os estudos foram os sintomas clínicos, o peso do corpo, a temperatura (retal) do corpo, a contagem de células brancas do sangue, o isolamento do vírus e a serolo- gia. A eficácia da vacina foi demonstrada por redução do número de dias nos quais os porcos vacinados eram virêmicos, evitando-se a Ieucopenia e a febre por manutenção da taxa de crescimento normal seguinte ao confronto.

As temperaturas (retais) do corpo foram medidas antes e após a vacinação. As temperaturas médias do grupo para o grupo 1 aumentaram por 2 DPV e 3 DPV, enquanto que o grupo 2 aumentou por 3 DPV. A dura- ção do aumento de temperatura para cada grupo foi breve, 2 dias para o grupo 1 e 1 dia para o grupo 2.

Nenhum dos grupos vacinados experimentou uma queda nas contagens das células brancas do sangue após o tratamento. Os estudos anteriores indicaram que a exposição ao vírus PRRS provocaria uma Ieuco- penia dentro de 72 horas seguintes à exposição.

Os resultados da medida do ganho de peso durante o período de pós-vacinação indicaram que o tratamento não afetou adversamente o desempenho dos porcos vacinados. Durante os 29 dias seguintes à vacina- ção, o ganho de peso por qualquer um dos grupos vacinados não era signi- ficativamente diferente no nível de confidência de 0,05 do ganho de peso dos grupos 3 e 4.

As observações clínicas apresentaram pouco desvio da norma na maior parte das categorias, exceto para as fezes e as narinas. A compa- ração dos escores fecais dos grupos vacinados com os escores dos grupos de controle combinados (grupos 3 e 4), usando um teste t de dois vínculos, não mostraram qualquer diferença significativa no nível de confidência 0,05.

O valor ρ entre o grupo 1 e os grupos de controle combinados foi de 0,47, enquanto que entre o grupo 2 e o grupo de controle combinado foi de 0,87. A comparação dos escores de narina entre o grupo 1 e o grupo de controle combinado tinha um valor ρ de 0,41. Apenas dois dos 21 porcos no grupo 2 foram observados como tendo escores clínicos para as narinas. A análise do teste t para os escores clínicos individuais dos grupos 1 e 2 com aqueles do grupo de controle combinado apresentaram um valor ρ de 0,53 e 0,74, respectivamente. Essas comparações demonstram a falta de diferença entre aqueles animais que recebem vacina em qualquer nível de dose e os con- troles não-vacinados.

Os resultados do isolamento de vírus do sangue indicaram que 100% (21 de 21) do grupo 1 se tornaram positivos, enquanto que o grupo 2 tinha 90% (19 de 21) de teste positivo. Por todo o período pós-vacinação, os grupos de controle 3 e 4 permaneceram negativos. Os resultados do ensaio IPT (Imunoperoxidase) proporcionaram um quadro similar pelo fato de que 100% do grupo 1 se tornaram serologicamente positivos, como se tornaram 90% do grupo 2. Ambos os grupos permaneceram negativos para os anti- corpos neutralizadores de soro através de 21 DPV. O anticorpo de neutrali- zação foi detectado em ambos os grupos a 29 DPV (0 DPV - consultar re- sultados pós-confronto). Os grupos de controle permaneceram serologica- mente negativos por ambos os procedimentos de teste até o período de confronto.

A análise das observações pós-vacina indicam que parece que não há efeito adverso resultante do tratamento com qualquer dosagem de vacina usada no estudo. No entanto, a dosagem mais alta converteu serolo- gicamente todos os porcos (21 de 21), enquanto que a dosagem mais baixa converteu 19 dos 21 porcos ou 90%.

Seguinte ao confronto com um vírus PRRS virulento, os parã- metros clínicos que foram monitorados nos grupos de confronto vacinados e não-vacinados proporcionaram evidência de proteção pelas duas doses de vacina testadas. Os resultados do teste para viremia proporcionaram uma evidência clara do benefício da vacina. O grupo não-vacinado (grupo 3) era 100% virêmico por 3 DPC, 5 DPC e 7 DPC, enquanto que a incidência de viremia para os mesmos dias de observação no grupo 1 (3,65 log/dose) e grupo 2 (1,85 log/dose) foi de 15,5 e 10% e 30%, 20% e 15%, respectiva- mente. Também, não foi recuperado qualquer vírus das amostras de sangue no grupo 1 após 9 DPC e do grupo 2 após 13 DPC, enquanto que 30% do grupo 3 ainda eram positivos por 19 DPC.

Os resultados da monitoração das temperaturas (retais) do cor- po também proporcionaram evidência da eficácia das vacinas. Durante o período de observação de 21 dias, a temperatura média do grupo 3 excedeu 40°C (104°F) em 5 dias. As temperaturas médias dos grupos 2 e 3 não ex- cederam 40°C (104°F). Além do mais, a temperatura média do grupo 3 ex- cedeu 40,3°C (104,5°F) em dois dias, 2 DPC e 6 DPC.

Seguinte ao confronto, os resultados das contagens de células brancas do sangue apresentaram o grupo 3 experimentando leucopenia, que teve uma queda de 16% ocorrendo por 5 DPC. Nenhum dos grupos va- cinados experimentou uma queda maior do que 6% por todo o período de observação.

A monitoração dos ganhos de peso dos vários grupos de trata- mento durante os 21 dias seguintes ao confronto mostrou que a vacinação com qualquer nível de dose manteve uma taxa de crescimento normal. Os dois grupos vacinados, 1 e 2, tinham um ganho em peso percentual médio de 74 e 73, respectivamente. O grupo 4, os animais de controle normais, tinha um aumento em peso médio do grupo de 75%. Em contraste, o ganho em peso percentual médio do grupo no grupo 3, os controles confrontados não-vacinados, foi de 69%. Isso foi significativamente diferente dos grupos 1, 2 e 4 a P = 0,009, usando um teste t de dois vínculos e um nível de confi- dência de 0,05.

Embora os resultados dos testes clínicos possam não ser tão definitivos na demonstração da eficácia, ainda ilustram os benefícios das vacinas. Seguinte ao confronto, os grupos 1, 2 e 3 apresentaram um au- mento significativo na incidência de sintomas respiratórias. O escore animal individual médio diário para os grupos 1, 2 e 3 foi de 0,39, 0,64 e 0,53, res- pectivamente. Isso ilustra os benefícios da dose mais alta (3,65 log/dose) em relação à dose mais baixa (1,85 log/dose) e nenhuma vacinação. Embo- ras as observações fecais fossem dramáticas após o confronto, não eram significativamente diferentes (usando um nível de confidência de 0,05) das observações seguintes à vacinação e antes do confronto. Desse modo, nes- se experimento o confronto com o vírus PRRS virulento não pareceu ter um efeito no aparelho gastrintestinal mais baixo. De uma maneira geral, as ob- servações clínicas remanescentes não apresentaram uma mudança signifi- cativa em conseqüência do confronto. Para os parâmetros de narinas e boca no grupo 1, um porco tinha 25% do escore de narina do grupo total e outro porco tinha 94% do escore do grupo da categoria boca. De modo si- milar, no grupo 2, um porco tinha 22% do escore de narina do grupo e outro porco tinha 43% do escore de boca do grupo. De uma maneira geral, a inci- dência das observações clínicas pós-confronto para esses dois parâmetros não era significativamente diferente das observações pós-vacinação. Po- dem ser tiradas conclusões similares em torno desses dois parâmetros clíni- cos para o grupo 3. O grupo 4 permaneceu relativamente normal por todo o corpo.

Ao final do período de observação, todos os porcos foram sub- metidos à eutanásia e os pulmões foram observados macroscopicamente para os sinais de envolvimento patológico. Sessenta por cento (6 de 10) do grupo 3 apresentaram um envolvimento considerável. Em comparação, 10% do grupo 1 e 19% do grupo 2 pareceram ter um envolvimento considerável.

Quando comparado com o grupo 4, os controles normais, 80% do grupo 1, 81 % do grupo 2 e 30% do grupo 3 foram descritos como não sendo obser- vavelmente diferentes.

O isolamento dos tecidos do pulmão foi feito. Nenhum vírus foi isolado dos tecidos do pulmão dos porcos do grupo 1. Uma amostra dos 21 porcos do grupo 2 foi positiva para o vírus. O vírus foi isolado de três das dez amostras dos porcos do grupo 3 e nenhum do grupo 4.

A conclusão extraída desses resultados é que ambos os níveis de dosagem (3,65 log/2,0 ml de dose e 1,85 log/2,0 ml de dose) de uma va- cina de vírus PRRS, contendo a passagem de VR-2332 75, foram eficientes contra a doença respiratória em porcos de 3 a 5 semanas de idade, que fo- ram confrontados a 29 DPV com vírus PRRS virulento.

Esse estudo indicou que a dose protetora mínima é de 3,65 log/2,0 ml. Em muitos parâmetros usados para avaliar a eficácia das dosa- gens de vacina, tal como viremia, sinais respiratórios clínicos, envolvimento patológico do pulmão e isolamento de vírus de tecido de pulmão, aqueles animais vacinados com a dosagem mais alta foram melhor protegidos. Tam- bém 21 dos 21 porcos vacinados com 3,65 log/dose seroconvertidos por 21 DPV. Em comparação, apenas 19 dos 21 porcos vacinados com a dose mais baixa tinha sido seroconvertidos por 29 DPV (0 DPV).

Exemplo 4

Neste exemplo, a duração da imunidade usando a vacina viva modificada por 75 passagens de PRRS descrita nos Exemplos 1 e 3 foi in- vestigada. Um porco em engorda normalmente atinge o peso de abate aos seis meses de idade. Nesse exemplo, os porcos foram vacinados a aproxi- madamente 1 mês de idade (4-5 semanas de idade) e depois confrontados 110 dias após a vacinação. Essa duração de imunidade cobriria então a maior parte do período de vida esperado dos porcos em engorda normais. Sessenta e dois porquinhos seronegativos PRRS foram obtidos e distribuídos em quatro grupos de estudo, designados 1, 2, 3 e 4. Vinte e um porcos no Grupo 1 foram vacinados com 2,0 ml da vacina de 75 passa- gens de PRRS-MLV tendo 3,32 Iog por dose. Vinte e um porcos do Grupo 2 foram vacinados com 2,0 ml dessa vacina tendo 1,64 porcos por dose. Os 10 porcos nos Grupo 3 e Grupo 4 não foram vacinados e foram alojados em instalações separadas para manter o estado seronegativo. Ao final do estu- do descrito no Exemplo 3, os porcos do Grupo 2 para esse exemplo foram removidos do estudo e submetidos à eutanásia, uma vez que se concluiu que a dose protetora mínima era de 3,68 Iog e não 1,87 Iog por dose. Os grupos 1 e 3 foram confrontados intranasalmente 110 dias após a vacinação (DPV), usando-se vírus de 3 passagens de VR-2332 (3,9 log/ml). Os porcos do Grupo 4 não foram confrontados. Os porcos foram monitorados 21 dias após a confrontação (DPC) para os sintomas clínicos, alteração no peso do corpo, temperatura (retal) do corpo, contagens de células brancas do san- gue, viremia e serologia. A imunidade protetora 110 dias após a vacinação foi demonstrada por ausência de viremia, prevenção de Ieucopenia e febre e ganho de peso aperfeiçoado, comparada com os porcos não-vacinados confrontados.

Seguinte à vacinação, os porcos vacinados foram monitorados para quaisquer reações adversas à vacina. Os parâmetros que foram moni- torados incluíram temperatura (retal) do corpo, contagens de células bran- cas do sangue, ganho de peso, sintomas clínicos, serologia e viremia.

As temperaturas (retais) do corpo foram monitoradas diaria- mente de -1 DPV a +4 DPV. A análise das médias do grupo não mostraram qualquer aumento significativo nas temperaturas dos grupos em tratamento em conseqüência da vacina. Os porcos vacinados do Grupo 1 experimenta- ram um aumento máximo de -17,7°C (0,2°F), comparada com a média pré- vacinação.

As contagens de células brancas do sangue foram monitoradas a vários pontos de tempo e seguinte à administração das vacinas. O Grupo 1 experimentou uma queda de 14%, quando comparado com a média pré- vacinação em 4 DPV. Todas as outras diminuições nas contagens para o Grupo 1 permaneceram abaixo de 9%. Os grupos remanescentes (3 e 4) não experimentaram quaisquer quedas nas contagens WBC superiores a 11 % durante o período de observação pós-vacinação.

Os resultados do ganho de peso de O DPV a 28 DPV eram con- flitantes pelo fato de que a alteração em peso pelo Grupo 1 era significati- vamente diferente do grupo 4 (P = 0,02). Não há qualquer explicação para essa diferença, uma vez que todos os outros parâmetros que foram monito- rados não apresentaram nenhuma grande diferença entre o Grupo 1 e o Grupo 4.

A análise estatística dos escores clínicos pós-vacinação não indicaram qualquer diferença entre os grupos vacinados e os grupos de controle não-vacinados. Embora o escore fecal tivesse a mais alta incidên- cia, não houve qualquer diferença significativa entre os Grupos 1 e Grupos 3 e 4, P = 0,75, P = 0,59, respectivamente. Da mesma forma, os escores de narinas clínicas não foram significativos. A comparação entre o Grupo 1 e o Grupo 3 tinha valores de P superiores a 0,8. O vapor de ρ para a compara- ção entre o Grupo 1 e o Grupo 4 foi de 0,02, com o Grupo 4 tendo a mais alta incidência. Nenhum dos outros parâmetros clínicos apresentou uma taxa de ocorrência significativa.

Os resultados serológicos pós-vacinação indicam que a dosa- gem da vacina imunizou com sucesso os animais tratados. A 14 DPV, o Grupo 1 tinha 48% de teste positivo pelo ensaio IPT. Sete dias mais tarde a 21 DPV, 100% do grupo de tratamento apresentaram teste positivo por IPT. O Grupo 1 permaneceu negativo para o anticorpo de neutralização de soro (SN) até 28 DPV. Todos os porcos no Grupo 1 permaneceram serologica- mente positivos por ambos os ensaios quando da confrontação a 110 DPV. Os porcos dos Grupos 3 e 4 permaneceram serologicamente negativos por todo o período pós-vacinação.

Os resultados do isolamento do vírus pós-vacinação indicaram que 100% do grupo de tratamento foram inoculados com sucesso. Isso su- porta os dados serológicos anteriormente descritos. Ambos os grupos de controle 3 e 4 permaneceram negativos durante o período de observação pós-vacinação.

As observações pós-vacinação indicam que os tratamentos não tinham qualquer resultados indesejáveis severos nos animais tratados e nos animais de controle remanescentes livres do vírus PRRS.

Seguinte ao confronto com o vírus PRRS virulento, foram moni- torados vários parâmetros clínicos para avaliar o benefício do tratamento da vacina. O grupo vacinado (Grupo 1) foi comparado com o grupo confrontado não-vacinado (Grupo 3) e o grupo não-confrontado não-vacinado (Grupo 4).

Os resultados serológicos pós-confronto demonstraram que o nível de confronto estimulou com sucesso uma imunorresposta no Grupo 3. O Grupo 1 não experimentou uma resposta de anticorpo anamnéstica se- guinte ao confronto com o vírus virulento. Os resultados serológicos indica- ram que o Grupo 4 permaneceu negativo por todo o período de observação de 21 dias.

As verificações mais dramáticas foram os resultados de isola- mento do vírus. Cem por cento do Grupo 3 deram teste positivo a 3, 5 e 7 DPC e antes de 21 DPC1 20% desse grupo deram teste positivo. O Grupo 1 foi negativo a 0 DPC e permaneceu assim por todo o período de observação de 21 dias. Um resultado inesperado foi o isolamento positivo do vírus PRRS das amostras de sangue do Grupo 4. 0 primeiro isolamento do vírus positivo do Grupo 4 ocorreu a 15 DPC. Essa observação correlacionada com outros parâmetros que serão discutidos mais tarde. Ainda que o Grupo 4 tenha entrada em contato com o vírus PRRS, os dados coletados devem ser ainda considerados válidos, uma vez que a exposição aparente ocorreu durante o terceiro e último período de observação e o intervalo de conside- ração primário é de 1 DPC a 11 DPC. É durante esse tempo que a maior parte das comparações entre os Grupos 1 e 3 foi feita. O resultado mais importante foi a prevenção evidente da infecção, como mostrado pela falta de isolamento do vírus no grupo de tratamento da vacina.

A importância dos escores clínicos pós-confronto parece ser Iimitante na avaliação do efeito do tratamento da vacina. Embora os sinais respiratórios clínicos fossem observados nos Grupos 1 e 3, os sinais não foram distribuídos uniformemente. No caso do Grupo 1, dois porcos repre- sentaram 88% do escore total para o grupo. Da mesma forma, dois porcos no Grupo 3 representaram 71% do escore total do grupo de 49. 0 escore fecal total do Grupo 1 é significativo, quando comparado com os outros gru- pos. No entanto, apenas 9 dos 21 porcos foram observados como tendo al- guns sinais clínicos nessa categoria e dos 9 porcos, 3 porcos representaram mais do que 55% do escore total para o grupo. Não foram atribuídos quais- quer escores fecais para o Grupo 3 e apenas 1 porco no Grupo 4 foi obser- vado como tendo sinais fecais clínicos. Os escores clínicos para as narinas e boca podem ter uma importância limitada sem estarem associados com outros parâmetros, tais como o respiratório. A incidência das observações nas narinas foi limitada em ambos os Grupos 1 e 3 tendo menos do que 50% de cada grupo tendo um escore. Os escores para as observações na boca tinham uma alta incidência com 90% do Grupo 3 e 76% no Grupo 1. Não houve qualquer diferença significativa entre esses dois grupos para os escores clínicos da boca, P = 0,45. Todos os outros parâmetros clínicos fo- ram observados como sendo normais.

Durante o período de observação pós-confronto, o Grupo 1 ga- nhou uma média de 19,33 quilogramas (42,62 libras). Não houve qualquer diferença significativa entre os Grupos 3 e 4, P = 0,9 e isso pode ter sido conseqüência do Grupo 4 ter sido acidentalmente exposto ao vírus PRRS. No entanto, isso não diminuiu a comparação dos dados entre os Grupos 1 e 3, em virtude de que há uma diferença estatisticamente diferente entre es- ses dois grupos. A avaliação do desempenho dos porcos por um período de tempo proporciona uma excelente ferramenta para avaliar a fonte global concernente a esses porcos. Esses dados em conjunto com outros parâme- tros indicam o benefício da vacina em teste à luz de um confronto experi- mental.

As temperaturas pós-confronto demonstraram o benefício do tratamento da vacina à luz de um confronto experimental. O grupo de con- trole de confronto, Grupo 3, tinha 8 dias nos quais a temperatura média do grupo tinha pelo menos um aumento de -17,2°C (1°F) em relação à média de pré-confronto. 0 Grupo 1 não teve um aumento médio do grupo de - 17,2°C (1°F) em tempo algum. Embora o Grupo 4 fosse contaminado com o vírus PRRS1 a temperatura média do grupo não aumentou por um grau. Isso foi devido à disseminação do vírus dentro do grupo sendo gradual e não sendo totalmente abrangente, comparado com o confronto experimental. No entanto, a análise das temperaturas dos porcos individuais de 15 DPC a 21 DPC apresentaram porcos do Grupo 4 experimentando aumentos de tempe- ratura seguinte à exposição ao vírus PRRS. A análise das temperaturas dos porcos individuais nos Grupos 1 e 3 enfatizaram ainda o benefício do trata- mento da vacina. Dez dos 10 porcos no Grupo 3 experimentaram um au- mento de -17,2°C (1°F) por dois dias consecutivos ou mais. Em contraste, os porcos do Grupo 1 não tiveram resultados comparáveis.

Uma outra evidência da eficácia da vacina foi demonstrada pe- los resultados das contagens WBC pós-confronto. A contagem WBC média do Grupo 1 diminuiu após o confronto. Diminuições de 14%, 19%, 14%, 21% e 13% ocorreram, respectivamente, 1, 3, 5, 7 e 9 dias seguintes ao con- fronto. Nos mesmos dias de teste, o Grupo 3 teve diminuições médias de 15%, 37%, 43%, 31% e 28%. 0 Grupo 4, o grupo de controle de não- confronto, experimentou quedas entre 11 % a 17% durante o mesmo período de tempo. As análises das contagens individuais dos porcos ainda substan- ciam a proteção proporcionada pelo tratamento da vacina. Dez dos 10 por- cos no Grupo 3 experimentaram uma queda de 25% ou mais nas contagens WBC em dois ou mais dias de teste consecutivos. O Grupo 1 tinha 2 dos 21 experimentando Ieucopenia de 25% ou mais nos dois dias consecutivos. Os porcos infectados do Grupo 4 experimentaram resultados similares aqueles do Grupo 3. A incidência de Ieucopenia ficou evidente na medida em que a disseminação do vírus progrediu através do grupo. Entre 15 DPC e 21 DPC, 50% do grupo experimentou diminuições da contagem WBC de 25% nos dias de teste consecutivos. Esses resultados indicam que os porcos vacina- dos não experimentaram a Ieucopenia que os porcos não-vacinados expe- rimentaram. A análise das observações grosseiras (macroscópicas) dos pulmões a 21 DPC foi dividida em escores de parênquima e pleura, que fo- ram depois combinados para o escore do pulmão total. A análise das obser- vações ficou mais difícil com a exposição acidental do vírus PRRS ao grupo de controle de não-confronto, uma vez que uma linha de base negativa não podia ser desenvolvida. Desse modo, é necessário limitar a comparação entre os Grupos 1 e 3, uma vez que esses grupos tiveram exposição ao mesmo confronto de vírus e ao mesmo tempo. Os escores de parênquima para o Grupo 3 foram maiores em gravidade do que com 4 dos 10 porcos tendo escores individuais de 200. O mais alto escore no Grupo 1 foi de 100. Ambos os percentuais do grupo de tratamento foram afetados e a gravidade das lesões de parênquima foi diminuída com o tratamento da vacina. De modo similar, o tratamento de vacina diminui a incidência e a gravidade das lesões pleurais. O Grupo 1 tinha 24% (5 de 21) tendo escores pleurais de 100; enquanto que o Grupo 3 tinha 50% (5 de 10) tendo escores de pleura de 100. Grande parte dos porcos (9 de 21) no Grupo 1 teve escores pleurais de 15 ou menos. A correlação dos escores do pulmão com os problemas respiratórios foi não-existente. Por exemplo, um porco do Grupo 3 teve es- core respiratório clínico de 23 e um escore total de pulmão de 287,5; en- quanto que outro porco do Grupo 3 teve escore respiratório clínico de 0 e um escore de pulmão total de 300. Há vários outros exemplos da falta de correlação entre os escores de pulmão e os escores respiratórios clínicos. Se as observações macroscópicas são ou não válidas para analisar o efeito benéfico da vacina, pode-se concluir que o grupo de tratamento, Grupo 1, tinha menos animais com lesões e a gravidades dessas lesões foi diminuí- da.

Concluindo, muitos dos parâmetros usados para avaliar o efeito da vacina, à luz de um confronto experimental 110 dias após a vacinação, ficaram bem correlacionados entre si. Durante o período (3-9 DPC) no qual a viremia é a mais evidente, ocorreram Ieucopenia e aumento na temperatu- ra do corpo significativo. Quando do confronto, os porcos eram de aproxi- madamente 20 semanas de idade ou 12 semanas mais velhos do que a ida- de dos porcos confrontados no Exemplo 3. Muitos dos sintomas clínicos notados nesse estudo foram mais graves. Por exemplo, o aumento na tem- peratura (retal) do corpo foi avaliada por 8 dias nesse estudo, comparados com os 5 dias no Estudo de lmunogenicidade. A gravidade da Ieucopenia experimentada pelo grupo de controle não-vacinado confrontado (Grupo 3) nesse estudo era muito mais dramática do que pelo grupo de controle de confronto do Estudo de lmunogeneticidade. No estudo anterior, o grupo de controle de confronto experimentou diminuições nas contagens WBC de 43% a 27% (3-9 DPC). No Estudo de lmunogeneticidade, o grupo de con- trole de confronto experimentou diminuições de 15-21% de 2-9 DPC. O nú- mero de dias nos quais a viremia foi detectada durante o período pós- confronto (1-14 DPC) para o grupo vacinado confrontado do Estudo de lmunogeneticidade foi de O dos 110 dias possíveis, comparados com os 45 dos 110 dias no grupo confrontado nesse estudo. Desse modo, o aumento na gravidade dos sinais clínicos não foi inteiramente devido a um aumento na duração da viremia.

Os resultados de pós-confronto desse estudo demonstraram que a vacinação com a vacina PRRS-MLV, tendo o nível de dosagem de 3,32 Iog por 2,0, proporcionou proteção contra um confronto com o vírus PRRS virulento 110 dias após a vacinação. Eles são: (1) Os animais vaci- nados foram inteiramente negativos para viremia durante o período de ob- servação de pós-confronto de 21 dias; (2) a despeito das menores ocorrên- cias de sinais clínicos respiratórios, fecais, nasais e orais, os porcos vaci- nados foram observados como sendo de sinais clínicos normais; (3) o peso ganho pelos porcos vacinados era significativamente maior do que a quanti- dade ganha pelos porcos não-vacinados confrontados; (4) os porcos vaci- nados não experimentaram um aumento notável na temperatura do corpo; (5) nenhuma diminuição marcante nas contagens WBC ocorreram nos por- cos vacinados; (6) a ocorrência e a gravidade de lesões de parênquima e de pleura foram menores nos porcos vacinados.

Exemplo 5

Neste exemplo, a vacina de 75 passagens de PRRS-MLV, des- crita nos Exemplos 1 e 3, foi testada para determinar o início da imunidade. Sete dias antes do início do estudo, 35 porcos foram testados para o anti- corpo PRRS usando o Teste de Imunoperoxidase (IPT) e para a presença do vírus PRRS na corrente sangüínea por isolamento do vírus nas células MA-104. Dez porcos no Grupo 1 foram vacinados intramuscularmente com 2,0 ml de vacina de 75 passagens de PRRS -MLV no dia de teste 0. Dez porcos no Grupo 2 foram vacinados da mesma forma que no dia de ensaio 7. Dez porcos do Grupo 3 e 5 do Grupo 4 foram mantidos em instalações separadas, mas em condições ambientais similares e serviram como con- troles contemporâneos não-vacinados. Os porcos nos Grupos 1, 2 e 3 foram confrontados no dia de teste 14. O inóculo de confronto, consistindo de ví- rus PRRS virulento (VR-2332, passagem 3, 3,7 Iogi0 vírus por 1,0 ml) foi administrado intranasalmente (2,0 ml/porco). Os porcos do Grupo 4 perma- neceram inalterados. Todos os porcos foram monitorados por 10 dias para os sinais clínicos de doença respiratória. Todos os porcos foram submetidos à eutanásia na conclusão do estudo para avaliação das lesões do pulmão.

Quando do confronto, os porcos do Grupo 1 foram serologica- mente positivos por IPT1 mas não para a atividade de neutralização do soro. Em contraste, todos os outros porcos incluindo aqueles no Grupo 2 foram negativos por ambos os procedimentos. Cinqüenta por cento dos porcos do Grupo 2 foram testados positivos por IPT a 7 DPC e 100% a 10 DPC. Os porcos do Grupos 3 foram testados positivos por IPT a 10 DPC. Um porco de cada um dos Grupos 1 e 2 desenvolveu atividade SN a 10 DPC e 7 DPC, respectivamente. Os resultados SN não são significativamente diferentes ao nível ρ = 0,05. Os resultados desse estudo demonstraram que a proteção foi deduzida em conseqüência dos tratamentos, ainda que os porcos quando do confronto foram serologicamente negativos ou sem atividade neutrali- zante do soro. A proteção pode não ser diretamente ligada à imunidade hu- moral. A imunidade mediada pela célula em resposta à vacinação com uma vacina viva modificada pode desempenhar um grande papel na proteção contra um confronto virulento.

No Exemplo 4, a falta de viremia seguinte ao confronto foi um critério importante para demonstrar a proteção por vacinação. No entanto, com o breve período entre a vacinação e o confronto no presente estudo, os animais vacinados não tinham resolvido a viremia pós-vacinação. Também, uma vez que o confronto era um confronto homólogo, não foi possível dife- renciar o vírus de confronto do vírus da vacina. Quatro porcos do Grupo 1 e 1 porco do Grupos 2 deram teste negativo para viremia por pelo menos um ponto de teste de 3 DPC a 9 DPC. Cem por cento do Grupo 3 deram teste positivo para viremia durante o mesmo período de tempo.

Diferentemente dos exemplos anteriores, o aparecimento signi- ficativo de sinais respiratórios clínicos foram detectados nesse estudo. O Grupo 3 tinha 9 de 10 animais experimentando dificuldades respiratórias em um ou mais dias (número médio de dias igualou a 3,6). O número de ani- mais para os Grupos 1 e 2 experimentando dificuldades de respiração por um ou mais dias era um e zero, respectivamente (p <0,001). A incidência de sinais clínicos para as narinas era similar àquela dos sinais respiratórios. O Grupo 3 tinha 8 de 10 experimentando sinais clínicos para narinas em um ou mais dias. A duração média de sinais clínicos foi de 3,1 dias. Em con- traste, os Grupos 1 e 2 foram significativamente diferentes com tempos de duração médios de 1,3 dia e 0,1 dia, respectivamente (p < 0,001). As ocor- rências dos parâmetros clínicos remanescentes foram rotineiros.

Ambos dos grupos vacinados ganharam mais peso do que o grupo de controle de confronto. O Grupo 2 ganhou uma média de 4,81 qui- logramas (10,6 libras) durante o período de observação de 10 dias, compa- rado com as 3,54 quilogramas (7,8 libras) para o Grupo 3 (p = 0,01). O ga- nho médio para o Grupo 1 foi de 4,35 quilogramas (9,6 libras), o que não foi significativamente diferente comparado com o Grupo 3. Esse grupo teve os dois menores porcos, que pesaram 3,17 e 5,67 quilogramas (7 e 12,5 li- bras), respectivamente, no dia de teste 0 e 2,72 e 5,44 quilogramas (6 e 12 libras), respectivamente, quando do confronto. O ganho médio do grupo com os dois menores porcos retirados é de 5,58 quilogramas (12,3 libras), que é significativamente diferente do Grupo 3 (P < 0,001). A taxa inferior de ganho pelos dois porcos pode ser atribuída às suas incapacidades para competir com os maiores porcos no grupo. Esses porcos também experi- mentaram diarréia durante o período de observação pós-confronto. Os por- cos no Grupo 4 tinham um ganho médio em peso de 6,89 quilogramas (15,2 libras) durante o período de 10 dias. Um ganho de peso diário médio entre 0,45 e 0,68 quilograma (1,0 e 1,5 libras) seria esperado em porcos dessa idade. Esses resultados demonstram que o tratamento de vacinação em 7 e 14 dias precedentes ao confronto proporcionaram proteção, que permitiram uma taxa de crescimento esperado.

Seguinte ao confronto, os porcos do Grupo 3 tinham um au- mento de temperatura sustentado de -17,2°C (1°F) em relação à média de pré-confronto para uma média de 4,6 dias. O número de dias médio nos quais os porcos nos Grupos 1 e 2 que tinham um aumento de temperatura comparável foi 0,5 e 1,1 dias, respectivamente (p < 0,001). Apenas 1 dos porcos vacinados teve um aumento de -17,2°C (1°F) nos 2 dias consecuti- vos, comparados com 8 de 10 no Grupo 3. A diferença estatística entre os vacinados e os controles foi de ρ < 0,001. Esses resultados demonstram que o tratamento de vacina dos porcos nos Grupos 1 e 2 evitaram a ocor- rência de febre em conseqüência da exposição ao vírus PRRS virulento.

Os porcos do Grupo 3 experimentaram uma dramática redução nas contagens de células brancas do sangue em 3, 5 e 7 DPC. Esses re- sultados foram estreitamente paralelos ao aumento de temperatura que es- ses animais experimentaram durante o mesmo período. Os porcos dos gru- pos vacinados tinham uma Ieucopenia branda durante 1-2 dias antes do retorno aos valores pré-confronto. Os valores para os porcos vacinados eram significativamente diferentes dos controles de confronto (p = < 0,001). Esses resultados enfatizaram o nível de proteção proporcionado pelo trata- mento de vacina a 7 ou 14 dias antes do confronto por redução do nível e da duração da leucopenia.

O tratamento de vacina em 14 dias ou 7 dias antes do confronto reduziu a gravidade das lesões do pulmão. Ambos os grupos vacinados eram significativamente diferentes do grupo de controle de confronto (P = 0,01). Os escores vacinados são similares aqueles para o Grupo 4, o grupo de controle normal. O escore de pulmão médio para o Grupo 3 foi de 97,1, comparados com 9,3 e 7 para os Grupos 1 e 2, respectivamente. As lesões observadas nos últimos dois grupos são consideradas como sendo ocorrên- cias normais e previstas nos porcos criados convencionalmente saudáveis.

Os resultados no presente estudo demonstraram que a imuni- dade protetora foi estimulada dentro de 7 dias da vacinação com uma vaci- na de vírus vivo modificado. Foram observadas diferenças significativas na resposta de temperatura, ganho de peso, leucopenia, lesões do pulmão e sinais clínicos seguintes ao confronto experimental nos porcos vacinados, quando comparados com os porcos não-vacinados confrontados.

Exemplo 6

Neste exemplo, dois grupos (A e B) de 100 porcos desmamados de três semanas de idade de um rebanho positivo para PRRS foram vacina- dos com a vacina de 70 passagens de PRRS-MLV do Exemplo 1 ou um pla- cebo (água estéril). Trinta porcos fora de cada tratamento foram monitora- dos para as reações adversas por monitoração da temperatura do corpo, ganho de peso e reações locais de injeção. Esses porcos e os 70 porcos remanescentes de cada grupo de tratamento também foram observadas para os sinais de saúde geral para os 28 dias seguintes ao tratamento. Os resultados desse estudo demonstraram que a vacina não provocou quais- quer efeitos colaterais e é segura quando usada apropriadamente em um rebanho positivo a PRRS.

As temperaturas retais nas pré-vacinações (-2 DPV) indicaram que os porcos usados nesse ensaio não foram porcos saudáveis normais.

As temperaturas do Grupo A foram significativamente mais altas do que aquelas para o Grupo B nos dias de ensaio -2 e -1 (P < 0,05). Não houve diferenças significativas entre os dois grupos nos dias de ensaio 0, 1, 2 e 3 (P < 0,05). Esses resultados indicam que a vacinação com a vacina PRRS viva modificada não exacerbaram as condições que provocaram a existên- cia de temperaturas elevadas.

Nenhum dos porcos de cada um dos grupos experimentou qual- quer reação pós-tratamento no local de inoculação. Esses resultados de- monstram ainda a segurança da vacina, quando administrada de uma ma- neira aprovada.

Durante o período de 29 dias dos dias de ensaio -2 a 27, os 30 porcos do Grupo A ganharam uma média de 21,02°C e os 29 porcos do Grupo B ganharam uma média de 18,18. Essa diferença é significativa a P < 0,05. Uma vez que essa tentativa foi realizada à luz de uma infecção PRRS ativa, os resultados são indicativos de segurança como também eficácia.

Os resultados das observações clínicas indicam que a vacina- ção reduz significativamente a incidência dos muitos parâmetros clínicos.

Os parâmetros reduzidos incluem apresentação de 62 a 6, fezes de 48 a 24, olhos de 162 a 89, narinas de 30 a 0, boca de 30 a 0, apetite de 91 a 13, tratamentos de 37 a 14 e mortes de 5 a 0. A diminuição no número de tra- tamentos recebidos pelo Grupo 1, quando comparado com o Grupo B, foi significativo (P < 0,05). A redução de sinais clínicos proporciona outra evi- dência de que a vacina PRRS viva modificada é segura, quando usada em um rebanho que está experimentando uma erupção clínica associada com o vírus PRRS.

Em conclusão, a vacina demonstrou ser segura, quando usada apropriadamente em um rebanho que está experimentando uma doença clínica ativa associada com uma infecção PRRS. A vacina não intensificou os sintomas clínicos se estão associados com o vírus PRRS, ou com agen- tes patogênicos secundários conhecidos como estando presentes nessa operação de suínos. Sob as condições que existem nesse local de teste, esses resultados também indicaram um efeito benéfico no grupo de trata- mento receptor da vacina.

Exemplo 7

Neste exemplo, o efeito da vacinação de 20 porquinhos de 5 semanas de idade Iandrace holandês, de sexos variados, isentos de agen- tes patogênicos específicos com uma baixa dose de vacina de 75 passa- gens de ATCC-VR2332 (ATCC VR-2495) na disseminação do vírus Lelystad (LV) foi determinado. Acredita-se que as linhagens naturais de LV sejam importantes na predisposição dos porcos para infecções respiratórias se- cundárias, provocando um mau desempenho e taxas de mortalidade mais altas. Esse exemplo proporciona os dados relativos ao efeito da vacina na transmissão do vírus LV do tipo antigênico europeu.

Os porcos foram separados em dois grupos de 10 porcos, um grupo experimental e um grupo de controle. Cada porco do grupo experi- mental foi vacinado intramuscularmente com 2 ml de vacina diluída conten- do aproximadamente 103 TCID5O da vacina de 75 passagens de ATCC- VR2332. Seis semanas mais tarde, 5 animais de cada grupo foram con- frontados por inoculação intranasal com a linhagem européia do tipo natural de LV (Código CDI-NL-2,91, Ter Huurne, 5a passagem nos macrófagos al- veolares de suínos), usando uma dose de confronto de 105,3 TCID5o/2 ml. Após 1 dia, os porcos confrontados foram retornados para os seus cerca- dos.

O experimento testou se, quando e quantos dos porcos vacina- dos e não-vacinados mostraram doença clínica ou se tomaram virêmicos e se e quantos dos ocupantes do cercado ficaram infectados com o vírus Le- lystad. A infecção nos grupos vacinado e de controle foi depois quantificada e as taxas de transmissão do vírus Lelystad nos grupos vacinados e de controle foram calculados. Para que a vacinação seja bem-sucedida, a gra- vidade e a duração da doença e da viremia e a taxa de transmissão no gru- po vacinado devem ser menores do que no grupo de controle.

Este estudo, testado sob condições extremas de baixa dose de vacina e de confronto heterólogo, demonstrou o valor protetor da vacina.

A vacinação reduziu os sinais clínicos da doença após o con- fronto. Reduziu, significativamente, a temperatura retal média após con- fronto; reduziu, significativamente, o número de dias nos quais os porcos confrontados eram virêmicos e reduziu, significativamente, o grau de viremia nos porcos confrontados. Além do mais, embora a transmissão dos porcos diretamente confrontados para os confrontados por contato não ocorresse em todos os porcos em ambos os grupos vacinado e não-vacinado, houve uma diferença significativa na transmissão LV do tipo natural entre o grupo vacinado e o não-vacinado. A vacinação com uma baixa dose de 75 passagens de ATCC- VR2332 da vacina PRRS tipo antigênica americana foi, portanto, eficaz em conferir proteção contra os confrontados com o vírus Lelystad do tipo natu- ral europeu.

Exemplo 8

Produção da Vacina em Escala Comercial

A Figura 1 ilustra um diagrama de processo esquemático para uso na produção de quantidades comerciais do vírus da Cultura de Semente Mestre modificado vivo do Exemplo 1. O Processo P10 começa com a etapa P12, que é a esterilização de todos os recipientes. A esterilização é, de preferência, conduzida por irradiação, mas também pode ser feita térmica ou quimicamente. Os tipos de recipientes incluem frascos de inóculo, por exemplo, de 75 a 150 ml, de cinco litros, frascos de cultura de tambor e re- cipientes biorreatores de agitação por ar de aço.

A etapa P14 inclui a preparação de culturas de expansão das células hospedeiras MA-104. Uma carga de linhagem de célula MA-104, na passagem 58, é armazenada em nitrogênio líquido e usada para suprir as células hospedeiras à cultura virulenta através de 78 passagens. A culturas MA-104 de carga são crescidas em frascos variando de cerca de 75 ml a 150 ml em volume e contendo 50 a 150 ml de meio. O meio inclui, de prefe- rência, MEM misturado com 10% de soro bovino ou fetal de bezerro e cerca de 30 microgramas por ml de neomicina. Os frascos estéreis e os meios são, de preferência, inoculados com cerca de 1 ml de uma cultura MA-104 da passagem anterior e incubados a 35°C a cerca de 37°C por três a sete dias.

A expansão das culturas de células de carga ocorre, de prefe- rência, de um frasco de 150 ml a cerca de 400-600 ml de meios, uma razão de 1 : 5 (volume a volume). Após cerca de 4-7 dias de incubação a cerca de 35-37°C, esses 400-600 ml de meios podem ser depois subcultivados em um frasco de cinco litros cheio com os meios. Alternativamente, o inóculo pode ser aplicado a uma razão de 1 : 3,4 em uma cultura de tambor tendo cerca de 670 a 850 cm2 de área de crescimento e 150 ml de meios, que é depois subcultivada em outros recipientes de cultura de tambor a uma razão de cerca de 1 : 9 a 1 : 11. As subculturas são incubadas por cerca de 4-7 dias a cerca de 35-37°C.

A etapa P16 inclui a preparação de culturas de produção de células de MA-104 virulentamente infectadas. As culturas de expansão da etapa P14 são, tipicamente, mais expandidas em recipientes biorreatores de maiores volumes a uma razão de cerca de 1 : 3 a cerca de 1 : 5 (volume a volume). Os recipientes de produção podem incluir, por exemplo, os frascos de cinco litros das culturas de expansão, ou os recipientes de cultura de aço inoxidável de 40 litros, equipados com um agitador suspenso de ar, controle de temperatura e controle de pH. O recipiente é cheio com uma quantidade apropriada de meio de crescimento, inoculado com células MA-104, incuba- das a cerca de 35°C por 4 a 7 dias e infectadas com o vírus da Cultura de Semente Mestre do Exemplo 1. Esse vírus vai ter, de preferência, um título de pelo menos cerca de 106 TCID50 por ml de CPE e vai ser adicionado à produção de culturas de recipientes a uma razão de pelo menos cerca de 0,1 a 10 ml a 100 ml de meios. As culturas de produção são incubadas a cerca de 35-37°C por 2 a 3 dias após infecção com o vírus atenuado.

A etapa P18 inclui a colheita das culturas de produção da etapa P16, após o período de incubação pós-infecção. O tempo apropriado para a colheita em massa deve ser determinado por observações de CPE, como indicado por cerca de 10% de mudanças macroscópicas (degradação das células arredondadas e da folha de célula), ou 10% de alteração no pH. A cultura de produção da etapa P16 é colhida sob uma campãnula de fluxo em um recipiente estéril, ou através de um sistema de colheita fechado sob pressão positiva. O vírus colhido em massa é congelado e armazenado a uma temperatura de cerca de -40°C a cerca de -70°C.

São obtidas alíquotas para as medidas de controle de qualida- de, quando necessário. As amostras de cada colheita em massa são testa- das em meios de digestão de tioglicolato e de caseína de soja, que são in- cubados a cerca de 36°C e 20°C, respectivamente, por 14 dias em cada temperatura. Esse vírus de semente é usado para procriar culturas subse- qüentes, se o teste indica um título de pelo menos cerca de 105 TCID50/ml por CPE. O material insatisfatório é esterilizado com hipoclorito de sódio a 5% por 24 horas, ou autoclavado.

A etapa P20 inclui a estabilização e a liofilização do vírus con- gelado em massa obtido na etapa P18. O vírus congelado em massa é des- congelado e, de preferência, misturado com um estabilizador farmacologi- camente compatível, tal como estabilizador de gelatina de sacarose con- vencional, em uma razão de cerca de três partes de Cultura de Semente Mestre a cerca de uma parte do estabilizador. Solução salina fisiológica pode ser adicionada para ajustar a concentração final do vírus.

A mistura é depois dividida em subvolumes de doses de cerca de 0,28 ml de fluido cada, com cada dose incluindo cerca de 0,20 ml de cultura PRRS por dose a um título mínimo de 104,9 TCID50 por dose. Deve-se notar que a quantidade de cultura de produção estabilizada que resulta das etapas P16, P18 e P20 serão suficientes para produzir entre 150.000 e 500.000 doses estabilizadas. Por meio de exemplo, 25 doses compreende- riam aproximadamente um subvolume de 7,0 ml. Esses subvolumes são tampados congelados, de preferência, em nitrogênio líquido. A câmara de secagem é mantida sob vácuo, enquanto que a temperatura é aumentada a um máxima de cerca de 30°C e o subvolume é mantido por um máximo de 18 horas para sublimar a umidade na amostra.

A etapa P22 inclui a monitoração contínua do produto de vacina que resulta da etapa P20. Um recipiente das amostras finais, ou bateladas em série ou única da vacina PRRS, é inspecionado pontualmente para ga- rantir que os teores de umidade se encontram abaixo de 5%. As séries com os teores de mistura superiores a 4% ou menos do que 1% serão testados para potência em intervalos de seis meses. Como uma medida de seguran- ça, porquinhos-da-índia são injetados com o peso equivalente de 10 doses de vacina e observados por 21 dias para os sinais desfavoráveis de reação clínica.

O vírus VR-2332 também foi adaptado a frio em paralelo com a atenuação descrita no Exemplo 1. Isso foi feito para desenvolver uma linha- gem de vacina que evitava a disseminação do vírus pelos animais infectados. Essa adaptação a frio foi conduzida por passagens sucessivas a uma tem- peratura de 31-35°C. As linhagens resultantes também estimulam uma imunorresposta.

Claims (6)

1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que com- preende um vírus de síndrome de reprodução e respiratória de suínos (PRRS) em uma forma modificada e substancialmente avirulenta e mistura- da com um agente veículo farmacologicamente compatível, o referido vírus modificado e substancialmente avirulento compreendendo o vírus ATCC- VR2332 passado pelo menos 70 vezes em uma cultura de células da linha- gem de células do rim do macaco MA-104, de modo que, quando o vírus modificado e substancialmente avirulento é administrado a um suíno pro- penso a PRRS, falha em provocar sinais clínicos da doença PRRS, mas é capaz de induzir uma resposta imunológica que imuniza o mamífero contra as formas patogênicas de PRRS.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido vírus compreende o ATCC-VR2495.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido agente veículo compreende um estabilizador de gelatina de sacarose.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido vírus é passado 75 vezes.

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser para a administração segura à suínos.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que não possui efeitos indesejáveis graves nos animais vacinados.