CN1130227C - 与猪的神秘疾病有关的病毒剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供抗猪生殖和呼吸综合症(PRRS)的基本无毒的疫苗，这种疫苗有效地免疫猪，使其抗该病的美国和欧洲型。本发明还提供体外生长该病毒剂的方法和将此病毒减毒用于制备疫苗的方法。

Description

与猪的神秘疾病有关的病毒剂
技术领域
本发明涉及免疫学和病毒学领域，更具体地涉及得自致病性病毒分离株的疫苗。更具体地，按照产生抗摧毁性新猪病疫苗的方法将致病型病毒改良或减毒成无毒型。
背景技术
一种新的猪病，称作“神秘猪病”、“猪不育和呼吸综合征”、“蓝耳病”或“猪生殖和呼吸综合症”(PRRS)，正在引起美国和加拿大繁殖畜牧群严重损失。类似的疾病也出现在欧洲。该疾病被证明有两种形式，一种引起生殖能力丧失，另一种引起幼猪呼吸窘迫。生殖型疾病的描述见Keffaber，K.K.，″Reproductive Failure of Unknown Etiology″，American Association of SwinePractitioners Newsletter，1：109，(1989)。
该病的生殖型最突出的临床症状是晚期自发性流产、早产(可高达20-30％)和一胎木乃伊化胎猪，死产或多病小猪。这样的临床症状典型地可见于饲养4-16周，甚至更长时间。如皮肤深棕色着色和死后自身分解所证实的，受侵袭的一胎死产胎猪常处于木乃伊化早期。有时也见胎颅骨穹隆形畸形。母猪的感染可被忽视或表现为持续数日的全身状况削弱。例如，母猪可不摄食、体温高于或低于正常。在下小猪期，母猪可显示抑郁、嗜睡、phyrexia，偶有呕吐。在一些感染畜群中，可失去高达75％的小猪。因此，此病的经济后果是摧毁性的。
该病的呼吸型在3-8周龄的小猪出现最明显的临床症状，但据报道可出现于感染的畜群中各龄小猪。患病小猪生长缓慢，皮毛粗糙、呼吸窘迫(“粗重(thumping)”)和死亡率增加(高达约80％断奶前死亡率)。感染该病呼吸型的小猪的肉眼和显微镜损害的初步研究发现提示，显微镜下肺损害是该病的重要临床特征。尽管该病有显著的呼吸症状，但看来并未合并继发性细菌感染的肺肉眼观察正常，或仅有肺表面轻度弥漫性深灰色着色。然而，患PRRS病小猪的肺组织的显微镜检查揭示特征型的间质性肺炎，per Collins，J.E.Et al.，″Respiratory Disease in a Swine Herd Experiencing a Reproductive FailureSyndrome″，Proceedings，Minnesota Swine Conference for Veterinarians，P.254，St.Paul.MN(September 10-18，1990)。
因此，本领域确实需要寻求消除或至少改善PRRS影响的有效疫苗。
发明内容
本发明提供疫苗，有效地减少或预防PRRS病毒在猪中引起的疾病，而克服上述问题。
广义地说，本发明包括PRRS病毒的生物纯或病毒纯培养物及其所有突变体和制备及使用这些病毒体的方法。野生型病毒能在猪中引起PRRS，但其经改良的病毒株或非致病性突变体产生抗这些疾病的有效的疫苗。疫苗较佳地包含活的改良或减毒病毒和药学上有效的载体物质。经改良的病毒株以在猿猴肾细胞系繁殖和保存为宜，该细胞系最佳为经20或20次以上传代的非洲绿猴(African GreenMonkey)肾细胞MA-104。
从受感染猪的组织匀浆回收致病性病毒剂，在大量小猪和怀孕母猪上引起PRRS疾病而加以证实。这种分离的病毒剂于1991年7月18日保藏于马里兰州Rockville的美国典型培养物保藏中心，保藏号为ACTT-VR2332。此病毒剂为需要复杂营养的非血凝性包膜RNA病毒。
野生型病毒最好是改良成基本无毒型的：将病毒接种于在合适的培养基中、有血清存在的猿猴细胞的完全或部分层上，在约35-37℃温度下将接种的细胞层进行培养，直至观察到细胞致病效应，在存在血清的维持培养基和合适的传代条件下，将病毒经猿猴细胞系反复传代。
疫苗包括载体剂，如蔗糖明胶稳定剂，它与如上所述制成的经改良的活病毒混合。该疫苗较佳为经局部(粘膜下)途径或胃肠外途径接种免疫猪来预防PRRS。被免疫的猪受野生型病毒攻击后典型地无疾病症状出现。
通过包括以下步骤的方法可以商业规模生产疫苗：制备猿猴细胞系的扩展培养物，用减毒的病毒感染此扩展培养物制备生产培养物，收取生产培养物，将病毒稳定化和冷冻干燥。
具体地说，本发明第一方面提供了一种疫苗组合物，它包括改良型猪生殖和呼吸综合症，即PRRS活病毒和与其混合的药理学上适合的载体剂，所述改良的病毒是在猿猴细胞系培养物中至少传代70次的ATCC-VR2332病毒，当将该改良的病毒给予易患PRRS的猪或其它哺乳动物时，它不会引起PRRS的临床症状，但能诱导产生使哺乳动物对病原型PRRS有免疫力的免疫应答。
在较佳的实施方案中，所述病毒包括ATCC-VR2495。在另一较佳的实施方案中，所述载体剂包括蔗糖明胶稳定剂。在另一较佳的实施方案中，所述病毒传代75次。
本发明另一方面提供了一种生产商品化量的PRRS疫苗的方法，包括以下步骤：
制备ATCC-VR2332病毒的改良型的生产培养物，包括使ATCC-VR2332病毒在猿猴细胞系培养物中传代至少70次来改良该病毒，使得当该改良的病毒给予易患PRRS的猪或其它哺乳动物时不会引起PRRS疾病的临床症状，但能诱导产生使哺乳动物对病原型PRRS有免疫力的免疫应答，从该生产培养物产生改良的ATCC-VR2332病毒；
收获病毒培养物；
添加稳定剂到病毒培养物中；和
将病毒培养物冷冻干燥。
在一个较佳的实施方案中，制备步骤包括用所述病毒感染猿猴细胞，将所得培养物在约35℃至约37℃的温度下培养。
在另一较佳的实施方案中，收获步骤包括将病毒培养物冷冻。
在另一较佳的实施方案中，添加步骤包括将约1份蔗糖明胶稳定剂和约3份病毒培养物混合。
在另一较佳的实施方案中，冷冻干燥步骤包括使水分从病毒培养物的冷冻样品中升华。
在另一较佳的实施方案中，所述培养物包括每剂0.28ml的150,000-500,000个剂量。更佳的是，该方法进一步包括在冷冻干燥步骤前再细分系列体积。
在另一较佳的实施方案中，所述基本无毒型病毒为ATCC 2495病毒。
在另一较佳的实施方案中，所述病毒传代75次。
附图说明
图1是用于制备商业规模PRRS疫苗的方法流程图。
具体实施方式
下面的非限制性实施例阐述了用于实施本发明的最佳方法和物质。
                           实施例1
        PRRS病毒的分离、鉴定和减毒及经改良的活疫苗的制备
A.分离和鉴定
从感染PRRS畜群的小猪得到组织匀浆，此匀浆给无菌小猪和孕母猪鼻内接种始终可引起呼吸型和生殖型PRRS。用经过滤或未经过滤的接种物(0.45、0.22或0.1μm)这样接种的无菌小猪变得厌食和发生类似于PRRS感染的畜群所见损害的显微镜下肺损害。相同的接种亦可引起在PRRS感染畜群中可见到的生殖能力丧失。
从中分离病毒的组织匀浆包括从PRRS感染畜群中的感染小猪得到的肺组织(第1组)和合并的脑-脾-肝-肾组织(第2组)。分离的匀浆组各于4000×g离心25分钟。收集所得的上清液，用0.45μm灭菌注射器滤器过滤。滤得的上清液再合并。用1ml合并的滤得的上清液作接种物，如下所述感染每个细胞系。
将滤过的上清液加到包含如下所述细胞系的生长培养基，得自JRHBiociences的改良Eagle培养基(“MEM”)，和约100μg/ml庆大霉素中。
每个细胞系用75ml塑料瓶进行两份试验。在第1号试验中，将滤过的上清液接种到两个瓶中，每个瓶有下面所列的每个细胞系的完全层。再向这第1瓶中加入约2.5mg胰蛋白酶。所有其它的条件与每个培养瓶相同。
在第2号试验中，将合并的组织匀浆物质接种到含有与第1号试验所用相同的细胞系，但在接种时细胞层只有20-40％融合。培养基还含约10％胎牛血清，这在试验1的培养基中是不存在的。再以1ml量进行接种，将培养物于约34℃培育约7天。
将所有的瓶子于约34℃培育约7天。在约7天末记录结果。在冻融后，取一个样品在同样的细胞系中进行第二次传代。剩下的材料冻在液氮中储存于-60℃。试验1和试验2的结果均列于下面的表1中。
                          表1
                作为病毒宿主的试验细胞系
所用的细胞系                 试验1           试验2
牛鼻甲(BT)                     -               -
猫肾(CRFK)                     -               -
猴(Vero)肾                     -               -
猴(Vero)肺                             -                 -
犬肾(MDCK)                     -               -
猪(PK2A)肾                     -               -
水貂肺                                 -                 -
雪貂肺                         -               -
牛肺                           -               -
水牛肺                         -               -
牛肾(MDBK)                     -               -
猪睾丸(ST)                     -               -
猴肾(MA-104)                   -               +
人直肠瘤(HRT-18)               -               NT
人肺                                    NT               -
+＝CPE效应
-＝无CPE效应
NT＝未试验
试验1中任何受评价的细胞系均未见细胞致病效应(“CPE”)。但在试验2中，MA-104细胞小团变得肿胀，并在沿瓶边的单层中形成“弱孔”。从瓶中分离出液体，放入新的MA-104细胞的瓶中(仍是20-40％细胞层)，然后接着第3次传代。每次传代，明显的CPE变得更强。第3代保留其毒力。将这一代保藏于马里兰州Rockville的美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC-VR2332。
ATCC-VR2332病毒在无菌小猪上始终可引起临床PRRS症状、肺损害和阳性ImF结果。因此，ATCC-VR2332病毒可代表囊膜病毒(Togaviridae)的未鉴定的属。ATCC-VR2332病毒也不是猪的已知病原体，因为对一些猪的常见病毒病原体的特异抗血清既不能中和病毒也不能检出感染细胞中的抗原。
ATCC-VR2332病毒是需要复杂营养的非血凝包膜RNA病毒。ATCC-VR2332病毒生长在连续细胞系中，特别是MA-104和其它猿猴细胞系。ATCC-VR2332病毒在商品化细胞系MA-104上生长成高滴度(107TCID50/1ml)。
ATCC-VR2332病毒含有脂质包膜，如表现为用氯仿处理后失去传染性。脂质包膜也可作为空心颗粒周围的半透明电子环而被看到。在直接电镜(DEM)上PRRS的形态学并无独特性，在含细胞碎片的制剂中极难鉴定。梯度纯化的ATCC-VR2332颗粒的形态学和平均直径62nm非常类似于马动脉炎病毒粒子和乳酸脱氢酶病毒。
据报告，马动脉炎(Arteritis)病毒颗粒大小范围为50-73nm，与ATCC-VR2332病毒的48-84nm颗粒大小相似。在几种ATCC-VR2332颗粒观察到30-35nm的核心，这种核心与关于马动脉炎病毒所描述的核壳体核心相似。因此，在形态学上，ATCC-VR2332最近似于动脉炎病毒组。
根据此病毒在5-溴-2-脱氧尿苷和丝裂霉素C(已知它们抑制DNA和一族RNA病毒(逆转汞病毒Retroviridae)但不抑制其它RNA病毒的复制)存在下持续复制的能力证实ATCC-VR2332病毒中存在RNA基因组。然而，ATCC-VR2332病毒的暂定分类为RNA病毒，与用ImF检出病毒抗原的存在所表明的此病毒在胞浆中复制的观察相一致。而且，干扰DNA依赖性RNA转换的放线菌素D对ATCC-VR2332病毒的复制无效。这些结果表明，ATCC-VR2332病毒复制不需要核功能。
简言之，从颗粒大小、形态学、RNA基因组的存在和其它生物学特性推定ATCC-VR2332病毒在囊膜病毒(Togaviridae)族中。但是，不能确定ATCC-VR2332病毒在这组的某个已知的属。虽然在形态学上ATCC-VR2332病毒与动脉炎病毒非常接近，但不应将此病毒归于特定的属，直至得到关于RNA和蛋白质结构的进一步信息。
B.减毒
从VR2332第三次传代所得物再按如下所述进行两次传代。第五次传代所得物送达外边的实验室纯化。具体地说，在以CsCl梯度(200,000×g离心)纯化然后用1，1，2-三氯-三氟乙烷萃取后鉴定ATCC-VR2332病毒体。用采用抗ATCC-VR2332超免疫血清和金结合物的免疫-金试剂盒标记纯化的病毒。在CsCl梯度中的ATCC-VR2332病毒体的浮力密度为1.18-1.19g/ml。蔗糖梯度始终导致病毒滴度的丢失，而被放弃作为纯化的合适的梯度。
然后使纯化的第5次传代的所得物如下所述再进行65次传代。第70次传代所得物是减毒的，被定为主种子培养物(Master Seed Culture)。这种无毒力的主种子培养物保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC VR-2495。最后，再进行5次传代，得到ATCC VR-2332第75代(如果需要，还可再进行传代)。
ATCC VR-2332病毒的第4-75次传代在宿主组织培养物储存，在市售MA-104绿猴肾细胞系中进行。组织培养储存物制备如下：制备生长培养基，包括购自JRHBiosciences的Eagles极限必需培养基(“MEM”)(编号#200-2041)和购自JRHBiosciences的10％胎牛血清的混合物。将约1ml ATCC-VR2332接种到含50ml这种生长培养基的75cm3瓶中。将此瓶在约35℃至约37℃的温度下保持约7天，进行培养。组织培养储存物瓶通过以如下方式作1∶4分割所得的经培养的培养物扩展而制成。将体积为约50ml的生长培养基倾析。加入10ml胰蛋白酶-依地酸1X除去细胞层，于37℃培养5-10分钟。接着，将细胞从瓶中除去。于270×g离心5-10分钟。倾析上清液，颗粒再悬浮于前述含10％胎牛血清的MEM培养基5-10ml。将细胞置于200ml生长培养基中，然后将其再分配于4个75ml瓶中，每瓶50ml，这样就得到1∶4分割。
将所得培养物保持于35-37℃的温度下直至使用。培养约3-4天后，瓶子发展成完全细胞层被覆，即可使用。
将PRRS病毒ATCC-2332在如上所述制得的MA-104连续细胞系培养基中增殖。将培养基的pH调至7.2，将培养物在约35-37℃温度下进行培养。加入前述传代物的冷冻培养物约1ml到液体生长培养基中，将病毒接种到MA-104细胞上。使病毒吸附到细胞上24小时。
在接种ATCC-2332病毒约24小时后倾析生长培养基，将烧瓶再充入50ml维持培养基，其中以4％胎牛血清取代生长培养基的10％含量胎牛血清。维持培养基的pH为7.6。此培养基更换后，将培养物于35-37℃温度进行培养。使病毒生长直至培养物中约50-60％的MA-104细胞层被病毒破坏。然后将样品冷冻于液氮中，准备传代到另一个烧瓶的MA-104细胞上。
第3-70次传代的交叉反应性也得到证明。用PRRS VR-2332第3次传代病毒免疫猪、家兔和山羊以产生对PRRS的抗血清。用此血清中和从第3至第70代各自传代水平的PRRS病毒。另外，用从以VR-2332 PRRS病毒免疫的小鼠所得的脾淋巴细胞制备两个单克隆抗体(SDOW-12和SDOW-17)。这两个单克隆抗体均显示对如1992.12.的全部美国和欧洲的PRRS分离株起反应。这些单克隆抗体用于鉴定或检出第3-70代PRRS病毒。
C.改良的活疫苗的制备
通过分别搀入主种子培养物(从ATCC VR-2332第70代收获)和从ATCCVR-2332第75代收获物配制两种疫苗制剂。主种子培养物病毒和第75代病毒基本上是无毒力的，即将疫苗施用于猪或易接触PRRS的其它哺乳动物时不引起PRRS疾病的临床症状，但能产生免疫反应，免疫动物抗致病型PRRS病毒。疫苗用常规方法进行制备。在冷冻干燥前加入常规稳定剂和载体。
                         实施例2
                   病毒分离株的体内试验
用从实施例1得到的ATCC-VR2332病毒的第三代有毒力收获物接种两个3日龄无菌小猪。两个小猪均鼻内接种，一个1ml，另一个2ml。将小猪临床观察7天，然后无痛苦处死并作尸检。从每个小猪收集组织样品用于组织病理和病毒剂回收。病理组织学报告确定，感染小猪的肺损害和已知有PRRS的小猪的肺损害相同。如实施例1所述，处理组织样品，然后在20-40％和100％单层MA-104细胞系上用胎牛血清进行培养。再回收病毒剂。
为了证明该病的生殖效应可被复制和确认，还用第3代病毒收获物接种母猪。将两只妊娠约93天的经产母猪进行鼻内接种。这两只母猪分别在妊娠112天和114天分娩，有50％死胎小猪(8/13和6/14死胎/存活)。死胎小猪中7只部分木乃伊化，活产小猪虚弱、不能养壮。按实施例1的方法从死胎小猪的组织回收病毒剂。
从3群已知有PRRS的小猪回收病毒剂。在这些同样的畜群中鉴定对ATCC-VR2332的抗体滴度。
                          实施例3
本研究的目的是确定选用作改良的活病毒疫苗的PRRS病毒(VR-2332第75代)的最低保护剂量。研究的进行是分析两个选定的疫苗剂量(4.0±0.5对数/剂量和2.0±0.5对数/剂量)能控制以有毒PRRS病毒(VR-2332第3代，3.5±0.5对数/剂量)攻击后异常状况发生的程度及对疫苗攻击、非疫苗攻击猪和未攻击(正常)猪进行比较。如前所述，用第75代病毒产生改良的活疫苗。
从农场选用62只血清阴性小猪，分成4个研究组，称为第1、2、3和4组。第1组的21只小猪以2.0ml PRRS疫苗L-4肌肉注射(4.0对数/剂量)进行接种。第2组的21只小猪以20ml PRRS疫苗L-2(2.0对数/剂量)进行接种。第3组10只小猪和第4组10只小猪不进行接种。对照3组和4组小猪圈养在分开的设施中以确保对攻击病毒的敏感性。在试验第28天，第1、2和3组鼻内给予2.0ml PRRS病毒VR-2332第3代进行攻击。第4组小猪不进行攻击。在攻击前31天和攻击后21天中定期观察和监测所有4个研究组的猪。用于评价这些研究的参数是临床症状、体重、体(直肠)温、白细胞计数、病毒分离和血清学检查。疫苗的功效用减少接种猪病毒血症的天数和防止白细胞减少和发热及保持攻击后的正常生长率加以证明。接种前后测量体(直肠)温。第1组的组平均体温在接种后第2天(2DPV)和第3天升高，而第2组在第3天升高。这两组的升温时间短，第1组2天，第2组1天。
接种组无一出现接种后白细胞降低。以前的研究表明，暴露于有毒PRRS病毒会在暴露后72小时内引起白细胞减少。
接种后测量体重增加的结果表明，该处理对接种猪的性能并无不良影响。接种后29天中，任一接种组的体重增加与第3组和第4组的体重增加差异均无显著意义(可信限0.05)。
临床观察大多数项目(除了粪便和鼻之外)几无差异。用双尾t测验比较接种组粪便评分和合并对照组(第3组和第4组)的评分，在0.05可信限水平未见显著差异。第1组和合并对照组之间的p值为0.47，而第2组和合并对照组之间的p值为0.87。第1组和合并对照组之间鼻评分比较的p值为0.41。第2组21只猪中只有2只观察到有临床鼻评分。第1组和第2组全部个体临床评分与合并对照组评分的t测验分析p值分别为0.53和0.74。这些比较证明，接受任何剂量水平的接种动物和未接种的对照组之间没有差异。
从血中分离病毒的结果表明，第1组100％(21/21)变阳性，而第2组90％(19/21)试验阳性。接种后整个过程中，对照组3和4保持阴性。免疫过氧化酶试验(IPT)结果提供了类似情况，其中第1组变成血清学阳性，第2组90％阳性。这两组在接种后21天中血清中和抗体均保持阴性。两组均在接种后第29天测定中和抗体(攻击后0天-见攻击后结果)。对照组直至攻击时两种试验方法均保持血清学阴性。
接种后观察分析表明，用试验中的任一疫苗剂量处理均未见不良反应。然而，高剂量确实在血清学上转化全部猪(21/21)，而低剂量转变19/21即90％。
用有毒PRRS病毒攻击后，在接种组和未接种组监测的临床参数提供了两种疫苗试验剂量有保护作用的证据。测试病毒血症的结果提供清楚的证据表明该疫苗的益处。攻击后第3、5和7天，未接种组(第3组)100％病毒血症，而在第1组(3.65对数/剂量)和第2组(1.85对数/剂量)同样观察天数的病毒血症发生率分别为15、5和10％及30％、20％和15％。而且，第1组攻击后第9天和第2组攻击后第13天，从血样中未回收到病毒，而第3组的30％在攻击后第19天仍为阳性。
监测(直肠)体温的结果也提供了疫苗功效的证据。在21天观察时期中，第3组的平均体温在第5天时超过104°F。第2组和第3组的平均体温不超过104°F。此外，第3组在攻击后第2天和攻击后第6天两天的平均体温超过104.5°F。
攻击后，白细胞计数的结果表明，第3组出现白细胞减少，攻击后第5天降低16％。接种组在整个观察期未见大于6％的降低。
攻击后21天中监测各处理组的增重显示两种剂量水平的接种均保持正常的生长率。两个接种组，第1组和第2组平均增重百分率分别为74和73。第4组，正常对照组动物组平均体重增加75％。相反，第3组，未接种-攻击对照组的组平均体重增加为69％。用双尾t测验，在0.05可信限水平得出这与第1、2和4组有显著差异(p＝0.009)。
尽管临床试验的结果在证明功效上可能不作界定的，但它们仍证实了疫苗的益处。在攻击后，第1、2和3组显示呼吸症状发生率的明显增加。第1、2、3组各动物每天平均评分分别为0.39/0.64h和0.53。这证明，较高剂量(3.65/剂量)的益处高于较低剂量(1.85对数/剂量)和未接种组。尽管攻击后粪便观察是明显的，但与接种后和攻击前的观察差异不显著(用0.05可信限)。因此，本试验中，有毒PRRS病毒的攻击看来对下部胃肠道无影响。总之，其余的临床观察未显示作为攻击结果的明显变化。第1组鼻和嘴的参数，一只猪有全组鼻评分的25％，另一只猪有嘴项目组内评分的94％。同样地，第2组中，一只猪有全组鼻评分的22％，另一只猪有嘴项目组内评分的43％。总的说来，关于这两个参数的攻击后临床观察的发生率与接种后观察无显著差异。关于第3组的这两个临床参数可得出类似的结果。第4组保持全身相对正常。
在观察时间末，将所有猪无痛苦处死，对于牵涉病理学的体征进行肺大体观察。第3组60％(6/10)显示可见的变化。相反，第1组10％和第2组19％看来有可见的变化。与第4组(正常对照组)比较时，第1组80％、第2组81％和第3组30％被描述为无可观察到的差异。
从肺组织进行病毒分离。从第1组猪的肺组织未分离到病毒。第2组21只猪中一个样品病毒阳性。从第3组10个样品中的3个分离出病毒，而从第4组未分离出病毒。
从这些结果得到的结论是：含VR-2332第75代的改良活PRRS病毒疫苗的两个剂量水平(3.65对数/2.0ml剂量和1.85对数/2.0ml剂量)对于对抗在接种后29天以有毒PRRS病毒攻击的3-5周龄猪的呼吸疾病上是有效的。本研究表明，较佳的最低限度保护剂量为3.65对数/2.0ml剂量。用几种参数，如病毒血症、临床呼吸体征、肺病理学改变和从肺组织的病毒分离，评价疫苗剂量效应几种高剂量的动物受到较好的保护。接种3.65对数/剂量的21只猪全部在接种后21天血清转化。与之相比，接种低剂量的21只猪中只有19只在接种后29天(攻击后0天)有血清转化。
                          实施例4
本实施例中，研究了用实施例1和3所述PRRS第75代改良的活疫苗的免疫时效。育肥猪通常在6月龄时达到屠宰体重。本实施例中，在约1月龄(4-5周龄)时将猪接种，然后在接种后110天进行攻击。该免疫时期覆盖正常育肥猪预期平均生命期的大部分。
购得62只PRRS血清阴性小猪，分成4个研究组，称为第1、2、3和4组。第1组21只猪接种每剂含3.32对数的2.0ml PRRS-MLV第75代疫苗。第2组21只猪接种每剂含1.64对数的2.0ml这种疫苗。第3组和第4组10只猪不接种，圈养在分开的设施内以保持血清阴性状态。在实施例3所述研究末，将用于本实施例的第2组猪从研究中取出，无痛苦处死，因为已有结论是最低限度保护剂量为每剂3.68对数而非1.87对数。第1组和第3组在接种后(DPV)110天用VR-2332第3代病毒(3.9对数/ml)进行鼻内攻击。第4组猪不进行攻击。攻击后(DPC)21天监测猪的临床症状、体重变化、(直肠)体温、白细胞计数、病毒血症和血清学。接种后110天的保护免疫通过与未接种的受攻击猪相比，不发生病毒血症、防止白细胞减少和发热及改善体重增长而加以证实。
接种后，检测受接种猪对疫苗的任何不良反应。检测的参数包括(直肠)体温、白细胞计数、体重增长、临床症状、血清学和病毒血症。
从-1DPV至+4DPV每天检测(直肠)体温，在作为疫苗结果的处理组的体温上，组平均值分析未显示明显的增高。第1组接种组猪与接种前平均值比较，最多升高0.2°F。
在接种疫苗前后的各时间点检测白细胞数。第1组与接种前相比，平均在4DPV降低14％。第1组计数上的其它所有降低小于9％。其余组(3和4)在接种后观察期间WBC计数上没有任何大于11％的降低。从0DPV至28DPV体重增加的结果在第1组体重变化显著区别于第4组这一点上是相抵触的(p＝0.02)。对此差异尚无解释，因为检测到的其它参数并未显示第1组和第4组之间大的差异。
接种后临床评分的统计学分析表明，在接种组和未接种对照组之间并无差异。虽然粪的评分有最高发生率，在第1组和第3组和第4组之间没有显著差异，分别为p＝0.75，p＝0.59。同样，临床鼻评分亦无显著差异。第1组和第3组之间比较，p值大于0.8。第1组和第4组之间比较，p值为0.02，第4组有较高的发生率，其它临床参数无一显示明显的发生率。
接种后血清学结果表明，疫苗剂量成功地免疫了受处理的动物。14DPV时，用IPT试验得到第1组48％试验阳性。在21DPV的7天后，100％处理组IPT试验阳性。直至28DPV，第1组血清中和(SN)抗体保持阴性。第1组所有猪直至110DPV进行攻击时两种试验均保持血清学阳性。第3组和第4组猪在接种后整个时期均保持血清学阴性。
接种后病毒分离结果表明，处理组100％被成功地接种。这支持前述血清学数据。第3和第4两个对照组在接种后整个观察期均保持阴性。
接种后观察表明，处理对于受处理的动物并无任何不合需要的严重影响，对照组动物保持无PRRS病毒。
在用有毒PRRS病毒攻击后，检测各种临床参数以评价免疫处理的益处。将接种组(第1组)与未接种-攻击组(第3组)和未接种-未攻击组(第4组)进行比较。
攻击后血清学结果证明，攻击水平在第3组成功地刺激了免疫反应。第1组在用有毒病毒攻击后无回忆抗体应答。血清学结果表明，第4组在整个21天观察期保持阴性。
最惊人的发现是病毒分离结果。在3、5和7DPC，第3组100％试验阳性，迟至21DPC，该组20％试验阳性。第1组在0DPC时为阴性，在整个21天观察期保持如此。一个预料不到的结果是第4组血样中PRRS病毒的阳性分离。从第4组的第一次病毒阳性分离出现于15DPC。这一观察与后面将讨论的其它参数相关。即使第4组接触到PRRS病毒，收集到的数据应仍然被认为是有效的，因为在后1/3观察期发生明显的暴露及主要事件间隔从1DPC至11DPC。在这时间内进行了第1组和第3组之间的大部分比较。最重要的结果是感染的明显制止，见于疫苗处理组未分离出病毒。
攻击后临床评分的重要性在评价疫苗处理的效应上看来是有限的。虽然在第1组和第3组观察到临床呼吸体征，但这些体征不是平均分布的。在第1组，2只猪占该组总分的88％，类似的，在第3组，2只猪占该组总分49的71％。第1组粪便总分与其它组比较是有统计学意义的。然而，21只猪中只有9只观察到这一项目有任何临床体征，9只猪中，3只猪占该组总分的55％以上。无粪便评分分布到第3组，第4组只有1只猪观察到具有粪便的临床体征。鼻和嘴的临床评分不与其它参数如呼吸相联系则可能其重要性有限，鼻观察的发生率在第1组和第3组都是有限的，每组低于50％有评分。嘴观察的评分发生率高，第3组为90％，第1组为76％。这两组嘴临床评分之间无统计学意义上的差异，p＝0.45。观察到其它所有临床参数都正常。
在攻击后观察期，第1组平均长42.62磅。第3组平均体重增长36.5磅，第4组增长平均37.1磅。第3组和第4组之间没有显著差异，p＝0.9，这可能是第4组偶然暴露于PRRS病毒之故。但是，这并不减弱第1组和第3组之间数据的比较，因为这两组间有统计学意义的差异。在一个时期内评价猪的性能提供了评价这些猪整体健康的极好工具。这一数据与其它参数一起，表明受试疫苗面对实验性攻击的益处。
攻击后体温证明受试疫苗处理面对实验性攻击的益处。攻击对照组，第3组，有8天组平均体温比攻击前平均值升高至少1°F。第1组任何时候都没有组平均体温升高1°F的。虽然第4组沾染了PRRS病毒，该组平均体温并未升高1°F。这是因为病毒的组内播散是逐渐的，与实验性攻击相比并不完全被包围。然而，从15DPC至21DPC各只猪体温的分析表明，第4组猪在暴露于PRRS病毒后实验性体温升高。第1组和第3组各只猪体温的分析使疫苗处理的益处显得更为突出。第3组10只猪中10只连续两天或更多天体温升高1°F。相反，第1组并无可比的结果。
疫苗效应的进一步证据被攻击后WBC计数结果所证实。在攻击后，第1组平均WBC数降低。攻击后，第1、3、5、7和9天，分别出现14％、19％、14％、21％和13％的降低。第3组平均降低15％、37％、43％、31％和28％。第4组，未攻击对照组，在同一时期降低11％-17％。各猪评分的分析进一步证实疫苗处理所提供的保护。第3组10只猪中10只连续2个或更多试验日WBC计数降低25％或更多。第1组连续2个试验日21只中2只白细胞减少25％或更多。第4组受感染猪与第3组的结果相似。当病毒播撤发展到全组时，白细胞减少的发生率变得很明显。在15DPC和21DPC之间，该组的50％在连续的试验日WBC计数降低25％。这些结果表明，接种疫苗的猪并不发生未接种猪所发生的白细胞减少。
21DPC的肺肉眼(大体)观察分析分为肺实质和肺胸膜评分，然后合并为总的肺评分。对于非攻击对照组偶有PRRS病毒暴露的，此观察的分析较难进行，因为不能显现出阴性基线。因此必须限制第1组和第3组之间的比较，因为这两组在同一时间暴露于同样的病毒下。在严重程度上第3组的实质评分较大，10只猪中4只个体评分为200。第1组的最高评分为100。用疫苗处理后，该处理组受侵袭的百分率和实质损害的严重程度降低。同样，疫苗处理降低了胸膜损害的发生率和严重程度。第1组24％(5/21)胸膜评分100；而第3组50％(5/10)胸膜评分100。第1组的大部分猪(9/21)偶然地胸膜评分为15或更少。肺评分与呼吸疾病之间不存在相关性。例如，第3组1只猪的临床呼吸评分为23，肺总评分为287.5；而第3组另一只猪临床呼吸评分为0，肺总评分为300。在肺评分和临床呼吸评分之间缺乏相关性还有一些例子。无论大体观察对分析疫苗的有益效应是否可靠，结论可以是处理组(第1组)较少猪有损害，且这些损害的严重程度降低。
总之，用于评价疫苗面对接种后110天的实验性攻击的效应的很多参数互相间相关性很好。在病毒血症是主要证据的时期(3-9DPC)，出现明显的白细胞降低和体温升高。在攻击时，猪约为20周龄或比实施例3中受攻击的猪大12周。本研究中见到的很多临床症状更为严重。例如，本研究中(直肠)体温升高8天，而与免疫原性研究中为5天。本研究中未接种-受攻击对照组(组3)白细胞减少的严重程度比免疫原性研究的攻击对照组更令人注目。在前一个研究中，攻击对照组WBC计数实验性降低43％-27％(3-9DPC)。在免疫原性研究中，攻击对照组WBC计数2-9DPC实验性降低15-21％。免疫原性研究的接种-攻击组在攻击后期间(1-14DPC)检出病毒血症的天数在有可能的110天中为0，与其相比，本研究中攻击对照组是110天中的45天。因此，临床体征严重程度的增加不完全是由于病毒血症时期的增加。
本研究的攻击后结果证明，剂量水平为3.32对数/2.0ml的PRRS-MLV疫苗的接种对于在接种后110天以有毒PRRS病毒攻击提供了保护。它们是：(1)在攻击后21天观察期间，接种动物病毒血症完全阴性；(2)除了呼吸、粪便、鼻和嘴临床体征少量出现外，接种猪以临床体征观察是正常的，(3)接种猪的增重明显大于未接种-受攻击猪的增重量，(4)接种猪无显著的体温升高；(5)接种猪未出现明显的WBC计数降低；(6)接种猪实质和胸膜损害的出现和严重程度较低。
                         实施例5
在本实施例中，用检测实施例1和3所述PRRS-MLV第75代疫苗以测定免疫的开始。在研究开始前7天，用免疫过氧化酶试验(IPT)测试35只猪的PRRS抗体，用在MA-104细胞上进行病毒分离以确定血流中PRRS病毒的存在。在试验0天，第1组10只猪肌肉接种2.0ml PRRS-MLV第75代疫苗。试验第7天，第2组10只猪以同样方式进行接种。第3组10只猪和第4组5只猪保持在分开圈养，但在同样的环境条件下，作为非接种的同期对照组。在试验第14天，第1、2和3组猪经受攻击。由有毒PRRS病毒(VR-2332，第3代，3.7 log10病毒/1.0ml)组成的攻击接种物鼻内给予(2.0ml/猪)。第4组的猪保留不受攻击。所有猪监测10天呼吸疾病的临床体征，在研究结束时将所有猪无痛苦处死以评价肺损害。
在攻击时，第1组的猪用免疫过氧化酶测得血清学阳性，但不是血清中和活性。相反，所有其它猪(包括第2组)两种方法都是阴性。第2组猪50％在7DPC时IPT试验阳性，100％在10DPC时试验阳性。第3组猪在10DPC时IPT试验阳性。第1和第2组各有一只猪分别在10DPC和7DPC时显现SN活性。SN结果在p＝0.05水平无显著性差异(p＝0.05)。本研究的结果证明，即使猪在攻击时血清学阴性或无血清中和活性，作为处理的结果，仍可认为得到保护。保护可能并不直接与体液免疫相联系。细胞介导的对以改良活疫苗接种的免疫应答在保护有毒株攻击上可能起主要的作用。
实施例4中，攻击后无病毒血症是证明受接种后保护的重要证据。但是，在本研究中接种和攻击之间的短时间内，接种动物没有清除接种后病毒血症。而且，由于攻击是同源攻击，因此不能区分攻击病毒和疫苗病毒。第1组4只猪和第2组1只猪在从3DPC至9DPC的至少一个测试点上病毒血症测试阴性。第3组在同样的时间阶段100％病毒血症测试阳性。
与前面的实施例不同，本研究中见到明显的临床呼吸体征的表现。第3组有9/10动物一天或几天呼吸困难(平均天数等于3.6)。第1组和第2组一天或几天呼吸困难的动物数分别为1和0(p＜0.001)。鼻临床体征的发生率与呼吸体征的发生率相似。第3组10只中8只在一天或几天中有鼻临床体征。临床体征的平均持续时间为3.1天。相反，第1组和第2组平均持续时间分别为1.3天和0.1天，有显著差异(p＜0.001)。其余临床参数的出现是极平常的。
两个接种组体重增加均大于攻击对照组。第2组在10天观察期中增加平均10.6磅，而第3组为7.8磅(p＝0.01)。第1组平均增重为9.6磅，与第3组相比无显著差异。此组有两只最小的猪，在试验日0分别重7和12.5磅，在攻击时分别重6和12磅。除去这两只最小猪的该组平均增重为12.3磅，与第3组有显著差异(p＜0.001)。这两只猪的增重率低可能是因为它们不能与组中较大的猪竞争。这些猪在攻击后观察期还有腹泻。10天期间第4组猪体重平均增加15.2磅。此年龄的猪预期每天平均增重在1.0至1.5磅之间。这些结果证明，攻击前7和14天的接种处理提供保护，使猪达到预期的生长率。
攻击后，第3组猪有持续平均4.6天的超过攻击前1°F的体温升高。第1组和第2组猪有可比的体温升高的平均天数分别为0.5和1.1天(p＜0.001)，20只接种猪中只有一只连续2天升高1°F，相比之下第3组10只中有8只。接种组和对照组之间统计学差异为p＜0.001。这些结果证明，第1组和第2组猪的疫苗处理预防了因暴露于有毒PRRS病毒所致的发热的发生。
第3组猪在3、5和7DPC白细胞计数显著降低。这些结果与同一时期这些动物的体温升高紧密平行。接种组的猪有持续1-2天的轻度白细胞减少，然后回升到攻击前的值。接种猪的这些值与攻击对照组有显著差异(p＝＜0.001)。这些结果着重于攻击前7或14天的疫苗处理通过降低白细胞减少的程度和缩短时间而提供的保护水平。
攻击前14天或7天的疫苗处理降低肺损害的严重程度。两个接种组均与攻击对照组有显著差异(p＝0.01)。接种的评分类似于第4组，正常对照组。第3组的平均肺评分为97.1，与之相比，第1组和第2组分别为9.3和7。后两组所观察到的损害被认为是正常的、在常规饲养在健康猪上预期会出现的。
本研究的结果证明，用改良的活病毒疫苗接种7天内刺激保护性免疫反应。接种组猪在实验性攻击后在体温反应、体重增加、白细胞减少、肺损害和临床体征上观察到与未接种-受攻击猪的显著差异。
                         实施例6
在本实施例中，将两组(A和B)100只来自PRRS阳性畜群的3周龄断奶猪用实施例1中PRRS-MLV传代70代的疫苗或安慰剂(无菌水)进行接种。监测体温、增重和注射部位反应，对每种处理后外余的30只猪检测其不良反应。这些猪和各个处理组的其余70只猪在处理后还观察28天全身健康情况。本研究的结果证明，当疫苗恰当地用于PRRS阳性畜群时不引起副作用，是安全的。
接种前(-2DPV)直肠温度表明，用于这一试验的猪不是正常健康猪。在试验日-2和-1时，A组的体温明显高于B组的体温(p＜0.05)。在试验的0、1、2和3日，两组间不存在显著差异(p＜0.05)。这些结果表明，用改良的活PRRS疫苗接种并不加重引起已存在的体温升高的状况。
任何一组都没有一只猪在接种部位有任何处理后反应。这些结果进一步证明该疫苗以合适的方式接种时的安全性。
从试验日-2至27的29天期间内，A组30只猪增重平均21.02磅，B组29只猪增重平均18.18磅。差异是显著的(p＜0.05)。因为本试验是面对PRRS活性感染而进行的，因此结果表示安全性及有效性。
临床观察的结果表明，疫苗显著地降低一些临床参数的发生率。降低的参数包括外观从62到6、粪便从48到24、眼从162到89、鼻从30到0、嘴从30到0、食欲从91到13、治疗从37到14、死亡从5到0。第1组接受处理数的降低与B组相比具有显著意义(p＜0.05)。临床体征的降低提供进一步的证据表明，改良活PRRS疫苗用于与PRRS病毒有关的临床发作时是安全的。
总之，本疫苗合适地用于患有与PRRS病毒感染有关的实验性活动性临床疾病的畜群时被证明是安全的。本疫苗不加剧临床症状，无论它们与PRRS病毒有关还是与人们所知的存在于这种猪的处理的继发病原体有关。在此试验部位存在的情况下，这些结果还显示在接受疫苗的处理组上的有益效应。
                          实施例7
在本实施例中，用低剂量ACTT-2332第75代疫苗(ACTT VR-2495)给20只无特别病原体的、雌雄兼用的Dutch landrace饲养的5周龄小猪接种，测定其对Lelystad病毒(LV)播散的作用。LV野生株据信在使猪易感染引起表现不良、死亡率高的继发性呼吸感染上起重要作用。本实施例提供有关疫苗对欧洲抗原型LV病毒传播的效应的资料。
将猪分成10只一组的两组，一个试验组，一个对照组。试验组的每只猪肌内接种含约103TCID50的ATCC VR2332第75代疫苗的稀释疫苗2ml。6周后，每组5个动物鼻内接种野生型LV欧洲株(编码CDI-NL-2.91，Ter Huurne，在猪肺泡巨噬细胞上的第5传代)进行攻击，攻击剂量采用105.3TCID50/20ml。1天后，将受攻击猪放回它们的圈中。
本试验检测是否、什么时候、多少接种和未接种猪显示临床疾病或产生病毒血症，及是否和多少接触受攻击猪的同圈猪被Lelystad病毒感染。然后将接种组和对照组的感染定量，并计算出接种组和对照组中Lelystad病毒的传播率。为使接种成功，接种组中疾病和病毒血症的严重程度和持续时间及传播率必须小于对照组。
在低剂量和异源攻击这样的极端情况下进行试验的本研究证明了疫苗的保护价值。
疫苗减轻攻击后疾病的临床体征。它明显地降低攻击后的平均直肠温度；它明显地减少受攻击猪病毒血症的天数；及明显地降低受攻击猪病毒血症的高度。此外，虽然在接种猪和未接种组的所有猪中都出现从直接受攻击和接触受攻击猪的传播，但野生型LV在接种组和未接种组之间的传播有显著的差异。
因此，用低剂量美国抗原型PRRS疫苗ATCC VR-2332第75代在传递对欧洲抗原性野生型Lelystad病毒攻击的保护作用上有效。
                          实施例8
                    商业规模的疫苗生产
图1描绘用于从实施例1生产商业规模的改良的主种子培养物活病毒的流程图。工序10开始于步骤P12，所有容器的灭菌。灭菌较佳为用放射法，但也可用热或化学方法进行。容器的类型包括接种烧瓶，如75-150ml、5升烧瓶，培养滚瓶和钢制空气搅动生物反应瓶。
步骤P14包括制备宿主MA-104细胞的扩展培养物。将MA-104细胞系第58代储备液储存在液氮中，用于提供给宿主细胞至第78代病毒培养物。储备MA-104培养物在约75ml至150ml体积的含50-150ml培养基的烧瓶中生长。培养基较佳包括与10％牛或胎牛血清和约30μg/ml新霉素混合的MEM。灭菌烧瓶和培养基较佳为接种1ml前代MA-104培养物，于约35-37℃培养3-7天。
储备细胞培养物的扩展较佳是从150ml烧瓶到约400-600ml培养基作1∶5扩展(体积/体积)。于约35-37℃培养约4-7天后，可将此400-600ml培养基传代培养到充填培养基的5升烧瓶中。或者，可将接种物以1∶3.4比例施加于有约670-850cm2生长面积和150ml培养基的滚瓶培养物中，然后将其以约1∶9至1∶11的比例传代培养到其它滚瓶培养容器中。将传代培养物于约35-37℃培养约4-7天。
步骤P16包括制备病毒感染的MA-104细胞的生产培养物。将步骤P14的扩展培养物典型地进一步以约1∶3至约1∶5(体积/体积)的比例扩展到较大体积的生物反应容器中，生产容器可包括如装有气升式搅拌器、温度控制器和pH控制器的5升扩展培养瓶或40升不锈钢培养器。将容器充填适当量的生长培养基，接种MA-104细胞，于约35℃培养4-7天，并以实施例1的主种子培养物病毒感染。此病毒以CPE测得滴度至少约106TCID50/ml为佳，可至少以0.1-10ml/100ml培养基的比例加到生产容器培养基中。生产培养物用此减毒病毒感染后即于约35℃至约37℃培养2-3天。
步骤18包括在感染后培养期后收获步骤P16的生产培养物。批量收获的合适时间应当根据CPE观察来决定，以约10％肉眼变化(完整细胞和细胞层降解)或10％pH变化为指标。在层流罩下通过倾倒到灭菌容器中或在正压下通过密闭的收获系统收获步骤P16的生产培养物。将批量收获的病毒冷冻、储存于约-40℃至约-70℃的温度下。
如果需要，取等分样品用于质量控制测定。每一批量收获物的样品在巯基乙酸盐和大豆酪蛋白消化培养基中进行测试，将其在分别在约36℃和20℃各培养14天。如果用CPE测试表明滴度至少约为105TCID50/ml，则将此种子病毒用于给其后的培养物大量移种。不满意的材料用5％次氯酸钠灭菌24小时或用高压灭菌器灭菌。
步骤P20包括使步骤P18中所得的批量冷冻病毒稳定化和冷冻干燥。将批量冷冻病毒融化，较佳为与药理学上相容的稳定剂，如常规的蔗糖明胶稳定剂，以约3份融化的主种子培养物与约1份稳定剂的比例进行混合。可加生理盐水以调整病毒终浓度。
然后将混合物分成每份约0.28ml液体的剂量分割物(subvolume)，每一剂量包括约0.20mlPRRS培养物，每剂最低限度滴度为104.9TCID50。此处注意到得自步骤P16、P18和P20的经稳定的生产培养物的优选量将足以得到150,000和500,000之间的稳定剂量。作为例子，25个剂量包括约7.0ml分割物。将这些分割物加塞冷冻，较佳为在液氮中冷冻。当温度升高到最高约30℃时，将干燥室放在真空下，将分割物最大限度放置18小时，使样品中的水分升华。
步骤P22包括连续监测从步骤P20得到的疫苗产物。将最终样品的容器或一系列单批PRRS疫苗作斑点棋盘检测以确保水分含量低于5％。水分含量大于4％或低于1％的样品以6个月间隔作效应测试。作为安全性测试，用相当于10个剂量的疫苗量给豚鼠注射，观察21天以上临床反应的不良体征。
将VR-2332病毒还与实施例1所述的减毒相平行地进行冷适应。这是为了发展防止受感染动物病毒脱落的疫苗株。这样的冷适应是在31-35℃温度进行连续传代而进行的。所得的病毒株也刺激免疫反应。

Claims (13)

1.一种疫苗组合物，它包括改良型猪生殖和呼吸综合症活病毒，即PRRS活病毒，和与其混合的药理学上适合的载体剂，所述改良的病毒是在猿猴细胞系培养物中至少传代70次的ATCC-VR2332病毒，当将该改良的病毒给予易患猪生殖和呼吸综合症的猪或其它哺乳动物时，它不会引起猪生殖和呼吸综合症的临床症状，但能诱导产生使哺乳动物对病原型猪生殖和呼吸综合症有免疫力的免疫应答。
2.如权利要求1所述的组合物，所述病毒包括ATCC-VR2495。
3.如权利要求1所述的组合物，所述载体剂包括蔗糖明胶稳定剂。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述病毒传代75次。
5.生产商品化量的猪生殖和呼吸综合症疫苗的方法，包括以下步骤：
制备ATCC-VR2332病毒的改良型的生产培养物，包括使ATCC-VR2332病毒在猿猴细胞系培养物中传代至少70次来改良该病毒，使得当该改良的病毒给予易患猪生殖和呼吸综合症的猪或其它哺乳动物时不会引起猪生殖和呼吸综合症疾病的临床症状，但能诱导产生使哺乳动物对病原型猪生殖和呼吸综合症有免疫力的免疫应答，从该生产培养物产生改良的ATCC-VR2332病毒；
收获病毒培养物；
添加稳定剂到病毒培养物中；和
将病毒培养物冷冻干燥。
6.如权利要求5所述的方法，其中制备步骤包括用所述病毒感染猿猴细胞，将所得培养物在35℃至37℃的温度下培养。
7.如权利要求5所述的方法，其中收获步骤包括将病毒培养物冷冻。
8.如权利要求5所述的方法，其中添加步骤包括将1份蔗糖明胶稳定剂和3份病毒培养物混合。
9.如权利要求5所述的方法，其中冷冻干燥步骤包括使水分从病毒培养物的冷冻样品中升华。
10.如权利要求5所述的方法，其中所述培养物包括每剂0.28ml的150,000-500,000个剂量。
11.如权利要求10所述的方法，进一步包括在冷冻干燥步骤前再细分系列体积。
12.如权利要求5所述的方法，其中所述基本无毒型病毒为ATCC2495病毒。
13.根据权利要求5所述的方法，其中所述病毒传代75次。
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