HU223763B1 - A "rejtélyes sertésbetegség" elleni vakcina, eljárás ennek előállítására, és alkalmazása - Google Patents
A "rejtélyes sertésbetegség" elleni vakcina, eljárás ennek előállítására, és alkalmazása Download PDFInfo
- Publication number
- HU223763B1 HU223763B1 HU9802493A HUP9802493A HU223763B1 HU 223763 B1 HU223763 B1 HU 223763B1 HU 9802493 A HU9802493 A HU 9802493A HU P9802493 A HUP9802493 A HU P9802493A HU 223763 B1 HU223763 B1 HU 223763B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- virus
- group
- prrs
- culture
- vaccine
- Prior art date
Links
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 title claims abstract description 95
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 title claims description 14
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 81
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 130
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 12
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 9
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 7
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims 2
- 230000000680 avirulence Effects 0.000 claims 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 18
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 abstract 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 65
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 29
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 27
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 18
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 16
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 16
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 16
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 15
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 14
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 14
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 13
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 13
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 13
- 244000144980 herd Species 0.000 description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 12
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 12
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 241000710788 Lelystad virus Species 0.000 description 9
- 235000021053 average weight gain Nutrition 0.000 description 9
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 9
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 4
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 208000012153 swine disease Diseases 0.000 description 3
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710803 Equine arteritis virus Species 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 2
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- 230000000578 anorexic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000001492 haemagglutinating effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 238000009021 pre-vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 1,1,2-Trichlorotrifluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(Cl)Cl AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000237536 Mytilus edulis Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010036595 Premature delivery Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010047897 Weight gain poor Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 201000011165 anus cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 206010003230 arteritis Diseases 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 208000003836 bluetongue Diseases 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000003750 lower gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 208000027405 mouth symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 235000020638 mussel Nutrition 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 208000002254 stillbirth Diseases 0.000 description 1
- 231100000537 stillbirth Toxicity 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 210000004916 vomit Anatomy 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10051—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/815—Viral vaccine for porcine species, e.g. swine
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
A találmány sertés-szaporodási és -légzési szindróma (PRRS)-víruselleni, lényegében avirulens, élő vakcinára vonatkozik, amely asertéseket hatékonyan immunizálja a betegség amerikai és európaiformái ellen. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a vakcinaüzemi méretű előállítására, valamint a vakcina alkalmazása is. ŕ
Description
A találmány sertés-szaporodási és -légzési szindróma (PRRS)-vírus elleni, lényegében avirulens, élő vakcinára vonatkozik, amely a sertéseket hatékonyan immunizálja a betegség amerikai és európai formái ellen. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a vakcina üzemi méretű előállítására, valamint a vakcina alkalmazása is.
HU 223 763 Β1
A leírás terjedelme 14 oldal (ezen belül 1 lap ábra).
HU 223 763 Β1
A találmány az immunológia és virológia területére, közelebbről vakcinára vonatkozik, amely egy patogén virális izolátumból származik. Még közelebbről a vírus patogén formáját vakcinák előállítására szokásosan alkalmazott eljárásokkal avirulens formává módosítottuk vagy gyengítettük, amely egy pusztító, új sertésbetegség ellen alkalmazható.
Egy új sertésbetegség, amelyet rejtélyes sertésbetegségnek, sertésterméketlenségi és -légzési szindrómának, kékfül-betegségnek, vagy sertésszaporodási és -légzési szindrómának (PRRS) neveznek, súlyos veszteségeket okoz az Amerikai Egyesült Államok és Kanada sertésállományában. Egy hasonló betegség Európa nagy részében is megjelent. A betegség két formában manifesztálódik, az egyik terméketlenséget okoz, míg a másik fiatal sertésekben nehézlégzést okoz. A betegség szaporodást befolyásoló formáját Keffaber K. K. írta le [„Reproductive Failure of Unknown Etiology”, American Association of Swine Practitioners Newsletter 1, 109 (1989)].
A betegség szaporodást befolyásoló megnyilvánuló formájának legfontosabb klinikai szimptómái a spontán késői vetélés, koraszülés (amely az összes szüléseknek 20-30%-át is kiteheti), és mumifikált magzatok ellése, halvaszülés vagy beteges malacok ellése. Az ilyen klinikai tünetek rendszerint 4-16 héten keresztül, vagy még hosszabb időn át is megfigyelhetők a kondában. Az érintett alomban lévő, halva született magzatok gyakran a mumifikálódás korai stádiumában vannak, amit a bőr sárgásbarna elszíneződése és a post-mortem autolízis bizonyít. Néha látható a magzat koponyájának kupola alakú torz fejlődése is. Az anyadisznó fertőzése észrevétlen maradhat, vagy néhány napon át tartó rosszabb általános állapotban manifesztálódhat. így például a kocák étvágytalanok, és testhőmérsékletük a normálisnál vagy magasabb, vagy alacsonyabb. Ellési szakaszban a kocák depressziót, letargiát mutathatnak, lázasak lehetnek, és alkalmanként hányhatnak. Az érintett kondában az összes malac 75%-a is elpusztulhat. A betegség gazdasági következményei ezért igen súlyosak.
A betegség légzést befolyásoló formája olyan klinikai tüneteket vált ki, amelyek 3-8 hetes malacokban a legkifejezettebbek, de már megfigyelték ezeket a tüneteket a fertőzött kondában bármely korosztályhoz tartozó sertésekben. A megbetegedett malacok lassan nőnek, szőrzetük durvábbá válik, nehézlégzést (thumping) és megnövekedett pusztulási arányszámot (ami elérheti a 80%-os pusztulást is elválasztás előtt) mutatnak.
A betegség légzési formájában szenvedő malacok durva és mikroszkopikus lézióinak előzetes vizsgálata során nyert tapasztalatok arra utalnak, hogy a betegség fő klinikai jellemzője a mikroszkopikus tüdőlézió. A betegség kifejezetten légzési tünetei ellenére azok a tüdők, amelyekben másodlagos bakteriális fertőzés nem bonyolítja a helyzetet, vagy durván normálisnak tűnnek, vagy enyhe, diffúz, sárgás-szürkés elszíneződés látszik a tüdő felületén. Azonban a PRRS-betegségben szenvedő malacok tüdőszövetének mikroszkopikus vizsgálata az intersticinális pneumonitis jellegzetes képét mutatja [Collins J. E. és munkatársai: „Respiratory Disease in a Swine Herd Experiencing a Reproductive Failure
Syndrome”, Proceedings, Minnesota Swine Conference fór Veterinarians, 254. oldal, St. Paul, MN (1990. szeptember 10-18.)].
A W093/03760 számú szabadalmi publikációban a rejtélyes sertésbetegség (Mystery Swine Disease, MSD) megelőzésére alkalmazható vakcinát ismertetnek, amely MSD-vel fertőzött sertés szövetéből származó inaktivált vagy gyengített fertőző anyagot tartalmaz.
Fentieknek megfelelően valóban szükség van hatékony vakcinára, amellyel a PRRS hatásai megszüntethetők, vagy legalábbis enyhíthetők.
A fent vázolt problémákat a találmány olyan új vakcinával oldja meg, amely hatékonyan csökkenti vagy megelőzi a PRRS-vírus által sertésben okozott betegséget.
A találmány tárgya tehát vakcinakészítmény, amely élő sertés szaporodási és légzési szindróma (PRRS)vírust tartalmaz módosított és lényegében avirulens formában, gyógyászatilag összeférhető hordozóanyaggal összekeverve, ahol a módosított, lényegében avirulens vírus az MA-104 majomvese-sejtvonal sejttenyészetében legalább 70-szer passzált ATCC-VR2332 vírus, amely módosított, lényegében avirulens vírus sertésnek vagy egyéb PRRS-re hajlamos emlősnek adagolva nem okoz PRRS-betegségre jellemző klinikai tüneteket, hanem az emlőst a PRRS patogén formái ellen immunizáló immunválaszt indukál. A vakcina tehát egy élő, módosított vagy gyengített vírust és egy gyógyászatilag hatékony hordozóanyagot tartalmaz. A módosított vírust majomvese-sejtvonalban szaporítjuk el és tartjuk fenn, ez a sejtvonal az MA-104, amely egy 20-szor vagy még többször passzált afrikaikabócamajom-vesesejt.
Fertőzött sertés szövethomogenizátumából nyertünk egy patogén virális szert, amelyet úgy azonosítottunk, hogy számos malacban és vemhes kocában PRRS-betegséget okozott. Az izolált virális szert 1991. július 18-án helyeztük letétbe az American Type Culture Collectionnél (Rockville, Maryland), letétbehelyezési száma: ATCC-VR2332. Ez a virális szer egy kényes, nem hemagglutináló, tokos RNS-vírus.
A vad típusú vírust előnyösen úgy alakítjuk lényegében avirulens formává, hogy a vírust majomsejtek teljes vagy részleges rétegére oltjuk le szérum jelenlétében, megfelelő tenyésztőközegben; az inokulált sejtréteget körülbelül 35 °C és körülbelül 37 °C közötti hőmérsékleten citopatikus hatás eléréséig inkubáljuk, és a vírust többször passzáljuk a majomsejtvonalon keresztül fenntartó közegre, szérum jelenlétében és megfelelő passzálási körülmények között.
A vakcina hordozóanyagot, például szacharózzselatin stabilizálószert tartalmaz, amelyet a fent említett módon előállított élő, módosított vírussal elegyítünk. A vakcinát előnyösen úgy használjuk PRRS megelőzésére, hogy a sertéseket lokálisan (felső nyálkahártyákon keresztül) vagy parenterálisan végzett vakcinálással immunizáljuk. Az immunizált sertések rendszerint nem mutatják a betegség tüneteit, ha azokat a vakcinálást követően vad típusú vírussal fertőzzük.
HU 223 763 Β1
A vakcinát ipari méretekben is előállíthatjuk oly módon, hogy majomsejtvonalból méretnagyított tenyészeteket állítunk elő; a méretnagyított tenyészeteket gyengített vírussal fertőzve termelőtenyészeteket állítunk elő; a termelőtenyészeteket összegyűjtjük, és a vírust stabilizáljuk és liofilizáljuk.
Az ábrákat röviden az alábbiakban ismertetjük.
Az 1. ábra mutatja a PRRS-vakcina ipari mennyiségben történő előállítására szolgáló eljárás folyamatábráját.
A találmányt közelebbről az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni a korlátozás szándéka nélkül.
1. példa
PRRS-vírus izolálása, azonosítása és gyengítése, és a módosított élő vakcina előállítása
A) Izolálás és azonosítás
PRRS-sel fertőzött kondából származó malacokból szövethomogenizátumot nyertünk. Ez a homogenizátum konzisztensen mutatta a PRRS légzési és szaporodási formáit, amikor azt intranazálisan inokuláltuk gnotobiotikus malacoknak és vemhes kocáknak. Az akár szüretien, akár szűrt (0,45, 0,22 vagy 0,1 pm) inokulummal fenti módon inokulált gnotobiotikus malacok étvágytalanná váltak, és tüdejükben a PRRS-sel fertőzött kondában látható léziókhoz hasonló mikroszkopikus tüdőléziók alakultak ki. Ugyanez az inokulum szaporodási hibákat is okozott, a PRRS-sel fertőzött kondában láthatókhoz hasonlóan.
A vírus izolálására alkalmazott szövethomogenizátumok 1. csoportját a tüdőszövetek, 2. csoportját a kombinált agy-, lép-, máj-, veseszövetek alkották, amelyeket PRRS-sel fertőzött kondában élő fertőzött malacokból nyertünk. Az egyes homogenizátumcsoportokat 4000 g-vel 25 percen keresztül centrifugáltuk. A kapott felülúszót összegyűjtöttük, és 0,45 mikron méretű steril fecskendős szűrő segítségével átszűrtük. A szűrt felülúszókat ezután egyesítettük. Az egyesített szűrt felülúszókból 1 ml-t alkalmaztunk inokulumként az egyes sejtvonalak fertőzésére az alább ismertetett módon.
A szűrt felülúszót egy tenyésztőközeghez adtuk, amely egy alább ismertetett sejtvonalat, módosított Eagle-féle tápközeget (MÉM, gyártja a JRH Biosciences) és körülbelül 100 pg/ml gentamicint tartalmazott.
Minden egyes sejtvonal esetén két kísérletet végeztünk 75 ml-es műanyag lombikokat alkalmazva. Az 1. kísérletben a szűrt felülúszót két lombikra oltottuk le, amelyek az alább említett sejtvonalak teljesen egybefolyó sejtrétegtenyészetét tartalmazták. Ezenkívül körülbelül 2,5 mg tripszint adtunk az első lombikhoz. Az összes többi tenyésztési körülmény azonos volt minden egyes tenyésztőlombik esetén.
A 2. kísérletben az egyesített szövethomogenizátumot az 1. kísérletben alkalmazott sejtvonalakat tartalmazó lombikokba inokuláltuk, azonban a sejtréteg csak 20-40%-osan volt egybefolyó az inokulálás időpontjában. Ezenkívül a tápközeg körülbelül 10% magzati borjúszérumot is tartalmazott, amely az 1. kísérlet közegében nem volt jelen. Az inokulumot ebben az esetben is körülbelül 1 ml mennyiségben alkalmaztuk, és a tenyészeteket körülbelül 34 °C-on körülbelül 7 napon keresztül inkubáltuk.
Az összes lombikot körülbelül 7 napon keresztül inkubáltuk körülbelül 34 °C-on. Az eredményeket a 7. nap végén olvastuk le. Fagyasztás és felolvasztás után mintát vettünk egy második passzálás céljából ugyanebben a sejtvonalban. A többi anyagot cseppfolyós nitrogénben lefagyasztottuk, és körülbelül -60 °C-on tároltuk. Az 1. és 2. kísérlet eredményeit az 1. táblázatban foglaljuk össze.
1. táblázat
Vírusgazdaként alkalmazott sejtvonalak
Sejtvonal | 1. kísérlet | 2. kísértet |
Marhaorrkagyló (BT) | - | - |
Lóvese (CRFK) | - | - |
Majom- (verő) vese | - | - |
Majom- (verő) tüdő | - | - |
Kutyavese (MDCK) | - | - |
Sertés- (PK2A) vese | - | - |
Vidramenyéttüdő | - | - |
Vadászmenyéttüdő | - | - |
Marhatüdő | - | - |
Bivalytüdő | - | - |
Marhavese (MDBK) | - | - |
Sertéshere (ST) | - | - |
Majomvese (MA-104) | - | + |
Humán végbéltumor (HRT-18) | - | NT |
Humán tüdő | NT | - |
+ = CPE hatás
- = nincs CPE hatás
NT = nem vizsgált
Az 1. kísérletben egyetlen vizsgált sejtvonal esetén sem észleltünk citopatikus hatást (CPE). A 2. kísérletben azonban az MA-104 sejtek kis csoportjai duzzadni kezdtek, és gyenge üregeket képeztek az egysejtrétegben a lombik szélein. A lombikból elkülönítettük a folyadékot, és egy MA-104 sejteket tartalmazó új lombikba vittük át (az egybefolyás ismét 20-40%), majd ezután harmadszor is passzáltuk. Ez a nyilvánvaló citopatikus hatás erősebbé vált minden egyes passzálásnál. A harmadik passzált tenyészet megtartotta virulenciáját. Ezt a passzált tenyészetet ATTC-VR2332 számon helyeztük letétbe az American Type Culture Collectionnél (Rockville, Maryland, USA).
Az ATTC-VR2332 típus következetesen klinikai PRRS-tüneteket, gnotobiotikus malacokban tüdőléziókat és pozitív ImF-eredményeket okoz. Ennek megfelelően az ATTC-VR2332 vírus a Togaviridae egy ez idáig nem azonosított nemzetségét jelentheti. Az ATCCVR2332 vírus sertések eddig nem ismert patogénje, mivel a sertések számos közönséges vírus patogénjével szembeni specifikus antiszérumok nem semlegesítik a vírust, és antigéneket sem detektálnak a fertőzött sejtekben.
HU 223 763 Β1
Az ATCC-VR2332 vírus egy érzékeny, nem hemagglutináló, tokos RNS-vírus. Az ATCC-VR2332 vírus egybefolyó sejtvonalon, közelebbről MA-104 sejtvonalon, vagy egyéb majomsejtvonalon szaporodik. Az ATCC-VR2332 vírus nagy titerekig (107 TCID50/1 ml) szaporodik a kereskedelmi forgalomban lévő MA-104 sejtvonalon.
Az ATCC-VR2332 vírus egy lipid tokot tartalmaz, amelyet kloroformmal végzett kezelést követően fertőzőképességének elvesztése mutat. A lipid tok vizuálisan is kimutatható az üres részecskéket övező, elektronátbocsátó gyűrűként. A PRRS-vírus morfológiája nem jellegzetes közvetlen elektronmikroszkópiával, (DEM) és rendkívül nehéz lenne sejttörmeléket tartalmazó preparátumokban azonosítani. A gradienstisztított ATCC-VR2332-részecskék morfológiája és 62 nmes átlagos átmérője nagyon hasonló a lóarterítis-vírionokhoz, és a tej-dehidrogenázvírusokhoz.
A lóarteritis-vírus mérete ismert módon 50-73 nm, ez hasonlít az ATCC-VR2332 vírus 48-84 nm méretéhez. Számos ATCC-VR2332-részecskében nem figyeltünk 3-35 nm-es magokat, amely magok emlékeztetnek a lóarteritis-vírus nukleokapszidmagjaira. így az ATCC-VR2332 morfológiailag leginkább az arteritisvírus-csoportra hasonlít.
Az RNS-genom jelenlétét az ATCC-VR2332 vírusban a vírus azon képessége támasztja alá, hogy 5bróm-2-dezoxi-uridin és mitomicin C jelenlétében szaporodni tud, amely szerek ismerten gátolják a DNS-vírusok és az RNS-vírusok egyik családjának (Retroviridae) replikációját, de a többi RNS-vírusét nem. Az ATCC-VR2332 ideiglenes osztályozása RNS-vírusként összhangban van azzal a megfigyeléssel is, hogy ez a vírus a sejt citoplazmájában szaporodik, amit a vírusantigének jelenléte mutat ImF-fel végzett detektálással. Ezenkívül az aktinomicin D, amely a DNS-dependens transzkripciót zavarja, nem fejt ki hatást az ATCCVR2332 vírus szaporodására. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ATCC-VR2332 vírus replikálódásához nincs szükség magfunkciókra.
Összefoglalóan, a méret, morfológia, egy RNS-genom jelenléte és egyéb biológiai tulajdonságok alapján az ATCC-VR2332 vírust a Togaviridae családba soroljuk. Az ATCC-VR2332-t azonban nem lehet kifejezetten egy család egy ismert nemzetségébe sorolni. Noha morfológiailag az ATCC-VR2332 vírus erősen emlékeztet az arterivírusokra, ezt a vírust nem lehet egy meghatározott nemzetségbe sorolni addig, amíg az RNS- és a proteinszerkezetről további információ nem áll rendelkezésre.
B) Gyengítés
A 3. passzálás után összegyűjtött VR-2332-t két további passzálásnak vetettük alá, amelyet alább részletesen ismertetünk, és az 5. passzálással kapott vírust külső laboratóriumba küldtük tisztítás céljából. Közelebbről, az ATCC-VR2332 virionokat CsCI-gradiensen történő tisztítás (centrifugálás 200 000 g-vel), majd 1,1,2-triklór-trifluor-etánnal végzett extrahálás után azonosítottuk. A tisztított virionokat immun-aranykészlettel jeleztük, anti-ATCC-VR2332 hiperimmun szérum és aranykonjugátum alkalmazásával. Az ATCCVR2332 virionok sűrűsége a CsCI-gradiensben
1,18-1,19 g/ml. A szacharózgradiens következetesen a vírustiter csökkenését okozta, ezért a tisztításra ezt nem találtuk alkalmas gradiensnek.
A tisztított, ötször passzált, összegyűjtött tenyészetet ezután további 65 passzálásnak vetettük alá az alább ismertetett módon. A 70. passzálásból származó összegyűjtött tenyészet gyengített volt, és ezt neveztük törzs-oltótenyészetnek (Master Seed Culture). Ezt az avirulens oltó törzstenyészetet ATCC-VR2495 számon helyeztük letétbe az American Type Culture Collectionnél. Végül további 5 passzálás végrehajtása után kaptuk a 75-ször passzált ATCC-VR2332-Í (további passzázsokat is végre lehet hajtani kívánt esetben).
A 4-75-ször passzált ATCC-VR2332 vírust kereskedelmi forgalomban lévő MA-104 kabócamajomvese-sejtvonalból nyert gazdaszövet törzstenyészetbe vittük be. Ezeket a szövet törzstenyészeteket az alábbiak szerint állítottuk elő. A tenyésztőközeget úgy állítottuk elő, hogy Eagle-féle minimális esszenciális tápközegbe (MÉM, JRH Biosciences, katalógusszám: 200-2041) és 10% magzati borjúszérumot (JRH Biosciences) kevertünk. Körülbelül 1 ml ATCC-VR2332 inokulumot adtunk egy 75 ml-es lombikba, amely 50 ml fenti tenyésztőközeget tartalmazott. A lombikot körülbelül 7 napon keresztül inkubáltuk 35-37 °C-on. A szövettörzstenyészet-lombikokat a kapott inkubált tenyészet méretnövelésével állítottuk elő, a nagyítás aránya 1:4, és ezt az alábbi módon értük el. A körülbelül 50 ml térfogatú tenyésztőközeget dekantáltuk. A sejtréteget 10 ml tripszin-verzén 1* hozzáadásával eltávolítottuk, és 37 °C-on 5-10 percen keresztül inkubáltuk. Ezután a sejteket a lombikból eltávolítottuk, és 270 g-vel 5-10 percen keresztül centrifugáltuk. A felülúszót dekantáltuk, és az üledéket 10% magzati borjúszérumot tartalmazó 5-10 ml MEM-közegben újraszuszpendáltuk. A sejteket 200 ml tenyésztőközegbe helyeztük, majd 4 db 75 ml-es lombikba osztottuk szét 50 ml/lombik mennyiségben, így 1:4 méretnagyítást értünk el.
A kapott tenyészeteket felhasználásukig 35-37 °C-on tartottuk. Körülbelül 3-4 nap inkubálás után alakult ki a lombikokban a teljes, egybefolyó sejtrétegbevonat, és ekkor voltak felhasználhatók.
Az ATCC-2332 PRRS-vírust a fenti módon előállított, egybefolyó MA-104 sejtvonaltenyészeten szaporítottuk el. A tenyésztőközeg pH-ját 7,2-re állítottuk be, és a tenyészeteket 35-37 °C-on inkubáltuk. A vírust úgy inokuláltuk az MA-104 sejtekre, hogy a megelőző passzálásból származó fagyasztott inokulumból 1 ml-t adtunk a cseppfolyós tenyésztőközeghez. A vírust 24 órán keresztül hagytuk a sejteken abszorbeálódni.
Az ATCC-VR2332 vírussal történő inokulálás után körülbelül 24 órával a tenyésztőközeget dekantáltuk, és a lombikot 50 ml fenntartó közeggel töltöttük újra, amely a tenyésztőközeg 10% magzatiborjúszérum-tartalma helyett csak 4% magzati borjúszérumot tartalmazott. A fenntartó közeg pH-ja 7,6. A fenti tápközegcsere után a tenyészetet 35-37 °C-on inkubáltuk. A vírust addig hagytuk szaporodni, amíg a tenyészetben az
HU 223 763 Β1
MA-104 sejtréteg körülbelül 50-60%-át elpusztította a vírus. A mintát ezután cseppfolyós nitrogénben lefagyasztottuk, és egy másik MA-104 sejtet tartalmazó lombik leoltására előkészítettük.
A 3-70-szer passzált vírusok keresztreaktivitását is meghatároztuk. A 3-szor passzált PRRS-VR2332 vírust alkalmaztuk sertések, nyulak és kecskék immunizálására, hogy PRRS-sel szembeni antiszérumot termeljünk. A szérumot alkalmaztuk a PRRS-vírus semlegesítésére az egyes passzálások után a 3-tól a 70. passzálásig. Ezenkívül két monoklonális antitestet (SDOW-12 és SDOW-17) állítottunk elő VR-2332 PRRS-vírussal immunizált egerekből nyert léplimfociták alkalmazásával. A monoklonális antitestekről kimutattuk, hogy minden amerikai egyesült államokbeli és európai PRRS-izolátummal úgy reagálnak, mint az 1992. decemberi izolátummal. A monoklonális antitesteket alkalmaztuk a 3-70-szer passzált PRRS-vírus azonosítására vagy detektálására.
C) Módosított élő vakcina előállítása
Két vakcinapreparátumot állítottunk az oltó törzstenyészet (70 passzálással nyert ATCC-VR2332) és a 75 passzálással nyert ATCC-VR2332 alkalmazásával. Az oltó törzstenyészetvírus és a 75-ször passzált vírus lényegében avirulens, azaz ha a vakcinát sertésnek vagy egyéb, PRRS-sel szemben érzékeny emlősnek adtuk, a PRRS-betegség klinikai tünetei nem jelentkeztek, de olyan immunválaszt tudott indukálni, amely az állatot a PRRS-vírus patogén formái ellen immunissá tette. A vakcinát szokásos módon állítottuk elő. A liofilizálás előtt szokásos stabilizálószereket és hordozóanyagokat adtunk hozzá.
2. példa
Virusizolátum in vivő vizsgálata
Az 1. példa szerint előállított, virulens 3-szor passzált ATCC-VR2332-tenyészetet használtuk két háromnapos gnotobiotikus malac fertőzésére. Mindkét malacot intranazálisan fertőztük, az egyik 1 ml, a másikat 2 ml inokulummal. A malacokat 7 napon keresztül tartottuk klinikai megfigyelés alatt, majd fájdalommentesen megöltük, és felboncoltuk.
Mindkét malacból szövetmintákat vettünk hisztopatológiai vizsgálatra és a virális szer visszanyerésére. A hisztopatológiai vizsgálati jelentés megerősítette, hogy a fertőzött malacokban a tüdőléziók azonosak az ismerten PRRS-ben szenvedő malacokban lévő tüdőléziókkal. A szövetmintákat az 1. példában leírtak szerint dolgoztuk fel, majd 20-40%-os és 100%-os MA-104 sejtvonal egysejtrétegen tenyésztettük magzati borjúszérummal. A virális szert ismét visszanyertük.
A háromszor passzált virális tenyészetet kocák fertőzésére is felhasználtuk annak érdekében, hogy igazoljuk, hogy a betegség szaporodásra kifejtett hatásai reprodukálhatók és megerősíthetők. Két többször szült kocát fertőztünk intranazálisan a terhesség körülbelül 93. napján. A kocák a terhesség 112., illetve 114. napján 50%-ban halva született malacot ellettek (8/13, illetve 6/14 a halva született/élő arány). A halva született malacok közül 7 részlegesen mumifikált állapotban volt, és az élve született malacok gyengék voltak és nem szoptak erőteljesen. A halva született malacok szöveteiből visszanyertük a virális szert az 1. példában ismertetett módon.
A virális szert három, ismerten PRRS-sel fertőzött kondából is visszanyertük. Az ATCC-VR2332-re kapott antitesttitereket ugyanezekben a kondákban azonosítottuk.
3. példa
A vizsgálat célja az volt, hogy meghatározzuk a módosított élő vírus vakcinakénti alkalmazásra kiválasztott PRRS-vírus (75-ször passzált VR-2332) minimális védődózisát. Ezt úgy végeztük, hogy meghatároztuk annak a mértékét, hogy két megválasztott vakcinadózis (4,0±0,5 log/dózis és 2,0+0,5 log/dózis) mennyire képes megakadályozni abnormális körülmények fellépését virulens PRRS-vírussal (3-szor passzált VR-2332, 3,5+0,5 log/dózis) történő fertőzést követően, és összehasonlítottuk a vakcináit, fertőzött sertéseket a nem vakcináit, fertőzött és a nem fertőzött (normális) sertésekkel. A módosított élő vakcinát a fentiek szerint 75ször passzált vírus alkalmazásával állítottuk elő.
szeronegatív malacot választottunk ki a vizsgálat céljára a forrásfarmról, és négy vizsgálati csoportra osztottuk, a csoportokat 1-től 4-ig számoztuk. Az 1. csoportban 21 malacot vakcináltunk intramuszkulárisan 2,0 ml PRRS-vakcina L-4-gyel (4,0 log/dózis). A 2. csoportban 21 malacot 20 ml PRRS-vakcina L-2-vel (2,0 log/dózis) vakcináltunk. A 3. csoportban 10 malacot, és a 4. csoportban 10 malacot nem vakcináltunk. A 3. és 4. kontrollcsoportba tartozó malacokat elkülönítetten tartottuk, hogy a fertőző vírussal szembeni érzékenységet biztosítsuk. Az 1., 2. és 3. csoportot 2,0 ml 3-szor passzált VR-2332 vírussal fertőztük intranazálisan a kísérlet 28. napján. A 4. csoportba tartozó malacokat nem fertőztük. Mind a négy vizsgált csoportot megfigyelés alatt tartottuk a fertőzést megelőző 31. naptól a fertőzés utáni 21. napig tartó periódusban. A vizsgálat kiértékelésére alkalmazott paraméterek az alábbiak: klinikai tünetek, testtömeg, testhőmérséklet (rektális hőmérséklet), fehérvérsejtszám, vírusizolálás és szerológia. A vakcina hatékonyságát az alábbiak bizonyítják: a vakcináit malacok kevesebb napon keresztül vírushordozók, nem alakul ki leukopénia és láz, és a fertőzés után megmarad a normális gyarapodási sebesség.
A rektális testhőmérsékletet a vakcinálás előtt és azt követően mértük. A csoport átlagos hőmérséklete az 1. csoportban a 2. vakcinálás utáni napon (DPV) és a 3. DPV-n emelkedett, míg a 2. csoportban a 3. DPV-n emelkedett. A hőmérséklet-emelkedés időtartama mindkét csoportban rövid volt, az 1. csoportban 2 nap, és a 2. csoportban 1 nap.
A vakcináit csoportok egyikében sem csökkent a fehérvérsejtszám a kezelést követően. Korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy virulens PRRS-vírus okozta fertőzés a fertőzés után 72 órán belül leukopéniát okozhat.
A vakcinálás utáni periódusban mért tömeggyarapodás eredményei azt mutatják, hogy a kezelés nem befolyásolta hátrányosan a vakcináit malacok viselke5
HU 223 763 Β1 dósét. A vakcinálás után 22 napon keresztül a vakcináit csoportok egyikében sem volt a tömeggyarapodás szignifikánsan eltérő 0,05 megbízhatósági szinten a 3. és 4. csoport tömeggyarapodásától.
A klinikai megfigyelések kis eltérést mutattak a normálistól a legtöbb megfigyelt kategóriában, a széklet és az orrlyukak kivételével. A vakcináit csoportok székletpontszámait összehasonlítva az egyesített kontrollcsoportok (3. és 4. csoport) pontszámaival kétfarkú t-teszt alkalmazásával azt mutatta, hogy nincs szignifikáns különbség 0,05 megbízhatósági határnál. Az 1. csoport és az egyesített kontrollcsoportok közötti p érték 0,47, míg a 2. csoport és az egyesített kontrollcsoportok közötti p érték 0,87 volt. Az 1. csoport és az egyesített kontrollcsoportok orrlyukpontszámai értékelésének összehasonlítására a p érték 0,41. A 2. csoportban lévő 21 malac közül csak kettőnél figyeltük meg a klinikai tüneteket az orrlyukra. Az 1. és 2. csoport összesített klinikai pontszámának t-teszt-analízise az egyesített kontrollcsoportéval szemben 0,53, illetve 0,74 p értéket mutatott. Ezek az összehasonlítások azt bizonyítják, hogy nincs különbség egyik dózisszinten sem a vakcináit állatok és a nem vakcináit kontrollok között. A vírus vérből történő izolálásának eredményei azt mutatták, hogy az 1. csoportban az állatok 100%-a (21 a 21-ből) pozitívvá vált, míg a 2. csoportban csak 90% vált pozitívvá (19 a 21-ből). A vakcinálás utáni teljes periódusban a 3. kontroll és a 4. kontrollcsoport negatív maradt. Az immunoperoxidáz-vizsgálat (IPT) eredményei hasonló képet mutattak, amennyiben az 1. csoport 100%-osan szerológiailag pozitívvá vált, míg a 2. csoportnak a 90%-a. Mindkét csoport negatív volt szérumsemlegesítő antitestekre 21 DPV-n keresztül. Mindkét csoportban semlegesítő antitestet mutattunk ki a 29. DPV-n (vagyis a 0. fertőzés utáni napon (DPC) - lásd a fertőzés utáni eredményeket). A kontrollcsoportok szerológiailag negatívak maradtak mindkét tesztben a fertőzés idejéig.
A vakcinálás utáni megfigyelések analízise azt mutatja, hogy nincs hátrányos hatása egyik vakcinadózissal végzett kezelésnek sem. Azonban a magasabb dózis szerológiailag megváltoztatta az összes malacot (21-et a 21-ből), míg az alacsonyabb dózis csak 19-et a 21-ből (90%).
Virulens PRRS-vírussal végzett fertőzés után a klinikai paramétereket vizsgáltuk mind a vakcináit, mind a nem vakcináit csoportokban, és kimutattuk, hogy a vakcina mind a két vizsgált dózisban védelmet biztosított. A virémiára végzett vizsgálat eredményei világosan bizonyították a vakcina jótékony hatását. A nem vakcináit csoport (3. csoport) 100%-osan virémiás volt a 3. DPCn, 5. DPC-n és 7. DPC-n, míg a virémia előfordulása ugyanezeken a megfigyelési napokon az 1. csoportban (3,65 log/dózis) és a 2. csoportban (1,85 log/dózis) 15%, 5% és 10%, illetve 30%, 20% és 15% volt. Ezenkívül nem nyertünk vissza vírust a vérmintából az 1. csoportban a 9. DPC, és a 2. csoportban a 13. DPC után, míg a
3. csoportban 30% még mindig pozitív volt a 19. DPC-n.
A testhőmérséklet (rektális hőmérséklet) vizsgálatának eredményei szintén bizonyították a vakcinálás hatékonyságát. A 21 napos megfigyelési periódusban a 3. csoport átlagos testhőmérséklete meghaladta a 40 °C-ot (104 °F) az 5. napon. A 2. és 3. csoportban az átlagos testhőmérséklet nem haladta meg a 40 °C-ot (104 °F). Ezenkívül a 3. csoportban az átlagos testhőmérséklet meghaladta a 40,3 °C-ot (104,5 °F) két napon, a 2. és a 6. DPC-n.
A fertőzést követően a fehérvérsejtszám vizsgálata azt mutatta, hogy a 3. csoportban leukopénia fejlődött ki, 16% csökkenést észleltünk az 5. DPC-n. Egyik vakcináit csoportban sem jelentkezett 6%-nál nagyobb csökkenés a megfigyelési periódusban.
A különböző kezelt csoportok tömeggyarapodásának megfigyelése a fertőzést követő 21 napon keresztül azt mutatta, hogy mindkét dózisszinttel történő vakcinálás után megmaradt a normális gyarapodási sebesség. A két vakcináit csoportban - az 1. és 2. csoportban - az átlagos tömeggyarapodás 74%, illetve 73% volt. A 4. csoportban - vagyis a normális kontrollcsoportban - az átlagos tömeggyarapodás 75%. Ezzel szemben a 3. csoportban, vagyis a nem vakcináit, fertőzött kontrollcsoportban, az átlagos tömeggyarapodás 69%. Ez szignifikánsan különbözött az 1., 2. és 4. csoporttól, P=0,009-nél kétfarkú t-teszt alkalmazásával, és a megbízhatósági határ 0,05 volt.
Noha a klinikai vizsgálatok eredményei nem lehetnek meghatározóak a hatékonyság bizonyítására, ezek a vakcinálás előnyeit azért mutatják. A fertőzést követően az 1., 2. és 3. csoportban szignifikánsan megnövekedett a légzési tünetek gyakorisága. A napi átlagos pontszám az egyes állatokra az 1., 2. és 3. csoportban 0,39, 0,64 és 0,53 volt. Ez a magasabb dózis (3,65 log/dózis) előnyét mutatja az alacsonyabb dózissal (1,85 log/dózis) és a nem vakcinálással szemben. Noha a székleteredmények drámaiak voltak a fertőzés után, ezek nem voltak szignifikánsan eltérőek (0,05 megbízhatósági határnál) a vakcinálás utáni és a fertőzés előtti megfigyelésektől. így ezekben a kísérletekben a virulens PRRS-vírussal történő fertőzés láthatólag nem fejtett ki hatást az alsó gasztrointesztinális traktusra, összességében a többi klinikai megfigyelés nem mutatott szignifikáns változást a fertőzés eredményeként. Az orrlyuk- és szájparaméterekre az 1. csoportban egy malac adta az egész csoport orrlyukpontszámainak 25%-át, és egy másik malac a csoport pontszámának 94%-át a szájkategóriában. Hasonlóképpen a 2. csoportban egy malac adta a csoport orrlyukpontszámainak 22%-át, és egy másik malac a csoport szájpontszámainak 43%-át. Összességében a fertőzés utáni klinikai megfigyelések gyakorisága a fenti két paraméterre nem volt szignifikánsan eltérő a vakcinálás utáni megfigyelésektől. Hasonló következtetések vonhatók le a fenti két klinikai paraméterre a 3. csoport esetén is. A 4. csoport viszonylag normális maradt az egész testet tekintve.
A megfigyelési periódus végén az összes malacot fájdalommentesen megöltük, és a tüdőket makroszkóposán megfigyeltük a patológiás változások szempontjából. 60% (10 állatból 6) a 3. csoportban figyelemreméltó változást mutatott. Ezzel szemben az 1. csoportban 10% és a 2. csoportban 19% mutatott figyelemreméltó változást. A 4. csoporttal, a normális kontrollok6
HU 223 763 Β1 kai összehasonlítva az 1. csoport 80%-át, a 2. csoport 81%-át és a 3. csoport 30%-át értékeltük úgy, hogy nem volt megfigyelhető eltérés.
Elvégeztük a vírus izolálását a tüdőszövetekből. Nem izoláltunk vírust az 1. csoportba tartozó malacok tüdőszövetéből. A 2. csoport 21 állatából egy mintát találtunk víruspozitívnak. A 3. csoport 10 mintája közül 3-ból izoláltunk vírust, míg egyből sem a 4. csoportban.
A fenti eredményekből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a 75-ször passzált VR-2332-t tartalmazó módosított élő PRRS-vírus-vakcina mindkét dózisa (3,65 lóg/ /2 ml dózis és 1,85 log/2,0 ml dózis) hatékony volt a légzési betegség ellen 3-5 hetes malacokban, amelyeket a 29. DPV-n virulens PRRS-vírussal fertőztünk.
A fenti vizsgálatok azt mutatják, hogy az előnyös minimális védődózis 3,65 log/2,0 ml dózis. A vakcinadózisok hatékonyságának kiértékelésére alkalmazott több paramétert - így például a virémiát, klinikai légzési tüneteket, tüdő patológiai változását, vírus izolálását a tüdőszövetből - tekintve a magasabb dózissal vakcináit állatok nagyobb mértékben lettek védettek. A 3,65 log/dózissal vakcináit 21 malacból 21 mutatott szerokonverziót a 21. DPV-re. Ezzel szemben alacsonyabb dózissal vakcináit 21 malac közül csak 19 mutatott szerokonverziót a 29. DPV-re (0. DPC).
4. példa
Ebben a példában az 1. és 3. példában ismertetett, 75-ször passzált PRRS módosított élő vakcina alkalmazásával kapott immunitás időtartamát vizsgáltuk. Egy zsírsertés a vágótömeget általában 6 hónapos korra éri el. Ebben a példában a malacokat körülbelül 1 hónapos (4-5 hetes) korban vakcináltuk, majd a vakcinálás után 110 nappal fertőztük. Ilyen immunitási időtartam a normális zsírsertések várható élettartamának legnagyobb részét már lefedi.
darab PRRS-szeronegatív malacot négy vizsgálati csoportba osztottunk, amelyeket 1., 2., 3. és 4. csoportnak jelöltünk. Az 1. csoportban 21 malacot 2 ml 75-ször passzált PRRS-MLV-vel vakcináltunk, 3,32 log/dózisban. A 2. csoportban 21 malacot 2,0 ml 1,64 log/dózis vakcinával vakcináltunk. A 3. és 4. csoportban 10-10 malacot nem vakcináltunk, hanem szeronegatív állapotuk fenntartása érdekében külön helyeztünk el. A 3. példában ismertetett vizsgálat befejezésekor a jelen példa 2. csoportjába tartozó malacokat a vizsgálatból kivettük, és fájdalommentesen megöltük, mivel arra a következtetésre jutottunk, hogy a minimális védődózis 3,68 lóg és nem 1,87 log/dózis. Az 1. és
3. csoportot intranazálisan fertőztük 110 nappal a vakcinálás után (DPV) 3,9 log/ml 3-szor passzált VR-2332 vírus alkalmazásával. A 4. csoportba tartozó malacokat nem fertőztük. A malacokat a fertőzés után 21 napon keresztül (DPC) megfigyeltük klinikai tünetek, testtömegváltozás, testhőmérséklet (rektális hőmérséklet) fehérvérsejtszám, virémia és szerológia szempontjából. 110 nappal a vakcinálás után a védő immunitást a virémia hiánya, a leukopénia és láz prevenciója, és a nagyobb testtömeg-gyarapodás bizonyította a nem vakcináit, fertőzött malacokkal szemben.
A vakcinálást követően a vakcináit malacokat minden, a vakcinának tulajdonítható káros reakció szempontjából megfigyeltük. A megfigyelt paraméterek közé tartozott a testhőmérséklet (rektális hőmérséklet), fehérvérsejtszám, testtkömeg-gyarapodás, klinikai tünetek, szerológia és virémia.
A testhőmérsékletet (rektális hőmérsékletet) a -1. DPV-től a +4. DPV-ig figyeltük meg. A csoport átlagának analízise nem mutatott szignifikáns növekedést a kezelt csoportok hőmérsékletében a vakcinálás miatt. Az 1. csoportba tartozó vakcináit malacokban maximálisán 1/9 °C (0,2 °F) emelkedést figyeltünk meg a vakcinálás előtti átlaghoz viszonyítva.
A fehérvérsejtszámot különböző időpontokban határoztuk meg a vakcinák beadása előtt, illetve azt követően. Az 1. csoportban 14% csökkenést tapasztaltunk a vakcinálás előtti átlagértékhez viszonyítva a 4. DPV-n. Az összes többi fehérvérsejtszám-csökkenés az 1. csoportban 9% alatt maradt. A többi csoportban (3. és 4. csoport) nem tapasztaltunk 11 %-nál nagyobb csökkenést a fehérvérsejtszámban a vakcinálás utáni megfigyelési periódusban.
A testtömeg-gyarapodás eredményei a 0. DPV-től a 28. DPV-ig ellentmondásosak voltak, amennyiben az
1. csoportban a testtömeg-változás szignifikánsan különbözött a 4. csoportétól (P=0,02). Nem találtunk magyarázatot erre a különbségre, mivel a többi megfigyelt paraméter nem mutatott nagyobb eltérést az 1. és 4. csoport között.
A vakcinálás utáni klinikai pontszámok statisztikai analízise nem mutatott különbséget a vakcináit csoportok és a nem vakcináit kontrollcsoportok között. Noha a székletpontszám gyakorisága volt a legnagyobb, nem találtunk szignifikáns különbséget az 1. csoport és a 3. és
4. csoport között (P=0,75, illetve 0,59). Hasonló módon a klinikai orrlyukpontszámok sem voltak szignifikánsan eltérőek. Az 1. és 3. csoport közötti összehasonlítás P értékre nagyobb mint 0,8. Az 1. és 4. csoport közötti összehasonlítás P értékre 0,02, a 4. csoport mutatta a legnagyobb gyakoriságot. Az egyéb klinikai paraméterek közül egy sem mutatott szignifikáns mértékű gyakoriságot.
A vakcinálás utáni szerológiai eredmények azt mutatják, hogy a vakcinadózis sikeresen immunizálta a kezelt állatokat. A 14. DPV-n az 1. csoport 48%-ban pozitív tesztet mutatott IPT-vizsgálatban. 7 nappal később, a 21. DPV-n a kezelt csoport 100%-a pozitívnak bizonyult IPT-vizsgálattal. Az 1. csoport negatív maradt a szérumsemlegesítő (SN) antitestre egészen a 28. DPV-ig. Az 1. csoport összes malaca szerológiailag pozitív maradt mindkét vizsgálatban egészen a fertőzés időpontjáig, amely a 110. DPV-n történt. A 3. és 4. csoportba tartozó malacok szerológiailag negatívak maradtak az egész vakcinálás utáni időszakban.
A vakcinálás utáni vírusizolálási eredmények azt mutatják, hogy a kezelt csoport 100%-a sikeresen volt oltva. Ez alátámasztja a fent ismertetett szerológiai adatokat. Mindkét kontrollcsoport (3. és 4. csoport) negatív maradt a vakcinálást követő megfigyelési periódusban.
A vakcinálás utáni megfigyelések azt jelzik, hogy a kezelések nem okoztak semmi súlyosabb, nemkívá7
HU 223 763 Β1 natos hatást a kezelt állatokban, és a kontrollállatok PRRS-vírustól mentesek maradtak.
A virulens PRRS-vírussal történő fertőzést követően megfigyeltük a különböző klinikai paramétereket, hogy kiértékeljük a vakcinával végzett kezelés jótékony hatását. A vakcináit csoportot (1. csoport) a nem vakcináit, fertőzött csoporttal (3. csoport) és a nem vakcináit, nem fertőzött csoporttal (4. csoport) hasonlítottuk össze.
A fertőzés utáni szerológiai eredmények azt bizonyítják, hogy a fertőző dózis sikeresen stimulálta az immunválaszt a 3. csoportban. Az 1. csoportban nem termelődött anamnesztikus antitestválasz a virulens vírussal történő fertőzést követően. A szerológiai eredmények azt mutatják, hogy a 4. csoport negatív maradt az egész 21 napos megfigyelési periódusban.
A legmeglepőbb eredményeket a vírusizolálás eredményei jelentették. A 3. csoport 0,01 %-a pozitív volt a 3., 5. és 7. DPC-n, és később, a 21. DPC-n a fenti csoport 20%-a volt pozitív. Az 1. csoport negatív volt a 0. DPC-n, és az maradt egészen a 21 napos megfigyelési periódus végéig. Váratlan eredmény volt, hogy a 4. csoport vérmintáiból a PRRS-vírus izolálása pozitív volt. A 4. csoportból az első pozitív vírusizolálás a 15. DPC-n történt. Ez a megfigyelés összhangban van az alább ismertetett egyéb paraméterekkel. Annak ellenére, hogy a 4. csoport érintkezésbe került a PRRS-vírussal, a begyűjtött adatokat mégis érvényesnek kell tekinteni, mivel a látszólagos érintkezés a megfigyelési periódus utolsó harmadában történt, és az elsődleges megfigyelt intervallum az 1. DPC-től a 11. DPC-ig tartott. Ez azt jelenti, hogy ez alatt az idő alatt végeztük az 1. és 3. csoport között az összehasonlítások többségét. A legfontosabb eredmény a fertőzés látható prevenciója volt, amelyet a vírusizolátum hiánya jelez a vakcinával kezelt csoportban.
A fertőzés utáni klinikai tünetek jelentősége láthatólag korlátozott a vakcinával történő kezelés hatásának kiértékelését. Noha klinikai légzési tüneteket találtunk az 1. és 3. csoportban, a tünetek nem oszlottak meg egyenletesen. Az 1. csoport esetében a csoportra kapott összes pontszám 88%-át két malac produkálta. Hasonló módon a 3. csoportban 2 malac volt felelős a csoport 49 összpontszámának 71%-áért. Az 1. csoport székletösszpontszáma jelentős, ha a többi csoporthoz hasonlítjuk. Azonban a 21 malac közül csak 9-nél figyeltünk meg ebben a kategóriában klinikai tüneteket, és a 9 malac közül 3 malac volt felelős a csoport összpontszámának több mint 55%-áért. A 3. csoportban nem kaptunk székletpontszámot, és a 4. csoportban csak 1 malacot figyeltünk meg, amely klinikai széklettüneteket produkált. Az orrlyukak és száj klinikai pontszámainak jelentősége korlátozott, ha egyéb paraméterekhez, például a légzési paraméterekhez nem kötjük azokat. Az orrlyukmegfigyelések gyakorisága az 1. és 3. csoportban korlátozott volt, az egyes csoportokban 50%-nál kevesebb állat kapott egyáltalán pontszámot. A szájtünetek pontszáma gyakoribb volt, a 3. csoportban 90% és az 1. csoportban 76%. Nem volt szignifikáns különbség a fenti két csoport között a száj klinikai pontszámokban (P=0,45). Az egyéb klinikai paraméterek normálisnak bizonyultak.
A fertőzés utáni megfigyelési periódusban az 1. csoport testtömeg-növekedése átlagosan 19,33 kg (42,62 font) volt. A 3. csoport átlagos testtömeg-gyarapodása 16,55 kg (36,5 font), míg a 4. csoporté átlagosan 16,83 kg (37,1 font) volt. Nem volt szignifikáns különbség a 3. és 4. csoport között (P=0,9), és ez annak tulajdonítható, hogy a 4. csoport csak véletlenszerűen került érintkezésbe a PRRS-vírussal. Azonban ez nem csökkenti az adatok összehasonlíthatóságát az 1. és 3. csoport között, mivel statisztikailag szignifikáns különbség volt a fenti két csoport között. A malacok viselkedésének kiértékelése egy bizonyos időszakon keresztül kiváló eszközt jelent a malacok általános jólétének becslésére. Ezek az adatok a fenti paraméterekkel összekapcsolva a vakcina jótékony hatását mutatják, ha azt egy kísérletes fertőzés tükrében vizsgáljuk.
A fertőzés utáni hőmérsékletek a vakcinakezelés jótékony hatását bizonyítják a kísérletes fertőzéssel szemben. A fertőzött kontrollcsoportban, a 3. csoportban 8 olyan nap volt, amikor a csoport átlagos hőmérséklete legalább 5/9 °C-kal (1 °F) magasabb volt, mint a fertőzés előtti átlag. Az 1. csoportban a csoportátlag soha nem emelkedett 5/9 °C-ot (1 °F). Noha a 4. csoport PRRS-vírussal fertőződött, a csoport átlagos testhőmérséklete nem emelkedett 5/9 °C-kal (1 °F). Ez azért volt így, mert a vírus terjedése a csoportban fokozatos volt, és nem teljesen egyidejű, ellentétben a kísérleti fertőzéssel. Azonban az egyes malacok testhőmérsékletének vizsgálata a 15. DPC-től a 21. DPC-ig a 4. csoportban azt mutatta, hogy a malacokban a PRRS-vírussal történő érintkezést követően hőmérséklet-növekedés lép fel. Az egyes malacok testhőmérsékletének analízise az 1. és 3. csoportban méginkább alátámasztja a vakcinával történő kezelés jótékony hatását. A 3. csoportban 10 malac közül 10 állatban tapasztaltunk 5/9 °C (1 °F) emelkedést két egymást követő napon, vagy tovább. Ezzel szemben az 1. csoportba tartozó malacokban nem volt ezzel összemérhető eredmény.
A vakcina hatékonyságának további bizonyítékát szolgáltatták a fertőzés utáni fehérvérsejt-számlálással kapott eredmények. Az 1. csoportban az átlagos fehérvérsejtszám csökkent a fertőzést követően. A fertőzés utáni 1., 3., 5., 7. és 9. napon 14%, 19%, 14%, 21% és 13%-os csökkenést észleltünk. Ugyanezen napokon a 3. csoportban az átlagos csökkenés 15%, 37%, 43%, 31% és 28% volt. A 4. csoportban, vagyis a nem fertőzött csoportban a csökkenés ugyanezen időszakban 11 % és 17% között változott. Az egyes malacok fehérvérsejtszámának analízise tovább erősítette a vakcinakezelés által biztosított védelmet. A 3. csoportban 10 malac közül 10-ben legalább 25% ferhérvérsejtszám-csökkenés volt az egymás követő két vagy több napon keresztül. Az 1. csoportban a 21 malac közül 2-ben fejlődött ki 25%-os vagy annál nagyobb leukopénia két egymást követő napon keresztül. A 4. csoport fertőzött malacaiban hasonló eredményeket kaptunk, mint a 3. csoportban. A leukopénia gyakorisága nyilvánvalóvá vált, ahogy a vírus terjedése a csoporton belül előrehaladott. A 15. DPC és a 21. DPC között a csoport 50%-ában 25%-os fehérvérsejtszám-csökkenés mutat8
HU 223 763 Β1 kozott az egymást követő vizsgálati napokon. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a vakcináit malacokban nem fejlődött ki olyan mértékű leukopénia, mint a nem vakcináit malacokban.
A tüdő durva (makroszkopikus) megfigyelésének analízisét a 21. DPC-π két csoportra, parenchyma- és pleurapontszámokra osztottuk fel, amelyeket azután összes tüdőpontszámként összesítettünk. A megfigyelések analízisét még bonyolultabbá tette az, hogy a nem fertőzött kontrollcsoportban véletlenszerűen PRRS-vírus-fertőzés ment végbe, mivel nem lehetett egy negatív alapvonalat felvenni. Ezért az 1. és 3. csoport közötti összehasonlításnak bizonyos korlátái vannak, mivel mindkét csoport ugyanazon vírusnak volt kitéve ugyanazon időben. A parenchymapontszámok a 3. csoportban súlyosságukat tekintve nagyobbak voltak 10 malac közül 4-ben, amelyek egyenként 200 pontszámot kaptak. Az 1. csoportban a legmagasabb pontszám 100 volt. A vakcinakezelés hatására mind a kezelt csoport százalékos értékei, mind a prenchymaléziók súlyossága csökkent. Hasonló módon a vakcinakezelés csökkentette a mellhártyaléziók gyakoriságát és súlyosságát. Az 1. csoportban az állatok 24%-ban (21 közül 5) volt a mellhártyapontszám 100; míg a 3. csoportban az állatok 50%-ában (10 közül 5) mutatott 100 mellhártyapontszámot. Az 1. csoportban az állatok többségében (21 közül 9-ben) 15, vagy annál kisebb mellhártyapontszámot kaptunk. Nem volt összefüggés a tüdőpontszámok és a légzési problémák között. Például a 3. csoportban 1 malacnak a klinikai légzési pontszáma 23 volt, míg az összes tüdőpontszáma 287,5; míg a másik, 3. csoportban a malacok klinikai légzési pontszáma 0 volt, míg az összes tüdő pontszáma 300. Több további példa is van a tüdő pontszámok és a klinikai légzési pontszámok közötti összefüggés hiányára vonatkozóan. Hogy a makroszkópos megfigyelések megfelelőek-e a vakcina jótékony hatásának analizálására vagy nem, abból lehet következtetni, hogy a kezelt csoportban (1. csoport) kevesebb volt a sérült állatok száma, és a sérülések súlyossága is csökkent.
Összefoglalóan: a vakcinálást követő 110. napon történő kísérletes fertőzéssel szemben a vakcinálás hatásának értékelésére alkalmazott paraméterek közül sok paraméter jó összefüggést mutatott egymással. Abban a periódusban (a 3-9. DPC-n), amelyben a virémia a legnyilvánvalóbb, szignifikáns leukopénia és testhőmérséklet-növekedés jelentkezett. A fertőzés időpontjában a malacok közelítőleg 20 hetesek voltak, vagyis 12 héttel öregebbek, mint a 3. példa szerint fertőzött malacok. Az ebben a vizsgálatban megfigyelt klinikai tünetek közül sok sokkal súlyosabb volt. így például a testhőmérséklet (rektális hőmérséklet) emelkedése 8 napon keresztül volt megfigyelhető ebben a vizsgálatban, szemben az immunizálóképesség vizsgálatában tapasztalt 5 nappal. A nem vakcináit fertőzött kontrollcsoportban (3. csoport) kifejlődött leukopénia súlyossága sokkal nagyobb volt ebben a vizsgálatban, mint az immunizálóképesség vizsgálatában alkalmazott, fertőzött kontrollcsoportban. Az előző vizsgálatban a fertőzött kontrollcsoportban a fehérvérsejtszám 43%ról 27%-ra csökkent a 3-9. DPC-n. Az immunizálóképesség vizsgálatában a fertőzött kontrollcsoportban a csökkenés 15-21% volt a 2-9. DPC-n. Azon napoknak a száma, amelyeken a virémiát kimutattuk a fertőzést követő periódusban (114. DPC) a vakcináit fertőzött csoportban 0 volt az immunizálóképesség vizsgálatában a lehetséges 110 napból, ezzel szemben a jelen vizsgálatban alkalmazott fertőzött kontrollcsoportban ez 45 volt a 110 napból. így a klinikai tünetek súlyosságának fokozódását nem lehetett teljesen a virémia időtartama növekedésének tulajdonítani.
A jelen vizsgálat fertőzés utáni eredményei azt bizonyítják, hogy a 3,32 log/2,0 ml dózisszinten a PRRSMLV vakcinával végzett vakcinálás védelmet biztosított a vakcinálás után 110 nappal virulens PRRS-vírussal történő fertőzéssel szemben. Ezek a bizonyítékok az alábbiak:
1. A vakcináit állatok teljesen negatívak voltak virémia szempontjából a fertőzés utáni 21 napos megfigyelési periódus alatt.
2. A légzési, széklet, nazális vagy orális klinikai tünetek ritka előfordulásától eltekintve a vakcináit malacok normális klinikai tüneteket mutattak.
3. A vakcináit malacok tömeggyarapodása szignifikánsan nagyobb volt, mint a nem vakcináit fertőzött malacoké.
4. A vakcináit malacokban nem mutatkozott jelentős testhőmérséklet-növekedés.
5. A vakcináit malacokban nem tapasztaltunk figyelemreméltó fehérvérsejtszám-csökkenést.
6. A parenchyma- és a mellhártyaléziók súlyosságának előfordulása ritkább volt a vakcináit malacokban.
5. példa
Ebben a példában az 1. és 3. példában ismertetett, 75-ször passzált PRRS-MLV vakcinát vizsgáltuk az immunitás kialakulásának meghatározására. A vizsgálat megkezdése előtt 7 nappal 35 malacot vizsgáltuk PRRS-antitestre immunperoxidáz-vizsgálattal (IPT) és a PRRS-vírus jelenlétére a véráramban MA-104 sejteken történő vírusizolálással. Az 1. csoportban 10 malacot vakcináltunk intramuszkulárisan 2,0 ml 75-ször passzált PRRS-MLV vakcinával a kísérlet 0. napján. A 2. csoportban 10 malacot vakcináltunk ugyanilyen módon a vizsgálat 7. napján. A 3. csoportban 10 malacot és a 4. csoportban 5 malacot elkülönítetten tartottunk, de hasonló körülmények között, és ezek szolgáltak nem vakcináit egyidejű kontrollként. Az 1., 2. és 3. csoport malacait a vizsgálat 14. napján fertőztük. A fertőző inokulum virulens PRRS-vírus volt (VR-2332, 3-szor passzált, 3,7 log-io vírus/1,0 ml), a vírust intranazálisan adagoltuk 2,0 ml térfogatban malaconként. A 4. csoport malacait nem fertőztük meg. Az összes malacot 10 napon keresztül tartottuk megfigyelés alatt a légzési betegség klinikai jeleinek megfigyelése céljából. A vizsgálat befejezésekor az összes malacot fájdalommentesen megöltük, hogy a tüdőléziókat kiértékelhessük.
A fertőzés időpontjában az 1. csoport malacai szerológiailag pozitívak voltak IPT-vizsgálat szerint, de
HU 223 763 Β1 szérumsemlegesítő aktivitás szempontjából nem. Ezzel ellentétben az összes többi malac - beleértve a 2. csoport malacait is - negatívak voltak mindkét módszer szerint. A 2. csoport 50%-a pozitív volt IPT-vizsgálattal a 7. DPC-n, és 100% pozitív volt a 10. DPC-n. A 3. csoport malacai IPT szerint pozitívak voltak a 10. DPC-n. Az 1. és 2. csoportban is egy-egy malacon szérumsemlegesítő aktivitás volt kimutatható a 10. DPC-n, illetve a 7. DPC-n. A szérumsemlegesítő eredmények nem szignifikánsan különböztek P=0,05 szinten. A fenti vizsgálat eredményei bizonyították a védőhatás megjelenését a kezelés következtében még akkor is, hogyha a malacok a fertőzés időpontjában szerológiailag negatívak voltak, vagy szérumsemlegesítő aktivitás nem jelentkezett. Nem biztos, hogy a védőhatás közvetlen kapcsolatban van a humorális immunitással. A módosított élő vakcinával végzett vakcinálásra válaszként keletkezett sejt mediálta immunitás fontos szerepet játszhat a virulens fertőzés elleni védelemben.
A 4. példában a fertőzést követően a virémia hiánya fontos kritérium volt a vakcinálás védőhatásának bizonyítására. Azonban a jelen vizsgálatban a vakcinálás és a fertőzés közötti rövid periódus miatt a vakcináit állatokban nem fejlődött ki vakcinálás utáni virémia. Továbbá, mivel a fertőzés egy homológ fertőzés volt, nem lehetett különbséget tenni a fertőző vírus és a vakcinavírus között. Az 1. csoportban 4 malac a 2. csoportban 1 malac negatív volt virémiára legalább egy vizsgálati időpontban a 3. DPC-től a 9. DPC-ig. A 3. csoport 0,01 %-a volt pozitív virémiára ugyanebben a periódusban.
Az előző példákkal ellentétben jelentős klinikai légzési tüneteket figyeltünk meg ebben a vizsgálatban. A 3. csoportban 10 állat közül 9-ben légzési nehézségek jelentkeztek egy vagy több napon keresztül (a napok átlagos száma 3,6 volt). Az 1. és 2. csoportban az egy vagy több napon keresztül légzési nehézségeket mutató állatok száma 1, illetve 0 volt (P<0,001). Az orrlyukak tekintetében a klinikai jelek gyakorisága hasonló volt a légzési jelekhez. A 3. csoportban a 10 állat közül 8 mutatott klinikai tüneteket az orrlyukat tekintve egy vagy több napon keresztül. A klinikai jelek átlagos időtartama 3,1 nap volt. Ezzel ellentétben az 1. és 2. csoportban szignifikánsan eltérő eredményeket kaptunk, az időtartam átlaga 1,3 nap, illetve 0,1 nap volt (p<0,001). A többi klinikai paraméter megjelenése nem volt jelentős.
Mindkét vakcináit csoportban nagyobb volt a tömeggyarapodás, mint a fertőzött kontrollcsoportban. A 2. csoportban az átlagos tömeggyarapodás 4,8 kg (10,6 font) volt a 10 napon megfigyelési periódus alatt, szemben a 3. csoportban mutatkozó 3,53 kg (7,8 font) tömeggyarapodással (P=0,01). Az 1. csoportban az átlagos tömeggyarapodás 4,35 kg (9,6 font) volt, amely nem volt szignifikánsan eltérő a 3. csoporthoz viszonyítva. Ebben a csoportban volt a két legkisebb malac, amelyek testtömege 3,17 kg (7 font), illetve 5,67 kg (12,5 font) volt a kísérlet 0. napján és 2,72 kg (6 font), illetve 5,44 kg (12 font) a fertőzés időpontjában. A csoport átlagos tömeggyarapodása, ha a két legkisebb malacot nem vettük figyelembe, 5,58 kg (12,3 font) volt, amely szignifikánsan eltért a 3. csoport eredményeitől (P<0,001). Két malac gyenge tömeggyarapodását annak lehetett tulajdonítani, hogy ezek nem tudtak versenyezni a csoportban lévő nagyobb malacokkal. Ezekben a malacokban hasmenést is megfigyeltünk a fertőzés utáni megfigyelési időszakban. A 4. csoportban a malacok átlagos tömeggyarapodása 6,89 kg (15,2 font) volt a 10 napos periódus alatt. Naponta átlagosan 0,45 - 0,68 kg (1,0 - 1,5 font) tömeggyarapodás várható ilyen korú malacoknál. Ezek az eredmények bizonyítják, hogy a vakcinával történő kezelés a 7. és 14. napon a fertőzést megelőzően védelmet biztosított, amelynek következtében a testtömeg a várt sebességgel gyarapodott.
A fertőzést követően a 3. csoportba tartozó malacokban elnyújtottan 5,9 °C (1 °F) hőmérséklet-emelkedést figyeltünk meg a fertőzés előtti átlagértékhez képest átlagosan 4,6 napon keresztül. Az 1. és 2. csoportba tartozó malacokban hasonló hőmérséklet-emelkedés átlagosan 0,5, illetve 1,1 napon keresztül volt megfigyelhető (P<0,001). A vakcináit 20 malac közül csak egyben alakult ki 5,9 °C (1 °F) hőmérséklet-emelkedés két egymást követő napon keresztül, ezzel szemben a 3. csoportba tartozó 10 malac közül 8-ban. A statisztikai különbség a vakcináit és kontrollállatok közül P<0,001. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az 1. és 2. csoportba tartozó malacokban a vakcinálás megakadályozta a virulens PRRS-vírussal történő érintkezés eredményeként a láz megjelenését.
A 3. csoportba tartozó malacokban drámai módon csökkent a fehérvérsejtszám a 3., 5. és 7. DPC-n. Ezek az eredmények szoros összefüggésben vannak az állatok fenti időszakban mutatott hőmérséklet-emelkedésével. A vakcináit csoportokba tartozó malacokban csak enyhe leukopénia volt megfigyelhető, amely 1-2 napon keresztül tartott, mielőtt visszaállt volna a fertőzés előtti érték. A vakcináit malacokban az értékek szignifikánsan eltérőek voltak a fertőzött kontrollokétól (P<0,001). Ezek az eredmények alátámasztják a fertőzés előtti 7. vagy 14. napon végzett vakcinakezelés által biztosított védelmet, mivel ennek eredményeként a leukopénia mértéke és időtartama is csökkent.
A fertőzés előtti 14. vagy 7. napon végzett vakcinakezelés csökkentette a tüdőléziók súlyosságát. Mindkét vakcináit csoport szignifikánsan különbözött a fertőzött kontrollcsoporttól (P=0,01). A vakcináit állatokban a pontszámok hasonlóak voltak a 4. csoportéhoz, vagyis a normálkontrollcsoporthoz. Az átlagos tüdőpontszám a 3. csoportban 97,1 volt, ezzel szemben az 1. és 2. csoportban 9,3, illetve 7. Az utóbbi két csoportban megfigyelt léziókat egészséges, hagyományosan nevelt malacokban is normális és várható előfordulásnak ítéltük meg.
A jelen vizsgálat eredményei azt bizonyítják, hogy egy módosított élő vírusvakcinával végzett vakcinálás 7 napon belül védő immunitást váltott ki. Szignifikáns különbségeket figyeltünk meg a hőmérsékletválaszokban, a testtömeg-gyarapodásban, a leukopéniában, tüdőléziókban és a klinikai tünetekben a vakcináit malacok kísérletes fertőzése után a nem vakcináit, fertőzött malacokkal összehasonlítva.
HU 223 763 Β1
6. példa
Ebben a példában 100-100 db háromhetes választási malacból álló két csoportot (A és B) vakcináltunk vagy az 1. példa szerinti 70-szer passzált PRRS-MLVvel, vagy placebóval (steril víz). Mindkét kezelési sorból 30 malacot figyeltünk meg a nemkívánatos reakciók szempontjából, a testhőmérséklet, tömeggyarapodás és az injekció által okozott helyi reakciói megfigyelésével. Ezeken a malacokon és a csoportba tartozó többi 70 malacon is mindkét csoportban a kezelést követő 28 napon keresztül megfigyeltük az általános egészségi állapot jeleit. A vizsgálat eredményei azt bizonyítják, hogy a vakcina nem okozott mellékhatásokat, és biztonságos volt, amikor egy PRRS-pozitív kondában megfelelően alkalmaztuk.
A vakcinálás előtti (-2. DPV) rektális hőmérsékletek azt mutatták, hogy a kísérletben alkalmazott malacok nem voltak normális, egészséges malacok. Az A csoportba tartozók hőmérséklete szignifikánsan nagyobb volt, mint a B csoportba tartozóké a -2. és a -1. napon (P<0,05). Nem volt szignifikáns különbség a két csoport között a kísérlet 0., 1., 2. és 3. napján (P<0,05). Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a módosított élő PRRS-vakcinával történő vakcinálás nem súlyosbította a fennálló magasabb testhőmérsékletek által okozott állapotot.
A két kezelt csoportba tartozó állatok közül egy sem mutatott kezelés utáni reakciót az oltás helyén. Ezek az eredmények tovább bizonyítják a vakcina biztonságosságát, ha azt megfelelő módon adagoljuk.
A kísérlet -2. napjától a kísérlet 27. napjáig tartó napos periódus során az A csoportba tartozó malac átlagos testtömeg-gyarapodása 9,53 kg (21,01 font), míg a B csoportba tartozó 29 malacé átlagosan 8,24 kg (18,18 font) volt. Ez a különbség szignifikáns P<0,05 szinten. Ezt a vizsgálatot aktív PRRS-fertőzéssel szemben végeztük, az eredmények a biztonságosságra ugyanúgy utalnak, mint a hatékonyságra.
A klinikai megfigyelések eredményei azt jelzik, hogy a vakcinálás szignifikánsan csökkenti a súlyos klinikai paraméterek gyakoriságát. A paraméterek pontszámai csökkentek, így a megjelenés 62-ről 6-ra, a széklet 48-ról 24-re, a szem 162-ről 89-re, az orrlyuk 30-ról 0-ra, a száj 30-ról 0-ra, az étvágy 91-ről 13-ra, a kezelések 37-ről 14-re és a pusztulás 5-ről 0-ra. Az 1. csoport által kapott kezelések számának csökkenése a B csoporthoz képest szignifikáns volt (P<0,05). A klinikai jelek csökkenése további bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a módosított élő PRRS-vakcina biztonságos, amikor olyan kondában alkalmazzák, amelyben PRRS-vírusnak tulajdonítható járvány kitörése van kialakulóban.
Összefoglalóan, bebizonyítottuk, hogy a vakcina biztonságos, amikor olyan kondában alkalmazzuk, amelyben PRRS-fertőzésnek tulajdonítható aktív klinikai betegség van kialakulóban. A vakcina nem erősíti a klinikai tüneteket akár a PRRS-vírusnak tulajdoníthatók, akár egy másodlagos patogénnek, amely a kísérlet során ismerten jelen volt. A fenti vizsgálati helyen fennálló körülmények között ezek az eredmények a jótékony hatást is bizonyították a vakcinával kezelt csoportban.
7. példa
Ebben a példában 20 db specifikus patogénmentes, vegyes nemű, holland fajtatenyészetből származó öthetes malacok 75-ször passzált ATCC-VR2332-vakcina (ATCC-VR2495) alacsony dózisával történő vakcinálásának hatását vizsgáltuk a Lelystad vírus (LV) terjedésére. Az LV vad törzsei azért fontosak, mert hajlamossá teszik a malacokat egy másodlagos légzőszervi fertőzésre, és rossz általános állapotot és nagyobb mortalitási arányokat okoznak. Ebben a példában adatokat közlünk a vakcina az európai antigén típusú LV vírus átvitelére kifejtett hatására vonatkozóan.
A malacokat két, 10-10 állatot tartalmazó csoportra választottuk szét, egy kísérleti csoportra és egy kontrollcsoportra. A kísérleti csoportba tartozó malacok mindegyikét intramuszkulárisan vakcináltuk 2 ml hígított vakcinával, amely közelítőleg 103 TCIDS0-et tartalmazott 75-ször passzált ATCC-VR2332-vakcinából. 6 héttel később mindegyik csoportból 5 állatot intranazálisan fertőztünk vad típusú európai LV törzzsel (kód CDI-NL-2.91, Tér Huurne, ötször passzálva sertés-alveolárismakrofágokban), a fertőző dózis 105·3 TCID50/2 ml volt. A fertőzés után 1 nappal a malacokat visszavittük óljaikba.
A kísérletben azt vizsgáltuk, hogy a vakcináit és nem vakcináit malacok közül mikor és mennyi mutatja a betegség klinikai tüneteit vagy válik virémiássá, és vajon az érintkezéssel fertőzött óltársak közül mennyien válnak Lelystad vírussal fertőzötté. Ezután számszerűleg meghatároztuk a fertőzést a vakcináit és kontrollcsoportban, és kiszámítottuk a Lelystad vírus átvitelének arányát a vakcináit és kontrollcsoportban. Ahhoz, hogy a vakcinálás sikeres legyen, a betegség és virémia súlyosságának és időtartamának, és az átvitel arányának kisebbnek kell lennie a vakcináit csoportban, mint a kontrollcsoportban.
Ebben a vizsgálatban, amikor a vizsgálatot egyrészt extrém alacsony vakcinadózissal és heterológ fertőzéssel végeztük, kimutattuk a vakcina védőhatását.
A vakcinálás csökkentette a betegség klinikai jeleit a fertőzés után. A vakcinálás szignifikánsan csökkentette az átlagos rektális hőmérsékleteket a fertőzés után; szignifikánsan csökkentette a fertőzött malacokban a virémiás állapot napjainak számát; és szignifikánsan csökkentette a virémia mértékét a fertőzött malacokban. Ezenkívül, noha átvitel a közvetlenül fertőzöttekről az érintkezéssel fertőzöttekre nem jelentkezett minden malacnál sem a vakcináit, sem a nem vakcináit csoportban, szignifikáns különbséget találtunk a vad típusú LV-átvitelben a vakcináit és nem vakcináit csoport között.
Megállapítottuk, hogy az amerikai antigén típusú PRRS-vakcinával, a 75-ször passzált ATCCVR2332 alacsony dózisával történő vakcinálás hatékonynak bizonyult védőhatás kialakításában az európai antigén vad típusú Lelystad vírussal történő fertőzés ellen.
HU 223 763 Β1
8. példa
Vakcina előállítása ipari méretekben
Az 1. ábra mutatja az 1. példa szerinti élő, módosított oltó törzstenyészet ipari mennyiségeinek előállítására szolgáló eljárás folyamatábráját.
A P10 eljárás a P12 lépéssel kezdődik, amely az összes tartály sterilizálásából áll. A sterilizálást előnyösen besugárzással végezzük, de termikusán vagy kémiai úton is végezhetjük. A tartályok típusa lehet inokulumlombik, például 75-150 ml-es, 5 l-es lombik, forgó tenyésztőedény és acél, légkeverős bioreaktor edény.
A P14 lépésben a gazda MA-104 sejtekből méretnagyított tenyészeteket állítunk elő. Az MA-104 sejtvonal törzstenyészetét 58 passzálás után cseppfolyós nitrogénben tároljuk, és ezt alkalmazzuk gazdasejtforrásként a vírustenyészet előállításához 78 passzáláson keresztül. Az MA-104 törzstenyészeteket 75-150 mles térfogatú lombikokban szaporítjuk el, amelyek 50-150 ml tápközeget tartalmaznak. A tápközeg előnyösen 10% marha- vagy magzati borjúszérummal, és körülbelül 30 pg/ml neomicinnel kevert MÉM. A steril lombikokat és tápközegeket előnyösen körülbelül 1 ml előpasszált ΜΑ-104-tenyészettel oltjuk be, és körülbelül 35 °C és körülbelül 37 °C közötti hőmérsékleten 3-7 napon keresztül inkubáljuk.
A törzs sejttenyészetek méretnagyítását előnyösen 150 ml-es lombikról körülbelül 400-600 ml tápközegre végezzük, 1:5 térfogatarányban. 4-7 nap inkubálás után körülbelül 35-37 °C-on ezt a 400-600 ml tenyészetet átoltjuk egy tápközeggel töltött 5 l-es lombikba. Úgy is eljárhatunk, hogy az inokulumot 1:3,4 arányban forgótenyészetbe visszük át, amelyben körülbelül 670-850 cm2 tenyésztőfelület és 150 ml tápközeg van, majd ezt oltjuk át egy másik forgó tenyésztőedénybe körülbelül 1:9-1:11 arányban. Az így nyert tenyészeteket azután körülbelül 4-7 napon keresztül körülbelül 35-37 °C-on inkubáljuk.
A P16 lépésben állítjuk elő a vírussal fertőzött MA-104 sejtek termelőtenyészetét. A 14. lépés szerinti méretnagyított tenyészetet rendszerint tovább nagyítjuk nagyobb térfogatú bioreaktor-edényekben, körülbelül 1:3-1:5 térfogatarányban. A termelőtenyészet például egy 5 l-es méretnagyító lombik lehet, vagy egy 40 l-es rozsdamentes acél tenyésztőedény, amely levegős keverővei, hőmérséklet-szabályozóval és pHszabályozóval van felszerelve. Az edényt a tenyésztőközeg megfelelő mennyiségével feltöltjük, MA-104 sejtekkel inokuláljuk, körülbelül 35 °C-on 4-7 napon keresztül inkubáljuk, és az 1. példa szerinti oltó törzstenyészettel fertőzzük. A vírus titere előnyösen legalább 10® TCID50/ml CPE szerint, és a termelőtenyészethez legalább 0,1-10 ml/100 ml tápközeg arányban adjuk hozzá. A termelőtenyészetet körülbelül 35 °C-körülbelül 37 °C-on 2-3 napon keresztül inkubáljuk a gyengített vírussal történő fertőzés után.
A P18 lépésben a P16 lépés szerinti termelőtenyészeteket a fertőzés utáni inkubációs periódus után összegyűjtjük. A massza összegyűjtésének megfelelő idejét a CPE megfigyelésével határozzuk meg, amelyet körülbelül 10%-os makroszkopikus változás (lekerekített sejtek és sejtréteg-degradálódás) vagy 10%-os pH-változás jelez. A P16 lépés szerinti termelőtenyészetet steril tető alatt (laminar flow hood) gyűjtjük össze úgy, hogy steril tartályba vagy zárt összegyűjtő rendszerbe öntjük pozitív nyomás alatt. Az így összegyűjtött vírust lefagyasztjuk, és -40--70 °C-on tároljuk.
A minőség-ellenőrzési mérésekhez szükséges esetben aliquotokat veszünk. Az egyes nagy tömegű, összegyűjtött tenyészetből származó mintákat tioglikolát és emésztett szójababkazein tápközegen vizsgáljuk, az inkubálást körülbelül 36 °C-on, illetve 20 °C-on végezzük 14 napon keresztül mindkét hőmérsékleten. Ezt az oltó vírust alkalmazzuk a soronkövetkező tenyészetek előállítására, ha a vizsgálatok legalább körülbelül 105 TCID50/ml titert mutatnak CPE-vel. A nem megfelelő anyagot 5%-os nátrium-hipoklorittal 24 órán keresztül végzett kezeléssel, vagy autoklávozással sterilizáljuk.
A P20 lépésben a P18 lépésben kapott nagy tömegű lefagyasztott vírust stabilizáljuk és liofilizáljuk. A nagy tömegű lefagyasztott vírust felolvasztjuk, és előnyösen gyógyászatilag összeférhető stabilizálószerrel, például szokásos szacharózzselatin stabilizálószerrel elegyítjük körülbelül 3 rész felolvasztott oltó törzstenyészet:körülbelül 1 rész stabilizátor arányban. A vírus végkoncentrációjának beállítására fiziológiás sóoldatot is adhatunk hozzá.
Az elegyet ezután körülbelül 0,28 ml folyadékmennyiségből álló dózis-altérfogatokra osztjuk szét, az egyes dózisok körülbelül 0,20 ml PRRS-tenyészetet tartalmaznak dózisonként, a minimális titer 104·9 TCID50/dózis. Itt jegyezzük meg, hogy a P16, P18 és P20 lépésből származó stabilizált termelőtenyészet előnyös mennyisége 150 000-500 000 stabilizált dózis előállításához elegendő. Például 25 dózis körülbelül 7,0 ml altérfogatot tartalmaz. Ezeket az altérfogatokat dugóként fagyasztjuk le, előnyösen cseppfolyós nitrogénben. A szárítókamrát vákuum alatt tartjuk, míg a hőmérsékletet maximálisan körülbelül 30 °C-ra emeljük, és az altérfogatot maximum 18 órán keresztül ezen a hőmérsékleten tartva szublimáljuk a mintából a nedvességet.
A P22 lépésben a P20 lépésből származó vakcinaterméket folyamatosan ellenőrizzük. A végső mintákat, vagyis a több adagban előállított PRRS-vakcina-szériát tartalmazó tartályt szúrópróbaszerűen vizsgáljuk annak biztosítására, hogy a nedvességtartalom 5% alatt maradjon. A 4%-nál nagyobb vagy 1 %-nál kisebb nedvességtartalmú szériák potenciálját 6 havonta ellenőrizzük. A biztonságosság mérésére tengerimalacokat injektálunk a vakcina 10 dózisával ekvivalens tömeggel, és az állatokat 21 napon keresztül megfigyeljük a klinikai reakciók nemkívánatos jelei szempontjából.
A VR-2332 vírust az 1. példában ismertetett gyengítéssel párhuzamosan hidegadaptáltuk is. Ezt olyan vakcinatörzs kialakítása érdekében tettük, amely megakadályozza a fertőzött állatban a vírus betokozódását. A fenti hidegadaptálást úgy végeztük, hogy a vírust sorozatosan passzáltuk 31-35 °C-on. Az így kapott törzsek is képesek voltak immunválasz kiváltására.
HU 223 763 Β1
Claims (16)
1. Vakcinakészítmény, amely élő sertésszaporodási és -légzési szindróma (PRRS)-vírust tartalmaz módosított és lényegében avirulens formában, gyógyászatilag összeférhető hordozóanyaggal összekeverve, ahol a módosított, lényegében avirulens vírus az MA-104 majomvese-sejtvonal sejttenyészetében legalább 70-szer passzált ATCC-VR2332 vírus, amely módosított, lényegében avirulens vírus sertésnek vagy egyéb PRRS-re hajlamos emlősnek adagolva nem okoz PRRS-betegségre jellemző klinikai tüneteket, hanem az emlőst a PRRS patogén formái ellen immunizáló immunválaszt indukál.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a módosított, lényegében avirulens vírus az ATCCVR2495.
3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a hordozóanyag szacharózzselatin stabilizátort tartalmaz.
4. MA-104 majomvese-sejtvonal sejttenyészetében legalább 70-szer végzett passzálással módosított és avirulenssé tett ATCC-VR2332 vírus - amely módosított és avirulens vírus sertésnek vagy egyéb PRRS-re hajlamos emlősnek adagolva nem okoz PRRS-betegségre jellemző klinikai tüneteket, hanem az emlőst a PRRS patogén formái ellen immunizáló immunválaszt indukál - alkalmazása sertések sertésszaporodási és -légzési szindróma (PRRS) elleni immunizálására alkalmas vakcinakészítmény előállítására, amely élő sertésszaporodási és -légzési szindróma (PRRS)-vírust tartalmaz gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal összekeverve.
5. Eljárás PRRS-vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy
a)az ATCC-VR2332 vírus lényegében avirulens formájából előállítunk egy termelőtenyészetet oly módon, hogy az ATCC-VR2332 vírust legalább 70-szer passzáljuk MA-104 majomvese-sejtvonal sejttenyészetében, ezáltal a vírust módosítjuk, és lényegében avirulenssé tesszük, amely módosított és lényegében avirulens vírus sertésnek, vagy egyéb PRRS-re hajlamos emlősnek adagolva nem váltja ki a PRRS-betegségre jellemző klinikai tüneteket, hanem az emlőst a PRRS patogén formái ellen immunizáló immunválaszt indukál, és a módosított, és lényegében avirulens ATCC-VR2332 vírusból termelőtenyészetet állítunk elő;
b) a termelő vírustenyészetet összegyűjtjük;
c) a termelő vírustenyészethez stabilizálószert adunk; és
d) a termelő vírustenyészetet liofilizáljuk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben az előállítás során a majomvesesejtvonalat a vírussal fertőzzük, és a kapott tenyészetet körülbelül 35 °C-körülbelül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben a tenyészet összegyűjtése során a vírustenyészetet lefagyasztjuk.
8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépésben körülbelül 1 tömegrész szacharózzselatin stabilizátort körülbelül 3 tömegrész vírustenyészettel elegyítünk.
9. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a d) lépésben a vírustenyészet lefagyasztott mintájából nedvességet szublimálunk el.
10. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyészet 0,28 ml/dózis térfogatokból 150 000-500 000 dózist tartalmazó tenyészetet állítunk elő.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a liofilizálási lépés előtt a tenyészetet dózistérfogatokra szétosztjuk.
12. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lényegében avirulens vírusként ATCC-2495 vírust alkalmazunk.
13. Vakcina, amely az 5. igénypont szerinti eljárással állítható elő.
14. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a vírus 75-ször van passzálva.
15. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a vírus 75-ször passzált vírus.
16. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépésben 75-ször passzált vírust alkalmazunk.
HU 223 763 Β1 Int. Cl.7: A 61 K 39/12
P12
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/440,750 US6042830A (en) | 1992-08-05 | 1995-05-15 | Viral agent associated with mystery swine disease |
PCT/US1996/006800 WO1996036356A1 (en) | 1995-05-15 | 1996-05-14 | Viral agent associated with mystery swine disease |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUP9802493A2 HUP9802493A2 (hu) | 1999-02-01 |
HUP9802493A3 HUP9802493A3 (en) | 2001-10-29 |
HU223763B1 true HU223763B1 (hu) | 2005-01-28 |
Family
ID=23750027
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9802493A HU223763B1 (hu) | 1995-05-15 | 1996-05-14 | A "rejtélyes sertésbetegség" elleni vakcina, eljárás ennek előállítására, és alkalmazása |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6042830A (hu) |
EP (1) | EP0830142B1 (hu) |
JP (1) | JP4300252B2 (hu) |
KR (1) | KR19990014840A (hu) |
CN (1) | CN1130227C (hu) |
AT (1) | ATE213166T1 (hu) |
AU (1) | AU717395B2 (hu) |
BR (1) | BR9608535B1 (hu) |
CA (1) | CA2221242C (hu) |
CZ (1) | CZ296208B6 (hu) |
DE (1) | DE69619233T2 (hu) |
DK (1) | DK0830142T3 (hu) |
ES (1) | ES2170234T3 (hu) |
HK (1) | HK1016872A1 (hu) |
HU (1) | HU223763B1 (hu) |
MX (1) | MX9708804A (hu) |
PL (1) | PL184973B1 (hu) |
PT (1) | PT830142E (hu) |
RU (1) | RU2166327C2 (hu) |
SK (1) | SK283579B6 (hu) |
UA (1) | UA39991C2 (hu) |
WO (1) | WO1996036356A1 (hu) |
Families Citing this family (67)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2103460C (en) * | 1991-06-06 | 2000-09-26 | Gert Wensvoort | Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits |
ATE144144T1 (de) † | 1991-08-26 | 1996-11-15 | James Edward Collins | Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas) |
US6982160B2 (en) | 1991-08-26 | 2006-01-03 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunogenic compositions that include SIRS virus |
US5846805A (en) | 1991-08-26 | 1998-12-08 | Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. | Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells |
US6080570A (en) * | 1991-08-26 | 2000-06-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Method of producing a vaccine for Swine Infertility and Respiratory Syndrome |
US5695766A (en) * | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
US6380376B1 (en) * | 1992-10-30 | 2002-04-30 | Iowa State University Research Foundation | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
US6773908B1 (en) | 1992-10-30 | 2004-08-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
US6592873B1 (en) | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
US5866401A (en) * | 1996-03-01 | 1999-02-02 | Schering Corporation | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine |
JP3135069B2 (ja) * | 1996-03-01 | 2001-02-13 | シェーリング コーポレイション | ブタ生殖および呼吸症候群ワクチン |
EP0839912A1 (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
US20040224327A1 (en) * | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
FR2771375A1 (fr) | 1997-11-25 | 1999-05-28 | Saint Gobain Isover | Procede et dispositif de conditionnement de materiaux compressibles |
US7132106B2 (en) * | 1998-12-22 | 2006-11-07 | Pfizer Inc. | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
NZ501264A (en) | 1998-12-22 | 2001-09-28 | Pfizer Prod Inc | Polynucleotide DNA sequence encoding an infectious RNA molecule encoding a North American PRRS |
US7618797B2 (en) * | 1998-12-22 | 2009-11-17 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
US7691389B2 (en) | 1998-12-22 | 2010-04-06 | Pfizer Inc | Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof |
EP1157121B1 (en) * | 1999-03-08 | 2013-04-24 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Prrsv replicon |
MXPA01010681A (es) * | 1999-04-22 | 2003-08-20 | Us Agriculture | Vacuna de sindrome respiratorio y reproductiva porcina a base de ja-142 aislado. |
US20020012670A1 (en) * | 2000-01-26 | 2002-01-31 | Knut Elbers | Recombinant attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV) |
AU2002249852A1 (en) * | 2000-11-09 | 2002-08-12 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Enhancement of immune response to vaccine by interferon alpha |
US6841364B2 (en) * | 2002-01-22 | 2005-01-11 | Protatek International, Inc. | Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof |
AR049924A1 (es) * | 2004-06-18 | 2006-09-13 | Univ Minnesota | Identificacion de organismos viralmente infectados y vacunados |
US7632636B2 (en) * | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
UA95602C2 (ru) | 2004-12-30 | 2011-08-25 | Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. | Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции |
US7833707B2 (en) | 2004-12-30 | 2010-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2 |
AU2006205852A1 (en) | 2005-01-13 | 2006-07-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Improved PRRS vaccines |
US8834891B2 (en) | 2005-03-14 | 2014-09-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis |
CA2894069C (en) | 2005-06-24 | 2019-02-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Prrs viruses, infectious clones, mutants thereof, and methods of use |
EP1968630B1 (en) | 2005-12-29 | 2018-01-24 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Multivalent pcv2 immunogenic compositions |
DK3127551T3 (da) | 2005-12-29 | 2020-10-12 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Pcv2-immunogen-sammensætning til at mindske kliniske symptomer i grise |
US20100129397A1 (en) | 2006-12-11 | 2010-05-27 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections |
PT2481420T (pt) | 2006-12-15 | 2019-05-31 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Vacina para porcos anti-pcv2 de dose única |
EP1941903A1 (en) | 2007-01-03 | 2008-07-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prophylaxis and treatment of PRDC |
CN100523177C (zh) * | 2007-01-09 | 2009-08-05 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒疫苗株及其应用 |
AR064888A1 (es) * | 2007-01-12 | 2009-04-29 | Univ Illinois | Celulas no simias para el crecimiento del virus del sindrome reproductor y respiratorio porcino (prrs) |
US8563313B2 (en) * | 2007-02-13 | 2013-10-22 | Washington State University Research Foundation | Macrophage cell-lines for propagation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus |
EP1958644A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prevention and treatment of sub-clinical pcvd |
US7666585B2 (en) * | 2007-06-15 | 2010-02-23 | Protatek International, Inc. | Construction of chimera PRRSV, compositions and vaccine preparations |
US7829274B2 (en) | 2007-09-04 | 2010-11-09 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen |
US20090317423A1 (en) | 2008-01-23 | 2009-12-24 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
CN101612395B (zh) * | 2008-06-24 | 2012-02-08 | 扬州优邦生物制药有限公司 | 一种培养敏感细胞生产蓝耳病疫苗的方法 |
US20100003278A1 (en) * | 2008-07-03 | 2010-01-07 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Immunological Compositions Effective for Lessening the Severity or Incidence of PRRSV Signs and Methods of Use Thereof |
WO2010025109A1 (en) * | 2008-08-25 | 2010-03-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedia, Inc. | Vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome (hp prrs) |
JP5306943B2 (ja) * | 2009-08-24 | 2013-10-02 | 全国農業協同組合連合会 | 弱毒ウイルスの作出方法 |
TWI627281B (zh) * | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低pcv-2組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之pcv-2組合物 |
UA108902C2 (uk) | 2010-11-10 | 2015-06-25 | Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування | |
PL2675475T3 (pl) * | 2011-02-17 | 2015-12-31 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Nowy europejski szczep prrs |
US9944902B2 (en) | 2011-02-17 | 2018-04-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Commercial scale process for production of PRRSV |
US9315781B2 (en) | 2011-07-29 | 2016-04-19 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Infectious CDNA clone of european PRRS virus and uses thereof |
US9187731B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-11-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells |
US8906385B2 (en) | 2011-12-01 | 2014-12-09 | University Of Maryland, College Park | Interferon-inducing porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate |
WO2013173443A1 (en) | 2012-05-17 | 2013-11-21 | Zoetis Llc | Effective vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) virus prior to weaning |
CN105308178B (zh) | 2012-12-07 | 2019-06-07 | 伊利诺伊大学评议会 | 猪繁殖与呼吸综合征病毒组合物及其用途 |
EP2968513A2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use |
US9505808B2 (en) | 2013-10-02 | 2016-11-29 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PCV2 ORF2 protein variant and virus like particles composed thereof |
MX2020010248A (es) | 2013-12-20 | 2020-10-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Variante del virus prrs, clon de adnc del virus europeo y sus usos. |
CN103690633B (zh) * | 2013-12-25 | 2015-10-28 | 成都乾坤动物药业有限公司 | 一种含有枇杷叶的治疗畜禽呼吸道疾病综合征的兽用药物组合物 |
US9920302B2 (en) | 2015-08-31 | 2018-03-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Pestivirus vaccines for congenital tremors |
US10188725B2 (en) | 2015-12-14 | 2019-01-29 | Elanco Us Inc. | Hybrid core feline vaccines |
DK3534939T3 (da) | 2016-11-03 | 2023-04-24 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Vaccine mod porcin parvovirus og porcin reproduktions- og respirationssyndromvirus og fremgangsmåder til fremstilling deraf |
WO2018099889A1 (en) * | 2016-11-29 | 2018-06-07 | Intervet International B.V. | Swine vaccine |
BR112019012158A2 (pt) | 2016-12-14 | 2019-11-12 | Zoetis Services Llc | vacinação eficaz contra cepas europeias de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (prrs) antes do desmame |
EP4335455A3 (en) | 2017-04-13 | 2024-05-22 | Intervet International B.V. | Vaccines containing swine pathogens for associated non-mixed use |
US11701419B2 (en) | 2019-04-04 | 2023-07-18 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | Porcine Circovirus Type 3 (PCV3) vaccines, and production and uses thereof |
BR112023001324A2 (pt) | 2020-07-24 | 2023-02-14 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Combinação de vacina de suíno |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4753884A (en) * | 1986-01-28 | 1988-06-28 | Novagene, Inc. | Pseudorabies virus mutants, vaccines containing same, methods for the production of same and methods for the use of same |
ATE144144T1 (de) * | 1991-08-26 | 1996-11-15 | James Edward Collins | Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas) |
CA2076744C (en) * | 1991-08-26 | 2000-06-27 | Danny W. Chladek | Viral agent associated with mystery swine disease |
US5695766A (en) * | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
CZ289743B6 (cs) * | 1993-02-08 | 2002-03-13 | Bayer Corporation | Izolát viru vepřového reprodukčního a respiračního syndromu PRRSV, způsob kultivace PRRSV, tkáňová kultura, způsob přípravy vakcíny a vakcína obsahující PRRSV izolát |
ES2074950B1 (es) * | 1993-09-17 | 1996-03-16 | Iberica Cyanamid | Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda. |
-
1995
- 1995-05-15 US US08/440,750 patent/US6042830A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-14 CN CN96195440A patent/CN1130227C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-14 CZ CZ0361697A patent/CZ296208B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-05-14 HU HU9802493A patent/HU223763B1/hu active IP Right Grant
- 1996-05-14 DK DK96915746T patent/DK0830142T3/da active
- 1996-05-14 EP EP19960915746 patent/EP0830142B1/en not_active Revoked
- 1996-05-14 BR BRPI9608535-5A patent/BR9608535B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-05-14 CA CA 2221242 patent/CA2221242C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-14 PL PL96323365A patent/PL184973B1/pl unknown
- 1996-05-14 WO PCT/US1996/006800 patent/WO1996036356A1/en active IP Right Grant
- 1996-05-14 AT AT96915746T patent/ATE213166T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-05-14 UA UA97126039A patent/UA39991C2/uk unknown
- 1996-05-14 PT PT96915746T patent/PT830142E/pt unknown
- 1996-05-14 DE DE1996619233 patent/DE69619233T2/de not_active Revoked
- 1996-05-14 RU RU97120712A patent/RU2166327C2/ru active
- 1996-05-14 JP JP53495496A patent/JP4300252B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-14 KR KR1019970708184A patent/KR19990014840A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-05-14 ES ES96915746T patent/ES2170234T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-14 SK SK1539-97A patent/SK283579B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-05-14 AU AU57443/96A patent/AU717395B2/en not_active Expired
- 1996-08-15 US US08/698,240 patent/US5989563A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-11-14 MX MX9708804A patent/MX9708804A/es unknown
-
1998
- 1998-12-31 HK HK98119251A patent/HK1016872A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU223763B1 (hu) | A "rejtélyes sertésbetegség" elleni vakcina, eljárás ennek előállítására, és alkalmazása | |
US10668144B2 (en) | European PRRSV strain | |
CA2076744C (en) | Viral agent associated with mystery swine disease | |
US5695766A (en) | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome | |
US6001370A (en) | Attenuated strain of the virus causing the porcine reproductive respiratory syndrome (PRRS), and vaccines | |
AU734320B2 (en) | Vaccines inducing an immune response against viruses causing porcine respiratory and reproductive diseases | |
AU771883B2 (en) | Vaccines inducing an immune response against viruses causing porcine respiratory and reproductive diseases |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20041122 |