CN100523177C

CN100523177C - 猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒疫苗株及其应用

Info

Publication number: CN100523177C
Application number: CNB2007100012530A
Authority: CN
Inventors: 蔡雪辉; 王洪峰; 刘永刚; 郭宝清; 柴文君
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2007-01-09
Filing date: 2007-01-09
Publication date: 2009-08-05
Anticipated expiration: 2027-01-09
Also published as: CN101220348A

Abstract

本发明公开了猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome virus)弱毒疫苗株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.1883。本发明弱毒疫苗株遗传变异稳定，安全性好，对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪只均安全，无致病力。用本发明弱毒疫苗株免疫仔猪后，所免疫仔猪均能抵抗猪繁殖与呼吸综合症病毒强毒的攻击。

Description

猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及一种弱毒疫苗株，尤其涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒疫苗株及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由PRRSV引起的，以繁殖障碍、呼吸道症状为特点的，具有高度传染性的病毒病。1987年美国首先发现该病，Wensvoort等于1991年分离并鉴定了该病病原，PRRSV归属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)的动脉炎病毒属，是一种有囊膜的正链单股RNA病毒，由于PRRSV具有抗原漂移和变异的特性，并且它的主要靶细胞是具有重要免疫作用的肺泡巨噬细胞(PAM)，因此PRRSV的感染常伴有各种病原的继发感染，尤其是呼吸道病原。目前已给养猪业造成重大损失，引起了国际上的广泛关注。为了控制该病的发生和蔓延，开展PRRS的疫苗的研究显得尤为重要。国外先后研制出了预防PRRS的灭活苗和弱毒苗，并在预防和防制PRRS的发生和蔓延上发挥了巨大的作用。

近年来PRRS已在我国蔓延开来，严重阻碍了我国养猪业的发展，引起了我国有关部门的重视。1996年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所首次在国内分离和鉴定了该病病原，同时建立了IFA检测方法，经普查PRRS已遍布我国大部分的省市自治区，因此针对国内流行毒株的疫苗的研究显得十分迫切。虽然国外已经研制出了商品化的灭活苗和弱毒苗，但由于该病毒具有抗原变异和漂移的特性，因此国外疫苗的针对性相对较差，往往免疫效果并不理想，且国外已有报道，因使用PRRS弱毒苗而引起该病的爆发。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一株新的猪繁殖与呼吸综合症病毒弱毒疫苗株，该弱毒疫苗株遗传稳定、安全性好，对于猪繁殖与呼吸综合症病毒具有良好的免疫原性。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

本发明选用国内分离毒株PRRSV CH-1a株，在Marc-145细胞上低温传代后，再在37℃传到第110～170代时，进行全面鉴定，检测其纯净性TCID₅₀、毒力和免疫原性测定，并通过RT-PCR试验和对各代次的病毒的ORF5进行RFLP分析，证明110～170代PRRSV CH-1a种毒除其在Marc-145细胞上的病毒滴度有很大提高和致病性明显降低外，其它特性基本与低代次PRRSV CH-1a毒株特性相一致，将110～170代PRRSV CH-1a致弱毒株种毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndromevirus)命名为PRRSV CH-1R株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.1883；保藏时间是：2006年12月11日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。

把110代PRRSV CH-1a株定义为PRRSV CH-1R株1代，把PRRS活疫苗(CH-1R株)原始种子代次定义为PRRSV CH-1R株25～35代(PRRSV CH-1a株135～145代)；基础种子代次为36～45代(PRRSV CH-1a株146～155代)；生产种子代次为46～55代(PRRSV CH-1a株156～165代)。

免疫原性试验表明，用本发明弱毒株免疫仔猪后，所免疫仔猪均能抵抗猪繁殖与呼吸综合症病毒强毒的攻击。

本发明弱毒株的安全性好，毒力测定试验结果表明，本发明弱毒株对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪只均安全，无致病力。

通过RFLP的分析表明，PRRSV CH-1a株通过低温连续传代和多次克隆，当传至110代在PRRSV ORF5发生稳定的点突变，该突变稳定保持到170代，说明本发明弱毒株是一株具有稳定遗传变异的致弱毒株。

本发明弱毒株湿毒在-20℃的保存期为12个月，在-70℃的保存期为24个月；本发明弱毒株冻干毒在-20℃和-70℃的保存期为24个月。

本发明疫苗的使用方法：

(1)接种途径：颈部肌肉注射。

(2)接种剂量：仔猪在3～4周龄免疫，每头颈部肌肉注射疫苗1头份；母猪于配种前1周免疫，每头颈部肌肉注射疫苗2头份。

本发明弱毒株应用范围较宽，例如，可应用于制备成诊断繁殖与呼吸综合症病毒的诊断试剂，还可应用于制备成单苗或联苗(活或灭活疫苗)疫苗等。

附图说明

图1PRRSV CH-1a株传代次数与病毒滴度关系。

图2ORF5基因片段的RFLP分析结果。

图3用TspE I酶切ORF5的电泳图。

M：Marker DL2000 1：MLV；2、3：CH-1a株；4：VR2332株；5：GD-3株；6：CH-1a70代；7：CH-1a90代；8：CH-1a110代；9：CH-1a130代；10CH-1a150代；11：CH-1a155代；12：CH-1a160代；13：CH-1a170代。

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

具体实施方式

1.1试验用猪购自非疫区的PRRS血清抗体阴性猪场。

1.2病毒细胞培养及克隆化

1.2.1细胞培养Marc-145细胞系用DMEM细胞培养液培养，其中含4％灭活犊牛血清、100U/ml的青霉素、80μg/ml的链霉素，并用NaHCO₃调整pH值至7.2左右，过滤除菌。用此细胞培养液复苏或传代细胞系Marc-145至容量为100ml的灭菌小扁瓶里，待长成良好细胞单层后用于接种病毒。

1.2.2种毒的克隆化从国内分离的PRRSV CH-1a株在Marc-145细胞上传代，分别在传至30、50、70、90、110、130代时进行了病毒克隆，除30代种毒克隆挑选2mm蚀斑外，随后克隆均选择1mm蚀斑。30、50代种毒选取群体蚀斑(3～7个单蚀斑混合培养)，从70代种毒开始选取1mm以内单一蚀斑传代培养，经过90、110、130代获得了比较单一的蚀斑直径在1mm以内的疫苗用种毒，每传5代进行1次蚀斑大小检查，如出现5％以上大于2mm的蚀斑，则进行再次克隆纯化。

1.2.3种毒的低温培育将30代进行了克隆的PRRSV CH-1a株，置于36℃下继代10代，然后置于35℃下继代20代，随后置于34℃下继代30代，传至90代，恢复37℃下继续培养传代至170代，选取不同代次测定TCID₅₀。选取10、30、50、70、90、110、130、150、155、160、170代次的病毒，做病毒滴度测定。

试验结果：当PRRSV CH-1a在Marc-145细胞系传至30代时，其病毒滴度在10^5.0TCID₅₀/ml左右，在低于37℃的条件下培养时，病毒滴度提高不明显，直到传至90代病毒滴度才达到10^6.3TCID₅₀/ml。经测定PRRSV CH-1a在Marc-145细胞上传至110～170代时，病毒滴度达到10^7.0TCID₅₀/ml以上；传至170代时，仍稳定维持在10^7.0TCID₅₀/ml以上。结果见表1、图1。

表1 传代次数与病毒滴毒的关系

1.3理化特性试验取分离毒株的90、110、130、150、155、160、170代细胞毒悬液(10^7.1～10^7.5TCID₅₀/ml)5ml，平均分装于5试管中，试管1于56℃水浴作用45min；试管2加20％的乙醚震荡10min后，4℃过夜，无菌挥去乙醚；试管3先用0.1MHCl调pH至3.0，于4℃作用2h后用0.1NaOH调pH至7.2；试管4加5-碘脱氧尿核苷(5-IUDR)50μl，4℃作用12h；测定经过处理和未经处理的细胞毒悬液的TCID₅₀，试验结果见表2

表2 理化特性试验结果

1.4红细胞凝集试验采用微量板法，分别用0.5％的鸡、豚鼠、大鼠、兔和绵羊的红细胞悬液测定110、130、150、155、160、170代细胞毒悬液(10^7.1～10^7.5TCID₅₀/ml)的HA滴度，以50％红细胞凝集的最高稀释度作为判定终点。试验结果表明110、130、150、155、160、170代细胞毒悬液对0.5％的鸡、豚鼠、大鼠、兔和绵羊的红细胞均无凝集作用。

1.5毒力测定选用26头怀孕85～93天的母猪，用10、30、50、70、90、110、130、150、170代PRRSV CH-1a(4×10^7.2TCID₅₀)滴鼻，观察发病情况。试验结果见表3。

表3 毒力测定结果

代次	接种剂量(TCID<sub>50</sub>/ml)	头数	发病数	发病率
代次	接种剂量(TCID<sub>50</sub>/ml)	头数	发病数	发病率	10	4×10<sup>1.2</sup>	4	4	100％
30	4×10<sup>5.6</sup>	4	3	75％	10	4×10<sup>1.2</sup>	4	4	100％
30	4×10<sup>5.6</sup>	4	3	75％	50	4×10<sup>6.2</sup>	4	2	50％
70	4×10<sup>7.2</sup>	5	3	60％	50	4×10<sup>6.2</sup>	4	2	50％
70	4×10<sup>7.2</sup>	5	3	60％	90	4×10<sup>7.1</sup>	5	1	20％
110	4×10<sup>7.4</sup>	4	0	0％	90	4×10<sup>7.1</sup>	5	1	20％
110	4×10<sup>7.4</sup>	4	0	0％	130	4×10<sup>7.3</sup>	6	0	0％
150	4×10<sup>7.5</sup>	3	0	0％	130	4×10<sup>7.3</sup>	6	0	0％
150	4×10<sup>7.5</sup>	3	0	0％	170	4×10<sup>7.2</sup>	3	0	0％

从表3中发现在Marc-145细胞上传至110～170代PRRSV的致病力明显降低，而病毒滴度维持在较高的水平。

1.6PRRSV ORF5基因的扩增分别对90、110、130、150、155、160、170代次病毒的ORF5基因进行扩增，使用引物见表4，反应条件见表5。

表4 ORF5基因进行扩增所用引物

引物名称	引物序列
引物名称	引物序列	P5S	5′AAG AAT TCA CCA TGG TGG GGA AAT GCT TGA C 3′
P5R	5′AAA CTA GTA TAG AGA CGA CCC CAT TG 3′	P5S	5′AAG AAT TCA CCA TGG TGG GGA AAT GCT TGA C 3′

表5 ORF5基因进行扩增PCR反应条件

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果，结果均扩增到特异目的条带(见图2)。

1.7ORF5基因片段的RFLP分析

采用TspE I限制性内切酶对已经纯化各代次的ORF5进行酶切，按TspE I限制性内切酶使用说明进行。以上反应均在37℃下，反应2小时，然后取10μl反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳分析，具体琼脂糖凝胶电泳结果见图3。

1.8免疫原性试验将25头28～35日龄PRRSV抗体阴性仔猪，随机分为5组(5头/组)，第1～4组为试验组，第5组为对照组。取150、155、160、170代细胞毒悬液(10^7.1～10^7.5TCID₅₀/ml)各免疫5头仔猪，2ml/头，第5组设为不注射疫苗的对照组。在免疫后28天经鼻内接种2×10^5.0TCID₅₀PRRSV CH-1a株强毒，测量仔猪体温并观察仔猪临床表现，共观察14天。

试验结果将150、155、160、170代细胞病毒悬液(10^7.1～10^7.5TCID₅₀/ml)接种仔猪后，均无不良临床反应出现。在免疫后28天用猪繁殖与呼吸综合症强毒攻击，免疫组仔猪体温正常，也无其它异常反应，而对照组的猪均出现了体温升高和呼吸困难的症状，说明这4代次细胞病毒悬液具有良好的免疫原性，均能完全保护仔猪抵抗强毒的攻击，具体结果见表6。

表6 PRRS活疫苗(CH-1R株)对仔猪的主动免疫试验结果

1.9无菌检验取分离毒株的110、130、150、155、160、170代细胞毒悬液(1×10^6.6TCID₅₀/ml)按照按《中国兽药典》进行，试验结果表明无杂菌污染。

1.10支原体检验取分离毒株的110、130、150、155、160、170代细胞毒悬液(1×10^6.6TCID₅₀/ml)按《中国兽药典》进行，试验结果表明无支原体污染。

1.11外源病毒检测按《中国兽药典》进行。

利用猪三价(HCV、PPV、BVDV)荧光抗体、猪伪狂犬病毒荧光抗体检测，均未检测到特异性荧光；采用细胞病变(CPE)方法检测，未见Vero细胞出现CPE；采用红细胞吸附法检测，未见Vero细胞出现血细胞吸附现象出现。试验证明，CH-1R株PRRS种毒未检测到外源病毒污染。

1.12毒种保存期试验将冻干毒种和湿毒种分别在-20℃和-70℃保存6、12、24、30月定期检查病毒滴度，并记录结果，试验结果见表7。

表7 毒种不同条件下的保存期试验结果

从表7可知，冻干毒种在—20℃下，最长可达24月，在—70℃下，保存24个月病毒滴度无明显变化。湿毒种在—20℃以下，最长可达12月，在—70℃以下，保存24个月病毒含量无明显变化。

Claims

1、猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndromevirus)弱毒疫苗株，其微生物保藏号是：CGMCC NO.1883。

2、一种疫苗组合物，其特征在于：由权利要求1的弱毒疫苗株、药学上可接受的佐剂或载体所组成。

3、权利要求1的弱毒疫苗株在制备防治猪繁殖与呼吸综合症病毒药物中的用途。