CN1284382A - 减毒的猪生殖及呼吸综合症病毒株及其应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及猪生殖及呼吸综合症(PRRS)病毒的一株新病毒株,并描述了这种PRRS病毒株的发现、分离、鉴定及用途。本发明还包括含有活的、死的,或者病毒的该病毒株,或者该病毒株的部分或成分的物质组合物。本发明还提供了疫苗组合物及以其为基础的诊断试剂盒。

Description

减毒的猪生殖及呼吸综合症病毒株及其应用方法
本发明涉及一株新的猪生殖与呼吸综合症(PRRS)病毒的发现、分离、鉴定和用途。本发明还涉及猪PRRS疾病的诊断与保护性抗原和疫苗，以及其制备和应用的方法。
本文所有的公开物和专利申请，均作为参考文献引用，就象每个公开物和专利申请具体和单独指明的那样是作为参考文献而引用。
最早描述猪生殖及呼吸综合症(PRRS)的是美国(1987年)和德国(1990年)。后来报道这种疾病的其它一些国家包括：法国(1)，丹麦(2)，荷兰(3)，日本(4)，加拿大(5)，西班牙(6)，英格兰(7)。PRRS可能对美国和欧洲的猪饲养者造成经济灾难。有证据表明，美国和欧洲分离株具有很大的遗传性和抗原性差别(29)。
这种综合症已有各种不同的称呼，如：神秘的猪病，猪不育和呼吸综合症(SIRS)，青紫流产胎，蓝耳猪病，“Lelystad病毒”，“Heko-heko”疾病，猪流行性流产和呼吸综合症(PEARS)(8-10)。
由PRRS病毒引起的疾病可由以下一些特征进行鉴定：大母猪严重的生育失败，导致木乃伊化，死产和衰弱猪的发生率增加的晚期流产；发情期恢复延迟的慢性病，轻微到严重的呼吸不畅，包括打喷嚏，咳嗽以及幼猪鼻眼流出物；断奶前、断奶及生长中的猪死亡率增加；成长猪到成熟猪中一种轻微的类似流感的疾病；结膜炎及淋巴结增大(11-13)。呼吸综合症常常与一些继发性细菌病原体的严重感染相关，包括出血败血性巴斯德氏菌，副猪嗜血杆菌及猪链球菌(8)。实验性接种小猪，显示出一些临床病症，如抑郁症，厌食，发热，腹泻，坐姿，眼周浮肿(12)，有研究估计，在91个荷兰饲养场中由于PRRS引起的经济损失是每年每头母猪平均29.5kg，这是由于每头母猪每窝生产的小猪数量减少，延长了产小猪的间隔期并加快了大母猪更换率(3)。
与这种疾病相关的病毒是一种有包膜的RNA病毒，属于披膜病毒科的动脉炎病毒属。有关的形态学，形态发生和病毒组成的资料首先提示，PRRS病毒属于动脉炎病毒属。通过分析基因组构成及基因表达策略，并比较推断的蛋白质序列，可以证实该结论。这些动脉炎病毒也包括马动脉炎病毒(EAV)，乳酸脱氢酶升高病毒(LDV)和猿猴出血热病毒(SHFV)。PRRS病毒属于单链RNA病毒，具有正极性的病毒基因组，其大小约为15kb(15)。据估计这些球形病毒粒子直径为48～83nm，含有被包膜包围的25～30nm的核心(3)。正链RNA基因组至少个有三种主要的结构蛋白，称其为N，M和E。其中N蛋白被认为是核衣壳的主要成分，而M和E是膜相关蛋白(16)。已经测定了来自重叠cDNA克隆的分离株CDI-NL-2.91(巴斯德研究所保藏号I-1102)的PRRS病毒的基因组RNA的核苷酸序列(17)，在该分离株得到的15088bp连续序列中已鉴定了八个开发读框(ORFs)。另一株美国分离株ATCC VR 2332的基因组3’一部分也已经克隆并测序(18)，所得的3358个核苷酸含有6个ORF，与PRRS病毒的欧洲株的第2到7个ORFs和动脉炎病毒属中的其它成员有同源性。
如前面所述，有证据显示，PRRS病毒的不同分离株之间的遗传性和抗原性差异很大。因此，有必要分离、鉴定并应用新的PRRS病毒分离株。在本文中，我们报道了命名为JK-100的一种新的PRRS病毒株的发现、分离和用途。
本发明包括取自受感染猪群中选定小猪的PRRS病毒株的鉴定和分离，所选用的小猪显示出病毒血症和血清转变的迹象，但还没有临床症状。更具体地说，我们已经鉴定并分离了一株命名为JK-100的新的PRRS病毒株。
这种命名为JK-100的PRRS病毒株按国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约，于2000年8月8日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC V200005。
本发明也提供了基本上相应于JK-100株的PRRS病毒株。术语“基本上相应于”指的是JK-100的自发变异和人工变异株，特别是那些可由以下技术检测的变异株，如杂交，PCR和用JK-100特异性材料如JK-100特异性抗体的ELISA。
本发明提供了在某种细胞系如MARC145细胞系中高效价繁殖JK-100株的方法。本发明提供了包括JK-100株的物质组合物。更具体地说，本发明提供了包含活的、灭活的或减毒的JK-100病毒的物质组合物。
本发明还提供了用于接种动物，特别是哺乳动物，更具体地说是猪或猪类，以保护动物抵抗PRRS病的疫苗组合物。更具体地说，该疫苗组合物包括：活的、灭活的或者减毒的JK-100病毒株；或者JK-100的抗原性部分或组份；来源于JK-100的蛋白质或其抗原性多肽，或者模拟其抗原性成分的肽；以及合适的载体或佐剂。因此，本发明也提供了制备和使用活体病毒或灭活的病毒抗原(常规的或重组的抗原)的方法，以及通过用稀释剂或/和佐剂分别结合免疫有效量的病毒得到的疫苗。
本发明也提供了一种检测样品，特别是来自动物，特别是哺乳动物，更具体地说是猪的生物样品，如血液或血清、痰、唾液、精液或组织的样品中来自JK-100的抗原的诊断试剂盒，该试剂盒包含特异识别JK-100的部分或组分的抗体，以及适当的抗原检测分析的检测工具。本发明还提供了一种检测样品中特异性识别JK-100的抗体的诊断试剂盒，所述样品特别是来自动物，特别是哺乳动物，更具体地说是猪的生物样品，如血液或血清、痰、唾液、精液或组织的样品，该试剂盒包含JK-100；JK-100的抗原性部分或组分；来源于JK-100的蛋白或抗原性多肽；或来源于JK-100的抗原多肽；模拟JK-100抗原性组分的肽；和抗体检测分析的适当的检测工具。
本领域的技术人员很容易根据特殊情况需要而进行一些必要的调整。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语，与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解具有相同的意义。尽管在实践或试验本发明时可以与本文所述类似或等价的任何方法和材料，但本文还是描述了优选的方法和材料。
如上所述，本发明描述了PRRS病毒分离株JK-100的分离，以获得用作疫苗和诊断分析的病毒抗原。接种疫苗是抗PRRS病毒或其组分的主动免疫，最终目的是保护宿主动物抵抗后来的自然出现的PRRS病毒的攻击。病毒疫苗的两个广义的分类是减毒活疫苗和非感染性疫苗。
非感染性疫苗包括失活的“灭活”病毒疫苗，亚单位疫苗，合成肽和生物合成多肽疫苗，以及抗独特型抗体疫苗。“灭活”的或“死的”病毒疫苗由经化学试剂或射线处理破坏了其感染力的病毒颗粒组成。用以下方法能很方便地制备疫苗：PRRS病毒在猪肺巨噬细胞培养物或者其它支持病毒生长的细胞体系中生长，再用已熟知的技术，如用福尔马林或γ-辐射灭活法灭活纯化的或者没有纯化的病毒。然后将灭活的PRRS病毒与佐剂结合，如弗氏佐剂或氢氧化铝或者其它佐剂，该组合物即可注射入猪体内。这些病毒粒子保留了引起免疫应答的能力，并能预防感染。用更小的PRRS病毒组分，如多肽、肽、或病毒抗原成分的模拟肽制成的疫苗也能用作死疫苗。
减毒的病毒指的是经受了在细胞培养物中连续传代或其它方法减毒的任何病毒。减毒疫苗是含有对宿主致病力已减小或消失的有机体的活疫苗。施用减毒疫苗产生主动免疫。通过在不同于自然宿主种类细胞中重复传代而减弱活体病毒毒性是产生减毒活病毒疫苗的主要方法之一。通过病毒在猪肺巨噬细胞，其它物种的肺巨噬细胞，或者其它细胞系统，或其它动物如兔中连续传代，直到其失去致病性，可制备针对PRRS的减毒疫苗。优选的能用于产生减毒PRRS的非宿主细胞包括非洲绿猴的肾细胞(22)和MARC-145细胞(19)。活体病毒疫苗可经过皮下、皮内、肌内、鼻内、口服用药，或者作为口咽部喷雾状药剂施用。
针对PRRS的活疫苗或死疫苗也可通过重组DNA技术制得，通过该技术，将病毒基因组或其部分掺入到诸如牛痘病毒、疱疹病毒、假狂犬病病毒、腺病毒的载体系统或其它能如此表达病毒抗原的合适的载体系统中。重组载体可包含：含有编码来源于PRRS病毒的蛋白或抗原肽的核苷酸序列的核酸；病毒的抗原性部分或组分；模拟病毒抗原性多肽或其抗原性组分的蛋白或肽；以及合适的载体或佐剂。动物，特别是哺乳动物，更特别是猪，接种这种载体体系后将会增强其针对PRRS的保护性免疫应答。
PRRS的血清学诊断可用本领域熟知的方法检测血清或初乳样品来完成，该方法包括免疫过氧化物酶单层分析测定(IPMA)，免疫荧光抗体(IFA)，酶联免疫吸附分析(ELISA)以及血清病毒中和(SVN)试验(23，27，30)。一旦鉴定出被感染的动物，就可用本领域的技术人员熟知的方法分离PRRS病毒。然后将PRRS病毒增殖到高效价，转化成高水平的抗原物质，可通过本领域已知的方法获得其衍生物。例如，通过稀释、浓缩或提取病毒可得到抗原物质。在中和试验中向病毒-血清混合物中加入10％或者20％的豚鼠新鲜血清可得到更高效价的中和抗体(24，25)。同时也表明，这种病毒-血清混合物不是直接在37℃保温60分钟，而是首先在4℃保温24小时或者48小时，然后与补体在37℃保温60分钟时，可增加许多血清样品中需要补体的中和抗体的效价(24，25)。另一方面，可在分子水平鉴定这种保护性抗原，并可通过重组技术进行繁殖和表达。衍生物的例子包括按照本发明有效的其亚基和重组体形式。
可用以下方法产生亚单位制剂。用经典的生化方法，从感染了PRRS病毒的宿主细胞溶胞产物制备病毒蛋白。用检测抗原表达的技术，如IFA监测感染细胞中感染原的生长。用现有的PRRS病毒纯制剂，我们可以利用重组DNA技术的宿主直接产生亚单位。用标准方法，从感染了PRRS病毒的细胞培养物的溶胞产物可很容易地制备PRRS病毒的遗传物质。编码已鉴定为重要免疫原蛋白的基因，或者编码可能是PRRS病毒致免疫的蛋白的基因，可以用从共有序列产生的引物进行定位，然后亚克隆到本领域公知的表达载体类型中。
这种载体可在细胞中表达，或在无细胞酶转录/翻译系统中表达。可表达和纯化由该载体编码的抗原性蛋白，如果它被正确地翻译后修饰，就可按照本发明用作免疫原。
经鉴定是编码免疫原性蛋白的基因，可以用本领域已知的标准技术进行扩增和纯化以便亚克隆以及DNA测序。例如，分离的基因或者基因片段可以直接克隆到载体中，或者首先连接到具有合乎需要的限制性酶切位点的接头上。从克隆的DNA片段获得的DNA测序数据可与已知的序列，如Gen Bank登录库中的序列相比较，以便鉴定所分离的有机体并更精确地探索PRRS病毒的分子生物学基础，以及预防由它引起的疾病。
上面提到的制剂要求有指示试剂鉴定抗原性蛋白或者检测宿主细胞中PRRS病毒的存在。这种指示剂能从接触了PRRS病毒的猪中分离的多克隆超免疫血清中获得，或者通过开发针对完整PRRS病毒的单克隆抗体组而获得。针对PRRS病毒的抗原的单克隆抗体，可通过裂解感染细胞，以梯度离心法从裂解物中纯化PRRS病毒，用SDS-PAGE电泳法分离并纯化蛋白而制得。SDS-PAGE凝胶可用考马斯蓝或者银染剂染色而得到PRRS病毒蛋白和碳水化合物的带型。可用受PRRS病毒感染猪的恢复期血清或用超免疫血清对部分SDS-PAGE凝胶进行Western印迹分析而检测猪中哪些蛋白是抗原性的，因而是免疫原。与血清抗体结合的转印蛋白，可通过顺序加入适当的用过氧化物酶标记的抗-抗体缀合物和识别过氧化物酶的显色底物来观测。更精确地测定抗原反应性不是通过整个蛋白质，而是对蛋白质片段进行SDS-PAGE电泳来测定。
可通过从SDS-PAGE凝胶中提取特殊蛋白并注射到适当的实验鼠系中来产生针对特殊蛋白的单克隆抗体组。从免疫鼠脾脏分离的B-细胞可以与一种永久细胞系融合，并筛选鉴定产生针对靶蛋白的抗体的稳定杂交瘤。
收集受PRRS病毒感染的细胞，经梯度离心纯化，并与针对PRRS病毒的单克隆抗体组接触，以测定PRRS病毒表面存在哪些抗原性表位。然后用荧光标记的抗免疫球蛋白显示已结合单克隆抗体的细胞。然后可大量生产特异性针对PRRS病毒表面抗原的单克隆抗体，并可预防性地施用到猪群中。例如已制得了抗该病毒核衣壳蛋白和19kDa膜蛋白的单克隆抗体(26，28)。有研究发现，从这种病毒的欧洲分离株制得的单克隆抗体不和美国分离株结合，表明美国和欧洲分离株推断的核衣壳间存在恒定的抗原性差异(31)。
针对PRRS病毒表面抗原的具有活性的单克隆和多克隆抗体，不仅可用作选择体外产生的抗原蛋白的工具，而且本身可能用作治疗剂。针对PRRS病毒表面抗原决定簇的抗体在小猪中施用时，很可能会针对PRRS病毒产生被动免疫。
针对PRRS病毒产生的抗体也可用于野外实验，通过以下分析方法监测猪群中PRRS病毒的存在，如用ELISA或Western印迹通过结合能专一识别该蛋白质的抗体到该蛋白质上而显示特异的PRRS病毒蛋白，如PRRS病毒表面携带的蛋白的存在。这种方法可用于鉴定某些家畜是否是不含PRRS病毒的。同时，这种方法用在常规的猪筛选计划方面时，可对种畜群的发育及生长情况向饲养者报警。
材料与方法
病毒的分离：
从受感染但未出现PRRS病的临床迹象的小猪中收集血清样品。通过0.45微米滤膜过滤血清，小容量等分，然后于-60℃贮存。
在含有铺满单层MARC-145细胞的75cm2烧瓶中接种1ml血清(19)。细胞系在补充了10％胎牛血清的Eagle极限必需培养基(MEM)中生长并在37℃保温(20)。接种培养物保存在含有5％胎牛血清的MEM中，并在32℃保温。每天观察细胞以证明致细胞病变效应(CPE)。最初通过细胞变圆来观察CPE，接种后3～4天，细胞从基质上的脱壁率为70％。
在另一个含有铺满单层的MARC-145细胞的75cm2培养瓶中接种1ml培养基。剩余的培养基小容量等分，并在-60℃贮存。
该过程重复5次。从第5次传代获得的效价为5.5 log TCID50/ml。
受孕卵上的检验：
传代5次的自然分离株(0.5ml)接种到10日龄的受孕鸡蛋中，保温5天。接种后鸡蛋的尿囊液进一步通过SPF鸡蛋传代二次。用鸡红血细胞与传代三次的尿囊液进行血凝试验(HA)(21)。
结果发现该病毒呈HA阴性。
猪肾细胞上的检验
PK15细胞系在25cm2烧瓶中生长，所用的培养基是Dulbecco改进的基础培养基(DMEM)，并补加10％的胎牛血清。
将1ml自然分离株接种到单层细胞中，在含有5％胎牛血清的DMEM中于37℃维持。培养基用同样方法盲传二次(21)。
该病毒对PK15细胞不产生致细胞病变效应(CPE)。
病毒的后续传代
该病毒在MARC-145细胞系中进一步传代到20代。后续的病毒传代物产生更显著的CPE，第20代传代物效价达到8.17 logTCID50／ml。
通过滴定可测定每次病毒传代物的病毒效价，也可通过免疫荧光抗体分析(IFA)测试以检验这种病毒。
免疫荧光分析
通过IFA(免疫荧光抗体分析)证实这种自然分离株是PRRS病毒，IFA用的是命名为SDOW17(1)的PRRS病毒属特异性单克隆抗体和来自没有显示PRRS病临床迹象的受感染猪的多克隆抗血清。
MARC-145细胞接种到96孔微量培养板中，在37℃ CO2培养箱中培养过夜。用MEM对病毒分离物进行连续稀释。稀释的病毒加入到孔中，再培养48小时。该细胞用无水乙醇固定并空气干燥。
来自SDOW17的单克隆抗体和猪的多克隆抗血清用作这种试验的主要抗体。用于SDOW17和猪血清的第二抗体分别是FITC缀合的抗小鼠IgG和FITC缀合的抗猪IgG(11)。
荧光仅在细胞的胞质中发现，显示出PRRS病毒的存在。
体内试验
该试验用传代20代的病毒在实验室进行。6log TCID50/ml的病毒接种五只3周龄小猪。实验包括有一个对照小猪。整个实验中，小猪都没有出现PRRS疾病的症状。
收集三周后小猪的血清用于IFA。用来自SDOW17的单克隆体和没有显示PRRS病症的受感染猪的多克隆抗血清一起检测受试血清。
结果显示这种自然分离物是PRRS病毒，在体内不产生临床病症。
功效试验
为了表明病毒株JK-100可防止PRRS，进行了接种疫苗攻击研究。对PRRS抗体呈阴性的小猪、小母猪和/或大母猪(在下文中统称为“猪”)，用活的或死的JK-100接种免疫。没有接种免疫的猪分开饲养用作对照组。检测全体猪的血清转变。随后，免疫接种和对照组猪接受PRRS攻击病毒。每天观察食物摄取、直肠温度和其它临床症状。对照组猪显示出疾病迹象，而接触JK-100(接种的)猪没有出现临床病症。这种接种疫苗攻击研究的结果表明，对临床PRRS的防护作用是用JK-100免疫接种的结果。
前述的详细描述仅仅是为了理解清楚而提供的，而不应理解为必要的限定，因为作出修改对本领域的技术人员而言是显而易见的。
参考文献：
下列每篇引用文献均在本文中作为参考文献引用：
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21、Wensvoort G,Terpstra C,Pol JMA,ter Laak EA,Bloemraad M,de Kluyer EP,Kragten C,Van Buiten L,den Besten A,Wagenaar F,Broekhuijsen JM,Moonen PLJM,Zestra T,de Boer EA,Tibben JH,deJong MF,van′t Veld P,Groenland GJR,Van Gennep JA,Voets Mth,Verheijden JHM,Braamskamp J，荷兰的神秘猪病：Leystad病毒的分离。Vet O13：121-130(1991)。
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29、Done SH,Paton DJ和White ME，猪生殖及呼吸综合症(PRRS)：着重于病理学，病毒学及诊断方法的回顾，Ｂr Vet J(英国)152(2)：153-174(1996)。
30、Yoon KJ,Zimmerman JJ,Swenson SL,McGinley MJ,EernisseKA,Brevik A,Rhinehart LL,Frey ML,Hill HT和Platt KB。J Vet DiagnInvest(美国)7(3)：305-312(1995)。
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Claims (7)

1、一种命名为JK-100的猪生殖及呼吸综合症病毒分离株，其于2000年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCV200005。
2、一种包含权利要求1的病毒的物质组合物。
3、根据权利要求2的物质组合物，其中的病毒是灭活的。
4、一种含有命名为JK-100的猪生殖及呼吸综合症病毒分离株的疫苗组合物，其中该病毒株于2000年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCV200005。
5、如权利要求4的疫苗组合物，进一步包括一种佐剂。
6、权利要求4的疫苗组合物，其中的病毒已被灭活。
7、权利要求6的疫苗组合物，进一步包括一种佐剂。
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