CN107815439A - 牛传染性鼻气管炎病毒jsm株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程和免疫领域，特别是涉及牛传染性鼻气管炎病毒JSM株及其应用，属于兽用生物制品领域，本发明利用牛传染性鼻气管炎病毒JSM株和牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型NMM株形成联合活疫苗，从而可以预防不同品种的牛由该两种病毒引起的感染，降低由上述病毒感染造成的经济损失。该疫苗使用后免疫牛无局部和全身不良反应，真正实现“一针两防”，安全可靠。

Description

牛传染性鼻气管炎病毒JSM株及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程和免疫领域，特别是涉及牛传染性鼻气管炎病毒株JSM及其应用，属于兽用生物制品领域。

背景技术

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV-1)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病，临床表现为上呼吸道及气管黏膜发炎、呼吸困难、流涕等症状，还可引起脓疱性外阴道炎、龟头炎、结膜炎、幼牛脑膜炎、乳房炎、流产等。该病于二十世纪50年代初最早见于美国，目前世界范围内流行。我国于1980年首次从新西兰进口种牛中发现此病，目前在大部分省份的奶牛、黄牛和水牛均有IBRV感染，造成较大的经济损失，疫苗是防控该病的主要措施之一。

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)引起的以发热、黏膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、咳嗽及怀孕母牛流产或产出畸形胎儿为主要特征的一种传染病。牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)属于黄病毒科(Flaviviridae)，瘟病毒属(Pestivirus)。基因组为单股正链RNA，由一个开放阅读框(ORF)和5’UTR及3’UTR组成。1946年Olafson等首次发现并分离出BVDV,目前，该病在世界上广泛存在。李佑民等于1983年首次从流产胎儿的脾脏中分离到了BVDV，证明该病已在我国存在。近年来从我国多个发病牛场分离到了BVDV，给我国养牛业带来巨大的经济损失。对我国部分省份的牛血清样品进行检测，结果表明，该病在我国呈上升态势。

在临床病例研究中发现，BVDV和IBRV往往混合感染。因此本领域迫切需要开发一种能够同时安全、有效抵抗BVDV和IBRV的疫苗制剂。

发明内容

为了获得安全性好、免疫力高、无免疫干扰的牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻二联活疫苗组合物，达到同时预防IBR和BVD的目的。本发明首先公开了一株牛传染性鼻气管炎病毒株，该毒株命名为IBRV JSM株，并于2016年8月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，其保藏号是：CGMCC NO.12666。

该病毒是由IBRV病毒在细胞连续传代弱化而来。具体来说，本发明人从疑似发病牛鼻拭子中分离得到IBRV病毒，并将其接种MDBK细胞连续传代培养，经细胞亚克隆筛选和病毒的克隆纯化100代获得。本发明人将其命名为IBRV JSM株，其病毒含量可达10^8.5TCID₅₀。

本发明同时保护这一IBRV JSM株在制备预防由牛传染性鼻气管炎病毒引起的疾病的药物中的应用。

同时，本发明公开了一种疫苗，该疫苗中含有前述的牛传染性鼻气管炎病毒株。

并且在本发明中我们进一步要求保护含有前述牛传染性鼻气管炎病毒株的疫苗或与其他病原体的疫苗组分共同组成的多联疫苗，特别是与其他病原体的疫苗组分共同组成的二联疫苗。

作为一种优选，在本发明中我们特别的公开了牛传染性鼻气管炎病毒与牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型组成的二联疫苗。

其中，牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型优选为本发明人新获得牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型NMM株(BVDVⅠ型NMM株)，该病毒于2016年8月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，其保藏号是：CGMCC NO.12664。

该病毒是由BVDVⅠ型病毒传代弱化而来。具体来说，本发明人从疑似感染牛血液中分离得到BVDVⅠ型病毒。并将其接种MDBK细胞连续传代培养，经细胞亚克隆筛选和病毒的克隆纯化80代获得，本发明人将其命名为BVDVⅠ型NMM株，其病毒含量可达10^6.5TCID₅₀以上。

进一步地，我们还保护这一牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型在制备预防由牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型引起的疾病的药物中的应用，其中所述的药物为疫苗。

最后，在本发明中我们还公开了以牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型NMM株与牛传染性鼻气管炎病毒JSM株制备牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻二联活疫苗的方法，包括以下步骤：

a)将牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型NMM株与牛传染性鼻气管炎病毒JSM株分别进行培养，收获病毒液；

b)将两种病毒液混合；

c)向混合病毒液中加入冻干保护剂，冷冻真空干燥，得到二联活疫苗。

关于这一制备方法，我们进一步将其细化描述为，包括以下步骤：

(1)将细胞系进行传代和培养；

(2)将牛传染性鼻气管炎病毒JSM株和牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型NMM株分别接种长满90％～100％细胞的介质上，用细胞维持液培养，制备生产种毒；

(3)将所制备的生产种毒分别接种长满90％～100％细胞的介质，用细胞维持液培养，得到牛传染性鼻气管炎病毒JSM株病毒抗原液和牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型NMM株病毒抗原液；

(4)将牛传染性鼻气管炎病毒JSM株病毒抗原液和牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型NMM株病毒抗原液,分别按每头份病毒含量为不低于10^3.5TCID₅₀混合，加入冻干保护剂，冷冻真空冻干制成。

其中，所述的细胞维持液为含0.5～2μg/ml胰酶及3.5％(v/v)马血清的DMEM培养液或MEM培养液，pH值为7.0～7.2。

优选地，步骤(1)中所述的传代细胞系包括牛肾细胞系(MDBK细胞系)、牛睾丸细胞(BT细胞系)、牛鼻甲骨细胞系(BT细胞系)、Vero细胞系、BHK21细胞系、牛原代细胞、MDCK细胞系、牛子宫细胞系(NCL-1细胞系)、NCL-1细胞系、兔肾原代细胞(CRL-1414)、兔肾细胞(LLC-RK1)。

作为另一优选，步骤(1)中所述细胞系的传代和培养包括：将细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，细胞长满90％～100％时，用于继续传代或接种病毒；其中，所述的细胞生长液为含有6％～8％(v/v)的小牛血清的DMEM培养液，pH值为7.0～7.2；所述的细胞培养方法为以下任意一种：在转瓶中培养，使其细胞密度达到2×10⁵～6×10⁵/ml；或在生物反应器中添加附着载体进行悬浮培养或不添加任何载体进行纯悬浮培养，使细胞密度达到2×10⁶～5×10⁶/ml，所述的附着载体为微载体或纸片。

同时，我们还进一步优选，步骤(1)、(2)或(3)中所述的培养温度为33～37℃，细胞培养环境是含5％左右CO₂的培养箱或生物反应器或不含CO₂的转瓶；病毒培养时间为30～72小时。

更进一步地，我们优选在步骤(2)或(3)中所述的牛传染性鼻气管炎病毒JSM株的病毒接种量MOI为0.01～0.03，牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型NMM株的病毒接种量MOI为0.03～0.05。

本发明中公开的二联疫苗为活疫苗，其制造成本低、免疫持续期长、安全性好、免疫效力好、实际使用方便；并且该疫苗可以同时预防牛传染性鼻气管炎和牛病毒性腹泻的二联活疫苗，通过该制品进行免疫接种，可有效保障牛免受BVDV和IBRV的感染，又可“一针两防”，省时、省力、节约成本。弥补了我国相关商品化疫苗市场中BVD疫苗和IBR疫苗的空白，能够有效缓解我国养牛业面对相关疫情时的巨大威胁。

附图说明

图1不同代次IBRVPCR扩增电泳图；

M.DNA Marker DL2000；1.F3 gB基因扩增条带；2.F100 gB基因扩增条带；3.阴性对照.

图2根据IBRV F3、F100代gB基因构建的系统进化树。

图3根据BVDV Ⅰ型F30、F80代E2基因构建的系统进化树。

图4 BVDV Ⅰ型F30、F80代E2基因与其他毒株E2基因核苷酸序列的同源性比较(％)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 IBRV JSM株的获得

(1)病毒的噬斑克隆纯化

将IBRV在MDBK细胞上连续传代，每8～10代进行一次噬斑克隆纯化，每隔若干代进行病毒含量测定及病毒中和试验，试验结果如表1、表2所示。

表1 不同代次IBRV病毒培养液的滴度

表2 不同代次IBRV病毒中和试验检验结果

(2)不同代次毒株致病性分析

将IBRV F30、F70和F105代病毒分别稀释至10^7.0TCID₅₀/ml，稀释后分别接种牛传染性鼻气管炎病毒抗原、抗体阴性健康牛3头，同时分别设2头接种PBS的牛作为对照。病毒接种后连续观察试验动物临床症状，测定试验动物体温。实验结果如下：

体温测定：F30代和F70病毒接种后1头牛接种后体温升高超过40.0℃以上其余毒种接种组和对照组牛体温均正常。

临床症状：F30代病毒接种后1头牛在接种后流鼻液症状，其余试验动物均无临床症状；F70代病毒接种组和对照组牛均无临床异常。

综合体温、临床症状及病毒分离结果，F30代病毒接种后试验动物1/3发病，F70代病毒对牛无致病力。

(3)PCR扩增及序列分析

IBRV F3和F100代病毒经PCR扩增，引物及反应条件与实施例1相同，结果均得到306bp的片段。经测序，确定为IBRV gB基因片段。如图1。

IBRV F3和F100代病毒均扩增得到306bp的gB基因，F3和F100代病毒gB基因的核苷酸序列相同，gB基因与其他参考毒株间亲缘关系未发生改变(见图2)。

综合上述试验结果分析，随着病毒在细胞上传代适应，F10代病毒病毒滴度可达到10^8.0TCID₅₀/ml；F30、F70和F100代病毒均能被IBRV阳性血清中和，接种MDBK细胞不出现细胞病变。致病性研究表明，F70和F100代病毒对牛无致病力，且均具有良好的免疫原性。序列分析结果表明，F3和F100代病毒gB基因核苷酸同源性在99％以上。将该传代致弱毒株命名为IBRV JSM株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.12666，保藏日期为2016年8月24日。

实施例2 BVDV Ⅰ型NMM株的获得

(1)病毒的噬斑克隆纯化

将BVDV1型病毒在MDBK细胞上连续传代，每8～10代进行一次克隆纯化，选择第F35、F55、F70和F80代病毒进行病毒含量测定和病毒中和试验，实验结果如表3、表4。

表3 不同代次BVDV Ⅰ型病毒培养液的滴度及中和试验结果

表4 不同代次BVDV1型病毒中和试验检验结果

(2)不同代次毒株致病性分析

病毒驯化致弱至F35和F80代时，将BVDV1F35和F80代病毒分别稀释至10^7.0TCID₅₀/ml，接种牛病毒性腹泻病毒抗原、抗体阴性健康牛各3头牛，同时分别设2头牛作为对照，接种PBS。病毒接种后连续14日每日观察试验动物临床症状，测定试验动物体温。实验结果如下：

体温测定：各代次病毒接种组和对照组牛体温均正常。

结果，F35、F80代病毒接种组和对照组牛均未发病。

(3)E2基因序列分析

用合成的引物对BVDV Ⅰ F3和F80代病毒的E2基因进行扩增，上游引物为E2PF：5’-CCAGTTGAACCTCACAGT-3’，下游引物为E2PR：5’-GTGCTGCCATTATTGTTACT-3’。结果均扩增获得1636bp的目的片段。对扩增序列进行分析，结果F35和F80代病毒E2基因大小均为1122bp，且同源性为97.8％。E2基因系统进化树见图2，与其他毒株E2基因核苷酸序列的同源性比较见图3。

综合上述试验结果，BVDVⅠ型F35和F80代病毒均能被BVDV阳性血清中和。动物试验结果表明，F35和F80代病毒对牛无致病力。经序列分析，F3和F80代病毒E2基因同源性为97.8％。我们选用该分离毒的传代致弱株作为制苗用毒株，并将其命名为BVDV1NMM株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.12664，保藏日期为2016年8月24日。

实施例3利用MDBK悬浮培养技术生产牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻Ⅰ型二联活疫苗

(1)将液氮罐中的MDBK细胞取出，置37℃水浴中融化，用含6％～8％血清的DMEM培养基重悬细胞，接种于普通细胞培养瓶内，置于37℃，5％CO2的培养箱中生长72小时，传代培养。

(2)将长满细胞单层的MDBK细胞消化后接种至2L生物反应器，50转/分-80转/分，向反应器中加入0.1％的消泡剂，培养72小时。pH值控制在7.2-7.4。当细胞密度达到2×106个/mL时，从2升反应器放大到10升反应器。细胞密度达到2×106个/mL。

(3)将经过驯化的MDBK细胞从2升反应器放大到10升反应器，加入0.1％消泡剂，培养48～72小时，当细胞密度达到2×106个/mL时，分别按BVDV Ⅰ型NMM株MOI 0.05、IBRV JSM株MOI 0.01接种病毒，37℃悬浮培养。每隔6小时取样一次检验细胞形态，约14小时收获病毒培养液。该步骤中所用培养基为无血清的专用悬浮培养基。

(4)将病毒含量和无菌检验合格的病毒液作为制苗用病毒液。将两种病毒抗原配比确定为每头份疫苗BVDV Ⅰ型NMM株和IBRVJSM株病毒含量均≥104.7TCID50。将病毒混合液与冻干保护剂按体积比4:1比例混合均匀，即为疫苗原液。

(5)将分装好的疫苗瓶置于冻干机内，对疫苗进行冻干。

(6)疫苗冻干后BVDV和IBRV病毒含量下降均≤100.5TCID50/ml；各批次疫苗真空度检验均呈紫色辉光，真空度良好；且剩余水分均不超过4.0％。

Claims (10)

1.一株牛传染性鼻气管炎病毒株，其特征是，该毒株命名为牛传染性鼻气管炎病毒JSM株(IBRV JSM株)，并于2016年8月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，其保藏号是：CGMCC NO.12666。

2.权利要求1所述的牛传染性鼻气管炎病毒株在制备预防由牛传染性鼻气管炎病毒引起的疾病的药物中的应用。

3.一种疫苗，其特征是，该疫苗中含有权利要求1所述的牛传染性鼻气管炎病毒株。

4.如权利要求3所述的疫苗，其特征是，所述疫苗为多联疫苗。

5.如权利要求4所述的疫苗，其特征是，所述疫苗为二联疫苗。

6.如权利要求5所述的疫苗，其特征是，所述疫苗中还含有牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型。

7.如权利要求6所述的疫苗，其特征是，所述牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型名称为BVDV Ⅰ型NMM株，并于2016年8月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，其保藏号是：CGMCCNO.12664。

8.权利要求7中牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型在制备预防由牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型引起的疾病的药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征是，所述的药物为疫苗。

10.制备牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎二联活疫苗的方法，其特征是，包括以下步骤：

a)将牛传染性鼻气管炎病毒JSM株和牛病毒性腹泻病毒Ⅰ型NMM株分别进行培养，收获病毒液；

b)将两种病毒液混合；

c)向混合病毒液中加入冻干保护剂，冷冻真空干燥，得到二联活疫苗。