CN118308291A - 牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株及制备方法与应用，属于生物医学技术领域。本发明通过筛选获得一种牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株，解决了目前MDBK‑野生型细胞株培养的BVDV病毒的复制滴度有限，生产效率低，成本较高的问题。所述牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株命名为牛源肾脏传代细胞系MDBK‑C14，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45823，保藏时间为2024年3月4日。本发明所述的牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株能够大幅度提高牛病毒性腹泻病毒的复制滴度，可应用于牛病毒性腹泻病毒疫苗种毒生产，从而降低成本。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株及制备方法与应用。
背景技术
牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus, BVDV）引起的一种急性、热性、接触性传染病。该病呈世界性分布，感染情况复杂，隐性感染率极高，给全球养牛业造成了巨大损失 。BVDV具有广泛的宿主嗜性及组织嗜性，通常感染牛，各年龄阶段牛对本病毒均易感，尤以6~18个月的犊牛发病率高，可引起牛生长缓慢、繁殖紊乱、产能降低等多种症状。山羊、绵羊、猪、骆驼等多种动物也可感染，但感染后不产生明显临床症状，是本病的重要传染源。更为主要的是，妊娠50~150天母畜感染后病毒可通过胎盘垂直传播至胎儿，此时由于胎儿免疫系统尚未发育完全，未能识别BVDV而引起免疫耐受，出生后即成为BVDV持续感染牛，且终生带毒，并通过鼻涕、唾液、精液等不断向外界排毒，成为畜群重要的传染源。更为重要的是，BVDV可经血清污染疫苗、干扰素、冻精等生物制品，严重威胁生物制品的安全性与有效性。自1980年我国科研人员首次分离报道BVDV以来，该病毒已在我国大多数省份地区广泛流行，流行病学调查研究发现，我国超过46.7%的牛场BVDV抗原检测为阳性，牛群中BVDV持续性感染率高达2.2%，BVDV在我国呈现感染范围广、感染率高等特点，且多病原混合感染严重 。牛肾传代细胞系（Madin-Darby bovine kidney, MDBK）是BVDV传代培养的常用细胞系，该细胞系通常用于牛病毒性腹泻病毒（BVDV）疫苗种毒生产。
BVDV属于黄病毒科瘟病毒属，含囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小为12.3~12.5 kb 。基因组分为两侧的非编码区（5’-UTR和3’-UTR）和一个大的开放阅读框（ORF），可以编码四种结构蛋白（C, Erns, E1, E2）和八种非结构蛋白（Npro, p7, NS2, NS3, NS4A,NS4B, NS5A, NS5B）。5’-UTR是最保守的区域，作为BVDV亚型区分的依据，不含帽结构，含有核糖体进入位点（IRES）。根据BVDV在体外培养中是否能够裂解细胞以及是否能够引起持续感染 (Persistently Infection, PI) 动物患有致死性粘膜疾病 (Mucosal Disease,MD)，BVDV分为两种生物型 (Biotype)：细胞病变型 (Cytopathic Biotype, CP) 和非致细胞病变型 (Non-Cytopathic Biotype, NCP)。根据5’-UTR和抗原性差异BVDV可分为BVDV-1，BVDV-2和Hobi-like。BVDV-1又根据非结构蛋白NPro可分为1a，1b，1c等至少23个亚型，BVDV-2分为2a~2d 等4个亚型 。目前分离出的BVDV-1毒株远多于BVDV-2，其中以 BVDV-1b最为常见，BVDV-1型毒株常用于疫苗生产，疾病诊断以及病原学研究。BVDV-2多为无毒、弱毒株，少数为强毒株，但所有BVDV-2的强毒株都是NCP型 。BVDV-2 主要引起感染牛白细胞和血小板减少、发热、腹泻、出血。2004 年首次从巴西胎牛血清分离到瘟病毒“Hobi”株，与BVDV-1和BVDV-2亲缘关系较近，归为BVDV-3 。
疫苗接种是预防BVDV感染的有效措施，但在实际大规模疫苗生产过程中，MDBK-野生型细胞株培养的BVDV的病毒滴度较低，病毒扩大培养不理想，生产效率低，耗时耗力，阻碍了疫苗的高效生产。因此，如何提高BVDV灭活疫苗生产过程中病毒滴度，仍亟待解决。
发明内容
本发明公开了一种牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株及制备方法与应用，解决了MDBK-野生型细胞株培养的BVDV病毒的复制滴度有限，生产效率低，成本较高的问题。
本发明的技术方案如下：
一种牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株，所述细胞株命名为牛源肾脏传代细胞系MDBK-C14，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.45823，保藏时间为2024年3月4日。
进一步的，所述牛源肾脏传代细胞系MDBK-C14感染牛病毒性腹泻病毒呈现易感。
所述牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株MDBK-C14在牛病毒性腹泻病毒疫苗种毒生产中的应用。
有益效果：本发明提供了一种牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株及制备方法与应用，利用贴壁牛源肾脏传代细胞系MDBK-C14及悬浮牛源肾脏传代细胞系MDBK-C14培养BVDV时，病毒能稳定增殖，获得的病毒培养液中病毒含量均高于MDBK-野生型细胞株，其中在贴壁牛源肾脏传代细胞系MDBK-C14中病毒滴度至少提高4倍，在悬浮牛源肾脏传代细胞系MDBK-C14中病毒滴度至少提高18倍。病毒培养液中病毒含量的提高，可提升疫苗免疫后的免疫原性。因此，本发明获得的牛源肾脏传代细胞系MDBK-C14可应用于BVDV灭活疫苗的制备，在生物反应器大规模生产中，可利用牛源肾脏传代细胞系MDBK-C14提升BVDV的复制滴度，从而节约大量的生产成本，提升产品质量。
附图说明
图1为BVDV-1b毒株及VSV-GFP毒株分别感染MDBK-野生型细胞株与MDBK-C14细胞株的荧光图；
图2为BVDV不同基因亚型毒株感染MDBK-野生型细胞株与MDBK-C14细胞株的荧光图；
图3为BVDV在感染贴壁及悬浮细胞株后的病毒滴度图，其中粉色柱状图为BVDV在感染贴壁MDBK-C14细胞株和贴壁MDBK-野生型细胞株后病毒滴度的比值，蓝色柱状图为BVDV在感染悬浮MDBK-C14细胞株和悬浮MDBK-野生型细胞株后病毒滴度的比值。
【生物保藏信息】牛源肾脏传代细胞系MDBK-C14，分类命名为牛源肾脏传代细胞系Madin-Darby bovine kidney cell line，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45823，保藏时间为2024年3月4日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
实验材料：
材料与试剂
MDBK-野生型细胞株购买自美国细胞培养物收藏中心 (ATCC CCL-22) ；牛病毒性腹泻病毒毒株BVDV-1a、BVDV-1b、BVDV-1c、BVDV-1p、BVDV-1m、BVDV-1v、BVDV-2a以及VSV-GFP毒株由本实验室保存；DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清FBS购自Hyclone公司；马血清购自GE公司；青-链霉素、DAPI、Triton、BSA、多聚甲醛组织细胞固定液购自碧云天公司；PBS溶液及胰蛋白酶溶液由本实验室配置；BVDV E2蛋白特异性一抗Bovine ViralDiarrhea Virus Type 1&2 (BVDV-1&2) MAb E2 gp53 IgG2b Isotype (348, mouse) 购自VMRD公司；二抗Goat anti-Mouse/Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-AdsorbedSecondary Antibody, Alexa Fluor™488 (A-11029/A-11034) 购自Invitrogen公司。
本发明提供的牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株牛源肾脏传代细胞系MDBK-C14，在以下实施例中简写为MDBK-C14细胞株。
实施例1. 通过单克隆筛选获得BVDV易感单克隆MDBK-C14细胞株
将MDBK-野生型细胞株用含有10%FBS和1%青-链霉素双抗的DMEM培养基在37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养。随后采用0.25%胰蛋白酶溶液将细胞离散成单个细胞，取该细胞悬液，透过滤网，加入流式细胞专用管中，混匀后在流式细胞分选系统SONY-MA900Flow Cell Sorter中上机，将单克隆MDBK-野生型细胞株分选至96孔板中培养。待单克隆MDBK-野生型细胞株生长至单层后，进行病毒感染实验。将牛病毒性腹泻病毒的代表毒株BVDV-1b（MOI=1）感染不同单克隆MDBK-野生型细胞株24h及48 h后，对96孔板中的细胞进行间接免疫荧光鉴定。首先，将病毒感染细胞的上清弃掉，并用高压灭菌的1×PBS清洗3次。按50 uL /孔加入4%多聚甲醛组织细胞固定液，在4℃固定30 min。弃去固定液，用1×PBS清洗三次，每次5 min。按50 uL /孔加入含有0.2% Triton ×100的1×PBS在室温透膜15 min。弃去废液，用1×PBS清洗透膜液三次，每次5 min。在每孔中加入50 uL含有1% BSA的1×PBS，在室温静置封闭1 h。弃封闭液，用1×PBS清洗封闭液三次，每次5 min。按照50 uL /孔加入配制好的BVDV E2蛋白特异性一抗Bovine Viral Diarrhea Virus Type 1&2 (BVDV-1&2) MAb E2 gp53 IgG2b Isotype (1:1000, 348, mouse, VMRD) 在4℃过夜孵育。次日，回收一抗，用1×PBS清洗一抗三次，每次5 min。在37℃避光孵育二抗Goat anti-Mouse/Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488(1:1000, A-11029/A-11034, Invitrogen) 45 min。回收二抗，用1×PBS避光清洗二抗三次，每次5 min。在室温孵育DAPI（1:1000）15 min染细胞核。弃上清液，用1×PBS避光清洗二抗三次，每次5 min。用倒置荧光显微镜拍照，通过间接免疫荧光的荧光强度筛选易感单克隆细胞株，易感单克隆细胞株命名为MDBK-C14细胞株。从图1中可以看到，相比于MDBK-野生型细胞株，病毒接种24 h及48 h后，MDBK-C14细胞株中的荧光分布更多，且呈聚集分布，说明BVDV病毒在MDBK-C14细胞株中的感染比例更高。更为值得关注的是，VSV-GFP病毒在MDBK-C14细胞株及MDBK-野生型细胞株中的感染能力无显著差异，因此，MDBK-C14细胞株可能仅特异性提高BVDV的病毒感染（图1）。因此，通过单克隆筛选的方法，最终筛选获得MDBK-C14细胞株为BVDV易感细胞系。
实施例2. 不同基因型BVDV毒株在MDBK-C14细胞株中的感染均提升
BVDV按照基因型分类可以分为BVDV-1型和BVDV-2型，进一步BVDV-1型可以分为23种亚型，BVDV-2型可以分为4种亚型。为了解MDBK-C14细胞株对于BVDV不同基因型的毒株是否具有相同的易感性，本发明将MDBK-C14细胞株及MDBK-野生型细胞株分别感染本实验室现有的不同亚型的BVDV毒株（BVDV-1a、BVDV-1c、BVDV-1p、BVDV-1m、BVDV-1v、BVDV-2a），感染后48 h，将病毒感染细胞的上清弃掉，并用高压灭菌的1×PBS清洗3次。按50 uL /孔加入4%多聚甲醛组织细胞固定液，在4℃固定30 min。弃去固定液，用1×PBS清洗三次，每次5min。按50 uL /孔加入含有0.2% Triton ×100的1×PBS在室温透膜15 min。弃去废液，用1×PBS清洗透膜液三次，每次5 min。在每孔中加入50 uL含有1% BSA的1×PBS，在室温静置封闭1 h。弃封闭液，用1×PBS清洗封闭液三次，每次5 min。按照50 uL /孔加入配制好的BVDV E2蛋白特异性一抗Bovine Viral Diarrhea Virus Type 1&2 (BVDV-1&2) MAb E2gp53 IgG2b Isotype (1:1000, 348, mouse, VMRD) 在4℃过夜孵育。次日，回收一抗，用1×PBS清洗一抗三次，每次5 min。在37℃避光孵育二抗Goat anti-Mouse/Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 (1:1000, A-11029/A-11034, Invitrogen) 45 min。回收二抗，用1×PBS避光清洗二抗三次，每次5min。在室温孵育DAPI（1:1000）15 min染细胞核。弃上清液，用1×PBS避光清洗二抗三次，每次5 min。用倒置荧光显微镜拍照，通过间接免疫荧光的荧光强度来比较病毒的感染情况。结果如图2所示，与MDBK-野生型细胞株相比，BVDV不同基因型毒株在MDBK-C14细胞株中的荧光区域更多，说明不同基因型BVDV在MDBK-C14细胞株中的感染均明显提升。
实施例3. BVDV在贴壁及悬浮MDBK-C14细胞株中的病毒滴度均明显提升
为了明确BVDV在MDBK-C14细胞株中感染提升的程度，本发明以感染复数MOI值为1的BVDV-1b毒株感染贴壁MDBK-C14细胞株和贴壁MDBK-野生型细胞株，并且在感染后24 h，48 h和72 h分别收集细胞病毒液，通过病毒滴度检测产生的BVDV病毒粒子量，即TCID50实验。TCID50是指半数组织培养感染剂量，又称50%组织细胞感染量，即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡 (cytopathic effect, CPE) 所需的病毒量，用以表征病毒的滴度。首先，准备细胞，96孔板中接种100uL/孔的贴壁MDBK-野生型细胞株，每孔细胞数约1.0×104-1.5×104个/孔，以10% FBS DMEM培养，第二天，在细胞培养16~24h后，长满单层，汇合度约80~90%进行后续实验。第二步，准备病毒稀释液，将2mL EP管每管中加入900uL 2%马血清DMEM作为稀释液，将每一个细胞病毒液样品（BVDV-1b毒株感染贴壁MDBK-C14细胞株和贴壁MDBK-野生型细胞株后24 h，48 h和72 h收集的细胞病毒液），分别10倍倍比稀释为6-8个稀释度（如10-1~10-8），具体操作为取100uL病毒原液加到900uL 2%马血清DMEM中，反复混匀，此管即为10-1，取其中100uL再加入到下一个900uL 2%马血清 DMEM中，反复混匀，此管即为10-2，以此类推，直至稀释到10-8。第三步，弃掉长满单层细胞的96孔板中的培养液，PBS洗三次，每孔加入每个稀释度病毒液100uL，每个稀释度重复4~8个孔，同时设置不加病毒液的细胞对照孔，加入2%马血清DMEM。第四步，每天观察细胞状态，以4-5天观察到达的最终CPE情况进行计算和读值。如图3所示，从BVDV在感染贴壁MDBK-C14细胞株和贴壁MDBK-野生型细胞株后病毒滴度的比值可以看出，贴壁MDBK-C14细胞株中BVDV的病毒滴度远高于贴壁MDBK-野生型细胞株。并且在病毒复制早期即感染后24 h，贴壁MDBK-C14细胞株中的BVDV病毒滴度比贴壁MDBK-野生型细胞株中高4.7倍左右。并且在后续的时间点中，贴壁MDBK-C14细胞株中的BVDV病毒滴度也均显著高于贴壁MDBK-野生型细胞株，约4倍左右。该结果显示贴壁MDBK-C14细胞株在BVDV感染后，其产生的BVDV病毒滴度得到了提升，并且在BVDV的复制早期已经有明显的差异。进一步，通过悬浮细胞培养技术，将贴壁MDBK-野生型细胞株及贴壁MDBK-C14细胞株进行悬浮细胞培养。将生长良好的悬浮MDBK-野生型细胞株及悬浮MDBK-C14细胞株加入装有无血清MDBK培养基（购自苏州沃美生物有限公司）的摇瓶中，至摇床中37℃、5%CO2、120rpm/min培养72h，传代，扩大培养。当悬浮细胞密度达到6.0×106/ml，细胞活率达到95%以上时，加入相同培养体积的无血清MDBK培养基，使细胞密度变为3.0×106/ml。在培养液中加入5.0%的BVDV-1b病毒。接种后于摇床中37℃、5%CO2、120rpm/min培养24h、48h、72h后，分别对病毒培养液进行病毒滴度检测。首先，准备细胞，96孔板中接种100uL/孔的悬浮MDBK-野生型细胞株，每孔细胞数约1.0×104-1.5×104个/孔，以10% FBSDMEM培养，第二天，在细胞培养16~24h后，长满单层，汇合度约80~90%进行后续实验。第二步，准备病毒稀释液，将2mL EP管每管中加入900uL 2%马血清DMEM作为稀释液，将每一个细胞病毒液样品（BVDV-1b毒株感染悬浮MDBK-C14细胞株和悬浮MDBK-野生型细胞株后24 h，48 h和72 h收集的细胞病毒液），分别10倍倍比稀释成6-8个稀释度（如10-1~10-8）。具体操作为取100uL病毒原液加到900uL 2%马血清DMEM中，反复混匀，此管即为10-1，取其中100uL再加入到下一个900uL 2%马血清 DMEM中，反复混匀，此管即为10-2，以此类推，直至稀释到10-8。第三步，弃掉长满单层细胞的96孔板中的培养液，PBS洗三次，每孔加入每个稀释度病毒液100uL，每个稀释度重复4~8个孔，同时设置不加病毒液的细胞对照孔，加入2%马血清DMEM。第四步，每天观察细胞状态，以4-5天观察到达的最终CPE情况进行计算和读值。结果如图3显示，从BVDV在感染悬浮MDBK-C14细胞株和悬浮MDBK-野生型细胞株后病毒滴度的比值可以看出，相比于悬浮MDBK-野生型细胞株，在悬浮MDBK-C14细胞株中BVDV的滴度更高，约是悬浮MDBK-野生型细胞株的18倍，说明BVDV在悬浮MDBK-C14细胞株中的感染滴度提升幅度更大。病毒培养液中病毒含量的提高，可提升疫苗免疫后的免疫原性。因此，将本发明获得的MDBK-C14细胞株应用于BVDV灭活疫苗的制备，在生物反应器大规模生产中，可提升BVDV复制滴度，提升产品质量，节约大量的生产成本。
Claims (3)
1.一种牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株，其特征在于，所述细胞株命名为牛源肾脏传代细胞系MDBK-C14，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45823，保藏时间为2024年3月4日。
2.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株，其特征在于，所述牛源肾脏传代细胞系MDBK-C14感染牛病毒性腹泻病毒呈现易感。
3.权利要求1-2任一项所述的牛病毒性腹泻病毒易感单克隆细胞株在牛病毒性腹泻病毒疫苗种毒生产中的应用。
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