EA006136B1 - Способ получения вируса или вирусного белка для получения вакцины - Google Patents
Способ получения вируса или вирусного белка для получения вакцины Download PDFInfo
- Publication number
- EA006136B1 EA006136B1 EA200200604A EA200200604A EA006136B1 EA 006136 B1 EA006136 B1 EA 006136B1 EA 200200604 A EA200200604 A EA 200200604A EA 200200604 A EA200200604 A EA 200200604A EA 006136 B1 EA006136 B1 EA 006136B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- virus
- cell
- cells
- adenovirus
- specified
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 182
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 40
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 33
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 292
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims abstract description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 62
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 96
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 claims description 53
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 claims description 52
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 claims description 52
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 claims description 52
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 claims description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 20
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 claims description 12
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 claims description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 8
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 5
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 claims description 4
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 claims description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 4
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 claims description 3
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 3
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims description 2
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims description 2
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 claims description 2
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims description 2
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 claims description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 2
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 claims description 2
- 241000713112 Orthobunyavirus Species 0.000 claims description 2
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 claims description 2
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 claims description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 claims description 2
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 claims description 2
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 2
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 claims description 2
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 claims description 2
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 claims description 2
- 108010057856 Adenovirus E2 Proteins Proteins 0.000 claims 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims 3
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 claims 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 abstract 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 39
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 39
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 39
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 29
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 23
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 23
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 22
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 22
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 21
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 20
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 19
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 18
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 18
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 18
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 17
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 15
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 13
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 12
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 11
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 101150026794 SHO1 gene Proteins 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 8
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 7
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 6
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 4
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 4
- 241000371980 Influenza B virus (B/Shanghai/361/2002) Species 0.000 description 4
- 241001500351 Influenzavirus A Species 0.000 description 4
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 4
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 4
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 4
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 4
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 241000702646 Rhesus rotavirus Species 0.000 description 4
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 4
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 4
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 102200157658 rs1555229948 Human genes 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005453 pelletization Methods 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108010057360 Adenovirus E1 Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 101000874334 Dalbergia nigrescens Isoflavonoid 7-O-beta-apiosyl-glucoside beta-glycosidase Proteins 0.000 description 2
- 101000757733 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Autolysin Proteins 0.000 description 2
- 241000617996 Human rotavirus Species 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241001500350 Influenzavirus B Species 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101000757734 Mycolicibacterium phlei 38 kDa autolysin Proteins 0.000 description 2
- 206010067470 Rotavirus infection Diseases 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 101710134986 Trypsin beta Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- POIUWJQBRNEFGX-XAMSXPGMSA-N cathelicidin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C1=CC=CC=C1 POIUWJQBRNEFGX-XAMSXPGMSA-N 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006487 Aciphylla squarrosa Species 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 241000710189 Aphthovirus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100309570 Caenorhabditis elegans let-765 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101000606129 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase receptor TYRO3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 208000005168 Intussusception Diseases 0.000 description 1
- 101900263680 Measles virus Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000581835 Monodora junodii Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100328463 Mus musculus Cmya5 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028400 Mutagenic effect Diseases 0.000 description 1
- 241001522010 Nomeus Species 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001137860 Rotavirus A Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 101710168844 Tyrosine-protein kinase receptor TYRO3 Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010064886 beta-D-galactoside alpha 2-6-sialyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000002987 choroid plexus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003366 colagenolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000243 mutagenic effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 125000005630 sialyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940031351 tetravalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- -1 thomyxovirus Species 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16651—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
- C12N2720/12351—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
- C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36211—Rubivirus, e.g. rubella virus
- C12N2770/36251—Methods of production or purification of viral material
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Представлены новые средства и способы производства вирусов млекопитающих. Представлен способ получения вируса или вирусных белков, отличных от аденовируса или аденовирусных белков, используемых в качестве вакцины, включающий в себя введение в клетку последовательности, кодирующей, по меньшей мере, один продукт гена Е1 аденовируса или его функциональное производное, и нуклеиновой кислоты, кодирующей вирус и/или вирусные белки, культивирование указанной клетки в подходящей среде, обеспечение возможности экспрессии вируса и/или вирусных белков и сбор указанного вируса и/или вирусных белков из культуральной среды и/или клетки. Вирусы или вирусные белки можно собрать и использовать для получения вакцин. Клетки по изобретению можно культивировать в определенных условиях без сыворотки и в суспензии. В частности, представлены способы получения в культивируемых клетках человека вируса гриппа и вакцин, полученных на его основе.
Description
Область изобретения
Данное изобретение относится к разработке и производству вакцин. В частности, изобретение относится к области получения вирусных белков и/или вирусов, более конкретно к применению клетки млекопитающих, предпочтительно клетки человека, для получения вирусов, растущих в эукариотических клетках, предпочтительно клетках млекопитающих, и, в частности, клетках человека. Изобретение особенно пригодно для получения вакцин с целью защиты от вирусных патогенов позвоночных, в частности млекопитающих, и особенно человека.
В изобретении раскрыты средства и способы для получения вирусов и/или вирусного белка в клетке (человека), предпочтительно с использованием определенной синтетической среды, и для очистки вирусов и/или их компонентов от клетки и/или культуральной среды. Представлены фармацевтические композиции, содержащие вирус или его компоненты, и способы производства и их выделения и/или очистки.
Предпосылка
Вакцинация является одним из наиболее важных путей борьбы с вирусными инфекциями. Хотя имеется ряд антивирусных средств, обычно указанные средства обладают ограниченной эффективностью. Введение антител против вируса может быть хорошим средством борьбы с вирусными инфекциями в том случае, если человек инфицирован (пассивная иммунизация), и обычно человеческие или гуманизированные антитела кажутся перспективными для борьбы с рядом вирусных инфекций, но наиболее эффективным и безопасным способом борьбы с вирусной инфекцией является, и вероятно будет являться, профилактика посредством активных иммунизаций. Активную иммунизацию обычно называют вакцинацией, и вакцины содержат по меньшей мере одну антигенную детерминанту, обычно вируса, предпочтительно ряд различных антигенных детерминант по меньшей мере одного вируса или другого патогена, например, посредством включения в вакцину по меньшей мере одного (вирусного) полипептида или белка, полученного из вируса (субъединичные вакцины). Как правило, упоминаемые до настоящего времени формы содержат адъюванты для того, чтобы усилить иммунный ответ. Это также возможно для вакцин, основанных на целом вирусе (патогене), например, в инактивированной форме. Другая возможность заключается в применении живых, но аттенуированных форм патогенного вируса. Следующая возможность состоит в применении вируса дикого типа, например, в тех случаях, когда взрослым людям инфекция не угрожает, но для детей существует опасность инфекции, и их можно защитить с помощью материнских антител, и тому подобное. Получение вакцин не всегда является легкой процедурой. В некоторых случаях вирусный материал получают на основе яиц, что ведет к трудностям при очистке материала и широким мерам безопасности в отношении загрязнения и т.д. Получение на бактериях и/или дрожжах, которые иногда, но не всегда являются альтернативой яйцам, также требует много стадий очистки и обеспечения безопасности. Альтернативой может быть получение на основе клеток млекопитающих, но все используемые до настоящего времени клетки млекопитающих требуют для роста, например, присутствия сыворотки и/или адгезии на твердом носителе. В первом случае проблемой снова становится очистка и безопасность и, например, потребность в протеазе для поддержания репликации некоторых вирусов. Во втором случае дополнительно проблематичными являются высокие выходы и простота получения. Данное изобретение преодолевает, по меньшей мере, ряд проблем, встречающихся в случае продуцирующих систем для получения вирусов и/или вирусных белков в целях создания вакцин, характерных для систем предшествующего уровня техники.
Подробное описание
Данное изобретение относится к новой линии иммортализованных клеток человека, предназначенной для размножения и сбора вируса, для получения указанного вируса. Клетки РЕК..С6 (ΛΟ 97/00326) созданы посредством трансфекции первичных эмбриональных клеток сетчатки глаза человека с использованием плазмиды, которая содержала последовательности, кодирующие Е1А и Е1В Аб серотипа 5 (А65) (нуклеотиды Аб5 459-3510) под контролем промотора фосфоглицераткиназы (РОК) человека.
Следующие характеристики делают РЕК..С6 или ее производные особенно пригодными в качестве хозяина для получения вирусов: указанная линия является полностью охарактеризованной линией клеток человека, она разработана в соответствии с ОЬР, ее можно выращивать в суспензионных культурах в определенной бессывороточной среде, не содержащей никаких белков сыворотки человека или животных; она растет в роллерных флаконах, встряхиваемых колбах, вращающихся флаконах и биореакторах, со временем удвоения, примерно равным 35 ч.
Эпидемиология гриппа
Вирусы гриппа, представители семейства Обйошухоушбае, являются возбудителями ежегодных эпидемий острого респираторного заболевания. Только в одних США 50 миллионов американцев ежегодно заболевают гриппом. Оцененное число случаев со смертельным исходом во всем мире (1972-1992) составляет 60000 (статистика СЭС). Имели место 3 основных случая вспышки пандемии гриппа, а именно в 1918 г (испанка, по оценкам 40 миллионов случаев со смертельным исходом), в 1957 г. (азиатский грипп, по оценкам 1 миллион случаев со смертельным исходом) и в 1968 г. (Гонконгский грипп, по оценкам 700000 случаев со смертельным исходом). Инфекции, вызванные вирусами гриппа, связаны с широким спектром заболеваний и осложнений, результатом которых является значительная доля заболе
- 1 006136 ваемости и смертности в мире, особенно среди пожилых людей и пациентов с хроническими заболеваниями. Вакцинация против гриппа наиболее эффективна для предотвращения зачастую смертельных осложнений, связанных с данной инфекцией (Мигрйу, В.В. аиб В.С. ХУсЬЧсг 1996). Сообщалось о получении вируса гриппа на диплоидной линии клеток человека МВС-5 (Неггего-ЕштЬе Ь. с1 а1., 1983). Однако титры вируса гриппа недопустимо малы.
Штаммы вируса гриппа
В настоящее время вакцины против гриппа содержат очищенный гемагглютинин и нейраминидазу вируса гриппа А и В. Важными с эпидемиологической точки зрения штаммами являются 3 вируса гриппа Α (Η1Ν1), гриппа Α (Η3Ν2) и гриппа В. Разделение на типы А и В основано на антигенных различиях их нуклеопротеидов (ΝΡ) и антигенов белков матрикса (М). Вирусы гриппа А, кроме того, подразделяются на подтипы на основании антигенного состава (последовательности) молекул гемагглютинина (Н1-Н15) и нейраминидазы (Ν1-Ν9). Представителей каждого их указанных подтипов выделили из водоплавающих птиц, которые вероятно являются исходным источником всех вирусов гриппа видов птиц и млекопитающих. Выявлена передача между свиньями и человеком и недавно (Η5Ν1) между птицами и людьми.
Вакцины против гриппа
В настоящее время в мире используют три типа инактивированной вакцины против гриппа: вакцины на основе целого вируса, продукта расщепления и поверхностного антигена или субъединицы. Все указанные вакцины содержат поверхностные гликопротеиды, гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (ΝΑ) штаммов вируса гриппа, которые предположительно циркулируют в популяции человека в наступающем сезоне. Указанные штаммы, которые включают в состав вакцины, выращивают в эмбрионах куриных яиц и затем вирусные частицы очищают перед дальнейшей обработкой. Необходимость в ежегодной корректировке вакцин гриппа является следствием вариациями антигенов, вызванных процессами, известными как антигенный дрейф и антигенный сдвиг.
Антигенный дрейф происходит при накоплении серии точечных мутаций либо в Н-, либо в Νбелке вируса, приводящих к аминокислотным заменам. Указанные замены предотвращают связывание нейтрализующих антител, индуцированных предыдущей инфекцией, и новый вариант может инфицировать хозяина.
Антигенный сдвиг представляет собой появление нового подтипа в результате перераспределения генетического материала между вирусами гриппа А животных и человека. Пандемичные штаммы 1957 (Η2Ν2) и 1968 гг. (Η3Ν2) являются примерами перераспределения материала вирусов, при котором гены Н или Ν птиц были интродуцированы в циркулирующие вирусы человека, которые впоследствии смогли распространиться в популяции человека.
На основании эпидемиологических исследований более чем сотни национальных центров гриппа во всем мире Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) ежегодно рекомендует состав вакцины против гриппа, обычно в феврале для северного полушария и в сентябре для южного полушария. Данная практика ограничивает промежуток времени для получения и стандартизации вакцины максимально до 9 мес. В случае срочной потребности большого количества доз вакцины, например в том случае, когда возникает новый подтип вируса гриппа А в результате антигенного сдвига или антигенного дрейфа, наличие ограниченного количества яиц- может препятствовать быстрому получению вакцины. Дополнительным недостатком данной продуцирующей системы является отсутствие гибкости, риск наличия токсинов и риск наличия случайных вирусов, особенно ретровирусов, и проблемы со стерильностью. Это представляет серьезную проблему в современной практике производства вакцины против гриппа на эмбрионах куриных яиц.
Вследствие этого применение системы культуры клеток для получения вакцины против гриппа было бы привлекательной альтернативой. Вирусы гриппа можно выращивать на ряде первичных клеток, включая клетки почки обезьян, почки теленка, почки хомячка и почки цыпленка. До сих пор применение этих клеток для производства вакцин не практиковалось из-за необходимости заново восстанавливать культуры из первичных клеток для каждого получения вакцины. Поэтому применение постоянных иммортализованных линий клеток для получения вакцины против гриппа является привлекательной альтернативой.
Применению систем на основе культур способствовало выяснение того, что для инфекционности вируса гриппа требуется протеолитическое расщепление НА на две его субъединицы (НА1 и НА2), которого можно достичь при добавлении трипсина. Добавление трипсина дает возможность для репликации и образования бляшек в клетках почки собаки Мабт-ЭатЬу (МОСК) (ТоЬйа е1 а1., 1975).
Недавно показано, что линия клеток МОСК поддерживает рост вируса гриппа при получении вакцины (Вгапб е1 а1., 1996 и 1997, Ра1аейе е1 а1. 1997). Применение трипсина требует выращивания клеток МОСК в среде для культуры ткани без сыворотки (МЭСК-8Е1). Однако в настоящее время клетки МОСК не одобрены в качестве субстрата для получения вируса гриппа.
Важно, что любой системе, основанной не на клетках человека, для получения вакцин против гриппа свойственен недостаток, известный как адаптация. Оба вируса гриппа А и В несут мутации в НА вследствие адаптации в эмбрионах куриных яиц. Указанные мутации приводят к измененной антигенно
- 2 006136 сти (Ые^тап с1 а1. 1993, ^1Шат8 апб КоЬетйоп 1993, КоЬетйоп е! а1. 1994, СиЬатеуа е! а1. 1994, 8сЫ1б е! а1. 1993, КоЬегйоп е! а1. 1987, КобШаШ е! а1. 1995). Иммунизация вакцинами, содержащими и несущими в НА мутацию в результате адаптации в яйцах, индуцирует у людей меньше нейтрализующих антител к вирусу, который содержит не адаптированный к яйцам НА (Ые\\шап е! а1. 1993).
Вирусы гриппа человека, размноженные в клетках собак, таких как клетки МОСК, также проявляют адаптацию, хотя и в меньшей степени. Такие вирусы больше похожи на природные изоляты у человека, чем вирусы, полученные из яиц (КоЬейкоп е! а1. 1990).
Кроме того, существует доказательство того, что специфичные для хозяина изменения в ΝΑ и специфичный для хозяина характер фосфорилирования ΝΑ могут влиять на репликацию вирусов гриппа (8сйи1тап апб Ра1е§е 1977; 8ид1ага апб Иеба 1980; КЩпет е! а1 1976).
Вследствие этого очевидно, что предпочтительным было бы избежать адаптации или других индуцированных в хозяина изменений вируса гриппа. Это может привести к более гомогенной популяции вирусов и сделать конечную вакцину более эффективной.
Поэтому объектом данного изобретения являются клетки человека в качестве субстрата для получения высоких титров вируса гриппа, подходящих для разработки вакцин.
Ротавирус и ротавакцины
Ротавирусы являются наиболее важной причиной тяжелых дегидратирующих гастроэнтеритов у маленьких детей во всем мире. В развивающихся странах инфекции ротавирусами ежегодно приводят к более 800000 случаям со смертельным исходом. В Соединенных Штатах по оценкам расходы здравоохранения из-за ротавирусных инфекций превышают 1 миллиард долларов США в год.
Ротавирусы, члены семейства Кеоушбае, представляют собой двунитевые РНК-вирусы, состоящие из 11 фрагментов РНК, каждый из которых кодирует структурный или неструктурный вирусный белок (УР). Внутреннее ядро вируса содержит четыре УР: УР1, 2, 3 и 6. УР определяют три основных антигенных свойства: НКУ-группу, подгруппу и серотип. Идентифицировано семь отличающихся по антигенам групп (Α-С), которые кодируются УР6. Инфекция ротавирусом человека (НКУ) главным образом вызвана ротавирусами группы А с серотипами 1-4, являющимися причиной 95% клинических случаев заболевания. Естественная защита от заболевания специфична для серотипа. Группу А, кроме того, делят на подгруппы I и II.
Двойной слой наружной оболочки, образующей капсид вируса, состоит из двух вирусных белков, УР4 и УР7, которые являются нейтрализуемыми антигенами, вовлеченными в защитный иммунитет, и которые определяют серотип, хотя УР4 играет меньшую роль в определении серотипа. Во время совместной инфекции разными серотипами сегментированные геномы легко подвергаются генетической пересортировке, свойство, которое использовали для создания вакцины (Матайа е! а1. 1999).
В связи с широкой распространенностью во всем мире связанной с ротавирусами детской заболеваемости и смертности наиболее эффективным способом борьбы с указанным вирусом считается крупномасштабная вакцинация против ретровируса. Целью вакцинации было бы не предотвращение заболевания, а снижение его тяжести и осложнений, особенно в первые годы жизни.
Единственной эффективной вакциной, доступной в настоящее время, является вводимая перорально живая аттенуированная вакцина, основанная на пересортировке фрагментов РНК ротавирусов человека, кодирующих УР7 серотипов 1, 2 и 4 в ротавирусе резус, обеспечивающем аттенуированный фон, с УР7 серотипа 3. Вакцинация указанной тетравалентной вакциной на основе пересортировки генов вирусов человека и макак-резус (ККУ-ТУ), хотя и является высоко эффективной в предотвращении тяжелых гастроэнтеритов, связана с инвагинацией, болезнью непроходимости кишечника. По этой причине указанную вакцину уже больше не используют.
Сущность изобретения
Изобретение относится к способу получения вируса и/или вирусных белков, отличных от аденовируса или аденовирусных белков, для применения в качестве вакцины, включающему в себя введение в клетку, по меньшей мере, последовательности, кодирующей по меньшей мере один продукт гена Е1 аденовируса или его функциональное производное, и нуклеиновой кислоты, кодирующей вирус или вирусные белки, культивирование указанной клетки в подходящей среде и обеспечение возможности размножения вируса или экспрессии вирусных белков и сбор указанного вируса и/или указанных вирусных белков из культуральной среды и/или клетки.
До настоящего изобретения существовало немного, если и существовали, клеток (человека), которые считались подходящими для получения вирусов и/или вирусных белков для применения в качестве вакцин каким-либо воспроизводимым и масштабным способом и/или с достаточно высоким выходом, и/или легко поддающихся очистке. Авторы изобретения обнаружили, что клетки, которые содержат последовательности Е1 аденовируса предпочтительно в их геноме, способны поддерживать размножение вирусов в значительных количествах.
Предпочтительно клетку согласно изобретению получают из первичной клетки человека, предпочтительно клетки, которая иммортализована генным продуктом указанного гена Е1. Для того, чтобы иметь возможность выращивать первичную клетку, ее, конечно, необходимо подвергнуть иммортализации. Хорошим примером такой клетки является клетка, полученная из ретинобласта эмбриона человека.
- 3 006136
Важно, чтобы в клетках согласно изобретению последовательности гена Е1 не терялись в ходе клеточного цикла. Поэтому предпочтительно, чтобы указанная последовательность, кодирующая по меньшей мере один генный продукт гена Е1, присутствовала в геноме указанной клетки (человека). По соображениям безопасности лучше позаботиться о том, чтобы избежать присутствия лишних аденовирусных последовательностей в клетках согласно изобретению. Таким образом, другим вариантом данного изобретения является подготовка клеток, которые не продуцируют структурных аденовирусных белков. Однако для того чтобы добиться крупномасштабного (непрерывного) получения вируса с помощью культуры клеток, предпочтительно иметь клетки, способные расти без необходимости в прикреплении. Клетки согласно данному изобретению обладают такой способностью. Для того чтобы получить чистую безопасную продуцирующую систему, из которой легко выделить и, при необходимости, очистить вирус, предпочтительно владеть способом согласно изобретению, при использовании которого указанная клетка не содержит других аденовирусных последовательностей. Наиболее предпочтительной клеткой для способов и применений изобретения является РЕК.С6, которая депонирована под № 96022940 в ЕСАСС, или производные от нее.
Таким образом, изобретение относится к способу, в котором используется клетка согласно изобретению, при этом указанная клетка, кроме того, содержит последовательность, кодирующую Е2А или его функциональное производное, аналог или фрагмент, предпочтительно клетка, в которой указанная последовательность, кодирующая Е2А или его функциональное производное, аналог или фрагмент, присутствует в геноме указанной клетки человека, и наиболее предпочтительно клетка, в которой указанная последовательность, кодирующая Е2А, кодирует чувствительный к температуре мутант Е2А.
Кроме того, как указано, изобретение также относится к способу согласно изобретению, при котором указанная клетка (человека) способна расти в суспензии.
Изобретение также относится к способу, при котором указанную клетку человека можно культивировать в отсутствие сыворотки. Клетки согласно изобретению, в частности РЕР.С6. обладают дополнительным преимуществом, состоящим в том, что их можно культивировать в отсутствие сыворотки или компонентов сыворотки. Таким образом, выделение является простым, достигается безопасность и система облает хорошей надежностью (синтетические среды являются наилучшими для размножения). Клетки человека согласно изобретению и, в частности, клетки, основанные на первичных клетках, и особенно клетки, основанные на клетках НЕК, способны осуществлять нормальные пост- и перитрансляционные модификации и сборку. Это означает, что они очень подходят для получения вирусных белков и вирусов для применения в вакцинах.
Таким образом, изобретение относится к способу согласно изобретению, при котором указанный вирус и/или указанные вирусные белки содержат белок, который подвергается посттрансляционной и/или перитрансляционной модификации, особенно при котором указанные модификации включают в себя гликозилирование. Хорошим примером вирусной вакцины, которую было трудно получить какимлибо надежным способом, является вакцина против гриппа. Изобретение относится к способу согласно изобретению, при котором указанные вирусные белки включают в себя по меньшей мере один из белков - нейраминидазу и/или гемагглютинин вируса гриппа. Другие вирусные белки (субъединицы) и вирусы (дикого типа, которые необходимо инактивировать) или аттенуированные вирусы, которые можно получить способами согласно изобретению, включают энтеровирус, такой как риновирус, афтовирус или вирус полиомиелита, вирус герпеса, такой как вирус простого герпеса, вирус псевдобешенства или вирус герпеса коров, ортомиксовирус, такой как вирус гриппа, парамиксовирус, такой как вирус ньюкаслской болезни, вирус дыхательного синцития, вирус эпидемического паротита или вирус кори, ретровирус, такой как вирус иммунодефицита человека или парвовирус или паповавирус, ротавирус или коронавирус, такой как вирус инфекционного гастроэнтерита, или флавивирус, такой как вирус клещевого энцефалита или вирус желтой лихорадки, тогавирус, такой как вирус краснухи или вирус восточного, западного или венесуэльского энцефаломиелита лошадей, вирус, вызывающий гепатит, такой как вирус гепатита А или гепатита В, пестивирус, такой как вирус холеры свиней, или рабдовирус, такой как вирус бешенства, буньявирус, такой как хантавирус.
В одном варианте клетка согласно изобретению пригодна для размножения штамма вируса гриппа, который не растет очень эффективно на эмбрионах яиц.
Изобретение также относится к применению клетки человека, содержащей в своем геноме последовательность, кодирующую по меньшей мере один белок Е1 аденовируса или его функциональное производное, гомолог или фрагмент, и при этом клетка не продуцирует структурные аденовирусные белки для получения вируса или по меньшей мере одного вирусного белка для использования в вакцине. Конечно, для такого применения также предпочтительны клетки, которые предпочтительны в способах согласно изобретению. Изобретение также относится к продуктам, получаемым способами и в результате применений согласно изобретению, особенно вирусным белкам и вирусам, получаемым согласно таким применениям и/или способам, особенно в том случае, когда они поставляются в фармацевтической композиции, содержащей подходящие наполнители и в некоторых формах (инактивированные вирусы, субъединицы) адъюванты. Дозирование и пути введения можно выяснить посредством обычного клинического тестирования, поскольку они еще не известны по уже разрешенным к выпуску вакцинам.
- 4 006136
Таким образом, изобретение также относится к вирусу или вирусному белку для применения в вакцине, получаемым способом или посредством применения согласно изобретению, при этом указанный вирус или указанный вирусный белок не содержит какого-либо белкового материала млекопитающего, такого как человек, и к фармацевтической композиции, содержащей такой вирус и/или вирусный белок.
Изобретение, кроме того, относится к клетке человека, содержащей в своем геноме последовательность, кодирующую по меньшей мере один белок Е1 аденовируса, или его функциональное производное, гомолог или фрагмент, и при этом клетка не продуцирует структурные аденовирусные белки, и содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую вирус или по меньшей мере один вирусный белок не аденовируса. Такую клетку можно использовать в способе согласно изобретению.
Предпочтительный вариант изобретения относится к вирусу гриппа, получаемому способом согласно изобретению, или в результате применения согласно изобретению. Другой вариант изобретения относится к вакцинам против гриппа, получаемым способом согласно изобретению или в результате применения согласно изобретению.
Для иллюстрации изобретения представлены следующие примеры, не предназначенные для того, чтобы ограничить рамки изобретения.
Пример 1.
Материалы и способы
Культура клеток РЕК. С 6 и МОСК
Клетки почки собаки Майш ИатЬу (МОСК) культивировали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (ИМЕМ, ЫГс Тсе1шо1ощс5 Вгейа, Т1е №1йет1аиЙ8), содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (ЕС8) и 1х Ь-глутамин (С1Ьсо-ВКЬ), при 37°С и 10% СО2. Суспензионные культуры РЕК.С6 культивировали в ЕхСе11 525 (1КН Вюкаепсек) с добавлением 1х Ьглутамина при 37°С и 10% СО2 в виде стационарных культур в 6-луночных чашках (Стешет) или в роллерных флаконах для культуры ткани объемом 490 см3 (Сотшпд Сойат Сотротайоп) при непрерывном вращении со скоростью 1 об/мин.
Иммунофлуоресцентный тест
Анализы прямой иммунофлуоресценции для выявления инфекции вирусом гриппа выполняли, используя набор для выявления вирусов гриппа А и В 1МАСЕИ™ (Иако), следуя стандартному протоколу поставщика. Образцы оценивали с помощью микроскопа, используя эпифлуоресцентное освещение. Инфицированные клетки характеризовали на основе яркой флуоресценции цвета зеленого яблока.
Окрашивание йодидом пропидия
Осадки клеток ресуспендировали в 300 мкл холодного РВ8/0,5% В8А + 5 мкл йодида пропидия (концентрация 50 мкг/мл) в растворе РВ8/ЕС8/азида, известном специалистам в данной области. Живые и мертвые клетки затем выявляли с помощью проточного цитофлуорометрического анализа.
Анализ гемагглютинации
В общем, анализы гемагглютинации для определения титров вируса гриппа выполняли в соответствии со способами, известными специалистам в данной области. В данном случае 50 мкл двукратного разведенного раствора вируса в РВ8 добавляли к 25 мкл РВ8 и 25 мкл 1% суспензии индюшачьих эритроцитов (Вюйайшд Вепе1их В.У.) в РВ8 и инкубировали в 96-луночных планшетах для микротитрования при 4°С в течение 1 ч. Изучали и оценивали характер гемагглютинации и выражали в виде единиц гемагглютинации (НАИ). Число НАИ соответствовало обратной величине наибольшего разведения вируса, при котором наблюдалась полная гемагглютинация.
Вестерн-блот-анализ белка НА вируса гриппа
В общем, полученные вирусы гриппа разрушали в буфере Лэммли согласно способам, известным специалистам в данной области, и разные объемы полученных смесей белков разделяли, используя 10% ИСН/ПААГ-гели. Коротко, блоты блокировали в течение 30 мин при комнатной температуре блокирующим раствором (5% порошок обезжиренного сухого молока (Вютай) в ТВ8Т с добавлением 1% сыворотки кролика (Коск1апй)) с последующими 3 промывками ТВ8Т. Затем блоты инкубировали с антисывороткой против НА А/Сидней/5/97 (И1В8С 98/768), разведенной 1/500 в 1% В8А/ТВ8Т с 5% сыворотки кролика (Коск1апй) О/Ν при комнатной температуре. Блоты снова 8 раз промывали ТВ8Т. Наконец блоты инкубировали с кроличьей антисывороткой против иммуноглобулина овцы (меченой НКР, Коск1апй), разведенной 1/6000 в блокирующем растворе, в течение 1 ч при комнатной температуре. После 8 промывок ТВ8Т комплекс конъюгированных белков выявляли с помощью ЕСЬ (Ашегайаш Рйатшааа Вю1ес11). и экспонировали пленки (НуретГйш, Ашегайаш ЫГе 8с1епсе). Антисыворотку получали из И1В8С (ИК) и использовали в разведениях, рекомендуемых МВ8С.
Анализ одномерной радиальной иммунодиффузии (8ΚΙΌ)
Концентрацию гемагглютинина в надосадках, полученных из клеток РЕК.С6, инфицированных вирусом гриппа, определяли посредством анализа одномерной радиальной иммунодиффузии (8ΚΙΌ), как описано ранее (\Уоой е1 а1. 1977). Анализ выполняли, используя стандартные антигены И1В8С (ИК) и реагенты антисыворотки.
- 5 006136
Анализ бляшек
Всего 1 мл 10-кратно серийно разведенных вирусных надосадков высевали на клетки МОСК, которые выращивали до 95% слияния в 6-луночных планшетах. После 1 ч при 35°С клетки дважды промывали РВ8 и покрывали 3 мл агарозной смеси (1,2 мл 2,5% агарозы, 1,5 мл 2 х МЕМ, 30 мкл 200 мМ Ьглутамина, 24 мкл трипсина-ΕΌΤΑ, 250 мкл РВ8). Затем клетки инкубировали во влажной атмосфере, содержащей 10% СО2, при 35°С примерно в течение 3 дней, и вирусные бляшки подсчитывали визуально.
Анализ инфекционности вируса (ТСШ50)
Титрование инфекционного вируса выполняли на клетках МОСК. Коротко, клетки высевали в 96луночные планшеты при плотности 4 х 104 клеток/лунку в ЭМЕМ с добавлением 2 мМ Ь-глутамина. Через двадцать четыре часа клетки инфицировали 100 мкл десятикратно серийно разведенными надосадками культуры в четырех повторах в среде, содержащей трипсин-ΕΌΤΑ в концентрации 4 мкг/мл. Спустя два часа монослой инфицированных клеток два раза промывали в РВ8 и инкубировали в среде, содержащей трипсин, в течение 7 дней при 35°С. Затем надосадки указанных культур тестировали в анализе НА. Титры ТСШ50 рассчитывали согласно способу КагЬег (1931).
Инактивация вируса гриппа β-пропиолактоном
Для инактивации вирусов с целью получения целого инактивированного вируса для создания вакцин, полученных из РЕВ.С6, протокол создания мутации, известный специалистам в данной области, выполняли, используя β-пропиолактон. β-пропиолактон является очень эффективным агентом, широко используемым для инактивации вирусов и хорошо известным в данной области вследствие его мутагенных эффектов. Он модифицирует основания нуклеиновых кислот в вирусном геноме и геноме клеткихозяина, вследствие чего блокирует репликацию. Следуя широко известному протоколу, используемому для получения целого инактивированного вируса гриппа, получаемого на эмбрионах яиц, инактивировали количество вируса, соответствующее примерно 400 мкг НА на штамм, и использовали для составления конечной вакцины. Коротко, один объем 0,3М натрий-фосфатного буфера добавляли к 9 объемам препарата вируса гриппа. Инактивацию вируса выполняли, добавляя один объем 10% β-пропиолактона (Ие^аИ Эе^щп. ИК) к 100 объемам вирусного препарата, забуференного фосфатом, и инкубировали при 20°С в течение 24 ч. Инактивацию вирусов проверяли анализом бляшек и ни в одной из инактивированных партий не выявляли бляшек (данные не показаны).
Пример 2 А. Создание банка клеток РЕВ.С6 и предварительное культивирование.
Использовали линию клеток РЕВ.С6 (депонирована под № 96022940 в Европейской коллекции культур клеток животных в Сеп1ег 1ог Аррйеб МюгоЬю1о§у апб Везеагсй) или производные от нее (описанные в \νϋ 97/00326). Банки линий клеток создавали посредством двухъярусной системы банков клеток. Банк выбранной линии клеток готовили в виде основного банка клеток для исследований (гМСВ), который хранили в разных местах. Из указанного гМСВ рабочие банки клеток для исследований (ΑνΤΈ) готовили следующим образом: размораживали ампулу гМСВ и размножали клетки до тех пор, пока количество клеток становилось достаточным для замораживания клеток с использованием сухого льда. До 500 ампул, содержащих 1 мл (1-2 х 106 клеток/мл) ^СВ, хранили в паровой фазе низкотемпературной камеры с жидким Ν2. Одну ампулу, содержащую 5 х 106 клеток РЕВ.С6 VСВ, размораживали в водяной бане при 37°С. Клетки быстро переносили в пробирки объемом 50 мл и ресуспендировали при добавлении 9 мл суспензионной среды ЕхСе11 525 (1КН Вюзстепсез) с добавлением 1 х Ь-глутамина. После 3 мин центрифугирования при 1000 об/мин в настольной центрифуге с верхней загрузкой клетки ресуспендировали в конечной концентрации 3 х 105 клеток/мл и культивировали во флаконах для культуры ткани Т 80 при 37°С, 10% СО2. Спустя 2-3 дня клетки высевали в роллерные флаконы для культуры ткани объемом 490 см3 (Согшпд Соз1аг Согрогабоп) при плотности 3 х 105 в мл и культивировали при непрерывном вращении со скоростью 1 об/мин.
Пример 2В. Клетки РЕВ.С6 в качестве пермиссивной линии клеток для вируса гриппа А
РЕВ.С6 как клетка человека не была известна по своей способности поддерживать инфекцию и репликацию вируса гриппа. Поэтому проверяли, являются ли клетки РЕВ.С6 пермиссивными в отношении инфекции вирусом гриппа по сравнению с линией собачьих клеток почки собак Мабт ИагЬу (МОСК), которые служили в качестве позитивного контроля.
За день до инфекции высевали 2 х 105 клеток МОСК на лунку в 6-луночные планшеты. Спустя двадцать четыре часа 4 х 105 высеянных клеток РЕВ.С6 и МИСК на лунку инфицировали Н1Ν 1-штаммом А/ПуэртоРико/8/34 (титр 3,6 х 107 БОЕ/мл) (полученным от Иг. Е. С1аак, Ье1беп Ишуегзйу Меб1са1 Сейег, Тйе №1йег1апбз). Инфицирование осуществляли при разной множественности инфицирования (шо1) в пределах от 0,1 до 10 БОЕ/клетку. После 2 ч инкубации при 37°С инокулят удаляли и заменяли свежей средой. Прямой иммунофлуоресцентный анализ для выявления инфекции вирусом гриппа проводили через 24 и 48 ч после инфицирования. Эксперимент продемонстрировал пермиссивность РЕВ.С6 для инфекции гриппом, при этом процент позитивных клеток зависел от тог и был сравним с МЭСК (фиг. 1).
- 6 006136
Пример 3. РЕР.С6, используемые для размножения вируса гриппа А
Проверяли, могут ли РЕР.С6 поддерживать репликацию и размножение вируса гриппа. В день инфицирования клетки РЕР.С6 высевали в роллерные флаконы для культуры ткани объемом 490 см при плотности 2 х 105 клеток/мл в конечном объеме 40 мл в присутствии 5 мкг/мл трипсина-ΕΌΤΑ (01ЬсоВКЕ). Клетки либо подвергали ложной инокуляции, либо инфицировали Н3Ы2-штаммом А/811спх11сп/227/95 (титр 1,5 х 106 БОЕ/мл) (полученным от Όγ. Е. С1аа§, Бс1бсп Ишуегайу Меб1са1 СсгИсг. Тйе №1йег1апб8). Инфицирование осуществляли при то1 10-4 и 10-3 БОЕ/клетку. После 1 ч инкубации при 37°С инокулят удаляли посредством осаждения клеток центрифугированием при 1500 об/мин и ресуспендированием клеток в свежей культуральной среде + 5 мкг/мл трипсина-ЕОТА. Сбор 1,3 мл суспензии клеток проводили каждый день с 1 по 6 день после инфицирования. Надосадки хранили при -80°С и использовали для анализов гемагглютинации. Осадки клеток использовали для прямых иммунофлуоресцентных анализов и для окрашивания йодидом пропидия.
Пример 4. Пермиссивность РЕР.С6 для разных штаммов гриппа
Для дальнейшего исследования пермиссивности РЕР.С6 для размножения разных штаммов гриппа проводили инфекцию с использованием вакцинного штамма Η1Ν1 А/Веушд/262/95 и его пересортированного варианта Х-127, полученного из Ναΐίοηαΐ 1п81йи1е £ог Вю1ощса1 81апбагб5 апб Соп1го1 (МВ8С, ИК). В день инфицирования клетки РЕР.С6 высевали в роллерные флаконы для культуры ткани объемом 490 см3 при плотности примерно 1 х 106 клеток/мл в конечном объеме 50 мл. Проводили инокуляцию клеток 5 мкл (разведение 10-4) и 50 мкл (разведение 10-3) вируса в присутствии 5 мкг/мл трипсина-ЕОТА. Для того чтобы установить, действительно ли необходим трипсин, проводили еще одну инфекцию посредством инокуляции 5 мкл штамма А/Веутд/262/95 в отсутствии протеазы. Примерно после 1 ч инкубации при 37°С инокулят удаляли посредством осаждения клеток центрифугированием при 1500 об/мин и ресуспендированием их в свежей культуральной среде ± 5 мкг/мл трипсина-ЕОТА. На 2 и 4 день после инфицирования к образцам еще добавляли трипсин. Сбор 1,3 мл суспензии клеток проводили каждый день с 1 по 6 день после инфицирования. Надосадки хранили при -80°С и использовали для анализов гемагглютинации и дальнейших инфицирований; осадки клеток использовали для прямых иммунофлуоресцентных анализов. Результаты, полученные с использованием упомянутых выше анализов иммунофлуоресценции и гемагглютинации, показаны на фиг. 4 и 5, соответственно, иллюстрирующих эффективную репликацию и высвобождение вирусов.
Пример 5. Инфекционность вируса, размноженного на РЕВ.С6
Проверяли, являются ли вирусы, выращенные в РЕР.С6, инфекционными, и может ли адаптация к линии клеток увеличивать выходы вируса. Использовали надосадки вирусов, полученные из РЕР.С6, инфицированных штаммом А/Вегрпд/262/95 и его пересортированным вариантом Х-127 (разведение 10-3) и собранных на 6 день после инфицирования. В день инфицирования РЕР.С6 высевали в роллерные флаконы для культуры ткани объемом 490 см3 при плотности примерно 1 х 106 клеток/мл в конечном объеме 50 мл. Проводили инокуляцию клеток 100 мкл и 1 мл надосадка вирусов в присутствии 5 мкг/мл трипсина-ЕИТА. Для того чтобы установить, требуется ли еще трипсин, проводили еще одно инфицирование посредством инокуляции 100 мкл штамма А/Веушд/262/95 в отсутствие протеазы. Примерно после 1 ч инкубации при 37°С инокулят удаляли посредством осаждения клеток центрифугированием при 1500 об/мин и ресуспендированием их в свежей культуральной среде ± 5 мкг/мл трипсина-ЕОТА. На 2 и 4 день после инфицирования к образцам еще добавляли трипсин. Сбор 1,3 мл суспензии клеток проводили с 1 по 6 день после инфицирования. Надосадки хранили при -80°С и использовали для анализов гемагглютинации и дальнейших инфицирований; осадки клеток использовали для прямых иммунофлуоресцентных анализов. Результаты, полученные с использованием упомянутых выше анализов иммунофлуоресценции и гемагглютинации, показаны на фиг. 6 и 7. Данные, полученные с помощью описанного эксперимента, показали инфекционность вирусов, выращенных в РЕР.С6, а также увеличение выходов вируса.
Пример 6. Наличие поверхностных клеточных рецепторов для вируса гриппа на РЕР.С6.
Размножение штаммов гриппа А и В человека в эмбрионах куриных яиц всегда приводит к селекции связывающих рецепторы вариантов, которые несут аминокислотные замены в дистальной части глобулярной головки НА в открытых и функционально важных районах молекулы. Вследствие указанных мутаций адаптированные к яйцам штаммы могут отличаться от исходных вирусов человека по своей антигенной и иммуногенной активности, а также по их вирулентности. В вирусах гриппа человека, выделенных из клеток МОСК, обычно присутствует белок НА, который идентичен белку НА, присутствующему на вирусе исходного клинического образца. В недавнем исследовании (Ооуогкоуа 1999) выяснена молекулярная основа селекции вариантов в куриных яйцах и отсутствия указанного явления селекции вариантов в клетках МОСК. Обнаружено, что все штаммы вируса гриппа А и В человека, выделенные из клеток МОСК, связываются с высоким сродством и специфичностью по отношению к мостикам альфа2,6-сиаловая кислота-галактоза, присутствующим в олигосахаридах, находящихся в поверхностных клеточных рецепторах, тогда как их эквиваленты, выросшие в яйцах, проявляют повышенное сродство к мостикам альфа-2,3-сиаловая кислота-галактоза в поверхностных клеточных рецепторах, несущих оли
- 7 006136 госахариды (81а2-3Са1). С использованием специфичных лектинов было показано, что на поверхности эмбриональных клеток цыплят присутствовали только рецепторы, содержащие 81а2-3Са1, тогда как клетки МОСК экспрессировали как 81а2-66а1, так и 81а2-36а1. Экспрессию компонентов 81а2-36а1 и 81а26Са1 на поверхности клеток РЕВ.С6 исследовали ЕАС8-анализом, используя два разных меченых дигоксигенином (ЭЮ) лектина: агглютинин 8атЬиса шдга (8ΝΆ), который специфично узнает мостики 81а26Са1, и агглютинин Мааскта атигеи818 (МАА), который специфично узнает мостики 81а2-3Са1. На фиг. 8А показано распознавание лектинами 8ΝΑ и МАА и их связывание с сайтами гликозилирования. Кроме того, на фиг. 8А схематично показано взаимодействие между ФИТЦ-меченым анти-ОЮ-антителом и ЭЮ-меченым лектином, который узнает специфичную связь с сиалилом в основной цепи гликозилирования рецептора, присутствующего на поверхности клеток. Оба лектина брали из набора для дифференциации гликанов (Воейгтдег-Ьа Воске).
Эксперимент проводили на клетках РЕВ.С6 в суспензии и прикрепленных клетках МОСК и СНО. Клетки МОСК и СНО освобождали от твердого носителя с использованием трипсина-ЕОТА (С1ЬсоВКЕ). Затем суспензии клеток один раз промывали Мет-5% ЕВ8 и инкубировали в указанной среде в течение 1 ч при 37°С. После промывки РВ8 (С1Ьсо-ВКЕ) клетки ресуспендировали до концентрации примерно 106 клеток/мл в среде для связывания (физиологический раствор, забуференный трисом, рН 7,5, 0,5% В8А и 1 мМ каждой из солей МдС12, МпС12 и СаС12). Аликвоты клеток инкубировали в течение ч при комнатной температуре с ОЮ-мечеными лектинами 8NΑ и МАА. Через 1 ч обработанные лектинами клетки промывали РВ8 и инкубировали еще час при комнатной температуре с ФИТЦ-меченым анти-ОЮ-антителом (Воекппдег-Маппкет). Наконец, клетки промывали РВ8 и анализировали посредством флуоресцентно-активируемой сортировки клеток, используя аппаратуру для ЕАС-сортировки (Вес1оп Оюкшзоп). Результаты, представленные на фиг. 8В, показывают, что клетки РЕВ.С6 были окрашены обоими лектинами, что свидетельствует о наличии как 81а2-6Са1-рецепторов, так и 81а2-3Са1-рецепторов.
В таком же эксперименте клетки МОСК использовали в качестве позитивного контроля в отношении обоих сиалированных рецепторов, в то время как клетки СНО вследствие отсутствия гликозилирующего фермента альфа-2-6-сиалилтрансферазы в данных клетках хомячка, представляли собой негативный контроль в отношении 81а2-6Са1-компонента. На верхних панелях показаны результаты, полученные с лектином 8NΑ, и на нижних панелях показаны результаты, полученные с лектином МАА. На основании указанных результатов можно сделать вывод, что РЕВ.С6 экспрессирует белки клеточной поверхности, которые имеют как 81а2-3Са1. так и 81а2-6Са1-мостики в своих олигосахаридных цепях.
Пример 7. Влияние разных концентраций трипсина-ЕОТА на жизнеспособность клеток РЕВ.С6, на продукцию вируса гриппа в клетках РЕВ.С6 и на полученный из них белок НА.
Из-за абсолютной потребности в трипсине для размножения вирусов гриппа в культурах клеток исследовали влияние разных концентраций трипсина-ЕОТА на жизнеспособность клеток РЕВ.С6 и репликацию вируса в клетках РЕВ.С6 после инфицирования, используя несколько штаммов вируса гриппа.
Инфекция штаммом вируса гриппа А/Сидней/5/97 в присутствии низких концентраций трипсина
В день инфицирования клетки РЕВ.С6 высевали в роллерные флаконы для культуры ткани объемом 490 см3 при плотности 1 х 106 клеток/мл в присутствии трипсина-ЕОТА в конечных концентрациях 0,5, 1, 2, 3 и 5 мкг/мл.
Указанные концентрации трипсина не влияли на характеристики роста клеток и их жизнеспособность (данные не показаны). Клетки либо подвергали ложной инфекции, либо инфицировали выращенном на РЕВ.С6 вирусом гриппа А/Сидней/5/97 при то1 10-4 БОЕ/клетку. Продукцию вируса контролировали посредством анализов прямой иммунофлуоресценции (данные не показаны), гемагглютинации, одномерной радиальной иммунодиффузии (8Κ4Ο), указанных выше, и анализом бляшек, все способы, как описано выше. Результаты данного эксперимента изображены на фиг. 9, и они показывают, что содержание НА по измерениям посредством 8КГО, а также биологическая активность вируса, выраженная в НАи, были наибольшими в случае использования концентрации трипсина, равной 1 мкг/мл. На фиг. 9 также показано, что при использовании анализа бляшек наибольшее количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) в мл наблюдалось в образце, соответствующем клеткам, выращенным в среде, содержащей мкг/мл трипсина.
Инфекция штаммом вируса гриппа В/НагЬш/7/94
В день инфицирования клетки РЕВ.С6 высевали в роллерные флаконы для культуры ткани объемом 490 см3 при плотности 1 х 106 клеток/мл в присутствии разных концентраций трипсина-ЕОТА в пределах от 1 до 5 мкг/мл. Клетки инфицировали выращенным на РЕВ.С6 вирусом гриппа В/НагЬш/7/94 при то1 10-3 БОЕ/клетку. Продукцию вируса контролировали посредством анализов прямой иммунофлуоресценции, гемагглютинации и анализом бляшек, как показано на фиг. 10. Инфицируемость РЕВ.С6 на 2 день возрастала с увеличением концентрации трипсина. Однако на 3 день не наблюдалось значительных различий в проценте инфицированных клеток в тех случаях, когда присутствовало 1, 2,5 или 5 мкг/мл трипсина. В отсутствие трипсина (0 мкг/мл) не выявлено инфекции вирусом гриппа. В день последнего сбора (4 день после инфицирования) биологическая активность вируса по измерениям в анализе гемагглютинации существенно не отличалась. Интересно, что анализ инфекционности, выполненный в образцах, которые были взяты на 3 и 4 день после инфицирования, показал различие в продукции вируса. Наи
- 8 006136 большие титры получали на 3 день и 4 день в том случае, когда использовали концентрацию трипсина от 2,5 до 5 (3 день) и 1 мкг/мл (4 день).
Инфекция пересортированным вирусом гриппа Х-127
В день инфицирования клетки РЕЕ.С6 высевали в роллерные флаконы для культуры ткани Т25 при плотности 1 х 106 клеток/мл в присутствии разных концентраций трипсина-ЕИТЛ в пределах от 0 до 7,5 мкг/мл. Клетки инфицировали выращенным на РЕЕ.С6 вирусом Х-127 (пересортированный в яйцах штамм Л/Веушд/262/95) при шо1 10-4 и 10-3 БОЕ/клетку. Рост вируса контролировали посредством анализов прямой иммунофлуоресценции, гемагглютинации и анализом бляшек. Как показано на фиг. 11 и 12, титры ИЛИ в образцах были идентичными, независимыми от концентрации трипсина и исходного значения шо1, которые использовали. Кроме того, не наблюдали значимых различий в титрах инфекционности, измеренных посредством анализа бляшек.
Инфекция РЕЕ.С6 штаммом вируса гриппа А/Сидней/5/97 в присутствии высоких концентраций трипсина
Для того чтобы исследовать влияние возрастающих концентраций трипсина на жизнеспособность клеток и репликацию вируса, клетки РЕЕ.С6 высевали в роллерные флаконы при плотности 1 х 106 клеток/мл в присутствии разных концентраций трипсина-ЕИТЛ в пределах от 0 до 12,5 мкг/мл. Клетки либо ложно инфицировали, либо инфицировали выращенным на РЕЕ.С6 вирусом гриппа А/Сидней/5/97 при шо1 4 х 10-5 БОЕ/клетку. ИЛИ в полученных партиях определяли, как описано. Важно, что данные, изображенные на фиг. 13, четко показывают, что концентрации трипсина вплоть до 10 мкг/мл не влияют на жизнеспособность клеток. Кроме того, биологическая активность вируса, полученного на 4 день после инфицирования, на основании измерений ИЛИ была выше, чем при использовании концентрации трипсина от 2,5 до 5 мкг/мл. Кроме того, измеряли ТСТИ50 (фиг. 14А) и выполняли анализ бляшек (данные не показаны). Не обнаружено значимых различий при указанных анализах бляшек в титрах инфекционности (ТСШ50), в расщеплении и количестве НА (примерно 10 мкг/мл), что определяли с помощью вестернблот-анализов, показанных на фиг. 14В.
Пример 8. Продукция вируса гриппа на клетках РЕЕ.С6 в системе перфузируемого биореактора на основе полых волокон
Масштабируемость продукции вируса гриппа в растущих в суспензии клетках РЕЕ.С6 изучали, используя биореакторы объемом 3 л (общий объем), содержащие 2-литровый объем суспензии клеток в бессывороточной среде, которая также не содержала белков животного происхождения или белков человека (ЕхСе11 525, ГЕН Вюкс1еисек).
Инфицирование вирусом гриппа выполняли при плотности клеток примерно 3 х 106 клеток/мл. В клетки инокулировали выращенный на РЕЕ.С6 вирус А/Сидней/5/97 при шо1 10-4 БОЕ/клетку. Каждый день брали образцы суспензий клеток объемом от 5 до 10 мл, чтобы выполнить подсчет общего количества клеток, чтобы определить жизнеспособность клеток, для измерения концентрации глюкозы, для анализов прямой иммунофлуоресценции, гемагглютинации и инфекционности. Результаты данных экспериментов показаны на фиг. 15.
Чтобы исследовать наличие и состояние белка НА, использовали вестерн-блоты с применением двух разных анти-НА-антител, полученных из ИТВ8С. Также выполняли анализы 8К1И, как описано выше. Результаты, изображенные на двух вестерн-блотах на фиг. 16, показывают, что партия вируса гриппа, полученная в данном биореакторе, давала содержание НА с определенной концентрацией, равной 15 мкг/мл, которая была подтверждена в анализах 8К1И. Полученный НА сравним с эталонным НА ИТВ8С по субъединичному составу и иммунной реактивности с эталонной антисывороткой, специфичной для подтипа.
Пример 9. Инфекция РЕЕ.С6 вирусом А/Сидней/5/97 в биореакторе объемом 15 л с последующей специфичной процедурой в нисходящем потоке (И8Р)
Растущие в суспензии клетки РЕЕ.С6 инкубировали при 37°С в перфузируемой системе биореактора объемом 15 л на основе полых волокон при объеме клеточной суспензии, равной 10 л, в бессывороточной среде ЕхСе11 525 ДЕН Вюкаеисек). Инфицирование вирусом осуществляли при 35°С при плотности клеток, примерно равной 3,3 х 106 клеток/мл, в среде, содержащей 5 мкг/мл трипсина-ЕИТЛ (ЬтГе Тес1шо1още5). В клетки инокулировали выращенный на РЕЕ.С6 вирус А/Сидней/5/97 (пассаж номер 3) при шо1 10-4 БОЕ/клетку. Перфузию бессывороточной средой ЕхСе11 525, содержащей трипсин-ЕИТЛ, продолжали в течение первых 24 ч инфекции. Через два дня после инфицирования клетки подкармливали питательным раствором, содержащим глюкозу, незаменимые аминокислоты и дополнительный глутамин: 82 мл на литр суспензии, содержащей 50 мас./об.% глюкозы (ИРВТ-Тйе Ие1йег1апб8), 50х незаменимых аминокислот без С1п (С1Ьсо-ВЕЕ-Е1Ге Тес1шо1още5) и 200 мМ глютамина (С1Ьсо-ВЕЕ-Е1Ге Тес1по1още5). Каждый день брали образцы суспензии клеток объемом 10 мл для того, чтобы выполнить стандартные подсчеты количества клеток (результаты показаны на фиг. 17, левый график), для измерений концентрации глюкозы (результаты показаны на фиг. 17, правый график), для анализов прямой иммунофлуоресценции (фиг. 18), гемагглютинации (фиг. 19) и инфекционности (данные не показаны). Кроме того, исследовали белок НА с помощью вестерн-блот-анализов и сравнивали со стандартным контролем НА ИТВ8С (фиг. 20). В день последнего сбора всей суспензии клеток (92 ч после инфицирования) очист
- 9 006136 ку от обломков клеток выполняли в непрерывном потоке при 20000 д, используя сепарирующую систему РотегГиде™ (Сагг, 1М Зерагайопк) в соответствии с протоколами, предоставляемыми производителем. Затем очищенный надосадок двадцатикратно концентрировали, используя мембранный картридж на основе полых волокон с отсечкой 500 кД (Л/С Тес11по1оду. ДМ 8ерага(юп5). Результаты, изображенные на фиг. 21, показывают, что количественное получение живого вируса гриппа после концентрирования на полых волокнах по измерениям с помощью анализов гемагглютинации и инфекционности является очень значительным.
Пример 10. Иммуногенность выращенных на РЕК.. С 6 вирусов гриппа и полученных на их основе вакцин
Чтобы определить иммуногенность выращенных на РЕК. С 6 вирусов гриппа, разработали исследование ίη у1уо и модель контрольного заражения хорьков. Использовали две партии тривалентной вакцины на основе целых инактивированных вирусов гриппа (состоящей из А/Сидней/5/97, А/Вегрпд/262/95 и В/НаГЫп/7/94), содержащей 15 мкг НА каждого из трех штаммов. Первую партию получали из оплодотворенных куриных яиц, а вторую получали из клеток РЕК.С6. Получение, очистку, инактивацию и приготовление состава тривалентных вакцин на основе целых инактивированных полученных из клеток РЕК.С6 вирусов гриппа выполняли, как описано ниже.
Рост штаммов вируса гриппа А/ Сидней/5/97, А/Вегрпд/262/95 и В/НагЫп/7/94 на РЕК.С6
Получение всех трех партий вируса гриппа осуществляли в трех отдельных системах биореакторов с подпиткой при помощи полых волокон объемом 3 л при объемах суспензии клеток, равной 2 л. Подпитку осуществляли путем добавления следующего раствора: один раз добавляли раствор, содержащий в общем объеме 96 мл 50 мас./об.% глюкозы (ИРВ1), 50х незаменимых аминокислот без С1п (С1Ьсо-ВКЬЬ1Ге Тесйпо1од1е8), 200 мМ глутамина (СЛсо-ВКЕ-ЬгГе Тесйпо1од1е8) и 7,5 мас./об.% ИаНСО3 (Мегск). Инфицирование вирусом гриппа выполняли при плотности клеток в пределах от 1,8 х 106 до 2,6 х 106 живых клеток/мл в бессывороточной среде ЕхСе11 525, содержащей 5 мкг/мл трипсина-ЕИТА. На клетки РЕК.С6 высевали выращенные на РЕК.С6 партии вируса А/Сидней/5/97, А/Вегцпд/262/95 и В/НагЬш/7/94 при разных значениях шок 10-4 (А/Сидней/5/97) или 10-3 (А/Вегцпд/262/95 и В/НагЬт/7/94) БОЕ/клетку. Во время периода продуцирования вируса каждый день отбирали образцы объемом 10 мл для того, чтобы выполнить стандартные подсчеты клеток и жизнеспособности, для измерений концентрации глюкозы, анализов прямой иммунофлуоресценции и гемагглютинации. На фиг. 22 (результаты для клеток РЕК.С6, инфицированных А/Сидней/5/97) показано общее количество клеток и количество жизнеспособных клеток после инфицирования вирусом (верхняя левая панель), потребление глюкозы (верхняя правая панель), процент позитивных клеток при определении прямой иммунофлуоресценции (нижняя левая панель) и НАИ (нижняя правая панель). На фиг. 23 (результаты для клеток РЕК.С6, инфицированных А/Вегрпд/262/95) показано общее количество клеток и количество жизнеспособных клеток после инфицирования вирусом (верхняя левая панель), потребление глюкозы (верхняя правая панель), процент позитивных клеток при определении прямой иммунофлуоресценции (нижняя левая панель) и НАИ (нижняя правая панель). На фиг. 24 (результаты для клеток РЕК.С6, инфицированных В/НагЫп/7/94) показано общее количество клеток и количество жизнеспособных клеток после инфицирования вирусом (верхняя левая панель), потребление глюкозы (верхняя правая панель), процент позитивных клеток при определении прямой иммунофлуоресценции (нижняя левая панель) и НАИ (нижняя правая панель). Концентраты, содержащие вирус, хранили при -80°С до И8Р.
Во всех трех случаях потребление глюкозы и жизнеспособность и общее количество клеток для клеток РЕК.С6 были сравнимы. Уровни продукции трех вирусов на основании измерений прямой иммунофлуоресценции также были сходными. Хотя по НАИ и титрам инфекционности разные штаммы отличались, РЕК.С6 поддерживали репликацию всех тестированных в данной работе вирусов гриппа.
В день сбора партий целиком (либо на 3, либо на 4 день после инфицирования) надосадки вирусов очищали центрифугированием при 2000 об/мин в настольной центрифуге с верхней загрузкой и десятикратно концентрировали посредством ультрафильтрации с использованием мембранного картриджа на основе полых волокон с отсечкой 750 кД (А/С Тесйпо1оду, 1М Зерагайопк), следуя протоколам, предоставляемым производителем. Вирусы гриппа очищали из концентрированных надосадков с помощью двух последовательных стадий центрифугирования в градиенте плотности: 25-70% ступенчатый градиент сахарозы (1,5 ч при 27 К) с последующим непрерывным градиентом сахарозы 25-70% (4 ч при 23 К). Полосы, соответствующие вирусам, разбавляли примерно 50 мл фосфатного буфера и, наконец, осаждали при 24000 об/мин в ультрацентрифуге. Вирусные осадки разводили в фосфатном буфере в объеме от 1,5 до 2,3 мл, разделяли на аликвоты и замораживали при -80°С. Композиция инактивированных вирусных вакцин основана на количестве (в микрограммах) иммунологически активного белка НА, измеренного посредством анализа 8КГО (\Уоо6 е1 а1. 1977). Выполняли тестирование, для того чтобы охарактеризовать содержание НА в партиях. В то же время измеряли количество белков, используя основанный на методе Лоури набор для анализа ИС-белков (Вюгаб), следуя процедурам, предлагаемым производителем. Обнаружено, что НА составляет примерно от 20 от 30% общего содержания белка в препаратах вируса.
- 10 006136
Пример 11. Иммуногенность ϊπ νίνο инактивированных вакцин, полученных в яйцах и на клетках РЕК.С6.
Хорьки и мыши представляют собой две хорошо разработанные животные модели для исследования инфекции гриппа, и их использовали для того, чтобы определить эффективность и иммуногенность вакцин гриппа. Используя мышиную модельную тест-систему, сравнивали иммуногенность тривалентных вакцин, содержащих А/Сидней/5/97, А/Вецтд/262/95 и В/НагЬ1п/7/94, полученных на РЕК.С6 и яйцах, анализируя сыворотки вакцинированных животных при анализе ингибирования гемагглютинации. Используя модель инфекции хорьков после иммунизации, проводили контрольное заражение А/Сидней/5/97. Выход вируса на клетках МБСК и анализ ингибирования гемагглютинации, выполненный на сыворотке, использовали для того, чтобы сравнить иммуногенность и эффективность двух вакцин.
Исследование ϊπ νίνο на мышах
Девяносто самок мышей Ва1Ь/С делили на девять групп по десять мышей. В день 0 собирали до 100 мкл крови. Отделяли сыворотку и хранили при -20°С. Затем каждую мышь вакцинировали соответствующей вакциной согласно схеме, указанной в таблице 1. На 28 день брали еще 100 мкл крови. Сыворотку хранили при -20°С. Каждую мышь снова вакцинировали согласно режиму, указанному в таблице 1. На 42 день отбирали 100 мкл крови и всех мышей забивали. Отделяли сыворотку и замораживали при -20°С. Анализы ингибирования гемагглютинации (ΗΙ) проводили на образцах сыворотки, отобранных на 0, 28 и 42 день. Все указанные анализы проводили в параллели для каждого дня для вирусов, выращенных как в яйцах, так и клетках.
Таблица 1. Тестирование иммуногенности у мышей
| Номер группы | Тип антигена | Объем иммунизации (мл) | Путь вакцинации | Всего мкг НА на дозу |
| 1 | Тривалентные цельновирионные из яиц | 0,5 | п/к | 9,0 |
| 2 | Тривалентные цельновирионные из яиц | 0,5 | п/к | 3,0 |
| 3 | Тривалентные цельновирионные из яиц | 0,5 | п/к | 1,5 |
| 4 | Тривалентные цельновирионные из яиц | 0,5 | п/к | 0,15 |
| 5 | Тривалентные цельновирионные из РЕК.Сб | 0,5 | п/к | 9,0 |
| 6 | Тривалентные цельновирионные из РЕК.С6 | 0,5 | п/к | 3,0 |
| 7 | Тривалентные цельно- вирионные из РЕК.Сб | 0,5 | п/к | 1,5 |
| 8 | Тривалентные цельно- вирионные из РЕК.Сб | 0,5 | п/к | 0,15 |
| 9 | РВ5 | 0,5 | п/к | 0 |
Исследование ϊπ νίνο на хорьках
Восемнадцать взрослых самок хорьков (альбиносы или черные) делили на три группы по шесть, разделенных следующим образом: группа 1 внутримышечно (в/м) получала тестируемую вакцину, полученную из яиц, животных контрольно заражали А/Сидней/5/97. Группа 2 в/м получала тестируемую вакцину, полученную на клетках РЕК.С6, животных контрольно заражали А/Сидней/5/97. Группа 3 получала только разбавитель тестируемой вакцины и животных контрольно заражали А/Сидней/5/97. Тестируемые вакцины вводили на 0 и 28 день. На 56 день всех хорьков инфицировали интраназально 0,5 мл вируса для контрольного заражения А/Сидней/5/97 при ТСГО50, равной 103. Выполняли назальные промывки и один раз в день с 57 по 63 день проверяли количество воспалительных клеток, температуру и массы хорьков. Всех животных забивали на 63 день. Отделяли сыворотку и хранили при -20°С. Образцы назальных промывок хранили на льду и подсчет выхода клеток в назальных промывках проводили, используя анализ исключения при окрашивании трипановым синим.
Титр вируса, полученного из образцов назальных промывок, определяли измерением выхода вируса на клетках МБСК. Использовали метод расчета по 8реагшап апб КагЬег (1931), чтобы вычислить значения ТСГО50. Анализы ингибирования гемагглютинации проводили на образцах сыворотки, отобранных
- 11 006136 на 0, 28, 56 и 63 день. На основе данного эксперимента сделан вывод, что полученная на клетках РЕК.С6 тестируемая вакцина была эффективной.
Пример 12. Характеристика белка НА, полученного из вируса гриппа, продуцируемого клетками РЕК..С6.
Для того чтобы исследовать гликозилирование НА в клетках РЕК.С6, получили партию нерасщепленного НА (НА0). Клетки РЕК..С6 инфицировали вирусом А/Сидней/5/97 (пассаж номер 5 на РЕК..С6) при то1 1; 0,1 и 0,01 БОЕ/клетку в среде ЕхСе11 525, содержащей трипсин-ЕОТА в конечной концентрации 5 мкг/мл. После 1 ч инкубации при 35°С клетки дважды промывали РВ8, чтобы удалить трипсин, и инкубировали в течение ночи при 35°С и 10% СО2 в отсутствии трипсина. Спустя день собирали суспензии клеток и центрифугировали (500 д), и осадки клеток дважды промывали средой. Вирусные надосадки замораживали при -80°С и их образцы использовали в вестерн-блот-анализах, как описано, чтобы исследовать наличие или отсутствие нерасщепленного белка НА.
Нерасщепленный белок НА (НА0) состоит из двух субъединиц: НА1 и НА2, которые связаны посредством дисульфидной связи. Поскольку указанную дисульфидную связь можно нарушить при восстановлении с помощью ДТТ, НА1 и НА2 можно разделить и визуализировать в восстанавливающем геле с последующими вестерн-блотами с использованием антисыворотки, которая узнает субъединицы. Если белок НА состоит только из НА0, будет видна одна полоса, которая мигрирует медленнее в ОС'Н/ПААГ геле по сравнению с субъединицей НА1 и самой быстро мигрирующей субъединицей НА2. Результаты, показанные на фиг. 25, свидетельствуют о наличии, главным образом, нерасщепленного НА0, полученного при инфекциях РЕК..С6, по сравнению с полученным из яиц позитивным контролем, который приобретали в ЫГВЗС (ИК). Чтобы подтвердить, что выявленная полоса действительно представляла собой нерасщепленный гемагглютинин, образец НА0 расщепляли трипсином в разных концентрациях в пределах от 2,5 до 10 мкг/мл в среде в течение ночи при 37°С. Расщепленные белки наносили при восстанавливающих условиях на ОСН/ПААГ-гель с последующим вестерн-блот-анализом с использованием такой же антисыворотки, как описано для фиг. 14. Как показано на фиг. 26А, можно добиться расщепления НА0, что подтверждает образование нерасщепленного белка НА в РЕК..С6. На основании указанных результатов разработали анализ для определения активности трипсина в культуральной среде с использованием НА0 вируса гриппа в качестве субстрата.
Анализ активности трипсина
Чтобы определить, активен ли еще трипсин, присутствующий в среде культивирования в период продуцирования вируса гриппа, разработали анализ активности трипсина. Указанный анализ основан на измерении ферментативной активности трипсина по расщеплению субстрата, который наиболее важен для продукции вакцины гриппа: НА0.
Определяли сохраняет ли трипсин активность в культуре РЕК..С6, зараженной вирусом гриппа В/НагЬш/7/94 (то1 10-3/10-4 БОЕ/клетку), в течение полного периода продуцирования. С этой целью 10 мкл надосадка, отобранного на 1, 2 или 3 день после инфицирования, использовали, чтобы расщепить 68 нг субстрата, который состоял из НА0 вируса гриппа А/Сидней/5/97, в течение ночи при 37°С. После расщепления добавляли ингибиторы протеазы до конечной концентрации 1х (полная смесь ингибиторов протеаз, ВоеРРидег МаииРет) в 3х буфере Лэмли с 150 мМ ДТТ (Р1ика). Образцы наносили на ОСН/ПААГ-гель в 10% трис-НС1 (Вюгаб) и разгоняли. Вестерн-блот выполняли, как описано. Результаты показаны на фиг. 26В и демонстрируют, что в культурах РЕК..С6, зараженных вирусом гриппа В/НагЬш, трипсин сохраняет активность в течение всего периода продуцирования, так как надосадки культуры обладали способностью полностью расщеплять НА0.
Пример 13. Расщепление НА0 Ν-гликозидазой Р
Белок НА вируса гриппа представляет собой гликопротеид, который содержит от 3 до 9 Νсвязанных сайтов гликозилирования олигосахаридами. Количество сайтов зависит от штамма вируса. Положение указанных сайтов определяют по нуклеотидной последовательности гена НА, и поскольку вирусный геном вируса гриппа реплицируется склонной к ошибкам РНК-полимеразой, с высокой частотой происходят мутации, которые вызывают добавление или удаление сайтов гликозилирования. Затем определяют состав и структуру олигосахаридных цепей, присутствующих на НА, с помощью ряда биосинтетических и корректирующих гликозилирование ферментов, предоставляемых клеткой-хозяином. Поскольку гликозилирование НА играет важную роль в вирулентности и эффективности вакцины, изучали свойства НА, полученного на инфицированных вирусом гриппа РЕК..С6. Расщепление нерасщепленного белка НА0 вируса А/Сидней/5/97 ферментом Ν-гликозидазой Р выполняли, используя протокол, предоставленный производителем, для того чтобы удалить семь олигосахаридов, предположительно присутствующих на полипептиде НА вируса А/Сидней/5/97. Вирус гриппа А/Сидней/5/97 лизировали 1% тритоном Х-100 (Мегск). Ингибитор протеазы добавляли к аликвоте данного лизированного вируса, соответствующей 68 нг НА, до конечной концентрации 1х (полная смесь ингибиторов протеаз ВоеРпидег МаииРет). Полученный образец инкубировали в присутствии 100 мМ NаРΟ4, рН 7, 10 мМ ЕЭТА (РТ. Вакег), 1% ОСН (РТ. Вакег) и 1% β-меркаптоэтанола (Мегск). Все это инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Образец разбавляли в пять раз в 100 ММ NаРΟ4, рН 7, 10 ММ ЕЭТА (РТ. Вагкег), 0,625% ΝΈ-40 и 1% β-меркаптоэтаноле (Мегск). Из полученной смеси 40 мкл использовали для
- 12 006136 глико-Е-расщепления. Для этого добавляли 2 мкл раствора глико-Е с концентрацией 1 и/мкл (Ν’гликозидаза Е, Воейппдег) и инкубировали в течение периода времени, равного как минимум 16 ч, при 37°С. Затем добавляли 3х буфер Лэммли с 150 мМ ДТТ (Е1ика) до конечной концентрации 1х. Образцы разгоняли в 7,5% ЭСН/ПААГ-геле. ЭСН-ПААГ и вестерн-блот выполняли следующим образом. Коротко, блот блокировали в течение 30 мин при комнатной температуре блокирующим раствором (5% сухой порошок обезжиренного молока, Вюгаб, в ТВБТ с добавлением 1% сыворотки кролика (Коск1апф, после чего 3 раза промывали ТВ8Т. Затем блот инкубировали с антисывороткой против А/Сидней/5/97 (98/768 МВБС) в разведении 1/500 в 1% В8А/ТВ8Т с 5% сыворотки кролика (Коск1апф в течение ночи при комнатной температуре. Блот снова 8 раз промывали ТВ8Т. Наконец блот инкубировали с меченой НКР кроличьей антисывороткой против иммуноглобулина овцы (КосИапф, разведенной 1/6000 в блокирующем растворе, в течение 1 ч при комнатной температуре. После 8 промывок ТВ8Т комплекс конъюгированных белков выявляли с помощью ЕСЬ (Атегкйат Рйагтас1а Вю1ес11) и экспонировали с пленками (НурегШт, Атегкйат Ьйе Баепсек). Как показано на фиг. 27, обработка ферментом гликозидазой Е отчетливо снижала размер белка примерно на 28-30 кД, при предполагаемой потере примерно 4 кД на олигосахарид. Полоса белка, указанная звездочкой (*), представляет собой дегликозилированный НА0, который мигрирует подобно продукту в виде субъединицы НА1, полученной после расщепления НА0 на субъединицы НА1 и НА2 (правые дорожки).
Пример 14. Расщепление НА0 с помощью Асси1аке
Исследовали возможность замены полученного из млекопитающих трипсина-ЕОТА белками не млекопитающих или рекомбинантными белками. Недавно для обычной культуры клеток появилась смесь протеолитических и коллагенолитических ферментов (Асси1аке™, РАА) из беспозвоночного. Вследствие своего происхождения не из организма млекопитающих Асси!аке не содержит прионов, парвовирусов и других компонентов, которые потенциально могут загрязнять растворы трипсина-ЕЭТА. До настоящего времени нет возможности получить информацию относительно типа протеаз, присутствующих в Асси!аке. Расщепление НА0 исследовали, используя вестер-блот-анализ. Постоянное количество белка НА0, полученного посредством РЕК.С6, инфицированных А/Сидней/5/97 при то1 1 БОЕ на клетку без трипсина, расщепляли с помощью нескольких серийных разведений Асси!аке в течение ночи при 37°С. В качестве позитивного контроля использовали такое же количество НА0, расщепленного 100 нг трипсина-ЕЭТА. Затем расщепленные белки наносили на 10% ЭСН-ПААГ-гель в восстанавливающих условиях для вестерн-блот-анализа. Как показано на фиг. 28, расщепление с помощью обработки 2 мкл Асси!аке приводила к полному расщеплению НА0; частичное расщепление наблюдали при использовании 0,2 мкл.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что обработка АссШаке во время репликации и продукции вируса гриппа может заменять трипсин-ЕЭТА во время инфекций на РЕК.С6.
Пример 15. Электронно-микроскопический анализ вирусов гриппа в клетках РЕК.С6
Исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии выполняли на клетках РЕК.С6, которые инфицировали штаммом гриппа А/Сидней/5/97, а также на надосадках, содержащих вирусы, и материале, очищенном в сахарозе, для того чтобы определить фенотип указанного вируса гриппа, продуцируемого в клетках РЕК.С6. Все использованные способы хорошо известны специалистам в данной области. На фиг. 29 показано, что последние стадии жизненного цикла вируса представлены активной репликацией и высвобождением покрытых оболочкой вирионов из цитоплазматической мембраны. Выявлены выступы, соответствующие вирусным белкам НА и ΝΆ, обрамляющие периферию вирионных частиц. На фигуре также показан характерный плейоморфизм вирусов гриппа.
Пример 16. Инфекция РЕК.С6 множеством штаммов вирусов гриппа А и В
Применение РЕК.С6 в качестве основной технологии получения вакцины гриппа требует, чтобы РЕК.С6 поддерживали рост широкого ряда штаммов разных подтипов вируса гриппа.
Стационарные суспензионные культуры клеток РЕК.С6, которые выращивали во флаконах Т25 и/или в 6-луночных планшетах в среде ЕхСе11 525, инфицировали при плотности клеток 106 клеток/мл 16 разными штаммами вирусов гриппа, показанными на фиг. 30 А. Указанные штаммы включали в себя несколько штаммов №N2, НШ1, В-типа и птичьи штаммы. Инфекции осуществляли в присутствии 5 мкг/мл трипсина. Вирусы получали из МВ8С (ИК) в виде пассируемых на яйцах штаммов дикого типа или пересортированных штаммов, и они отмечены. Инфекции выполняли разведениями вирусов, рекомендованными МВ8С в технологических картах, которые предоставлены с разными штаммами. Все тестируемые вирусы были способны размножаться в РЕК.С6, что определяли по иммунофлуоресценции (данные не показаны) и титрованию надосадочных жидкостей в анализе БОЕ (фиг. 30В).
Полученные результаты показывают, что даже штаммы вируса гриппа (обозначенные звездочками), такие как А/1ойаппекЬигд/33/94, В/Веушд/184/93 и А/Оиск/8упдароге-0/Е119-3/97, которые обычно очень трудно получать на эмбрионах яиц, могут реплицироваться и могут быть получены на клетках РЕК.С6 человека.
- 13 006136
Пример 17. Получение вируса простого герпеса типа 1 (Η8ν-1), вируса простого герпеса типа 2 (Η8ν-2) и вируса кори на РЕК.С6
Проверяли, могут ли на РЕК.С6 также реплицироваться другие вирусы, отличные от вируса гриппа и аденовируса, такие как вирус простого герпеса типа 1 и 2 и вирус кори. На основе выращенных на РЕК.С6 партиях вирусов созданы вакцины, которые получены из указанных выращенных на РЕК.С6 вирусах, и которые индуцируют нейтрализующее действие у человека для защиты от инфекций дикого типа. Штаммы, которые получали из АТСС и использовали для инфекции клеток РЕК.С6, указаны в табл. 2.
Таблица 2.
Штаммы вируса простого герпеса и кори, которые получали из АТСС и которые использовали для инфекции клеток РЕК.С6
| Вирус | Штамм | АТСС Катал. № | № партии | История пассажей | Титр |
| Простого герпеса типа 1 | Мас1пЕуге | УК-539 | 1327850 | у.5./12, РК КаЬК/5, МЬ/1, РгКаЬК/5, Уего/4, Уего (АТСС СС1-81)/1 | Ю6'75 ТСЮ50/ 200 мкл |
| Простого герпеса типа 2 | М3 | УК-540 | 216463 | Хориоидное сплетение овцы/?, НеЬа/?, РтКаЬК/7, Уего (АТСС СС1-81)/3 | 107'6 ТСЮ50/ 200 мкл |
| Кори | ЕбтопзТоп | УК-24 | 215236 | НК/24, НиАт/40, МКС-5/1, МКС-5 (АТСС ССЬ-171)/1 | 104 ТСЮ50/ мл |
Для того чтобы тестировать, могут ли вирусы Η8ν-1 и Η8ν-2 и кори, полученные из АТСС, реплицироваться и продуцироваться в РЕК.С6, клетки пассажа номер 46 высевали в камеры ЬаЫек, покрытые поли-Ь-лизином с использованием способов, известных специалистам в данной области, при плотности 105 клеток/лунку. Клетки Еего от обезьян (полученные из АТСС) культивировали в пассаже номер 137 и использовали в качестве позитивных контролей, и высевали при плотности 2,5 х 104 клеток/лунку. В день 0, когда в лунках клетки РЕК.С6 сливались на 60% и клетки Сего на 80%, клетки инфицировали при разных значениях шо1 (10-3, 10-2, 10-1 и 1 ТСГО50 на клетку). С промежутками в один день при инфекции клетки фиксировали и анализировали по иммунофлуоресценции с использованием специфичных моноклональных антител, конъюгированного с ФИТЦ типа, используя набор (для вируса простого герпеса (Η8ν) типа 1 и 2 1тадеп, (Иако)) и ФИТЦ-конъютированные антитела против НА и белка матрикса вируса кори (набор ΙΤΑ для кори, Ι,ίμΙιΙ сНеЩпоФез), следуя процедурам, предлагаемым производителем. Антисыворотка направлена против антигенов Η8ν-1 и Η8ν-2 и вируса кори.
Результаты, суммированные на фиг. 31, показывают, что РЕК.С6 является пермиссивной для инфекций Η8ν-1 (фиг. 31Ό), Η8ν-2 (фиг. 31Е) и вирусом кори (фиг. 31 А). Кроме того, кинетика свидетельствует о том, что указанные вирусы реплицируются на РЕК.С6 зависимым от то1 образом.
Затем исследовали, могут ли Η8ν-1, Η8ν-2 и вирус кори размножаться на РЕК.С6. С этой целью клетки инфицировали при то1 0,01; 0,1 и 1 ТСГО50/клетку для Η8ν-1 (фиг. 32С) и Η8ν-2 (фиг. 32А) и при то1 0,001 ТСГО50/клетку для вируса кори (фиг. 32В) (пассаж номер 1). При проявлении почти полного ЦПД собирали клетки и надосадки, быстро замораживали в жидком Ν2 и размораживали. После этого осветленные надосадки вслепую пассировали, используя примерно 100 мкл, на РЕК.С6 (пассаж номер 2). И снова после достижения почти полного ЦПД сходным образом проводили третий пассаж (пассаж номер 3). Значения то1 пассажа номер 2 и 3 определяли ретроспективно по анализам ТСГО50.
Результаты проведенных экспериментов показывают, что вирус простого герпеса типа 1 и 2 и вирус кори могут реплицироваться в РЕК.С6, и что репликация и размножение могут даже происходить уже при использовании значении то1 10-7.
Пример 18. Скрининг ротавируса в отношении репликации на РЕК.С6
Чтобы проверить, могут ли РЕК.С6 поддерживать репликацию ротавируса, клетки РЕК.С6 инфицировали ротавирусом резус (ММи 18006; ΑΤΟΟ#νΚ-954; штамм 8:ϋ8Α:79:2; партия №2181153). Клетки РЕК.С6 (пассаж номер 41) культивировали при плотности 1 х 105 в мл и клетки Еего от обезьян (получены из АТСС, пассаж номер 139) культивировали при плотности 2,5 х 104 в мл и затем высевали в камеры ЬаЫек, которые были предварительно покрыты поли-Ь-лизином с применением способов, известных специалистам в данной области. Клетки инфицировали при то1 1 ТСГО50/клетку ротавирусов резус в
- 14 006136 присутствии и отсутствии 2 мкг/мл трипсина-ΕΌΤΆ. После 90 мин инфекции клетки промывали средой ЕхСе11 525 и далее инкубировали при 37°С при 10% СО2 во влажной атмосфере. В 5 последующих дней после инфицирования собирали образцы надосадков, очищали от клеток и клеточных остатков центрифугированием при 2000 об/мин в настольной центрифуге с верхней загрузкой и анализировали способом ЕЫ8А, специфичным в отношении ротавируса (ΙΌΕΙΆ Во1ау1ги8, Эако). Результаты, изображенные на фиг. 33, четко показывают, что ротавирус резус реплицируется на РЕК..С6.
Подписи к фигурам
Фиг. 1. Процент инфицированных клеток (позитивные клетки), видимых под микроскопом после анализа иммунофлуоресценции, против процента погибших клеток, измеренных с помощью ЕАС8 после окрашивания йодидом пропидия, при шо1 10-3 и 10-4.
Низкая жизнеспособность клеток в образцах, полученных для инфекции при шо1 10-3, не давала возможности получить надежные данные.
Фиг. 2. Процент инфицированных клеток, видимых под микроскопом после анализа иммунофлуоресценции. Образцы, полученные при инфицировании с шо1 10 и 1 через 48 ч после инфицирования, не показаны из-за полного ЦПД.
Фиг. 3. Кинетика размножения вируса, измеренная в единицах гемагглютинации (НАИ) с 1 по 6 день после инфицирования.
Фиг. 4. Процент инфицированных клеток (позитивные клетки), видимых под микроскопом после анализа иммунофлуоресценции.
Фиг. 5. Кинетика размножения вируса, измеренная в единицах гемагглютинации (НАИ) с 1 по 6 день после инфицирования.
Фиг. 6. Процент инфицированных клеток (позитивные клетки), видимых под микроскопом после анализа иммунофлуоресценции.
Фиг. 7. Кинетика размножения вируса, измеренная в единицах гемагглютинации (НАИ) со 2 по 6 день после инфицирования.
Фиг. 8. Экспрессия мостиков 81а2-30а1 и 81а2-60а1 на рецепторах клеточной поверхности, присутствующих на клетках яичника китайского хомячка (СНО), клетках РЕК..С6 и клетках МОСК. (А) Схематичное представление взаимодействия агглютинина 8ашЬиеа шдта (8ΝΑ), лектина, который специфично узнает мостики 81а2-60а1, и агглютинина МааеШа ашигеп515 (МАА), лектина, который специфично узнает мостики 81а2-30ак Также схематично изображено взаимодействие с ФИТЦ-меченым антителом против ΌΙΟ и ΌΙΟ-меченым лектином, связанным с олигосахаридной цепью на белке клеточной поверхности. (В) ЕАС8-анализ клеток, инкубированных с ΌΙΟ-мечеными лектинами. Лектины, связанные с клетками, выявляли с помощью ФИТЦ-меченого анти-ЭЮ-антитела, используя способы, известные специалистам в данной области. Подсчитанное количество клеток наносили против интенсивности флуоресценции окрашенных лектином клеток (серые) по сравнению с клетками, которые инкубировали только с ФИТЦ-анти-ОЮ-антителом (не закрашены). На верхних панелях показан сдвиг при анализе ЕАС8, полученный при использовании лектина 8ЫА, а на нижних панелях показан сдвиг при анализе ЕАС8, полученный при использовании лектина МАА.
Фиг. 9. Инфекция А/Сидней/5/97 в РЕВ.С6. (А) Влияние трипсина-ЕЭТА на титры НАИ. (В) Концентрация НА в мкг/мл и (С) титры инфекционности вируса в БОЕ/мл, которые измеряли в неочищенных вирусных надосадках через 96 ч после инфицирования.
Фиг. 10. Инфекция В/НатЬш/7/94 в РЕВ.С6. (А) Влияние разных концентраций трипсина-ЕЭТА, присутствующего во время и после вирусной инфекции, на кинетику роста. (В) Титры НАИ на 50 мкл и (С) титры инфекционности вируса в БОЕ/мл.
Фиг. 11. Инфекция Х-127 в РЕВ.С6 при шо1 10-3. (А) Влияние трипсина-ЕЭТА на НАИ, приведенное в НАИ/50 мкл, и (В) титры инфекционности вируса в БОЕ/мл в течение 5 дней после инфицирования.
Фиг. 12. Инфекция Х-127 в РЕВ.С6 при шо1 10-4. (А) Влияние трипсина-ЕИТА на НАИ, приведенное в НАИ/50 мкл, и (В) титры инфекционности вируса в БОЕ/мл в течение 5 дней после инфицирования.
Фиг. 13. Влияние трипсина-ЕИТА на (А) жизнеспособность клеток РЕК..С6 и (В) биологическую активность вируса. Жизнеспособность клеток измеряли после окрашивания трипановым синим. Титры НАИ измеряли, как описано, и приводили в НАИ на 50 мкл.
Фиг. 14. Влияние трипсина-ЕЭТА на титры инфекционности вируса и содержание белка НА после инфицирования гриппом клеток РЕК..С6 с использованием А/Сидней/5/97. (А) Анализ инфекционности выполняли посредством инокуляции в четырех повторах клеток МОСК общим объемом 100 мкл 10кратно серийно разведенных надосадков, содержащих вирусы, в бессывороточной среде с трипсиномЕЭТА (4 мкг/мл). Через семь дней надосадок указанных культур тестировали в отношении активности НА. Титры инфекционного вируса рассчитывали согласно способу 8реагшап-КатЬег (1931). (В) Вестернблот-анализ НА-белка А/Сидней/5/97. Сбор вирусных белков выполняли путем разрушения и денатурации белков, используя лизирующий буфер, содержащий ЭСН. Электрофорез выполняли в 10% ЭСН/ПААГ-геле в восстанавливающих условиях. Разделенные белки исследовали с помощью специфичной антисыворотки против А/Сидней-НА. Наносили возрастающие количества А/Сидней-НА- 15 006136 антигена позитивного контроля (4 левых дорожки) и 10 мкл надосадков образцов клеток РЕК.С6, инкубированных с указанным количеством трипсина (5 правых дорожек).
Фиг. 15. Жизнеспособность клеток РЕК.С6, концентрация глюкозы и кинетика роста А/Сидней/5/97 в перфузируемой системе на основе полых волокон.
Фиг. 16. Характеристика и количественный анализ вируса гриппа А/Сидней/5/97, размножаемого в РЕК.С6 в перфузируемой системе на основе полых волокон. ОСН-ПААГ и вестерн-блоты выполняли, как описано в подписи к фиг. 14, для анти-А/Сидней-НА-антитела. Моноклональное антитело анти-НАметка (НА-зонд (Е7), мышиное моноклональное, (8ап!а Сгпх) использовали в разведении 1:1000. В качестве второго антитела использовали конъюгированное с НКР антимышиное антитело козы (Вюгаб) в разведении 1:7500.
Фиг. 17. Жизнеспособность клеток РЕК.С6 (левая панель) и концентрация глюкозы (правая панель) в биореакторе объемом 12 л вплоть до 92 ч после инфицирования вирусом А/Сидней/5/97.
Фиг. 18. Инфекция РЕК.С6 вирусом А/Сидней/5/97 в 10 л суспензии клеток в биореакторе объемом 12 л. Кинетика репликации вируса, измеренная при анализе иммунофлуоресценции, приведена в процентах позитивно окрашенных клеток.
Фиг. 19. Инфекция РЕК.С6 вирусом А/Сидней/5/97 в 10 литрах суспензии клеток в биореакторе объемом 12 л. Кинетика репликации вируса, измеренная при анализе гемагглютинации, приведена в НАи в течение нескольких дней после вирусной инфекции. Столбик, обозначенный звездочкой, представляет количество НАИ, полученное после очистки в РотеНиде™, как описано в тексте.
Фиг. 20. Вестерн-блот после инфицирования РЕК.С6 вирусом А/Сидней/5/97 в 10 л суспензии клеток в биореакторе объемом 12 л. Показана характеристика и количественный анализ полипептида НА вируса гриппа А/Сидней/5/97. ОСН/ПААГ и вестерн-блот выполняли, как описано в подписи к фиг. 14. Разные субъединицы (НА1 и НА2) и нерасщепленные белки НА0 показаны острием стрелок. В качестве позитивного контроля служил НА, полученный из ЫВ8С.
Фиг. 21. Определение НАИ и БОЕ/мл после инфицирования РЕК.С6 вирусом А/Сидней/5/97 в 10 л суспензии клеток в биореакторе объемом 12 л. После инфицирования следовала обработка нисходящим потоком (Э8Р). Также показан выход при сборе вирусов после ультрафильтрации на полых волокнах (20кратное концентрирование).
Фиг. 22. Инфекция РЕК.С6 вирусом А/Сидней/5/97 в 2 л суспензии клеток в биореакторе объемом 3 л. Приведены жизнеспособность клеток РЕК.С6 (вверху слева), концентрация глюкозы (вверху справа) и кинетика роста вирусов в процентах позитивно окрашенных клеток (внизу слева) и НАИ (внизу справа).
Фиг. 23. Инфекция РЕК.С6 вирусом А/Веушд/262/95 в 2 л суспензии клеток в биореакторе объемом
л.
Приведены жизнеспособность клеток РЕК.С6 (вверху слева), концентрация глюкозы (вверху справа) и кинетика роста вирусов в процентах позитивно окрашенных клеток (внизу слева) и НАИ (внизу справа).
Фиг. 24. Инфекция РЕК.С6 вирусом В/НагЫп/7/94 в 2 л суспензии клеток в биореакторе объемом 3 л. Приведены жизнеспособность клеток РЕК.С6 (вверху слева), концентрация глюкозы (вверху справа) и кинетика роста вирусов в процентах позитивно окрашенных клеток (внизу слева) и НАИ (внизу справа).
Фиг. 25. Вестерн-блот-анализ нерасщепленного белка НА0 вируса А/Сидней/5/97. Позитивно окрашенные белки выявляли после инкубации со специфичной антисывороткой против А/Сидней, полученной из Ы1В8С, и как описано в подписи к фиг. 14 и в тексте.
Фиг. 26. (А) Вестерн-блот-анализ полученного из вируса А/Сидней/5/97 белка НА0, расщепленного трипсином. Белки выявляли после инкубации со специфичной антисывороткой против А/Сидней. Слева стандартный расщепленный НА А/Сидней, справа - НА0, обработанный возрастающими количествами трипсина. (В) Определение активности трипсина в надосадке культуры в ходе получения вируса гриппа В/НагЬш с использованием в качестве субстрата НА0 вируса гриппа А/Сидней/5/97. Вестерн-блот-анализ продуктов расщепления НА0, НА1 и НА2, которые визуализировали с помощью специфичной антисыворотки против НА вируса гриппа А/Сидней/5/97, указанной в подписи к фиг. 14.
Фиг. 27. Вестерн-блот-анализ НА0 А/Сидней, расщепленного Ν-гликозидазой Е. Белки выявляли после инкубации со специфичной антисывороткой против А/Сидней. Полоса белка, отмеченная звездочкой, соответствует дегликозилированному продукту.
Фиг. 28. Вестерн-блот-анализ НА А/Сидней/5/97 после расщепления Асси!а§е. Белки выявляли после инкубации со специфичной поликлональной антисывороткой против НА А/Сидней. Слева - НА0 перед и после обработки трипсином, справа - НА0, расщепленный уменьшающимися количествами Асси1а§е.
Фиг. 29. Электронная микрофотография вируса гриппа А/Сидней/5/97. (А) Клетки РЕК.С6 через 72 после инфицирования. (В и С) Негативное окрашивание на вирус, полученный из инфицированных РЕК.С6. (Ό и Е) Негативное окрашивание материала, очищенного в сахарозе.
Фиг. 30. (А) Тестированные на клетках РЕК.С6 разные штаммы вируса гриппа А и В. (В) Титры инфекционности трех указанных вирусов гриппа А- и В-типа, полученных из инфицированных клеток РЕК.С6.
- 16 006136
Фиг. 31. Иммунофлуоресценция клеток РЕВ.С6 и Уего, инфицированных другими вирусами, отличными от вирусов гриппа. (А) Позитивно окрашиваемые клетки при инфекции вирусом кори. (В) Позитивно окрашиваемые клетки при инфекции клеток Уето вирусом Н8У-1. (С) Позитивно окрашиваемые клетки при инфекции клеток Уего вирусом Н8У-2. (Ό) Позитивно окрашиваемые клетки при инфекции клеток РЕВ.С6 вирусом Н8У-1. (Е) Позитивно окрашиваемые клетки при инфекции клеток РЕВ.С6 вирусом Н8У-2.
Фиг. 32. Титры инфекционности, определенные после размножения вируса кори (средняя панель), Н8У-1 (нижняя панель) и Н8У-2 (верхняя панель) на клетках РЕВ.С6.
Фиг. 33. Репликация ротавируса после инфицирования клеток РЕВ.С6 (верхняя панель) и Уего (нижняя панель) при разных значениях шо1, измеренная с помощью ЕЫ8А в неочищенных надосадках.
Ссылки
ВасНшауег Н. 8е1есбте зо1иЬШза(1оп о! НаешаддШбшп апб пемгамишбазе !гош бтПмепха тймз. Ιηίοτνίго1оду 1975 ; 5 : 260-272.
Вгапбз В, Ра1асНе АМ, νаη ЗсЬатгепЬитд С1М. Мабш ИатЬу Сашпе К1бпеу (МОСК)-се11з !ог (Не ргобисбоп о! шасбта(еб НтПмепха зиЬипб тассше. 8а.Ге(у сНагас(епзбсз апб сбшса1 гезиНь ш (Не е1бег1у. 1п : Вгочп ЬЕ, Нашрзоп Е^, ХУеЬЧег ВС, ебботз. Орбоп Гог (бе соп(го1 о! бтПмепха III.
Ашз(етбаш Ебетзег. 1996. Р. 683-693.
Вгапбз В, Ра1асНе АМ, тап ЗсбаттепЬитд СДМ. Оете1оршеп( о! НтПмепха зиЬипб тассше ргобисеб изшд шашшабап се11 сибите (есНпо1оду. 1п. Саггопбо М1Т, СпП1Нз В, Мотейа 1ЪР, ебботз. Ашша1 се11 (есНпо1оду: Ггош тассшез (о депебс шебюше. ЭогбгесЫ : К1мчег Асабешк РиЬбзНетз, 1997 : 165-167.
СиЬагета ЬУ, \Уооб 1М, Меуег VI, Ка(х 1М, ВоЬейзоп 18, Мфог Ό, \УеЬ8(ег ВС. Собошшап! мбхШгез о! тбмзез ш зйашз о! НтПмепха тбмз бие (о Ноз( се11 тапабоп. Убо1. 1994 ; 199 : 89-97.
Сотогкота ЕА, МабизотюН МЫ, Тм/|кот АВ, Вотш ЫУ, Сетбб С, Еапде( В, \УеЬ8(ег ВС. 8е1ес(юп о! тесерФт-Ьшбшд тапап(з о! Нишам НтПмепха А апб В т1гизез ш ЬаЬу Нашз(ег к1бпеу се11з. Убо1оду 1999 15 ; 262(1) : 31-8 Неттего-ЕштЬе Ь е( а1. Вербсабоп о! бтПмепха А апб В т1гизез ш Нишап б1р1о1б се11з. 1. Сеп. Уио1. 1983 ; 64 : 471475.
КагЬег С. Вебтад /иг кобекбтеп ЬеНапб1ипд рбагшако1од1зсбег геФептегзмсНе. Ехр. Ра(Но1. РНагшако1. 1931 ; 162, 480-483.
*Коб1На1б 8, 1из(е\т1сх ИМ, СиЬагета ЬУ, \УеЬз(ег ВС. 8е1есбоп о! а зшд1е ашшо ас1б зиЬзбФбоп ш (Не НаешаддШбшп шо1еси1е Ьу сЫскеп еддз сап гепбег НтПмепха А т1гиз (Н3) сапб|ба(е тассше ше!!есбте. 1. Уио1. 1995 ; 69 : 4888-4897.
КйзЫетО, Ми11ег К, 8сНо1бззек С. ПШегепбЫ рНозрНогу 1абап о! (Не пмс1еорго(еш о! бтПмепха А ть гизез.
1. Сеп. У1ю1. 19989 ; 70 : 2421-2431.
МагзНа А. е( а1. РНатшасоЛетару 19(11) : 1279-1295, 1999 : Ро(ат1гпз б1зеазе апб бз ртетепбоп ш ш!ап(з апб сЫ1бтеп.
МигрНу ВВ апб \УеЬз(ег ВС. Огбюшухотбизез. 1п : Е1е1бз Убо1оду, сНар(ег 46, 1397. Ебз. В. Ν. Е1е1бз, Ό. М. Кшре, Р. М.
НоМеу, е( а1. Ырршсоб-Ватеп РиЬПзНегз- РЫ1абе1рЫа 1996.
Ые\\таап В^, 1еппшд В Ма)ог ИЬ, ВоЬейзоп 18, 1епкшз В, Ройет С^, Витей I, 1е\тез Ь, Апбегз М, 1аскзоп Ό, Ох!огб 18. Iштиηе гезропзе о! Нишап то1ип1еегз ап ашша1з (о тассшабоп \\ЙН едд дгочп бтПмепха А(Н 1Ν1) тпиз 1з шПмепсеб Ьу (Нгее ашшо ааб зиЬз(бибопз ш (Не НаешаддЫйпт шо1еси1е. Уассше 1993 ; 11 : 400-406.
Ра1асНе АМ, Вгапбз В, тап 8сНаггепЬигд С1М. ^шиподепесбу апб геасФдепесбу о! НтПмепха зиЬипб тассшез ргобисеб ш МОСК се11з ог !ейШ/еб сЫскеп еддз. 1. Ыес!. И1з. 1977 ; 176 :820-823.
ВоЬейзоп 18, Соок Р, №со1зоп С, №\\шап В, \Уооб 1М. М1хеб рори1абопз ш НтПмепха тассше зйашз. Уассше 1994 ; 12 : 1317-1320.
ВоЬейзоп 18, Воо(шап 18, №со1зоп С, М)ог Ό, ВоЬейзоп Ξν, \Уооб 1М. ТНе НаешаддЫбЫп о! бтПмепха В т1гиз ргезеп( ш с11шса1 ша(епа1 1з а зшд1е зрешез 1бепбса1 (о (На! о! шатта1^аη се11 дгочп-т!гпз. У1го1. 1990 ; 179 : 35-40
ВоЬейзоп 18, Воо(шап 18, пе\\шап В, Ох!огб 18, ИаЫе1з В8, \УеЬз(ег ВС, 8сЫ1б СС. 8(гпс(пга1 сНапдез ш (Не НаешаддЫбЫп \тЫсН ассошрапу едд абар(абоп о! ап НтПмепха А(Н1Ы1) тпиз. Уго1. 1987 ; 160 : 31-37.
8сНбб СС, Ох!огб 18, бе 1опд 1С, \УеЬз(ег ВС. Ет1бепсе !ог Ноз(-се11 зе1есбоп о! НтПмепха тпиз апбдешс тапап1з. Ыа(иге 1983 ; 303 : 706-709.
8сНи1шап 1Ъ, Ра1езе Р. У1ти1епсе !ас(огз о! бтПмепха А тиизез : ν8Ν т1тиз ηеи^ат^η^базе гес.|мбеб !ог р1ас.|ие ртобисбоп ш МИВК се11з. 1. Убо1. 1977 ; 24 : 170-176.
8ид1ата А, Иеба М. №мготйм1епсе о! бтПмепха т1тиз ш шке.
I. Ыемгот1гм1епсе о! тесошЬшаШз Ьейтееп тпи1еп1 апб атии1еп1 тпиз з(гашз. Упо11980; 101: 440-449., 495, 271).
- 17 006136
ТоЬйа К, Зидшта А, ЕпошоЮ С, Еитиуата М. Р1ас.|ие аккау апб рптагу ίδοίηΐίοη οί ЕчПиепха А У1гикек ίη ап ек1аЬ1к11еб 1ше οί сашпе Ктбпеу се11к (МОСК) ίη (Не ргекепсе οί 1гуркт. Меб. МюгоЬю1. Iттиηο1. 1975; 162: 9-14.
ХУПНатк 8Р, ЩЬег^!'! 13. Апа1ук1к οί гек!пс1юп ΐο (Не дго\\1Н οί ηοη-едд-абарΐеб Нитап ЕчПиепха т еддк. У1го1. 1993; 196: 660665.
Χνοο6 1М, 8сЫ1б СС, Ые^тапп ЕХУ. Зеадгоай V. АррЕса1юп οί ап ппргоуеб ктд1е-габ1а11ттигюб|ГГикюп 1есНпк|ие ίοΓ (Не аккау οί Наетадд1и11шп апбдеп отШей οί \\'1ю1е νίπικ апб киЬиш! ЕчПиепха уасс1пек. Эеу. Βίο1. 81апб. 1977 13; 39: 193-20.
Claims (34)
1. Способ получения вируса или вирусных белков, отличных от аденовируса или аденовирусных белков, для применения в качестве вакцины, включающий в себя введение в клетку последовательности, кодирующей по меньшей мере один продукт гена Е1 аденовируса или его функциональное производное, и нуклеиновой кислоты, кодирующей вирус и/или вирусные белки, культивирование указанной клетки в подходящей среде, обеспечение возможности экспрессии вируса и/или вирусных белков и сбор указанного вируса и/или вирусных белков из культуральной среды и/или клетки.
2. Способ по п.1, где указанной клеткой является первичная клетка человека.
3. Способ по п.1 или 2, где указанная первичная клетка иммортализована продуктом гена Е1.
4. Способ по любому из пп.1-3, где указанную клетку получают из ретинобласта эмбриона человека.
5. Способ по любому из пп.1-4, где указанная последовательность, кодирующая по меньшей мере один продукт гена Е1, присутствует в геноме указанной клетки человека.
6. Способ по любому из пп.1-5, где указанная клетка не продуцирует структурные белки аденовируса.
7. Способ по любому из пп.1-6, где указанная клетка дополнительно, содержит последовательность, кодирующую продукт гена Е2А аденовируса или его функциональное производное, аналог или фрагмент.
8. Способ по п.7, где указанная последовательность, кодирующая продукт гена Е2А аденовируса или его функциональное производное, аналог или фрагмент, присутствует в геноме указанной клетки человека.
9. Способ по любому из пп.7 или 8, где продукт гена Е2А аденовируса является температурочувствительным.
10. Способ по любому из пп.1-9, где клетка не содержит других аденовирусных последовательностей.
11. Способ по любому из пп.1-10, где указанная клетка способна расти в суспензии.
12. Способ по любому из пп.1-11, где указанную клетку можно культивировать в отсутствие сыворотки.
13. Способ по любому из пп.1-12, где указанной клеткой человека является клетка РЕК..С6 ЕСАСС 96022940 или производная от нее.
14. Способ по любому из пп.1-13, где указанные вирусные белки как сами по себе, так и в составе вируса, подвергаются посттрансляционным и/или перитрансляционным модификациям.
15. Способ по п.14, где указанные модификации включают в себя гликозилирование.
16. Способ по любому из пп.1-15, где по крайней мере одним из указанных вирусных белков является нейраминидаза и/или гемагглютинин вируса гриппа.
17. Способ по любому из пп.1-16, где указанный вирус является энтеровирусом, таким как риновирус, афтовирус или вирус полиомиелита.
18. Способ по любому из пп.1-16, где указанный вирус является вирусом герпеса, таким как вирус простого герпеса, вирус псевдобешенства или вирус коровьего бешенства.
19. Способ по любому из пп.1-16, где указанный вирус является ортомиксовирусом, таким как вирус гриппа, или парамиксовирусом, таким как вирус ньюкаслской болезни, респираторно-синцитиальный вирус, вирус эпидемического паротита или вирус кори.
20. Способ по любому из пп.1-16, где указанный вирус является ретровирусом, таким как вирус иммунодефицита человека, или где указанный вирус является парвовирусом или паповавирусом.
21. Способ по любому из пп.1-16, где указанный вирус является ротавирусом или коронавирусом, таким как вирус инфекционного гастроэнтерита, или флавивирусом, таким как вирус клещевого энцефалита или вирус желтой лихорадки.
22. Способ по любому из пп.1-16, где указанный вирус является тогавирусом, таким как вирус краснухи или вирус восточного, западного или венесуэльского энцефаломиелита лошадей.
23. Способ по любому из пп.1-16, где указанный вирус является вирусом, вызывающим гепатит, таким как вирус гепатита А или гепатита В.
24. Способ по любому из пп.1-16, где указанный вирус является пестивирусом, таким как вирус холеры свиней, или рабдовирусом, таким как вирус бешенства.
- 18 006136
25. Способ по любому из пп.1-16, где указанный вирус является буньявирусом, таким как хантавирус.
26. Применение клетки человека, содержащей в своем геноме последовательность, кодирующую по меньшей мере один продукт гена Е1 аденовируса или его функциональное производное, причем указанная клетка не продуцирует структурных белков аденовируса для получения вируса или вирусных белков, отличных от аденовируса или аденовирусных белков, для применения в качестве вакцины.
27. Применение по п.26, где указанную клетку человека получают из первичной клетки.
28. Применение по п.26 или 27, где указанная клетка является клеткой РЕК.С6 или производной от нее.
29. Применение по пп.26-28, где указанная клетка дополнительно содержит в своем геноме последовательность, кодирующую продукт гена Е2А аденовируса или его функциональное производное, аналог или фрагмент.
30. Применение по п.29, где продукт гена Е2А аденовируса является температурочувствительным.
31. Клетка человека, содержащая в своем геноме последовательность, кодирующую по меньшей мере один продукт гена Е1 аденовируса или его функциональное производное, причем указанная клетка не продуцирует структурных белков аденовируса и содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вирус, или по меньшей мере один белок вируса, не являющегося аденовирусом, где указанная клетка предназначена для получения вируса или вирусных белков, отличных от аденовируса или аденовирусных белков, для применения в качестве вакцины.
32. Клетка человека по п.31, которую получают из клетки РЕК..С6 ЕСАСС 96022940.
33. Клетка человека по п.31 или 32, которая дополнительно содержит в своем геноме последовательность, кодирующую продукт гена Е2А аденовируса или его функциональное производное, аналог или фрагмент.
34. Клетка человека по п.33, где продукт гена Е2А является температурочувствительным.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99203983A EP1103610A1 (en) | 1999-11-26 | 1999-11-26 | Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines |
| PCT/NL2000/000862 WO2001038362A2 (en) | 1999-11-26 | 2000-11-24 | Production of vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200200604A1 EA200200604A1 (ru) | 2002-12-26 |
| EA006136B1 true EA006136B1 (ru) | 2005-10-27 |
Family
ID=8240914
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200200604A EA006136B1 (ru) | 1999-11-26 | 2000-11-24 | Способ получения вируса или вирусного белка для получения вакцины |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP1103610A1 (ru) |
| JP (1) | JP4331432B2 (ru) |
| KR (2) | KR20060107868A (ru) |
| CN (1) | CN1306033C (ru) |
| AT (1) | ATE286537T1 (ru) |
| AU (2) | AU775966B2 (ru) |
| BR (1) | BR0015846A (ru) |
| CA (1) | CA2392653C (ru) |
| DE (1) | DE60017234T3 (ru) |
| DK (1) | DK1108787T4 (ru) |
| EA (1) | EA006136B1 (ru) |
| ES (1) | ES2235770T5 (ru) |
| HK (1) | HK1057236A1 (ru) |
| IL (2) | IL149788A0 (ru) |
| MX (1) | MXPA02005237A (ru) |
| NO (1) | NO333527B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ527942A (ru) |
| PT (1) | PT1108787E (ru) |
| SI (1) | SI1108787T2 (ru) |
| WO (1) | WO2001038362A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200204078B (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2475536C2 (ru) * | 2007-07-03 | 2013-02-20 | Трансген С.А. | Иммортализованная клеточная линия птиц |
Families Citing this family (70)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2333425T5 (es) | 1995-06-15 | 2012-08-28 | Crucell Holland B.V. | Sistemas de empaquetado para adenovirus recombinante humano destinados a terapia génica |
| US7297680B2 (en) | 1999-04-15 | 2007-11-20 | Crucell Holland B.V. | Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content |
| WO2003048348A2 (en) * | 2001-12-07 | 2003-06-12 | Crucell Holland B.V. | Production of viruses, viral isolates and vaccines |
| US6855544B1 (en) | 1999-04-15 | 2005-02-15 | Crucell Holland B.V. | Recombinant protein production in a human cell |
| US8236561B2 (en) | 1999-04-15 | 2012-08-07 | Crucell Holland B.V. | Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells |
| US7604960B2 (en) | 1999-04-15 | 2009-10-20 | Crucell Holland B.V. | Transient protein expression methods |
| US7192759B1 (en) | 1999-11-26 | 2007-03-20 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| US7521220B2 (en) | 1999-11-26 | 2009-04-21 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| US7527961B2 (en) | 1999-11-26 | 2009-05-05 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| US7425437B2 (en) | 1999-11-26 | 2008-09-16 | Crucell Holland B.V. | Vaccines against West Nile Virus |
| NZ527221A (en) | 2001-01-19 | 2006-09-29 | Vironovative B | A negative-sense single stranded RNA virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals |
| US8715922B2 (en) | 2001-01-19 | 2014-05-06 | ViroNovative | Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals |
| EP1256803A1 (en) | 2001-05-07 | 2002-11-13 | Crucell Holland B.V. | Methods for the identification of antiviral compounds |
| AU2002225509A1 (en) * | 2001-12-07 | 2003-06-17 | Crucell Holland B.V. | Production and of viruses, viral isolates and vaccines |
| DK1456238T3 (da) * | 2001-12-17 | 2008-08-18 | Crucell Holland Bv | Produktion af F(ab')2-fragmenter i pattedyrceller |
| JP4553588B2 (ja) | 2002-02-21 | 2010-09-29 | メディミューン，エルエルシー | メタニューモウイルス（ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）株と、ワクチン製剤でのおよび抗原配列発現用ベクターとしてのその使用 |
| ES2310247T3 (es) | 2002-04-25 | 2009-01-01 | Crucell Holland B.V. | Vectores adenovirales estables y metodos de propagacion de los mismos. |
| NZ538808A (en) * | 2002-11-08 | 2008-03-28 | Crucell Holland Bv | Vaccines against west nile virus |
| AU2003299244A1 (en) * | 2002-12-20 | 2004-07-14 | Crucell Holland B.V. | Recombinant virus production for the manufacturing of vaccines |
| JP2006524511A (ja) * | 2003-04-25 | 2006-11-02 | メッドイミューン バクシーンズ，インコーポレイティド | メタニューモウイルス由来の異種抗原を含む組換えパラインフルエンザウイルス発現系およびワクチン |
| WO2004099396A1 (en) * | 2003-05-09 | 2004-11-18 | Crucell Holland B.V. | Cultures of e1-immortalized cells and processes for culturing the same to increase product yields therefrom |
| CN1863918B (zh) | 2003-10-02 | 2011-03-30 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 用于重组腺病毒的包装细胞 |
| AU2005214090B2 (en) | 2004-02-23 | 2008-09-11 | Crucell Holland B.V. | Virus purification methods |
| ES2456015T3 (es) * | 2004-03-05 | 2014-04-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Procedimiento para cultivar células mediante perfusión continua y flujo tangencial alternante |
| JP5600375B2 (ja) | 2004-03-09 | 2014-10-01 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | インフルエンザウイルスワクチン |
| EP2811027A1 (en) | 2004-05-21 | 2014-12-10 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Alphavirus vectors for RSV and PIV vaccines |
| DE602005024827D1 (de) * | 2004-09-09 | 2010-12-30 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Verminderung von potentiellen iatrogenen risiken in verbindung mit influenza impfstoffen |
| JP2006090864A (ja) * | 2004-09-24 | 2006-04-06 | Denka Seiken Co Ltd | ワクチン中の特定成分の含量を求める方法 |
| AU2005314138B2 (en) | 2004-12-08 | 2011-11-17 | Medimmune, Llc | Methods of producing influenza vaccine compositions |
| CA2591665C (en) | 2004-12-20 | 2015-05-05 | Crucell Holland B.V. | Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof |
| CN101155915B (zh) | 2005-04-11 | 2013-12-04 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 利用超滤进行病毒纯化 |
| AU2006245734C1 (en) | 2005-05-12 | 2012-05-24 | Crucell Holland B.V. | Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof |
| WO2007010028A1 (en) * | 2005-07-22 | 2007-01-25 | Crucell Holland B.V. | Cell line for producing coronaviruses |
| NZ567817A (en) | 2005-11-01 | 2012-01-12 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Cell-derived viral vaccines with low levels of residual cell DNA by beta-propiolactone treatment |
| PT2634250T (pt) | 2006-07-14 | 2017-07-13 | Patheon Holdings I B V | Processo melhorado para a cultura de células |
| WO2009074318A2 (en) * | 2007-12-13 | 2009-06-18 | Roche Diagnostics Gmbh | Novel rubella e1 envelope protein variants and their use in the detection of anti-rubella antibodies |
| EP2268309B1 (en) * | 2008-03-18 | 2015-01-21 | Novartis AG | Improvements in preparation of influenza virus vaccine antigens |
| EP2296701A1 (en) | 2008-06-11 | 2011-03-23 | Flugen, Inc. | Cell-based systems for producing influenza vaccines |
| ES2558436T3 (es) * | 2008-07-15 | 2016-02-04 | Crucell Holland B.V. | Proceso escalable para cultivar células PER.C6 y producir productos a partir de estas |
| EP2168987A1 (en) * | 2008-09-22 | 2010-03-31 | Mucosis B.V. | Multifunctional linker protein containing an antibody against hemagglutinin, a conserved influenza antigen and an immunostimulating carrier binding domain |
| WO2010046335A1 (en) * | 2008-10-21 | 2010-04-29 | Crucell Holland B.V. | Production of influenza virus by reverse genetics in per.c6 cells under serum free conditions |
| US20110217330A1 (en) | 2008-11-05 | 2011-09-08 | Bruno Rene Andre | Novel method |
| AU2010272685B2 (en) * | 2009-07-16 | 2015-02-26 | Crucell Holland B.V. | Production of polio virus at high titers for vaccine production |
| US20130203151A1 (en) | 2010-04-26 | 2013-08-08 | Scott Balsitis | Production of alphavirus replicon particles in packaging cells |
| ES2716243T3 (es) | 2010-10-11 | 2019-06-11 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Plataformas de suministro de antígenos |
| EP3527224A1 (en) | 2011-01-26 | 2019-08-21 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Rsv immunization regimen |
| EP2768530A1 (en) | 2011-10-11 | 2014-08-27 | Novartis AG | Recombinant self-replicating polycistronic rna molecules |
| WO2013054199A2 (en) | 2011-10-12 | 2013-04-18 | Novartis Ag | Cmv antigens and uses thereof |
| CN102526720B (zh) * | 2012-01-11 | 2013-12-11 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种流感病毒疫苗的制备方法 |
| CA2866465A1 (en) | 2012-03-06 | 2013-09-12 | Crucell Holland B.V. | Improved vaccination against influenza |
| CN102631673A (zh) * | 2012-04-17 | 2012-08-15 | 金宇保灵生物药品有限公司 | 口蹄疫疫苗浓缩纯化方法 |
| DK2970843T3 (da) | 2013-03-15 | 2021-11-22 | Genzyme Corp | Fremgangsmåder til frembringelse af cellebank med høj densitet |
| WO2016044670A1 (en) | 2014-09-18 | 2016-03-24 | Genzyme Corporation | Ultra-high density cell banking methods |
| AR102548A1 (es) | 2014-11-07 | 2017-03-08 | Takeda Vaccines Inc | Vacunas contra la enfermedad de manos, pies y boca y métodos de fabricación y uso |
| AR102547A1 (es) | 2014-11-07 | 2017-03-08 | Takeda Vaccines Inc | Vacunas contra la enfermedad de manos, pies y boca y métodos de fabricación y su uso |
| HUE048551T2 (hu) | 2014-12-17 | 2020-08-28 | Fundacion Para La Investig Medica Aplicada | Nukleinsav-szerkezetek és génterápiás vektorok Wilson-kór és egyéb állapotok kezelésében történõ alkalmazásra |
| IL252917B2 (en) | 2014-12-17 | 2023-10-01 | Fundacion Para La Investig Medica Aplicada | Vectors and vectors for gene therapy for use in the treatment of Wilson's disease |
| HUE051783T2 (hu) * | 2015-07-07 | 2021-03-29 | Seqirus Uk Ltd | Eljárás immunogén hemagglutinin mennyiségi meghatározására |
| ES2642723B1 (es) | 2016-05-12 | 2018-10-22 | Servizo Galego De Saúde (Sergas) | Uso de los niveles de anticuerpos anti-CD26 como biomarcadores de enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias. |
| MX2020004543A (es) | 2017-11-03 | 2020-09-18 | Takeda Vaccines Inc | Vacunas contra el zika, composiciones inmunogenicas y metodos que las utilizan. |
| KR20200015323A (ko) | 2018-08-03 | 2020-02-12 | 에릭스바이오(주) | 바이러스 치료 장치 또는 백신 제조 장치 |
| EP3863682B1 (en) | 2018-10-12 | 2023-05-17 | Vivet Therapeutics | Codon-optimized transgene for the treatment of progressive familiar intrahepatic cholestasis type 3 (pfic3) |
| TW202039854A (zh) | 2018-11-16 | 2020-11-01 | 美商編碼製藥公司 | 治療威爾遜氏病的組合物和方法 |
| WO2020226831A1 (en) | 2019-05-08 | 2020-11-12 | Takeda Vaccines, Inc. | Inactivated virus compositions and zika vaccine formulations |
| JP2023536080A (ja) | 2020-08-06 | 2023-08-23 | ファンダシオン パラ ラ インベスティガシオン メディカ アプリカダ | 遺伝子治療によるアルツハイマー病などのタウオパチーの治療に使用するためのウイルス粒子 |
| US20230265456A1 (en) | 2020-08-10 | 2023-08-24 | Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada | Gene therapy vector expressing cyp27a1 for the treatment of cerebrotendinous xanthomatosis |
| WO2022074105A1 (en) | 2020-10-09 | 2022-04-14 | UCB Biopharma SRL | Nucleic acid constructs, viral vectors and viral particles |
| IL312340A (en) | 2021-10-28 | 2024-06-01 | UCB Biopharma SRL | Nucleic acid structures, viral vectors and viral particles |
| WO2023154043A1 (en) | 2022-02-09 | 2023-08-17 | Takeda Vaccines, Inc. | Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same |
| WO2024059507A1 (en) | 2022-09-12 | 2024-03-21 | Akero Therapeutics, Inc. | Fgf21 mutant polypeptides |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3547779A (en) * | 1968-12-18 | 1970-12-15 | Merck & Co Inc | Process for producing purified concentrated influenza virus |
| US5192539A (en) * | 1988-07-21 | 1993-03-09 | Akzo N.V. | Infectious bursal disease virus production in continuous cell lines |
| FR2723740B1 (fr) * | 1994-08-16 | 1996-11-08 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procede de preparation d'antigenes du virus grippal, antigenes obtenus et leurs applications |
| US5989805A (en) * | 1995-10-27 | 1999-11-23 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Immortal avian cell line to grow avian and animal viruses to produce vaccines |
-
1999
- 1999-11-26 EP EP99203983A patent/EP1103610A1/en not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-11-24 JP JP2001540125A patent/JP4331432B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-24 KR KR1020067020200A patent/KR20060107868A/ko active IP Right Grant
- 2000-11-24 MX MXPA02005237A patent/MXPA02005237A/es active IP Right Grant
- 2000-11-24 DE DE60017234T patent/DE60017234T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-24 WO PCT/NL2000/000862 patent/WO2001038362A2/en active IP Right Grant
- 2000-11-24 EP EP00204190A patent/EP1108787B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-24 PT PT00204190T patent/PT1108787E/pt unknown
- 2000-11-24 CN CNB008186634A patent/CN1306033C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-24 SI SI200030638T patent/SI1108787T2/sl unknown
- 2000-11-24 AT AT00204190T patent/ATE286537T1/de active
- 2000-11-24 AU AU25572/01A patent/AU775966B2/en not_active Expired
- 2000-11-24 BR BR0015846-1A patent/BR0015846A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-11-24 IL IL14978800A patent/IL149788A0/xx unknown
- 2000-11-24 KR KR1020027006678A patent/KR100683374B1/ko active IP Right Grant
- 2000-11-24 EP EP04105656A patent/EP1514937A1/en not_active Withdrawn
- 2000-11-24 EA EA200200604A patent/EA006136B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-11-24 CA CA2392653A patent/CA2392653C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-24 NZ NZ527942A patent/NZ527942A/en unknown
- 2000-11-24 ES ES00204190T patent/ES2235770T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-11-24 DK DK00204190T patent/DK1108787T4/da active
-
2002
- 2002-05-21 IL IL149788A patent/IL149788A/en unknown
- 2002-05-22 ZA ZA200204078A patent/ZA200204078B/xx unknown
- 2002-05-27 NO NO20022500A patent/NO333527B1/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-01-09 HK HK04100143A patent/HK1057236A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2004-08-05 AU AU2004203642A patent/AU2004203642A1/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2475536C2 (ru) * | 2007-07-03 | 2013-02-20 | Трансген С.А. | Иммортализованная клеточная линия птиц |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA006136B1 (ru) | Способ получения вируса или вирусного белка для получения вакцины | |
| US7521220B2 (en) | Production of vaccines | |
| US7550284B2 (en) | Production of vaccines | |
| US7527961B2 (en) | Production of vaccines | |
| AU2002338666B2 (en) | Multiplication of viruses in a cell culture | |
| US10329536B2 (en) | Methods for producing an active constituent of a pharmaceutical or a diagnostic agent in an MDCK cell suspension culture | |
| JP4447054B2 (ja) | 細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製の方法、および本方法によって入手可能なインフルエンザウイルス | |
| CA2616210A1 (en) | Influenza vaccine compositions | |
| JP2012125261A (ja) | インフルエンザウイルスを培養物中で複製するための方法 | |
| WO2007132763A1 (ja) | インフルエンザウイルスの増殖方法 | |
| CN105886529A (zh) | 一种重组冷适应减毒流感疫苗株的方法及应用 | |
| EA024262B1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОИНФЕКЦИОННОГО ВИРУСА ГРИППА, СТАБИЛЬНОГО ПРИ НИЗКИХ pH | |
| JPS6168428A (ja) | 牛アデノウイルス７型ワクチン |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |