PT2634250T - Processo melhorado para a cultura de células - Google Patents

Processo melhorado para a cultura de células Download PDF

Info

Publication number
PT2634250T
PT2634250T PT131696940T PT13169694T PT2634250T PT 2634250 T PT2634250 T PT 2634250T PT 131696940 T PT131696940 T PT 131696940T PT 13169694 T PT13169694 T PT 13169694T PT 2634250 T PT2634250 T PT 2634250T
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
cells
cell culture
biological substance
cell
culture medium
Prior art date
Application number
PT131696940T
Other languages
English (en)
Inventor
Meile Zijlstra Gerben
Patrick Hof Robert
Schilder Jacob
Original Assignee
Patheon Holdings I B V
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38441437&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PT2634250(T) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Patheon Holdings I B V filed Critical Patheon Holdings I B V
Publication of PT2634250T publication Critical patent/PT2634250T/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D69/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D69/08—Hollow fibre membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/28—Constructional details, e.g. recesses, hinges disposable or single use
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/18—External loop; Means for reintroduction of fermented biomass or liquid percolate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/99—Serum-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

DESCRIÇÃO
PROCESSO MELHORADO PARA CULTURA DE CÉLULAS A invenção refere-se a um processo para a cultura de células num reator em suspensão num meio de cultura de células.
Um tal processo é por exemplo conhecido da WO04/099396. Aqui é descrito como a densidade celular da cultura de células e o rendimento do material biológico desejado podem ser melhorados através da otimização das condições de crescimento num processo alimentado em lote.
Além disso, a WO05/095578 descreve um processo para a cultura de células por cultura de perfusão contínua de uma cultura de células compreendendo meio de cultura celular e células, em que o meio de cultura de células é adicionado à cultura de células, a cultura de células é circulada sobre um módulo de filtro compreendendo fibras ocas resultando num fluxo de saida de liquido possuindo uma densidade de células mais baixa do que a cultura de células, e o fluxo no interior do módulo de filtro é um fluxo tangencial alternativo, em que as células produzem uma substância biológica. Nos exemplos da WO05/095578 é mostrado que é produzido 0,9 g/L/dia de produto, correspondendo a uma concentração de produto no fluxo de saida de aproximadamente 0,3 g/L.
Quanto maior o volume de liquido que contém a substância biológica, mais trabalhoso se torna a purificação da substância biológica. A concentração de substância biológica obtida não é tão elevada nos processos das WO04/099396 e WO05/095578. Por conseguinte, o processamento a jusante desta substância biológica é pesado, porque a substância biológica necessita de ser concentrada antes de serem aplicadas outras etapas de purificação ou de ser necessário purificar grandes volumes de substância biológica menos concentrada. Além disso, a cultura de células com densidades de células mais baixas resulta em produtividade volumétrica mais baixa e, por conseguinte, requer recipientes maiores e/ou mais cultivadores e, deste modo, investimentos mais elevados em equipamento para um dado nível de produção.
Por conseguinte, é o objeto da invenção proporcionar um processo em que o produto é obtido a partir da cultura celular em concentrações mais elevadas.
Um objetivo adicional da presente invenção é permitir a cultura das células e a produção do material biológico durante um período prolongado.
Em conformidade, a presente invenção proporciona uma cultura de células compreendendo uma suspensão de células de mamífero produzindo uma substância biológica desejada com uma densidade celular viável de, pelo menos, 50 x 106 células/mL e uma concentração da substância biológica de, pelo menos, 5 g/L, obtida por um processo para a cultura das células num reator em suspensão num meio de cultura celular, em que as células produzem a substância biológica desejada, em que, pelo menos, um componente de meio de cultura celular é alimentado à cultura celular e em que a cultura celular compreendendo as células, a substância biológica e o meio de cultura de células desejados são circulados sobre um filtro utilizando um fluxo tangencial e em que o filtro tem uma dimensão de poro caracterizada por um corte de peso molecular menor do que o peso molecular da substância biológica desejada para separar a substância biológica desejada de substâncias com um peso molecular mais baixo do que a substância biológica desejada, em que o escoamento de líquido do filtro, essencialmente, apenas contém componentes possuindo um peso molecular inferior ao da substância biológica desejada e em que a substância biológica desejada é retida ou introduzida no reator.
Por exemplo, a invenção refere-se a um processo para a cultura de células num reator num meio de cultura de células, em que as células produzem uma substância biológica, em que nutrientes e/ou meio de cultura de células são alimentados ao reator e em que a cultura de células que compreende as células e o meio de cultura celular é circulado sobre um filtro com um tamanho de poro ou peso molecular cortado entre 5 e 500 kD.
Verificou-se que, utilizando um sistema de separação que separa a substância biológica de substâncias com um peso molecular mais baixo do que a substância biológica, a substância biológica pode ser acumulada na cultura celular em concentrações mais elevadas.
Deste modo, a presente invenção difere da cultura de células descrita na técnica anterior por permitir a acumulação do material biológico desejado em conjunto com a massa celular.
Numa forma de realização preferida da presente invenção parte das substâncias de menor peso molecular são continuamente removidas da cultura celular.
Uma vantagem adicional do processo da presente invenção é que pode ser alcançada uma concentração de células viáveis mais elevada em comparação com, por exemplo, processos em lote ou alimentados em lote. Além disso, o tempo de produção - o período durante o qual as células produzem a substância biológica - pode ser prolongado em comparação com, por exemplo, processos de lote ou alimentados em lote. Além disso, em comparação com um processo descontínuo ou alimentado, é possível utilizar um reator mais pequeno. 0 uso de reatores menores é vantajoso, pois isso reduz os investimentos em equipamentos e instalações.
Além disso, concentrações mais elevadas da substância biológica podem ser obtidas em tempos mais curtos.
Verificou-se que era possível obter concentrações elevadas de substância biológica dentro do reator sem diminuir acentuadamente a viabilidade celular e, portanto, sem limitar o tempo de produção. 0 especialista na matéria teria esperado que a inibição do produto, isto é, a inibição da produção da substância biológica pela própria substância biológica ou a inibição por outras macromoléculas produzidas pela célula (tais como, por exemplo, proteínas das células hospedeiras, enzimas ou detritos celulares) ocorreria. Além disso, verificou-se que a acumulação do material biológico desejado não prejudica a função do sistema de separação. 0 processo da presente invenção proporciona uma vantagem considerável em termos de densidade celular, concentração de produto na cultura de células e período de cultura prolongado em comparação com os processos de acordo com as WO05/ 095578 e WO04/099396. Como resultado, o presente processo resulta numa produção melhorada do material biológico desej ado.
As células que podem ser utilizadas para produzir a substância biológica são, em princípio, todas as células conhecidas dos especialistas na técnica, que têm a capacidade de produzir um produto biológico. As células podem ser eucarióticas, por exemplo, fungos filamentosos, por exemplo Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Penicillium chrysogenum, leveduras, por exemplo Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Phaffia rhodozyma, levedura do género Pichia, por exemplo Pichia pastoris ou Procariótico, por exemplo Escherichia coli, Bacillus sp, por exemplo B. licheniformis, B. suhtilis, B. amyloliquefaciens, B. alkalophilus, Streptomyces sp., Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas sp.Chu, L., Robinson, DK, (2001) Curr. Opinion Biotechn., Vol. 12, p. 180-187. De preferência, as células que são utilizadas no processo da presente invenção são células animais, em particular, células de mamífero. Exemplos de células de mamífero incluem células CHO (Ovário de Hamster Chinês), hibridomas, células BHK (células de rim de Baby Hamster), células de mieloma, células humanas, por exemplo células HEK-293, células linfo blastoides humanas, células EI imortalizadas HER, células de ratinho, por exemplo NSO. Mais preferencialmente, utilizam-se células EI imortalizadas HER, mais preferencialmente células PER.C6.
As células primárias da retina embrionária humana (HER) podem ser isoladas de fetos (Byrd P, Brown KW, Gallimore PH. 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69-71, Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus EI regions and combinations of EIA + ras. Oncogene 2: 477-484) . As células primárias morrerão durante a cultura para várias passagens. As células EI imortalizadas HER para a finalidade da presente invenção são derivadas de células HER primárias através da expressão de ADB codificando proteínas EIA e E1B adenovirais nelas, para obter células imortalizadas. Essas células imortalizadas podem ser cultivadas durante mais de 100 passagens. Métodos para obter células EI imortalizadas HER foram, por exemplo, descritos em Patente US 5994128, em Byrd P, Brown KW, Gallimore PH. 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69-71, in Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus EI regions and combinations of EIA + ras. Oncogene 2: 477-484, and in Gallimore, P.H., Grand, R.J.A. and Byrd, P.J. (1986). Transformação de retino blastos de embriões humanos com vírus símio 40, adenovirus e oncogenes ras. AntiCancer
Res. 6, p499-508. Por exemplo, foram geradas células HER imortalizadas, incluindo células PER.Cl, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8 e PER.C9 por transfecção de células HER primárias utilizando um plasmideo que continha as sequências codificadoras de adenovirus serotipo 5 (Ad5) EIA e E1B (nucleótidos Ad5 459-3510) sob o controlo do promotor de fosfoglicerato cinase humana ("PGK") (ver a Patente US 5994128).
Numa forma de realização preferida, as células no processo da presente invenção são células HER de El-imortalizadas, mais preferencialmente células PER.C6 (ver a Patente US 5994128). As células PER.C6 são exemplificadas por células como depositadas sob o n° de ECACC 960 22940 (Ver, por exemplo, a Patente US 5994128, EP 0833934 Bl).
No processo da invenção, as células podem ser cultivadas em suspensão sob qualquer forma, por exemplo, como células imobilizadas, células individuais ou em agrupamentos de células ou como uma combinação dos mesmos. De preferência, as células são cultivadas como células únicas e/ou como pequenos agregados de células não superiores a 100 células, mais preferencialmente não superiores a 20 células. As células podem, por exemplo, ser imobilizadas em microtransportadores tais como os que estão comercialmente disponíveis a partir, por exemplo, da GE Healthcare (Cytodex).
Um reator tal como aqui definido é um sistema que compreende a cultura de células cuja cultura celular compreende, por sua vez, células e um meio de cultura celular. Preferencialmente, proporciona barreiras estéreis, tais como, filtros de ar, para impedir que outras células contaminem as células desejadas e mantém de preferência um ambiente favorável para as células, proporcionando as condições de cultura adequadas tais como mistura, temperatura, pH, concentração de oxigénio, etc. 0 reator pode, por exemplo, ser de natureza mais permanente, por exemplo, o reator pode ser de aço inoxidável ou de vidro ou pode, por exemplo, ser de natureza descartável, por exemplo, o reator pode ser um frasco ou saco de plástico. Exemplos de reatores adequados para utilização na presente invenção incluem, mas não estão limitados a recipientes de tanque de agitação, recipientes de transporte aéreo e sacos descartáveis que podem ser misturados por balanço, movimento de vibração ou agitação. De preferência utilizam-se reatores (bio) descartáveis porque são favoráveis, porque requerem custos de investimento relativamente baixos, têm grande flexibilidade operacional, curtos tempos de giro e são facilmente configuráveis para o processo. Os reatores (bio) descartáveis estão comercialmente disponíveis a partir, por exemplo, de Hyclone, Sartorius, Applikon ou Wave. 0 termo "sistema de separação" é definido no âmbito da invenção como um sistema capaz de se separar com base no peso molecular. 0 sistema de separação utilizado no processo da invenção é capaz de separar a substância biológica de substâncias com um peso molecular mais baixo do que a substância biológica. Por outras palavras, o limite de peso molecular é escolhido de tal modo que o limite de peso molecular (MWCO) seja menor do que, mais preferencialmente pelo menos, um fator 2, mais preferencialmente, pelo menos, um fator 3 menor do que o peso molecular da substância biológica. Tipicamente, mas evidentemente dependendo do peso molecular da substância biológica produzida no processo da presente invenção, o MWCO do sistema de separação é preferencialmente, pelo menos 5, mais preferencialmente, pelo menos, 10, mais preferencialmente, pelo menos, 30 kDa e preferencialmente no máximo 500 kDa, mais preferencialmente no máximo 300 kDa, mais preferencialmente no máximo 100 kDa. Por exemplo, para uma IgG com um peso molecular de 150 kDa, é mais preferido um sistema de separação com um MWCO de no máximo 50 kDa.
Exemplos de sistemas de separação incluem, mas não estão limitados a filtros, centrífugas e sistemas de extração aquosos de duas fases. 0 termo "filtro", tal como aqui utilizado, pretende incluir todos os dispositivos com a capacidade de separar partículas com base no tamanho ou peso molecular. Em princípio, no processo da presente invenção, qualquer filtro pode ser utilizado desde que a dimensão de poro ou MWCO seja escolhida de tal modo que a substância biológica seja separada de substâncias com um peso molecular mais baixo do que a substância biológica, tipicamente esta terá um tamanho de poro ou MWCO entre 5 e 500 kDa. Exemplos de filtros adequados para utilização na presente invenção incluem filtros de membrana, filtros cerâmicos e filtros metálicos. 0 filtro pode ser utilizado em qualquer forma; o filtro pode, por exemplo, ser enrolado em espiral ou tubular ou pode ser utilizado na forma de uma folha. De preferência, no processo da invenção, o filtro utilizado é um filtro de membrana, de preferência um filtro de fibra oca. Com o termo "fibra oca" pretende-se significar uma membrana tubular. O diâmetro interno do tubo é de, pelo menos, 0,1 mm, mais preferencialmente, pelo menos, 0,5 mm, o mais preferencialmente, pelo menos, 0,75 mm e, preferencialmente, o diâmetro interno do tubo é, no máximo, 10 mm, mais preferencialmente, no máximo 6 mm, o mais preferencialmente, no máximo, 1 mm. Módulos de filtro compreendendo fibras ocas estão comercialmente disponíveis a partir de, por exemplo, General Electric (GE, anteriormente Amersham).
Fazendo circular a cultura de células compreendendo a substância biológica, as células e o meio de cultura celular através de um sistema de separação, a substância biológica e as células são retidas no reator e a saída de líquido tem, portanto, uma menor concentração de substância biológica e uma densidade celular mais baixa do que a cultura de células. Normalmente, no processo da invenção, o fluxo de saída de líquido não contém ou dificilmente contém qualquer substância biológica e células. Normalmente, a saída de líquido contém essencialmente apenas componentes com um peso molecular inferior ao da substância biológica. Essencialmente, todas as células e essencialmente toda a substância biológica são, portanto, normalmente retidas no reator.
Preferencialmente, o tamanho de poro ou MWCO do filtro é escolhido de tal modo que o tamanho dos poros ou MWCO do filtro seja menor do que, mais preferencialmente, pelo menos, um fator 2, mais preferencialmente, pelo menos, um fator 3 menor do que o diâmetro ou o peso molecular do produto, assegurando uma elevada retenção do produto. Tipicamente, mas evidentemente dependendo do tamanho ou peso molecular do produto, isto é, substância biológica produzida no processo da presente invenção, o tamanho de poro ou MWCO do filtro é preferencialmente, pelo menos, 5, mais preferencialmente, pelo menos, 10, mais preferencialmente, pelo menos 30 kDa e/ ou a dimensão dos poros ou MWCO do f iltro/membrana é preferencialmente no máximo 500 kDa, mais preferencialmente no máximo 300 kDa, mais preferencialmente no máximo 100 kDa.
Com peso molecular de corte (MWCO) entende-se o peso molecular acima do qual pelo menos 90% das partículas são retidos pelo sistema de separação. A circulação da cultura de células sobre um sistema de separação, por exemplo um filtro, significa que a cultura de células é passada através de um sistema de separação, por exemplo, um filtro que resulta num fluxo de saida de liquido e um fluxo cujos conteúdos são mantidos ou introduzidos no reator. 0 escoamento cujos conteúdos são mantidos ou introduzidos no reator normalmente só contêm componentes com um peso molecular, pelo, menos igual ao da substância biológica ou superior e, portanto, o referido fluxo compreenderá mais substância biológica do que a saida liquida.
Em principio, não é critico quando a circulação da cultura de células sobre o sistema de separação é iniciada durante o processo da invenção. A circulação da cultura celular pode por exemplo ser iniciada diretamente a partir do inicio do processo ou quando a densidade celular viável das células atingiu um certo nível. A circulação da cultura celular sobre um filtro pode ser um fluxo substancialmente perpendicular em relação à superfície do filtro, também conhecido como fluxo sem fim ou um fluxo substancialmente paralelo à superfície do filtro, também conhecido como fluxo tangencial, por exemplo fluxo tangencial unidirecional (TFF) ou fluxo cruzado. Um exemplo preferido de fluxo cruzado é fluxo tangencial alternante (ATF) como com ATF verificou-se que a obstrução do filtro não ocorre (rapidamente) mesmo a densidades celulares muito elevadas. É comum o conhecimento geral que em filtragem em profundidade, o filtro de poro pequeno final precisa ser protegido de entupimento por pré-filtros de curso. Esta prática baseia-se no conhecimento geral de que os filtros com poros mais pequenos ou com um MWCO menor obstruem mais facilmente, limitando assim o tempo de produção. Se for utilizado ATF, o uso de um pré-filtro torna-se supérfluo. 0 fluxo pode ser dirigido movendo a cultura celular, movendo o filtro ou ambos. 0 filtro pode por exemplo ser movido por rotação (filtro rotativo) ou vibração (filtro vibratório). Alternativamente, se o fluxo for dirigido apenas pelo movimento da cultura de células, o filtro é estático e a cultura de células pode por exemplo ser movida por meio de bombas ou pressão.
Com "fluxo tangencial alternativo" entende-se que existe um fluxo na mesma direção (ou seja, tangente à) superfície (s) do filtro, cujo fluxo vai e vem, e que existe outro fluxo numa direção substancialmente perpendicular à superfície do filtro. 0 fluxo tangencial alternado pode ser conseguido de acordo com métodos conhecidos do especialista na técnica (por exemplo, como descrito na US 6544424).
Durante a cultura das células, pelo menos, um componente de meio de cultura de células, por exemplo, um ou mais nutrientes e/ou meio de cultura celular pode ser alimentado às células. No processo de acordo com a invenção, é vantajoso suplementar em parte ou de preferência, no seu todo, pelo menos um dos nutrientes esgotados por meio de uma alimentação deste nutriente ou destes nutrientes para o reator. Por exemplo, o meio de cultura celular completo pode ser alimentado ao reator, o que é vantajoso como uma necessidade de alimentação separada, então não deve ser preparado separadamente. 0 meio de cultura celular pode, por exemplo, também ser alimentado às células numa forma mais concentrada; isso é vantajoso, pois volumes menores são mais fáceis de manusear. Também podem ser introduzidos no reator um ou mais nutrientes. Por exemplo, hidratos de carbono, por exemplo glucose ou frutose; aminoácidos, tais como, glutamina e/ou péptidos podem ser vantajosamente alimentados para o reator.
Numa forma de realização preferida da invenção, as condições de cultura de células são escolhidas de tal modo que a taxa de crescimento celular e/ou a produtividade específica das células não seja limitada e mais preferencialmente tal que a concentração de, pelo menos, um dos componentes do meio de cultura celular permanece essencialmente constante. Exemplos de condições de cultura de células limitantes são limitações de nutrientes e formação de metabolitos de inibição, tais como amónia, dióxido de carbono e lactato. Por exemplo, condições de cultura de células tais como a alimentação podem ser escolhidas de tal modo que a taxa de crescimento de células não seja limitada, por exemplo, fornecendo nutrientes suficientes para compensar a depleção e/ou evitar a produção de metabolitos de inibição tais como lactato ou amoníaco. Por exemplo, as condições de aeração podem ser escolhidas de modo que a formação de dióxido de carbono não esteja a limitar a taxa de crescimento celular. Crescer a célula sob condições não limitantes é altamente vantajoso do ponto de vista das Boas Práticas de Fabricação (GMP) como 1) isto pode dar um ambiente de cultura de células constante que em muitos casos também dá boa qualidade de produto constante e 2) isto pode levar a alta viabilidade celular, em alguns casos a uma viabilidade celular de mais de 98%. A viabilidade celular elevada reduz a libertação de contaminantes relacionados com células, tais como, proteínas de células hospedeiras, o que facilita a purificação do produto. Além disso, o crescimento das células a uma velocidade de crescimento celular ilimitada e/ou uma produtividade específica ilimitada tem a vantagem comercial de ser possível produzir mais substância biológica num tempo ainda mais curto à medida que uma densidade celular mais elevada será atingida anteriormente no processo. A "produtividade específica" das células é a quantidade de uma determinada substância biológica produzida por célula por unidade de tempo e é usualmente expressa em pg.célula-1 dia-1. A taxa de adição de, pelo menos, um componente de meio de cultura de células, por exemplo nutrientes e/ou meio de cultura de células à cultura de células (a taxa de entrada ou a taxa de perfusão) influencia a viabilidade e a densidade das células. No processo da invenção, o (s) componente (s) do meio de cultura de células, tais como nutrientes e/ou meio de cultura de células podem ser alimentados, por exemplo, num fluxo continuo, num fluxo semi-continuo, por exemplo, fluxo por passos ou fluxo escalonado. Preferencialmente, o componente (s) de meio de cultura de células, por exemplo nutrientes e/ou meio de cultura de células são adicionados num fluxo continuo. 0 (s) componente (s) do meio de cultura celular, tal como meio de cultura celular completo e/ou nutrientes podem, em princípio, ser alimentados ao reator a qualquer momento durante o processo. Preferencialmente, a alimentação é iniciada antes de substratos, tais como glutamina e glucose terem atingido níveis tão baixos como para fazer cessar o crescimento das células ou antes de metabolitos inibitórios, por exemplo, lactato ou amónia atingir níveis tão elevados que o crescimento cessaria. A partir deste ponto, o (s) componente (s) do meio de cultura de células, tais como nutrientes e/ou meio de cultura de células completo, são de preferência alimentados ao reator a uma taxa tal que a procura de substrato é satisfeita.
Numa forma de realização da invenção, o meio de cultura de células é adicionado a uma taxa de alimentação de acordo com a fórmula (1):
Taxa de alimentação= SFR x (volume total de cultura celular x (densidade celular viável) em que a velocidade de alimentação é expressa em litros por dia, em que a SFR é a taxa de alimentação específica, ou seja, a velocidade na qual o meio de cultura de células é alimentado para a cultura de células expressa como o volume de meio adicionado por célula viável por unidade de tempo e em que a densidade celular viável é o número de células viáveis por unidade de volume. 0 número de células viáveis pode ser determinado pelo especialista na técnica, por exemplo, através do método de exclusão de azul de tripano. A taxa de alimentação específica é preferencialmente escolhida entre 0,01 e 0,3 nL/célula/dia, mais preferencialmente entre 0,01 e 0,2 nL/célula/dia.
Pode ser vantajoso ter em conta parâmetros adicionais quando se ajusta a velocidade de alimentação, por exemplo a quantidade de glucose a ser alimentada à cultura e/ou a taxa de absorção de oxigénio. Por exemplo, para PER.C6 a taxa de alimentação do meio de cultura de células e/ou dos nutrientes é preferencialmente escolhida de tal modo que a concentração de glucose seja mantida entre 3 e 20 mmol/L, mais preferencialmente entre 5 e 15 mmol/L. De preferência, a concentração de glucose é, pelo menos, 3 mmol/L, mais preferencialmente, pelo menos, 5 mmol/L e preferencialmente no máximo 20 mmol/L, mais preferencialmente no máximo 15 mmol/L.
Numa forma de realização especial da invenção, a cultura de células (compreendendo células, substância biológica e meio de cultura de células) é removida, pelo menos, uma vez do reator e liquido, por exemplo, meio de cultura de células ou uma alimentação de nutriente é adicionada ao reator para compensar a célula Remoção de cultura. A remoção da cultura celular pode levar a tempos de processo mais longos a densidades celulares elevadas em combinação com viabilidades celulares elevadas resultando numa maior produtividade. A cultura celular pode ser removida continuamente ou passo a passo.
Numa forma de realização preferida da invenção, a cultura de células (células, meio de cultura celular e de substância biológica compreendendo) é removida do reator assim que a densidade celular desejada, por exemplo uma densidade celular de pelo menos 10.106 células viáveis/ml, de preferência de, pelo menos, 20.106 células viáveis/ml, mais preferencialmente de, pelo menos, 30,106 células viáveis/ml, por exemplo, uma densidade de célula de, no máximo, 200. 106 células viáveis/mL, é atingido e liquido, por exemplo meio de cultura celular ou o alimento nutriente é adicionado ao reator para compensar a remoção da cultura celular. De preferência, a cultura celular é removida a uma velocidade tal que a densidade celular permanece na gama de densidade celular desejada. Esta forma de realização da invenção é altamente vantajosa quando comparada com um processo convencional de lote ou alimentado a lote, uma vez que combina as vantagens do processo da invenção com uma viabilidade elevada que pode ser mantida mais tempo, tornando possível obter uma produtividade volumétrica global ainda mais elevada. Por «produtividade volumétrica» entende-se a quantidade de substância biológica produzida por unidade de volume do reator por unidade de tempo e é usualmente expressa em gL-1. dia-1. Em comparação com um processo de perfusão convencional, esta forma de realização da invenção é também altamente vantajosa uma vez que combina as vantagens do processo da invenção com uma corrente de remoção de cultura de células tendo uma concentração elevada de substância biológica. A alta concentração de substância biológica na corrente de remoção de cultura de células torna comercialmente interessante a colheita da substância biológica a partir daí. Num processo de perfusão convencional em que a cultura de células é removida, a corrente de remoção de cultura de células não contém substância biológica suficiente para tornar comercialmente vantajoso colher a substância biológica e a corrente de remoção de cultura de células é, portanto, normalmente considerada como resíduo. Assim, nesta forma de realização da invenção, em teoria, toda a substância biológica produzida pode ser colhida de uma maneira simples, economicamente viável e simples.
Numa forma de realização particularmente preferida da invenção, as condições de cultura de células são escolhidas de modo a que a taxa de crescimento celular e/ou a produtividade específica das células não seja limitada e mais preferencialmente tal que também a concentração de, pelo menos, um dos componentes da cultura celular, tal como, glucose ou glutamina permanece constante e a cultura celular é removida pelo menos uma vez do reator assim que a densidade celular desejada é atingida e líquido, por exemplo, meio de cultura de células é adicionado ao reator para compensar a remoção da cultura celular.
Preferencialmente, a taxa do fluxo de saída é escolhida de modo a ser substancialmente igual à taxa de adição de, pelo menos, um componente de meio de cultura de células, por exemplo, nutrientes e/ou meio de cultura celular menos a taxa de remoção opcional de cultura de células.
As células que produzem uma substância biológica são, por exemplo, células capazes de expressar um gene que codifica a substância biológica. As células capazes de expressar um gene que codifica a substância biológica podem, por exemplo, ser preparadas por transfecção das células com um plasmídeo contendo o gene que codifica a substância biológica e o gene que codifica um marcador de seleção adequado, por exemplo, um gene que codifica uma resistência à neomicina (gene marcador Neo). As células transfectadas estavelmente podem então ser selecionadas por pressão de seleção, por exemplo, - no caso de um gene marcador Neo - por cultura das células transfectadas na presença de G418 (genericina) e rastreio imediato das células para células que exibem uma expressão de alto nível de substância biológica. Métodos para preparar clones de células EI imortalizadas HER que expressam uma proteína, e métodos para cultivar tais células para produzirem a proteína, são bem conhecidos dos peritos, e podem, por exemplo, ser encontrados na US 6855544.
As substâncias biológicas que podem ser produzidas pelas células, por exemplo por expressão de um gene (recombinante) que codifica, são, por exemplo, proteínas (recombinantes), em particular recetores, enzimas, proteínas de fusão, proteínas sanguíneas, tais como, proteínas da cascata de coagulação sanguínea, proteínas multifuncionais, tais como, por exemplo, eritropoietina, vírus ou proteínas bacterianas, por exemplo, para utilização em vacinas; imunoglobulinas tais como, anticorpos, por exemplo IgG ou IgM, e semelhantes; de preferência, uma proteína, mais preferencialmente um anticorpo é produzida pelas células . De preferência, as substâncias biológicas, tais como, proteínas ou vacinas produzidas pelas células podem ser utilizadas como ingrediente ativo numa preparação farmacêutica. No contexto da presente invenção, os termos "produto" e "substância biológica" são permutáveis.
No âmbito da presente invenção, com preparação farmacêutica entende-se qualquer preparação, que pode ser utilizada como um medicamento, em particular como um medicamento em seres humanos. Um tal medicamento pode por exemplo ser utilizado para o diagnóstico, ou para fins profiláticos, tais como, por exemplo, uma vacina e/ou para fins terapêuticos, tais como, por exemplo, uma enzima ou proteína para a qual um doente é deficiente, ou um anticorpo para matar células indesejadas. Uma preparação farmacêutica pode ainda conter um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, exemplos dos quais são bem conhecidos dos especialistas na técnica. A linha celular PER.C6 pode ser utilizada para a produção de substâncias biológicas, tais como adenovirus suprimido EI (ver por exemplo a Patente US 6994128;Nichols et al, 2002, Propagation of adenoviral vectors: use of PER.C6 cells. In: Curiel D, Douglas JT, editors. Adenoviral vectors for gene therapy. San Diego: Elsevier. p 129-167), outros vírus (ver, por exemplo, a WO 01/38362), ou proteínas recombinantes (ver, por exemplo, a Patente US 6855544; Yallop et al, 2005, PER.C6 cells for the manufacture of biopharmaceutical proteins, Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, 4 Volumes, 779-807, Jõrg Knãblein (Editor)).
Exemplos de proteínas que podem ser utilizadas como ingrediente ativo em preparações farmacêuticas (com a marca entre parênteses) incluem Tenecteplase (TN Kase”) , fator anti-hemofílico (recombinante) (ReFacto”) , Interferão a-nl linfoblastoide (Wellferon”) fator de coagulação recombinante (NovoSeven”) , Etanercept (Enbrel™) , trastuzumab (Herceptin™) , infliximab (Remicade”) , palivizumab (Synagis”) , Basiliximab (Simulect”) , daclizumab (Zenapaz”) , rituximab (Rituxan”) , Fator de Coagulação (recombinante) IX (Benefix”) e Interferão β-la (Avonex”) .
Exemplos de vacinas que podem ser utilizadas como um ingrediente ativo na preparação farmacêutica incluem antigénios proteicos isolados, exemplos dos quais incluem, mas não estão limitados a vacina Rotavírus oral rotativa, RotaShield”, vacina contra a raiva (RanAvert”) , vacinas contra a gripe e vacina inativada contra a hepatite A (VAQTA”) . O pH, a temperatura, a concentração de oxigénio dissolvido e a osmolaridade do meio de cultura celular não são, em princípio, críticos e dependem do tipo de célula escolhida. De preferência, o pH, a temperatura, a concentração de oxigénio dissolvido e a osmolaridade são escolhidos de modo a serem ótimos para o crescimento e a produtividade das células. 0 especialista na técnica sabe como encontrar o pH, a temperatura, a concentração de oxigénio dissolvido e a osmolaridade ótimas para a cultura (ver, por exemplo, a WO 2004/099396). Preferencialmente, para o processo da invenção, quando se utilizam células EI imortalizadas, o pH é escolhido entre 6,6 e 7,6 e/ou a temperatura é escolhida entre 30 e 39°C e/ou a osmolaridade é escolhida entre 260 e 400 mOsm/kg. Para manter condições de processo ótimas é desejada a automação para controlar as condições do processo. A fim de otimizar as condições do processo, por exemplo para obter a paragem do crescimento para aumentar a produtividade celular, durante a cultura pode ser aplicada uma mudança nas condições de cultura. Isto pode ser estabelecido por, por exemplo, um desvio de temperatura (tal como de 37 a 32 °C), um desvio de pH ou um desvio de osmolaridade. O processo da presente invenção pode, em principio, ser realizado em qualquer tipo de meio de cultura celular adequado para a cultura de células. As diretrizes para a escolha de um meio de cultura celular e condições de cultura celular são bem conhecidas e são, por exemplo, fornecidas nos Capítulos 8 e 9 de Freshney, R. I. Culture of animal cells (a manual of basic techniques), 4th edition 2000, Wiley-Liss and in Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G. Cell &Tissue culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons.
Por exemplo, o meio de cultura celular pode compreender, por exemplo, como componente do meio de cultura celular uma fonte de hidrato de carbono, sais e/ou aminoácidos e/ou vitaminas e/ou lípidos e/ou detergentes e/ou tampões e/ou fatores de crescimento e/ou hormonas e/ou citoquinas e/ou oligoelementos. Exemplos de fontes de hidratos de carbono incluem glucose, frutose, galactose e piruvato. Exemplos de sais incluem sais de magnésio, por exemplo, MgCl2.6H20, MgSC>4 e MgS04.7H20, sais de ferro, por exemplo, de FeS04.7H20, sais de potássio, por exemplo, KH2PO4, KC1; sais de sódio, por exemplo, NaH2P04, Na2HPC>4 e sais de cálcio, por exemplo, CaCl2.2H20. Os exemplos de aminoácidos incluem todos os aminoácidos proteinogénicos conhecidos, por exemplo histidina, glutamina, treonina, serina, metionina. Exemplos de vitaminas incluem: ascorbato, biotina, colina.Cl, mio-inositol, D-pantotenato, riboflavina. Exemplos de lipidos incluem: ácidos gordos, por exemplo, ácido linoleico e ácido oleico; Exemplos de detergentes incluem Tween® 80 e Pluronic® F68. Exemplo de tampões incluem HEPES e Na2C03. Exemplos de fatores de crescimento/hormonas/citoquinas incluem IGF (fator de crescimento semelhante a insulina), hidrocortisona e insulina (recombinante). Exemplos de elementos vestigiais são conhecidos do especialista na técnica e incluem Zn, Mg e Se. 0 meio de cultura celular pode, por exemplo, compreender também outros componentes de meio de cultura celular, por exemplo, pectina de soja ou etanol amina.
Para a produção de substâncias biológicas de acordo com a invenção, em particular se as substâncias biológicas forem utilizadas como um ingrediente ativo em preparações farmacêuticas, os meios isentos de soro são preferidos aos meios contendo uma fonte de soro. A razão para isto é que o meio de origem sérica pode estar contaminado com vírus, apresentar o risco de infeções priónicas e pode criar um grande obstáculo no processamento a jusante do produto bio farmacêutico (isto é, a purificação adicional da substância biológica a partir da cultura celular). Deste modo, o processo da invenção é de preferência realizado num meio de cultura de células que não compreende soro de uma fonte animal, incluindo a humana. Uma vez que os compostos de uma fonte de mamífero também apresentam um risco de infeção, de preferência o meio de cultura celular é uma fonte livre de mamíferos (isto é, 0 meio de cultura celular não compreende soro ou componentes de uma fonte de mamífero) . Mais preferencialmente, o meio de cultura de células é livre de origem animal (isto é, o meio de cultura celular não compreende soro ou componentes de uma fonte animal, incluindo a humana). Exemplos de meios livres de soro que podem ser utilizados para a cultura de células PER.C6 incluem comercialmente meios disponíveis, tais como, por exemplo, EX Cell" meio VPRO (SAFC), HyQ® CDM4Retino” (HyClone), IS ProVec CD (Irvine Scientific), 293-SFM II (Invitrogen).
Em formas de realização preferidas, a substância biológica produzida no processo da presente invenção é colhida a partir do fluxo cujos conteúdos são mantidos ou de preferência alimentados de volta para o reator ou a partir da cultura de células que é removida do reator ou de ambos. A (s) substância (s) biológica (s) produzida (s) no processo da presente invenção pode ser ainda colhida a partir da cultura de células no chamado processamento a jusante, utilizando métodos dependentes da substância biológica, métodos esses que são bem conhecidos dos especialistas. 0 processamento a jusante geralmente compreende vários passos de purificação em combinações e ordem variáveis. Exemplos de passos de purificação no processamento a jusante são passos de separação (por exemplo, por cromatografia de afinidade e/ou cromatografia de troca iónica e/ou extração por sistemas aquosos bifásicos e/ou por precipitação através de, por exemplo, sulfato de amónio), passos para a concentração da substância biológica (por exemplo, por ultrafiltração ou diafiltração) , passos para troca de tampões e/ou passos para remover ou inativar vírus (por exemplo, por filtração de vírus, mudança de pH ou tratamento de detergente de solvente).
Num aspeto, a invenção refere-se a uma cultura de células compreendendo células de mamíferos, de preferência, El-imortalizada células HER, células PER.C6 um modo mais preferido, com uma densidade de células viáveis de, pelo menos, 50.106 células/ml, preferivelmente, pelo menos, 60.106 células/Ml, em particular, pelo menos, 90.106 células/mL e uma concentração de substância biológica de, pelo menos, 5 g/L, mais preferencialmente, pelo menos, 10 g/L, em particular, pelo menos, 11 g/L. Em princípio, a concentração de substância biológica pode ser tão elevada como a solubilidade da substância biológica permite. A concentração de ci^ulas viáveis é tipicamente não superior a 200.106 células/mL e preferencialmente na gama de 80- 150.106 células/mL. A densidade de células viáveis pode, por exemplo, ser determinada utilizando o método de exclusão de azul de triptano, por exemplo, utilizando um contador de células tal como está comercialmente disponível a partir, por exemplo, de Innovatis (contador de células Cedex).
Com cultura de células entende-se o líquido que compreende meio de cultura celular, células e substância biológica, cujo líquido é o resultado de um processo para a cultura de células num reator num meio de cultura de células, em que as células produzem a substância biológica. A invenção será agora elucidada através dos seguintes exemplos sem, contudo, ser limitado aos mesmos.
Descrição das figuras
FI6. 1/9. mostra a densidade de células viáveis Y (106.ml_1) em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo A (carga), B (alimentação por carga) e Cl (processo da invenção). FI6. 2/9. mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG no processo A) em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo A (lote), B (alimentado) e Cl (processo da invenção). FIG. 3/9. mostra a densidade de células viáveis Y (106.ml_1) em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo A (carga), B (alimentado) C2 (processo da invenção). FIG. 4/9. mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG no processo A) em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo A (lote), B (alimentado) e C2 (processo da invenção). FIG. 5/9. mostra a densidade de células viáveis Y (ΙΟ^ΜΙ-1) em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo A (lote), B (alimentado) C3 (processo da invenção). FIG. 6/9. mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG no processo A3) versus o tempo de processo X (dias) para o processo A e C3. FIG. 7/9. mostra o rendimento cumulativo Q (% em comparação com o rendimento no processo A, por volume de reator L) traçado em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo A, B e C3. FIG. 8/9. mostra o número de células Y (106.ml·-1) traçado em relação ao tempo de processo X (dias) para C4 (processo da invenção). FIG. 9/9. mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração máxima de IgG atingida em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo C4 (uma concretização do processo da invenção)
Exemplos
Exemplo 1: Comparação entre um processo descontinuo, um processo descontinuo alimentado e o processo de acordo com a invenção.
Neste exemplo, o desempenho do processo de acordo com a presente invenção foi comparado com processos descontínuos e alimentados. A FIG. 1/9 mostra a densidade de células viáveis Y (106.ml“ 1) em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo A (carga), B (alimentação por carga) e Cl (processo da invenção). A FIG. 2/9 mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG no processo A) em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo A (lote), B (alimentado) e Cl (processo da invenção).
Todas as fermentações foram realizadas utilizando um controlador Sartorius Biostat B para controlar a temperatura a 36,5°C, o pH entre 7,2 e 6,8 e a DO a 50% de saturação de ar e a 200 rpm. A mesma linha celular PER.C6 produzida por IgG (ver a WO 2004/099396) foi utilizado em todas as experiências.
Processo Lote A O processo em lote foi executado a 4 L de volume de trabalho num recipiente Sartorius B5. As células foram inoculadas a 3xl05 células/mL em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM de L-glutamina e subsequentemente cultivadas durante 17 dias.
Processo de alimentação-Lote B 0 processo de lote alimentado foi executado a 4 L de volume de trabalho num recipiente Sartorius B5. As células foram inoculadas a 3xl05 células/mL em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM de L-Glutamina. Durante a cultura foram adicionados glicose e glutamina para manter a concentração acima respetivamente de 15 mM e 1 mM. Aminoácidos e péptidos foram adicionados a partir do dia 5 para reabastecer os aminoácidos consumidos.
Processo da invenção Cl 0 processo da invenção foi realizado num recipiente Applikon de 2 L. Utilizou-se uma membrana de fibra oca de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa obtida da General Electric (GE) operada em modo de fluxo ATF com um sistema ATF-2 (Tecnologia Refine) para reter as células e o produto IgG. A cultura foi iniciada com 3xl05 células/mL em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM de L-Glutamina. O meio de cultura VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM de L-Glutamina foi perfundido através da cultura de células em suspensão utilizando um Taxa de Fluxo Específico (SFR) entre 0,05 e 0,2 nL/célula/ dia. A maior concentração de produto obtida foi 1,4 g/L. O processo da invenção resultou em densidades de células viáveis aumentadas e concentrações de produto aumentadas em comparação com os modos de cultura mencionados em menos tempo, como pode ser visto a partir da Fig. 1 e Fig. 2 abaixo.
Exemplo 2: Comparação entre um processo descontinuo, um processo descontinuo alimentado e o processo de acordo com a invenção.
Neste exemplo, o processo de acordo com a presente invenção é novamente comparado com processos descontínuos e alimentados; no processo 2, a pressão de CO2 é controlada e foi utilizado um sistema de separação de 50 kDa. A FIG. 3/9 mostra a densidade de células viáveis Y (106.ml~ 1) em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo A (lote), B (alimentado) C2 (processo da invenção). A FIG. 4/9 mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG no processo A) em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo A (carga), B (alimentação por carga) e C2 (processo da invenção)) .
Todas as fermentações foram realizadas utilizando um controlador Sartorius Biostat B para controlar a temperatura a 36,5°C, pH entre 7,2 e 6,8 e DO a 50% de saturação de ar e a 200 rpm. A mesma IgG (de aproximadamente 150 kDa) produzindo a linha celular PER.C6 (ver a WO 2004/099396) foi utilizado em todas as experiências.
Processo Lote A O processo em lote foi executado a 4 L de volume de trabalho num recipiente Sartorius B5. As células foram inoculadas em 3,105 células.mL-1 em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM de L-glutamina e subsequentemente cultivadas durante 17 dias.
Processo de alimentação-Lote B O processo alimentado em lote foi executado a 4 L de volume de trabalho num recipiente Sartorius B5. As células foram inoculadas em 3,105 células.mL-1 em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM de L-glutamina. Durante a cultura foram adicionados glicose e glutamina para manter a concentração acima respetivamente de 15 mM e 1 mM. Aminoácidos e péptidos foram adicionados a partir do dia 5 para reabastecer os aminoácidos consumidos.
Processo da invenção C2
0 processo da invenção foi realizado num recipiente Applikon de 2 L. Utilizou-se uma membrana de fibra oca (GE) de corte de peso molecular de 500 kDa (MWCO) operada em modo ATF com um sistema ATF-2 (Refine Technology) para reter as células e o produto IgG. A cultura foi iniciada com 3xl05 células/mL em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM de L-Glutamina. O meio de cultura VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM de L-Glutamina é perfundido através da cultura de células em suspensão utilizando um SPR entre 0,05 e 0,2 nL.células-1.dia-1. A pressão de CO2 foi controlada abaixo de 15%.
Resultado
Como pode ser visto a partir da Fig. 3/9 e da Fig. 4/9, o processo de acordo com a invenção resulta em densidades de células viáveis significativamente aumentadas e em concentrações de produto aumentadas (2415% x rendimento de Lote; 690% x rendimento de lote alimentado) em igual ou menos tempo (100% Tempo de lote, 81% de tempo de lote alimentado). O aumento global da produtividade em gL-1.dia-1 do processo da invenção é 23,9 vezes a produtividade em lotes em gL-1.dia-1) e 8,5 vezes a produtividade em lotes alimentados em gL-1. dia-1. No processo da invenção C2, foram produzidos 11,1 g de produto/L. A obstrução do dispositivo de retenção não ocorreu durante 17 dias, mesmo com densidade celular muito elevada.
Exemplo 3: Comparação entre um processo descontinuo, um processo descontinuo alimentado e o processo de acordo com a invenção.
Neste exemplo, o desempenho do processo de acordo com a presente invenção com remoção de cultura de células e novamente comparado com processos em lote e alimentados em lote; no C3 processo a cultura de células foi removida. A FIG. 5/9 mostra a densidade de células viáveis Y (106.ml-1) em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo A (lote), B (alimentado) C3 (processo da invenção). A FIG. 6/9 mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG no processo A3) versus o tempo de processo X (dias) para o processo A e C3. A FIG. 7/9 mostra o rendimento acumulado Q (% em relação ao rendimento no processo A, por volume de reator L) traçado em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo A, B e C3.
Todas as fermentações foram realizadas utilizando um controlador Sartorius Biostat B para controlar a temperatura a 36,5°C, pH entre 7,2 e 6,8 e DO a 50% de saturação de ar e a 200 rpm. A mesma IgG (de aproximadamente 150 kDa) produzindo a linha celular PER.C6 (ver a WO 2004/099396) foi utilizada em todas as experiências.
Processo Lote A 0 processo em lote foi executado a 4 L de volume de trabalho num recipiente Sartorius B5. As células foram inoculadas em 3,105 células.mL-1 em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM de L-glutamina e subsequentemente cultivadas durante 17 dias.
Processo de alimentação-Lote B O processo alimentado em lote foi executado a 4 L de volume de trabalho num recipiente Sartorius B5. As células foram inoculadas em 3,105 células.mL-1 em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM de L-glutamina. Durante a cultura foram adicionados glicose e glutamina para manter a concentração acima respetivamente de 15 mM e 1 mM. Aminoácidos e péptidos foram adicionados a partir do dia 5 para reabastecer os aminoácidos consumidos.
Processo da invenção C3 O processo da invenção foi realizado num recipiente Applikon de 2 L. Utilizou-se uma membrana de fibra oca (GE) de corte de peso molecular de 100 kDa (MWCO) operada em modo de fluxo ATF com um sistema ATF-2 (Refine Technology) para reter as células e o produto IgG. A cultura foi iniciada com 3xl05 células/mL em meio VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM de L-Glutamina. O meio de cultura VPRO (SAFC) suplementado com 6 mM de L- Glutamina é perfundido através da cultura de células em suspensão utilizando um SPR entre 0,05 e 0,2 nL.células _1.dia_1 . A cultura celular é removida a 10% do volume de trabalho por dia acima de 10.106 células.mL-1 e a 30% do volume de trabalho por dia quando a densidade celular viável excede 30.106 células.mL-1 e em diante.
Resultado
Como pode ser visto a partir da Fig. 5/9 com o processo da invenção são atingidas rapidamente densidades de células viáveis mais elevadas. Além disso, a Fig. 5/9 também mostra que a viabilidade das células pode ser mantida mais tempo com o processo da invenção, uma vez que o processo C3 foi mantido em funcionamento durante um período de cerca de 40 dias, porque não ocorreu obstrução do dispositivo de retenção mesmo com densidades celulares elevadas. A FIG. 6/9 mostra que as concentrações de produto para o processo da presente invenção são muito mais elevadas do que a concentração do produto no processo descontínuo. O fluxo do produto contendo o produto foi recolhido a partir do processo C3 a aproximadamente 200% a 250% vezes a concentração final no processo em lote A. A FIG. 7/9 mostra que a maior parte do produto é formada pelo processo da presente invenção e que o processo da invenção pode ser mantido mais longo do que o processo em lote A ou o lote alimentado B. No dia 17, o rendimento cumulativo do processo C3 é 8,1 vezes o rendimento acumulado do processo em lote (A3) e 2,1 vezes o rendimento cumulativo do processo de lote alimentado (B) . Também, no dia 17, o processo descontínuo terminou. No dia 21, o rendimento cumulativo do processo C3 é 3,0 vezes o rendimento cumulativo do processo em lote alimentado B. No dia 21, terminou o processo de lote alimentado. Depois de 39 dias, o rendimento cumulativo global do processo C3 é 25 vezes o rendimento acumulado do processo em lotes A e 6 vezes o rendimento do processo de lote alimentado B.
Pode concluir-se a partir desta experiência que o rendimento global de um material biológico desejado no processo de acordo com a presente invenção pode ser ainda melhorado pela aplicação de um sangramento da cultura celular quando a densidade celular excede um determinado nível elevado.
Exemplo 4: Cultivo e produção com células CHO.
Neste exemplo, o processo de acordo com a presente invenção foi realizado com uma linha celular CHO de produção de IgG e inclui uma queda de temperatura para diminuir o crescimento celular. A FIG. 8/9 mostra o número de células Y (106.ml_1) traçado em relação ao tempo de processo X (dias) para C4 (processo da invenção). A FIG. 9/9 mostra a concentração de IgG no reator Z (% em comparação com a concentração de IgG máxima atingida em relação ao tempo de processo X (dias) para o processo C4 (uma concretização do processo da invenção) A fermentação foi realizada utilizando um controlador Sartorius Biostat B para controlar a temperatura a 36,5°C, pH entre 7,1 e 6,9 e DO a 40% de saturação de ar e a 100 rpm. A temperatura foi deixada cair para 32°C no dia 5.
Processo da invenção C4 O processo da invenção foi realizado num recipiente Applikon de 2 L. O dispositivo de retenção de células e produtos é uma membrana de fibra oca de corte de peso molecular (MWCO) de 50 kD (General Electric) operada em modo de fluxo ATF com um sistema ATF-2 (Refine Technology). A cultura foi iniciada com 5,106 células.mL_1 em meio de cultura MTCM-49 (Hyclone) . O meio foi perfundido através da cultura de células em suspensão utilizando um SPR entre 0,1 e 0,4 nL. células-1. dia -1. A pressão de CO2 foi controlada abaixo de 15%.
Resultado
Os dados mostram que o processo da invenção também funciona quando se utiliza uma proteína que produz a linha de células CHO. A densidade celular obtida e as concentrações de produto são aumentadas em comparação com a cultura em lotes. Os dados também mostram que, no processo de acordo com a presente invenção, o crescimento celular pode ser interrompido (por exemplo, por uma queda de temperatura), enquanto que a acumulação do produto no sistema de cultura continua.
Exemplo 5: Processo da invenção realizado com uma linha de células de mieloma. 0 processo de acordo com a presente invenção também pode ser aplicado a linhas celulares de mieloma. Para este fim, a fermentação é realizada utilizando um controlador Sartorius Biostat B para controlar a temperatura a 36,5°C, pH entre 7,2 e 6,8 e DO a 40% de saturação de ar e a 100 rpm. A cultura de células começa com a inoculação das células de mieloma a 3x10 células/ml em meio de cultura SFM4Mab (Hyclone) num vaso Sartorius de 5 L. O dispositivo de retenção de células e produtos é uma membrana de fibra oca de corte de peso molecular (MWCO) de 30 kD (General Electric) operada em modo de fluxo ATF com um sistema ATF-4 (Refine Technology). O meio de cultura SFM4Mab (Hyclone) é perfundido através da cultura de células em suspensão utilizando um SPR entre 0,1 e 0,4 nL. células-1. dia-1. A pressão de CO2 é controlada abaixo de 15%.
Exemplo 6: Processo da invenção realizado com uma linha celular MDCK. 0 processo de acordo com a presente invenção também pode ser aplicado a linhas de células MDCK transformadas em suspensão. Para este fim, a fermentação é realizada utilizando um controlador Sartorius Biostat B para controlar a temperatura a 36,5°C, pH entre 7,2 e 6,8 e DO a 40% de saturação de ar e a 100 rpm. A cultura celular inicia-se com a inoculação das células MDCK transformadas a 3xl05 células/ ml em meio de cultura VP-SFM (Invitrogen) num vaso Sartorius de 5 L. O dispositivo de retenção de células e produtos é uma membrana de fibra oca de corte de peso molecular (MWCO) de 30 kD (General Electric) operada em modo de fluxo ATF com um sistema ATF-4 (Refine Technology). O meio de cultura VP-SFM (Invitrogen) é perfundido através da cultura de células em suspensão utilizando um SPR entre 0,1 e 0,4 nL.células-1.dia-1. A pressão de CO2 é controlada abaixo de 15%.

Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Cultura celular compreendendo uma suspensão de células de mamífero produzindo uma substância biológica desejada com uma densidade celular viável de, pelo menos, 50 x 106 células/mL e uma concentração da substância biológica de, pelo menos, 5 g/L, obtenível por um processo para a cultura das células num reator em suspensão num meio de cultura de células, em que as células produzem a substância biológica desej ada, em que, pelo menos, um componente de meio de cultura de células é alimentado para a cultura de células e em que a cultura de células compreendendo as células, a substância biológica e o meio de cultura de células desejados são circulados sobre um filtro utilizando um fluxo tangencial e em que o filtro tem uma dimensão de poro caracterizada por um corte de peso molecular menor do que o peso molecular da substância biológica desejada para separar a substância biológica desejada de substâncias com um peso molecular mais baixo do que a substância biológica desej ada, em que o escoamento de líquido a partir do filtro, essencialmente, apenas contém componentes com um peso molecular inferior ao da substância biológica desejada e em que a substância biológica desejada é retida ou reenviada para dentro do reator.
  2. 2. Cultura celular de acordo com a reivindicação 1, em que a substância biológica desejada é codificada por, pelo menos, um gene transfectado para dentro das células.
  3. 3. Cultura celular de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a concentração da substância biológica desejada é pelo menos 10 g/L.
  4. 4. Cultura celular de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a concentração da substância biológica desejada é, pelo menos, 11 g/L.
  5. 5. Cultura celular de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a substância biológica desejada é uma IgG.
  6. 6. Cultura celular de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que as células de mamífero são células HER imortalizadas com El.
  7. 7. Cultura celular de acordo com a reivindicação 6, em que as células de mamífero são células PER.C6.
  8. 8. Cultura celular de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a densidade de células viáveis está na gama de 50 x 106 células/mL a 200xl06 células/mL.
  9. 9. Cultura celular de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a densidade de células viáveis está na gama de 80xl06 celulas/mL a 200xl06 células/mL.
PT131696940T 2006-07-14 2007-07-04 Processo melhorado para a cultura de células PT2634250T (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06014671 2006-07-14
EP07002571 2007-02-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT2634250T true PT2634250T (pt) 2017-07-13

Family

ID=38441437

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT131696940T PT2634250T (pt) 2006-07-14 2007-07-04 Processo melhorado para a cultura de células
PT131696932T PT2634243T (pt) 2006-07-14 2007-07-04 Método para melhorar a cultura de células
PT131696858T PT2634242T (pt) 2006-07-14 2007-07-04 Processo melhorado para cultura de células
PT101836773T PT2343362T (pt) 2006-07-14 2007-07-04 Processo melhorado para a cultura de células
PT77650497T PT2041259E (pt) 2006-07-14 2007-07-04 Processo melhorado para a cultura de células

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT131696932T PT2634243T (pt) 2006-07-14 2007-07-04 Método para melhorar a cultura de células
PT131696858T PT2634242T (pt) 2006-07-14 2007-07-04 Processo melhorado para cultura de células
PT101836773T PT2343362T (pt) 2006-07-14 2007-07-04 Processo melhorado para a cultura de células
PT77650497T PT2041259E (pt) 2006-07-14 2007-07-04 Processo melhorado para a cultura de células

Country Status (21)

Country Link
US (7) US8119368B2 (pt)
EP (5) EP2634243B1 (pt)
JP (4) JP5092129B2 (pt)
KR (3) KR101685246B1 (pt)
CN (2) CN102876628A (pt)
AR (1) AR062072A1 (pt)
AU (1) AU2007272054C1 (pt)
BR (1) BRPI0714347A2 (pt)
CA (1) CA2657040C (pt)
CL (1) CL2007002060A1 (pt)
DK (4) DK2634243T3 (pt)
EA (2) EA201101581A1 (pt)
ES (5) ES2625062T3 (pt)
HU (5) HUE032608T2 (pt)
IL (2) IL196322A0 (pt)
MX (2) MX2009000522A (pt)
PL (5) PL2634243T3 (pt)
PT (5) PT2634250T (pt)
SI (5) SI2634250T1 (pt)
TW (3) TWI512102B (pt)
WO (1) WO2008006494A1 (pt)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2456015T3 (es) 2004-03-05 2014-04-21 Dsm Ip Assets B.V. Procedimiento para cultivar células mediante perfusión continua y flujo tangencial alternante
US8585594B2 (en) * 2006-05-24 2013-11-19 Phoenix Biomedical, Inc. Methods of assessing inner surfaces of body lumens or organs
PT2634250T (pt) 2006-07-14 2017-07-13 Patheon Holdings I B V Processo melhorado para a cultura de células
US9109193B2 (en) 2007-07-30 2015-08-18 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Continuous perfusion bioreactor system
US8623650B2 (en) 2007-10-19 2014-01-07 Viacyte, Inc. Methods and compositions for feeder-free pluripotent stem cell media containing human serum
US9238792B2 (en) * 2009-09-15 2016-01-19 E I Du Pont De Nemours And Company Compartmentalized simultaneous saccharification and fermentation of biomass
AU2010305765B2 (en) 2009-10-15 2015-07-02 Crucell Holland B.V. Method for the purification of adenovirus particles
CN102575233B (zh) 2009-10-15 2014-07-16 克鲁塞尔荷兰公司 从高细胞密度培养物纯化腺病毒的方法
WO2012030512A1 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Percivia Llc. Flow-through protein purification process
ES2556454T3 (es) * 2010-10-05 2016-01-18 Novo Nordisk Health Care Ag Proceso para producción de proteínas
BR112013019325B1 (pt) 2011-02-10 2020-12-15 Janssen Vaccines & Prevention B.V Sistema de filtração de fluido e processo para filtrar um fluido
RU2580020C2 (ru) * 2011-04-29 2016-04-10 Биокон Рисерч Лимитед Способ снижения гетерогенности антител и способ получения соответствующих антител
DK3626737T3 (da) 2011-05-13 2024-02-05 Octapharma Ag Fremgangsmåde til at forøge produktiviteten af eukaryote celler i produktionen af rekombinant fviii
SI2837680T1 (sl) 2011-07-01 2020-07-31 Amgen Inc. Celična kultura sesalca
TWI637057B (zh) 2012-11-09 2018-10-01 拜爾沙納有限公司 具交替生物反應器用途之不連續進料批次製程
JP6017060B2 (ja) * 2012-11-29 2016-10-26 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン フード付き磁気インペラアセンブリを備える容器
DK2970843T3 (da) * 2013-03-15 2021-11-22 Genzyme Corp Fremgangsmåder til frembringelse af cellebank med høj densitet
ES2842350T3 (es) 2013-03-19 2021-07-13 Cmc Biologics As Un procedimiento para la producción de un producto (por ejemplo, polipéptido) en un proceso de fermentación de cultivo celular continuo
KR20220031937A (ko) * 2013-09-16 2022-03-14 젠자임 코포레이션 세포 배양물을 가공하는 방법 및 시스템
WO2015044418A1 (en) * 2013-09-30 2015-04-02 Crucell Holland B.V. Method for the clarification of high density crude cell culture harvest
DK3152317T3 (en) 2014-06-04 2019-04-08 Amgen Inc Methods for Harvesting Mammalian Cell Cultures
WO2015188224A1 (en) * 2014-06-13 2015-12-17 Csl Limited Improved production of recombinant von willebrand factor in a bioreactor
EP3172317B1 (en) 2014-07-24 2019-05-01 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Process for the purification of poliovirus from cell cultures
JP6530171B2 (ja) * 2014-09-09 2019-06-12 旭化成メディカル株式会社 培養産生物の回収方法
WO2017147536A1 (en) 2016-02-24 2017-08-31 The Rockefeller University Embryonic cell-based therapeutic candidate screening systems, models for huntington's disease and uses thereof
AU2017249402A1 (en) * 2016-04-12 2018-10-04 Artemis Biosystems, Inc. Perfusion filtration systems
EP3591030A4 (en) 2017-03-03 2020-03-25 FUJIFILM Corporation CELL CULTURE DEVICE AND CELL CULTURE METHOD
KR20200068697A (ko) 2017-10-06 2020-06-15 론자 리미티드 라만 분광법을 사용하는 세포 배양의 자동 제어
KR20200062236A (ko) 2017-10-16 2020-06-03 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 관류 바이오리액터 및 관련 사용 방법
CN111263631A (zh) 2017-10-26 2020-06-09 瑞普利金公司 微型交替切向流灌注过滤器、处理容器及其使用方法
EA202091422A1 (ru) * 2017-12-11 2020-08-28 Эмджен Инк. Способ непрерывного производства продуктов на основе биспецифических антител
EP3762122A4 (en) * 2018-03-08 2021-05-05 Repligen Corporation TANGENTIAL DEEP FILTRATION SYSTEMS AND FILTRATION METHODS USING THESE SYSTEMS
CN111868249B (zh) * 2018-03-19 2024-06-18 富士胶片株式会社 生产物的制造方法
CN109157690A (zh) * 2018-06-15 2019-01-08 翁炳焕 猴-人细胞融合母胎血型不合治疗杂交株的制备
EP3647405A1 (en) * 2018-11-02 2020-05-06 Microfluidx Cell culture device and method of using the same
SG11202104417UA (en) * 2018-11-02 2021-05-28 Wuxi Biologics Ireland Ltd Cell culture process by intensified perfusion with continuous harvest and without cell bleeding
WO2020238918A1 (en) * 2019-05-28 2020-12-03 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. A raman spectroscopy integrated perfusion cell culture system for monitoring and auto-controlling perfusion cell culture
CN115667491A (zh) 2020-03-10 2023-01-31 赛阿瑞斯公司 用于细胞处理的系统、装置及方法
WO2024072444A1 (en) * 2022-09-26 2024-04-04 Upside Foods, Inc. Harvesting cell-based meat
US11898127B1 (en) 2022-09-26 2024-02-13 Upside Foods, Inc. Harvesting cell-based meat

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4477342A (en) 1982-08-31 1984-10-16 Becton, Dickinson And Company Apparatus and method for controlling ultrafiltration during hemodialysis
EP0205404B1 (en) * 1985-06-11 1992-07-15 Ciba-Geigy Ag Hybrid interferons
US5286646A (en) 1985-11-25 1994-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Method for mammalian cell culture
PT84991B (pt) 1986-06-06 1990-03-08 Genentech Inc Processo para a producao de actividador do plasminogenio biologicamente activo
JPH0642905B2 (ja) 1986-06-13 1994-06-08 東レ株式会社 血液透析膜
GB8617646D0 (en) 1986-07-18 1986-08-28 Manchester Inst Science Tech Recovery of biological material
US6022742A (en) * 1986-11-26 2000-02-08 Kopf; Henry B. Culture device and method
US4806484A (en) * 1987-08-07 1989-02-21 Igb Products, Ltd. Perfusion airlift bioreactor
JPH0797982B2 (ja) * 1987-09-24 1995-10-25 東洋紡績株式会社 細胞培養装置
US4921792A (en) 1987-11-27 1990-05-01 Miles Inc. Continuous cell dispersion, cultivation and substance recovery process
JPH01243985A (ja) 1988-03-25 1989-09-28 P C C Technol:Kk 植物器官の培養法及びその培養槽
US5595909A (en) 1988-05-23 1997-01-21 Regents Of The University Of Minnesota Filter device
JPH02119772A (ja) * 1988-10-29 1990-05-07 Shimadzu Corp 細胞培養装置
JP2625990B2 (ja) * 1988-11-19 1997-07-02 株式会社島津製作所 細胞培養装置
US5019512A (en) 1989-03-17 1991-05-28 Baxter International Inc. Spin filter for removing substantially cell-free culture medium from suspension cell culture system
JP2690144B2 (ja) * 1989-04-24 1997-12-10 哲哉 峠 膜型細胞培養装置
JPH0793874B2 (ja) * 1989-04-27 1995-10-11 日本碍子株式会社 バイオリアクタ
US5256294A (en) 1990-09-17 1993-10-26 Genentech, Inc. Tangential flow filtration process and apparatus
JP2948675B2 (ja) * 1991-03-20 1999-09-13 日本碍子株式会社 発酵液中の有価物を回収するクロスフロー濾過方法
JPH0531332A (ja) * 1991-07-30 1993-02-09 Toto Ltd 微生物の膜分離方法
GB9118664D0 (en) 1991-08-30 1991-10-16 Celltech Ltd Cell culture
JPH07123972A (ja) * 1993-11-01 1995-05-16 Fumio Yamauchi 膜型バイオリアクター
JPH07298871A (ja) * 1994-05-06 1995-11-14 Fumio Yamauchi 膜型バイオリアクター
US6204000B1 (en) 1995-04-28 2001-03-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Diagnostic methods and gene therapy using reagents derived from the human metastasis suppressor gene KAI1
ES2333425T5 (es) 1995-06-15 2012-08-28 Crucell Holland B.V. Sistemas de empaquetado para adenovirus recombinante humano destinados a terapia génica
US5994728A (en) 1995-11-15 1999-11-30 Matsushita Electronics Corporation Field effect transistor and method for producing the same
JPH1015357A (ja) * 1996-07-01 1998-01-20 Nitto Denko Corp 排水の処理方法
JPH1033671A (ja) * 1996-07-24 1998-02-10 Jms Co Ltd 中空糸型人工肝臓とその灌流及び培養システム
JP3346996B2 (ja) 1996-09-18 2002-11-18 金剛株式会社 免震自立棚
JPH10108673A (ja) * 1996-10-04 1998-04-28 Asahi Medical Co Ltd 中空糸型培養器を用いた動物細胞の培養方法
JPH10108666A (ja) * 1996-10-04 1998-04-28 Asahi Medical Co Ltd 中空糸型培養器
US6001585A (en) 1997-11-14 1999-12-14 Cellex Biosciences, Inc. Micro hollow fiber bioreactor
US8026096B1 (en) 1998-10-08 2011-09-27 Protein Sciences Corporation In vivo active erythropoietin produced in insect cells
PT1147180E (pt) 1999-01-26 2009-03-10 Schering Plough Ltd Propagação de coronavírus bovino em células de ovário de hamster chinês
SI1533380T1 (sl) 1999-04-15 2010-03-31 Crucell Holland Bv Proizvajanje rekombinantnega proteina v človeški celici ki obsega vsaj en protein E adenovirusa
US6855544B1 (en) * 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
EP1103610A1 (en) 1999-11-26 2001-05-30 Introgene B.V. Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines
JP2001149099A (ja) 1999-11-26 2001-06-05 Olympus Optical Co Ltd 染色体異常解析のための有核細胞の標本作製方法
US6544424B1 (en) 1999-12-03 2003-04-08 Refined Technology Company Fluid filtration system
US6168941B1 (en) 2000-04-07 2001-01-02 Genvec, Inc. Method of producing adenoviral vector stocks
JP4138209B2 (ja) 2000-06-29 2008-08-27 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 プラバスタチン含有組成物
JP2002113896A (ja) 2000-10-05 2002-04-16 Seiko Epson Corp 画像形成装置
US6733662B2 (en) 2001-02-23 2004-05-11 V.A.I. Ltd. Methods and apparatus for biological treatment of waste waters
JP3547715B2 (ja) * 2001-03-06 2004-07-28 榮 新垣 ベクター精製用装置及び方法
US6716354B2 (en) 2001-03-08 2004-04-06 Cdg Technology, Inc. Methods of treating water using combinations of chlorine dioxide, chlorine and ammonia
EP1302544B1 (en) 2001-04-17 2009-02-04 Seiren Kabushiki Kaisha Medium additives and media for culturing animal cells
DE10120838A1 (de) 2001-04-27 2002-10-31 Basf Ag Stoffmischung zur UV-Stabilisierung von Kunststoffen und Herstellung davon
DE10120835C2 (de) 2001-04-27 2003-04-10 Sifin Inst Fuer Immunpraeparat Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern
WO2003020919A2 (en) 2001-08-31 2003-03-13 Bayer Healthcare Ag A unit and a process for carrying out high cell density fermentation
HU225988B1 (en) 2001-09-05 2008-02-28 Yamasa Corp Use of cytidine-phosphocholine for producing pharmaceutical compositions for diabetic neuropathy
WO2003025158A1 (en) 2001-09-14 2003-03-27 Medcell Biologics, Inc. Oxygen enriched bioreactor and method of culturing cells
GB0123098D0 (en) * 2001-09-26 2001-11-14 Lonza Biologics Plc Use of aminoglycoside resistance gene
ES2243794T3 (es) 2001-11-15 2005-12-01 AESCULAP AG & CO. KG Recipiente esteril.
JP2003219873A (ja) 2002-01-24 2003-08-05 Japan Science & Technology Corp サケ科キングサーモン由来の不死化細胞
US20030186335A1 (en) 2002-03-28 2003-10-02 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Monoclonal antibodies, hybridomas, cell isolation method, isolated cells and immunological diagnostic method
US6902909B2 (en) 2002-07-09 2005-06-07 Synthecon, Inc. Methods for efficient production of mammalian recombinant proteins
DE10237082B4 (de) 2002-08-09 2014-12-31 Sartorius Stedim Biotech Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur biotechnologischen Herstellung von Wertstoffen
JP2006525015A (ja) * 2003-05-01 2006-11-09 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． 懸濁した動物細胞の灌流培養による生物学的物質の製造方法
WO2004099396A1 (en) * 2003-05-09 2004-11-18 Crucell Holland B.V. Cultures of e1-immortalized cells and processes for culturing the same to increase product yields therefrom
CN101416059A (zh) * 2003-07-17 2009-04-22 格洛伯塞尔解决方案公司 自动化细胞培养系统及方法
JP2005041984A (ja) 2003-07-22 2005-02-17 Shin Kobe Electric Mach Co Ltd 水架橋ポリオレフィン製シートの製造法
ES2456015T3 (es) 2004-03-05 2014-04-21 Dsm Ip Assets B.V. Procedimiento para cultivar células mediante perfusión continua y flujo tangencial alternante
CA2560716A1 (en) * 2004-03-29 2005-10-13 Pall Corporation Pleated, crossflow fluid treatment elements, methods for making them, and methods for treating cellular solutions
KR20130101161A (ko) * 2005-01-05 2013-09-12 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 세포의 배양 방법 및 그 이용
CN100354408C (zh) * 2005-10-09 2007-12-12 南京工业大学 一种高密度细胞培养方法及其生物反应装置
JP2009519819A (ja) * 2005-12-17 2009-05-21 エアーインスペース・ビー．ブイ． 空気浄化装置
JP5031332B2 (ja) 2006-03-31 2012-09-19 旭化成ホームズ株式会社 線切断具
PT2634250T (pt) * 2006-07-14 2017-07-13 Patheon Holdings I B V Processo melhorado para a cultura de células
EP2014760A1 (en) 2007-06-13 2009-01-14 CMC Biopharmaceuticals A/S A method for producing a biopolymer (e.g. polypeptide) in a continuous fermentation process
JP2008308560A (ja) 2007-06-13 2008-12-25 Tohcello Co Ltd 表面防汚性複合フィルムの製造方法
JP5426937B2 (ja) * 2009-06-19 2014-02-26 興和株式会社 光学的反応測定装置および光学的反応測定方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN102876628A (zh) 2013-01-16
JP5448010B2 (ja) 2014-03-19
ES2650042T3 (es) 2018-01-16
PT2634242T (pt) 2017-07-12
JP2014217395A (ja) 2014-11-20
PL2634242T3 (pl) 2017-09-29
SI2634250T1 (sl) 2017-06-30
US9469865B2 (en) 2016-10-18
PL2343362T3 (pl) 2016-11-30
HUE034299T2 (en) 2018-02-28
EP2634243B1 (en) 2017-09-06
US20160265017A1 (en) 2016-09-15
US20120149107A1 (en) 2012-06-14
TW201604277A (zh) 2016-02-01
WO2008006494A1 (en) 2008-01-17
HUE032608T2 (en) 2017-10-30
AU2007272054C1 (en) 2014-08-28
TWI627274B (zh) 2018-06-21
US9670520B2 (en) 2017-06-06
EP2343362B1 (en) 2016-03-30
PT2634243T (pt) 2017-12-18
HUE028593T2 (en) 2016-12-28
TW201341527A (zh) 2013-10-16
EP2634250B1 (en) 2017-04-05
DK2634243T3 (en) 2017-12-11
US20100075413A1 (en) 2010-03-25
PL2634243T3 (pl) 2018-02-28
SI2041259T1 (sl) 2016-04-29
BRPI0714347A2 (pt) 2013-05-07
ES2579957T3 (es) 2016-08-17
PT2343362T (pt) 2016-07-13
EA200900188A1 (ru) 2009-06-30
CN104263700A (zh) 2015-01-07
EP2343362A1 (en) 2011-07-13
EP2041259A1 (en) 2009-04-01
PL2634250T3 (pl) 2017-09-29
DK2041259T3 (en) 2016-01-25
HUE028365T2 (en) 2016-12-28
TWI413689B (zh) 2013-11-01
AU2007272054A1 (en) 2008-01-17
US20140154745A1 (en) 2014-06-05
ES2559308T3 (es) 2016-02-11
CL2007002060A1 (es) 2008-04-18
KR20130014640A (ko) 2013-02-07
KR101685246B1 (ko) 2016-12-09
AR062072A1 (es) 2008-10-15
PT2041259E (pt) 2016-02-15
JP2012165764A (ja) 2012-09-06
EP2634242B1 (en) 2017-04-05
KR20120009530A (ko) 2012-01-31
MX340242B (es) 2016-07-01
US8119368B2 (en) 2012-02-21
DK2634242T3 (en) 2017-05-22
EP2343362B8 (en) 2016-05-18
EA016451B1 (ru) 2012-05-30
US20120149063A1 (en) 2012-06-14
US8440458B2 (en) 2013-05-14
JP5092129B2 (ja) 2012-12-05
JP2011067222A (ja) 2011-04-07
SI2343362T1 (sl) 2016-09-30
HUE035109T2 (en) 2018-05-02
US20130095527A1 (en) 2013-04-18
EP2634242A1 (en) 2013-09-04
US8222001B2 (en) 2012-07-17
US8685731B2 (en) 2014-04-01
CA2657040A1 (en) 2008-01-17
TW200813216A (en) 2008-03-16
JP2009543565A (ja) 2009-12-10
MX2009000522A (es) 2009-01-27
SI2634242T1 (sl) 2017-07-31
EP2634243A1 (en) 2013-09-04
ES2625066T3 (es) 2017-07-18
EP2041259B1 (en) 2015-10-14
EA201101581A1 (ru) 2012-04-30
AU2007272054B2 (en) 2011-09-08
KR101143796B1 (ko) 2012-05-21
DK2343362T3 (en) 2016-07-18
TWI512102B (zh) 2015-12-11
EP2634250A1 (en) 2013-09-04
PL2041259T3 (pl) 2016-04-29
US20120064623A1 (en) 2012-03-15
SI2634243T1 (en) 2018-01-31
EP2343362B2 (en) 2024-04-03
IL234890A (en) 2016-05-31
KR20090031899A (ko) 2009-03-30
IL196322A0 (en) 2009-09-22
ES2625062T3 (es) 2017-07-18
CA2657040C (en) 2013-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT2634250T (pt) Processo melhorado para a cultura de células
AU2013204016B2 (en) Improved process for the culturing of cells