KR20130014640A - 개선된 세포 배양 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 반응기 내의 세포 배양 배지 중에서 현탁액 상태로 세포, 바람직하게는 E1-불멸화 HER 세포, 보다 바람직하게는 PER.C6 세포를 배양하는 방법에 관한 것으로서, 이때 세포는 생물학적 물질, 바람직하게는 항체를 생성하고, 하나 이상의 세포 배양 배지 성분은 세포 배양물로 공급되며, 세포, 생물학적 물질 및 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물은 분리 시스템 상에서 순환하고, 분리 시스템은 분자량이 생물학적 물질보다 낮은 물질로부터 생물학적 물질을 분리하고, 생물학적 물질은 반응기 내에 보유되거나 반응기로 다시 공급된다. 바람직하게는, 분자량이 생물학적 물질보다 낮은 물질의 일부가 세포 배양물로부터 연속적으로 제거된다.

Description

개선된 세포 배양 방법{IMPROVED PROCESS FOR THE CULTURING OF CELLS}
본 발명은 반응기 내의 세포 배양 배지 중에서 현탁액 상태로 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.
이러한 방법은 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 04/099396호로부터 공지되어 있다. 상기 국제특허출원에는 유가배양식 공정에서 생장 조건을 최적화함으로써 세포 배양물의 세포 밀도 및 원하는 생물학적 물질의 수율을 개선할 수 있는 방법이 기재되어 있다.
나아가, 국제특허출원 공개 제WO 05/095578호에는 세포 배양 배지 및 세포를 포함하는 세포 배양물의 연속식 관주 배양에 의한 세포 배양 방법이 개시되어 있는데, 세포 배양 배지는 세포 배양물에 첨가되고, 세포 배양물은 세포 밀도가 상기 세포 배양물보다 더 낮은 액체의 유출을 초래하는 중공 섬유를 포함하는 필터 모듈 상에서 순환하고, 상기 세포는 생물학적 물질을 생성한다. 국제특허출원 공개 제WO 05/095578호의 실시예에서, 약 0.3 g/ℓ의 유출물 중의 생성물 농도에 상응하는 0.9 g/ℓ/일의 생성물이 생성됨이 입증되었다.
생물학적 물질을 함유하는 액체의 부피가 클수록 생물학적 물질의 정제가 더 어려워진다. 국제특허출원 공개 제WO 04/099396호 및 제WO 05/095578호에 개시된 방법에서 수득된 생물학적 물질의 농도는 그다지 높지 않다. 따라서, 추가 정제 단계가 적용되기 전에 생물학적 물질이 농축될 필요가 있거나 큰 부피의 덜 농축된 생물학적 물질이 정제될 필요가 있기 때문에 상기 생물학적 물질의 하류(downstream) 처리공정이 번거롭다. 뿐만 아니라, 보다 낮은 세포 밀도에서의 세포 배양은 보다 낮은 부피 생산성을 초래하여 보다 크고/크거나 보다 많은 배양 용기를 필요로 함으로써 소정의 생산 수준에 대한 보다 많은 설비 투자 비용이 요구된다.
본 발명의 목적은 세포 배양물로부터 보다 높은 농도로 생성물을 수득하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 연장된 기간 동안 세포의 배양 및 생물학적 물질의 생성을 가능하게 하는 것이다.
이 목적들은 반응기 내의 세포 배양 배지 중에서 현탁액 상태로 세포를 배양하는 방법에 의해 달성되는데, 이때 상기 세포는 생물학적 물질을 생성하고, 하나 이상의 세포 배양 배지 성분이 세포 배양물로 공급되며, 생물학적 물질 및 세포 배양물을 포함하는 세포 배양물이 분리 시스템 상에서 순환하고, 분리 시스템이 생물학적 물질보다 낮은 분자량을 가진 물질로부터 생물학적 물질을 분리하고, 생물학적 물질이 반응기 내에 보유되거나 반응기로 다시 공급된다.
분자량이 생물학적 물질보다 낮은 물질로부터 생물학적 물질을 분리하는 분리 시스템을 이용함으로써 생물학적 물질이 세포 배양물 중에 보다 높은 농도로 축적될 수 있음을 발견하였다.
본 발명의 방법의 추가 이점은 예를 들어, 회분식 또는 유가배양식 공정에 비해 더 높은 생존 세포 농도가 달성될 수 있다는 점이다. 뿐만 아니라, 생산 기간, 즉 세포가 생물학적 물질을 생성하는 기간이 예를 들어, 회분식 또는 유가배양식 공정에 비해 연장될 수 있다. 또한, 회분식 또는 유가배양식 공정에 비해 더 적은 반응기를 사용할 수 있다. 더 적은 반응기의 사용은 장치 및 설비 관련 투자 비용을 감소시키기 때문에 유리하다.
또한, 보다 높은 농도의 생물학적 물질이 보다 짧은 시간 내에 수득될 수 있다.
도 1은 방법 A(회분식), B(유가배양식) 및 C1(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 생존 세포 밀도 Y(106 ㎖-1)를 보여준다.
도 2는 방법 A(회분식), B(유가배양식) 및 C1(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 반응기 내의 IgG 농도 Z(방법 A에서의 IgG 농도에 비교할 때 %)를 보여준다.
도 3은 방법 A(회분식), B(유가배양식) 및 C2(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 생존 세포 밀도 Y(106 ㎖-1)를 보여준다.
도 4는 방법 A(회분식), B(유가배양식) 및 C2(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 반응기 내의 IgG 농도 Z(방법 A에서의 IgG 농도에 비교할 때 %)를 보여준다.
도 5는 방법 A(회분식), B(유가배양식) 및 C3(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 생존 세포 밀도 Y(106 ㎖-1)를 보여준다.
도 6은 방법 A 및 C3에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 반응기 내의 IgG 농도 Z(방법 A3에서의 IgG 농도에 비교할 때 %)를 보여준다.
도 7은 방법 A(회분식), B(유가배양식) 및 C3(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 축적 수율 Q(방법 A에서의 반응기 내의 수율과 비교할 때 반응기 부피(ℓ) %)를 보여준다.
도 8은 C4(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 세포 수 Y(106 ㎖-1)를 보여준다.
도 9는 방법 C4(본 발명의 방법의 한 실시양태)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 반응기 Z 내의 IgG 농도 Z(도달된 최대 IgG 농도에 비교할 때 %)를 보여준다.
예를 들어, 본 발명은 반응기 내의 세포 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 방법에 관한 것이고, 이때 상기 세포는 생물학적 물질을 생성하며, 영양분 및/또는 세포 배양 배지는 상기 반응기로 공급되고, 세포 및 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물은 공극 크기 또는 분자량 컷-오프(MWCO)가 5 내지 500 kD인 필터 상에서 순환한다.
분자량이 생물학적 물질보다 낮은 물질로부터 생물학적 물질을 분리하는 분리 시스템을 이용함으로써 생물학적 물질이 세포 배양물 중에 보다 높은 농도로 축적될 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 세포 덩어리와 함께 원하는 생물학적 물질을 축적할 수 있다는 점에서 선행기술로부터 공지된 세포 배양과 상이하다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 분자량이 보다 낮은 물질의 일부는 세포 배양물로부터 연속적으로 제거된다.
본 발명의 방법의 추가 이점은 예를 들어, 회분식 또는 유가배양식 공정에 비해 더 높은 생존 세포 농도가 달성될 수 있다는 점이다. 뿐만 아니라, 생산 기간, 즉 세포가 생물학적 물질을 생성하는 기간이 예를 들어, 회분식 또는 유가배양식 공정에 비해 연장될 수 있다. 또한, 회분식 또는 유가배양식 공정에 비해 더 적은 반응기를 사용할 수 있다. 더 적은 반응기의 사용은 장치 및 설비 관련 투자 비용을 감소시키기 때문에 유리하다.
또한, 보다 높은 농도의 생물학적 물질이 보다 짧은 시간 내에 수득될 수 있다.
세포 생존율을 급격히 감소시키지 않음으로써 생산 기간을 제한하지 않으면서 반응기 내에서 보다 높은 농도의 생물학적 물질을 수득할 수 있음을 발견하였다. 당업자는 생성물 억제, 즉 생물학적 물질 자체에 의한 생물학적 물질의 생성 억제 또는 세포에 의해 생성된 다른 거대분자(예컨대, 숙주 세포 단백질, 효소 또는 세포 데브리스(debris))에 의한 억제가 일어날 것임을 예측할 것이다. 나아가, 원하는 생물학적 물질의 축적이 분리 시스템의 기능을 손상시키지 않음을 발견하였다.
본 발명의 방법은 국제특허출원 공개 제WO 05/095578호 및 제WO 04/099396호에 따른 방법에 비해 세포 밀도, 세포 배양물 중의 생성물 농도 및 연장된 배양 시간 면에서 상당한 이점을 제공한다. 따라서, 본 발명의 방법은 원하는 생물학적 물질의 생성을 개선한다.
생물학적 물질의 생성에 사용되는 세포는 원칙적으로 생물학적 생성물을 생성하는 능력을 가진, 당업자에게 공지된 모든 세포이다. 상기 세포는 진핵세포, 예를 들어, 섬유상 진균, 예컨대, 아스퍼길러스 니게르(Aspergillus niger), 아스퍼길러스 오리재(Aspergillus oryzae), 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei), 페니실리움 크라이소게눔(Penicillium chrysogenum), 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 파피아 로도자이마(Phaffia rhodozyma), 또는 피키아(Pichia) 속으로부터 유래된 효모, 예컨대, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris); 또는 원핵세포, 예를 들어, 에쉬케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스(Bacillus) 종, 예컨대, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alkalophilus), 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 종일 수 있다. 진핵세포의 예는 예를 들어, 문헌(Chu, L., Robinson, D.K., (2001 ) Curr. Opinion Biotechn., vol. 12, p. 180-187)에도 기재되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 세포는 동물 세포, 특히 포유동물 세포이다. 포유동물 세포의 예는 CHO(중국 햄스터 난소) 세포, 하이브리도마, BHK(새끼 햄스터 신장) 세포, 골수종 세포, 인간 세포, 예를 들어, HEK-293 세포, 인간 림프모구 세포, E1-불멸화 인간 배아 망막(HER) 세포, 마우스 세포, 예를 들어, NS0 세포이다. 보다 바람직하게는, E1-불멸화 HER 세포, 가장 바람직하게는 PER.C6 세포가 사용된다.
일차 HER 세포는 태아로부터 단리될 수 있다(Byrd P, Brown K.W., Gallimore P.H. 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69-71, Byrd P.J., Grand R.J.A., Gallimore P.H. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus E1 regions and combinations of E1A + ras. Oncogene 2: 477-484). 일차 세포는 여러 세대 동안 배양할 때 사멸할 것이다. 본 발명의 목적상 E1-불멸화 HER 세포는 일차 HER 세포 내에서 E1A 및 E1B 단백질을 코딩하는 DNA를 발현시켜 불멸화 세포를 수득함에 의해 상기 일차 HER 세포로부터 유래된다. 이러한 불멸화 세포는 100 세대 이상 동안 배양될 수 있다. E1-불멸화 HER 세포를 수득하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,994,128호, 문헌(Byrd P, Brown K.W., Gallimore P.H.. 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69-71), 문헌(Byrd P.J., Grand R.J.A., Gallimore P.H.. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus E1 regions and combinations of E1A + ras. Oncogene 2: 477-484) 및 문헌(Gallimore P.H., Grand, R.J.A. and Byrd, P.J. (1986). Transformation of human embryo retinoblasts with simian virus 40, adenovirus and ras oncogenes. Anticancer Res. 6, p499-508)에 기재되어 있다. 예를 들어, PER.C1, PER.C3, PER.C4, PER.C5, PER.C6, PER.C8 및d PER.C9 세포를 비롯한 불멸화 HER 세포는 인간 포스포글리세레이트 키나제("PGK") 프로모터의 조절 하에 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) E1A- 및 E1B-코딩 서열(Ad5 뉴클레오티드 459-3510)을 함유하는 플라스미드를 사용하여 일차 HER 세포를 형질감염시킴으로써 발생시켰다(미국특허 제5,994,128호 참조).
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 공정에서 세포는 E1-불멸화 HER 세포, 보다 바람직하게는 PER.C6 세포이다(미국특허 제5,994,128호 참조). PER.C6 세포는 ECACC 제96022940호 하에 기탁된 세포로 예시된다(예를 들어, 미국특허 제5,994,128호 및 유럽특허 제0833934 B1호 참조).
본 발명의 방법에서, 세포는 임의의 형태로서, 예를 들어, 불멸화 세포, 단일 세포, 세포 덩어리 또는 이들의 조합물물로서 현탁액 상태로 배양될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 단일 세포로서 배양되고/되거나 100개 이하, 보다 바람직하게는 20개 이하의 세포로 구성된 작은 세포 덩어리로서 배양된다. 예를 들어, 세포는 예컨대, 지이 헬스케어(GE Healthcare)로부터 시판되는 담체(사이토덱스(Cytodex))와 같은 마이크로담체 상에 고정될 수 있다.
본원에서 정의된 반응기는 세포 및 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물을 포함하는 시스템이다. 상기 반응기는 바람직하게는 다른 세포들이 원하는 세포를 오염시키는 것을 방지하기 위해 멸균 장벽, 예컨대, 공기 필터를 제공하고, 바람직하게는 정확한 배양 조건 예컨대, 혼합, 온도, pH, 산소 농도 등을 제공함으로써 세포에 유리한 환경을 유지한다.
반응기는 예를 들어, 보다 영구적인 반응기, 예를 들어, 스테인레스 강철 또는 유리로 만들어진 반응기일 수 있거나, 일회용 반응기, 예를 들어, 플라스틱 플라스크 또는 백(bag)일 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 반응기의 예로는 요동, 진탕 운동 또는 교반에 의해 혼합될 수 있는 교반 탱크 용기, 공수 용기 및 일회용 백을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 바람직하게는, 일회용 (생물)반응기는 비교적 저렴한 투자 비용을 요구하고, 작동 유연성이 높고, 처리 소요 시간이 짧고 공정에 용이하게 적용시킬 수 있기 때문에 유리하다. 일회용 (생물)반응기는 예를 들어, 하이클론(Hyclone), 사르토리우스(Sartorius), 애플리콘(Applikon) 또는 웨이브(Wave)로부터 시판된다.
본 발명의 골격 내에서 용어 "분리 시스템"은 분자량을 기초로 하여 분리할 수 있는 시스템으로서 정의된다. 본 발명의 방법에서 사용되는 분리 시스템은 분자량이 생물학적 물질보다 낮은 물질로부터 생물학적 물질을 분리할 수 있다. 다시 말해, MWCO는 이 MWCO가 생물학적 물질의 분자량보다 작도록, 보다 바람직하게는 2배 이상 작도록, 가장 바람직하게는 3배 이상 작도록 선택된다. 전형적으로, 분리 시스템의 MWCO는 본 발명의 방법에서 생성되는 생물학적 물질의 분자량에 따라 바람직하게는 5 kDa 이상, 보다 바람직하게는 10 kDa 이상, 가장 바람직하게는 30 kDa 이상 내지 바람직하게는 500 kDa 이하, 더 바람직하게는 300 kDa 이하, 가장 바람직하게는 100 kDa 이하이다. 예를 들어, 분자량이 150 kDa인 IgG의 경우, MWCO가 50 kDa 이하인 분리 시스템이 가장 바람직하다.
분리 시스템의 예로는 필터, 원심분리기 및 수성 2상 추출 시스템을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "필터"는 크기 또는 분자량을 기초로 하여 입자를 분리하는 능력을 가진 모든 장치를 포함한다. 원칙적으로, 본 발명의 방법에서 생물학적 물질이 이 물질보다 낮은 분자량을 가진 물질로부터 분리되도록 공극 크기 또는 MWCO가 선택되는 한 임의의 필터가 사용될 수 있는데, 이때 상기 공극 크기 또는 MWCO는 5 내지 500 kDa의 공극 크기 또는 MWCO일 것이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 필터의 예로는 막 필터, 세라믹 필터 및 금속 필터를 들 수 있다. 상기 필터는 임의의 형태로 사용될 수 있는데, 상기 필터는 예를 들어, 나선형으로 감겨있을 수 있거나 관형일 수 있거나, 또는 시트의 형태로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용되는 필터는 막 필터, 바람직하게는 중공 섬유 필터이다. 용어 "중공 섬유"는 관형 막을 의미한다. 관의 내경은 0.1 mm 이상, 보다 바람직하게는 0.5 mm 이상, 가장 바람직하게는 0.75 mm 이상 내지 바람직하게는 10 mm 이하, 보다 바람직하게는 6 mm 이하, 가장 바람직하게는 1 mm 이하이다. 중공 필터를 포함하는 필터 모듈은 예를 들어, 제너럴 일렉트릭(General Electric; GE)(이전 명칭: 아머샴(Amersham))으로부터 시판된다.
생물학적 물질, 세포 및 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물을 분리 시스템 상에서 순환시킴으로써 생물학적 물질 및 세포는 반응기 내에 보유되고 이에 따라 액체 유출물의 생물학적 물질 농도 및 세포 밀도는 세포 배양물보다 낮다. 본 발명의 방법에서 통상 액체 유출물은 임의의 생물학적 물질 및 세포를 함유하거나 또는 거의 함유하지 않는다. 통상, 액체 유출물은 본질적으로 분자량이 생물학적 물질보다 낮은 성분만을 함유할 것이다. 따라서, 본질적으로 모든 세포 및 본질적으로 모든 생물학적 물질은 통상 반응기 내에 보유된다.
바람직하게는, 필터의 공극 크기 또는 MWCO는 생성물이 많이 보유되게끔 생성물의 직경 또는 분자량보다 작도록, 보다 바람직하게는 2배 이상 작도록, 가장 바람직하게는 3배 이상 작도록 선택된다. 전형적으로, 생성물, 즉 본 발명의 방법에서 생성된 생물학적 물질의 크기 또는 분자량에 따라 필터의 공극 크기 또는 MWCO는 바람직하게는 5 kDa 이상, 보다 바람직하게는 10 kDa 이상, 가장 바람직하게는 30 kDa 이상이고/이거나 필터/막의 공극 크기 또는 MWCO는 바람직하게는 500 kDa 이하, 보다 바람직하게는 300 kDa 이하, 가장 바람직하게는 100 kDa 이하이다.
MWCO는 입자의 90% 이상이 분리 시스템에 의해 보유되는 분자량의 하한을 의미한다.
세포 배양물을 분리 시스템, 예를 들어, 필터 상에서 순환시킴은 내용물이 반응기 내에 유지되거나 반응기로 다시 공급되는 액체 유출 및 유동을 발생시키는 분리 시스템, 예를 들어, 필터에 세포 배양물을 통과시킴을 의미한다. 일반적으로, 내용물이 반응기 내에 유지되거나 반응기로 다시 공급되는 유동은 본질적으로 분자량이 생물학적 물질의 분자량 이상인 성분들만을 함유하므로 상기 유동은 액체 유출물보다 더 많은 생물학적 물질을 포함할 것이다.
원칙적으로, 세포 배양물을 분리 시스템 상에서 순환시킴이 본 발명의 방법 도중에 언제 개시되는 지는 그다지 중요하지 않다. 세포 배양물의 순환은 예를 들어, 방법의 개시로부터 직접 개시될 수 있거나 세포의 생존 세포 밀도가 일정 수준에 도달하였을 때 개시될 수 있다.
세포 배양물을 필터 상에서 순환시킴이 데드-엔드(dead-end) 유동으로도 공지되어 있는, 필터 표면에 대해 실질적으로 수직인 유동일 수 있거나, 또는 접선 유동, 예를 들어, 일방향 접선 유동(TFF) 또는 교차-유동으로도 공지되어 있는, 필터 표면에 실질적으로 평행한 유동일 수 있다. 교차-유동의 바람직한 예는 교류 접선 유동(ATF)인데, 이는 ATF의 경우 필터 응괴가 매우 높은 세포 밀도에서조차도 (급속히) 일어나지 않음이 발견되었기 때문이다. 심층 여과에서 있어서 중간 전단필터에 의한 응괴로부터 보호하기 위해 최종적으로 작은 공극 필터가 필요하다는 것은 통상의 일반 지식이다. 이 관행은 작은 공극 또는 작은 MWCO를 가진 필터가 보다 용이하게 막힘으로써 생산 시간을 한정한다는 통상의 일반 지식을 기초로 한 것이다. ATF가 사용되는 경우, 전단필터의 사용은 필요 없게 된다.
유동의 방향은 세포 배양물의 이동, 필터의 이동 또는 둘다에 의해 결정될 수 있다. 필터는 예를 들어, 회전(회전 필터) 또는 진동(진동 필터)에 의해 이동될 수 있다. 별법으로, 유동의 방향이 세포 배양물만의 이동에 의해 결정되는 경우, 필터는 정적이고 세포 배양물은 예를 들어, 펌프 또는 압력에 의해 이동될 수 있다.
"교류 접선 유동 또는 ATF"는 필터 표면과 동일한 방향(즉, 접선 방향)으로 전진하고 후진하는 하나의 유동이 있고 상기 필터 표면에 실질적으로 수직인 방향의 또 다른 유동이 있음을 의미한다. ATF는 (예를 들어, 미국특허 제6,544,424호에 기재된 바와 같이) 당업자에게 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다.
세포 배양 과정 동안에, 하나 이상의 세포 배양 배지 성분, 예를 들어, 하나 이상의 영양분 및/또는 세포 배양 배지가 세포로 공급될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서, 이 영양분 또는 이 영양분들을 반응기로 공급함으로써 하나 이상의 고갈된 영양분을 부분적으로 또는 바람직하게는 전체적으로 보충하는 것이 유리하다. 예를 들어, 완전한 세포 배양 배지가 반응기로 공급될 수 있는데, 이것은 분리된 공급물이 별도로 제조될 필요가 없기 때문에 유리하다. 세포 배양 배지는 예를 들어, 보다 농축된 형태로 세포에 공급될 수도 있고, 이것은 보다 작은 부피의 취급이 더 용이하기 때문에 유리하다. 또한, 하나 이상의 영양분이 반응기로 공급될 수 있다. 예를 들어, 탄수화물, 예를 들어, 글루코스 또는 프럭토스, 아미노산, 예컨대, 글루타민 및/또는 펩티드를 반응기에 공급하는 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 조건은 세포 생장 속도 및/또는 세포의 비생산성(specific productivity)이 한정되지 않도록, 보다 바람직하게는 세포 배양 배지의 성분들 중 하나 이상의 농도가 본질적으로 일정하게 유지되도록 선택된다. 세포 배양 조건을 제한하는 예는 영양분 제한, 및 억제 대사물질, 예컨대, 암모니아, 이산화탄소 및 락테이트의 형성이다. 예를 들어, 공급물과 같은 세포 배양 조건은 예를 들어, 고갈을 보충하고/하거나 억제 대사물질, 예컨대, 락테이트 또는 암모니아의 생성을 피하기에 충분한 영양분을 공급함으로써 세포 생장 속도가 제한되지 않도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 통기 조건은 이산화탄소 형성이 세포 생장 속도를 제한하지 않도록 선택될 수 있다. 비-제한 조건 하에서 세포를 생장시킴은 1) 이것이 많은 경우 생성물의 일정하고 우수한 품질을 제공하는 일정한 세포 배양 환경을 제공할 수 있고 2) 이것이 일부 경우 높은 세포 생존율, 98% 이상의 세포 생존율을 이끌어 낼 수 있기 때문에 우수 의약품 제조기준(Good Manufacturing Practice; GMP) 관점에서 매우 유리하다. 높은 세포 생존율은 세포 관련 오염물, 예컨대, 숙주 세포 단백질의 방출을 감소시킴으로써 생성물 정제를 용이하게 한다. 나아가, 무제한 세포 생장 속도 및/또는 무제한 비생산성으로 세포를 생장시킴은 보다 높은 세포 밀도가 공정에서 보다 빨리 도달될 것이기 때문에 훨씬 더 짧은 시간 내에 보다 많은 생물학적 물질을 생성할 수 있다는 상업적 이점을 가진다.
세포의 "비생산성"은 단위 시간 및 세포 당 생성된 소정의 생물학적 물질의 양이고 통상적으로 pg/(세포·일)로 표시된다.
하나 이상의 세포 배양 배지 성분, 예를 들어, 영양분 및/또는 세포 배양 배지를 세포 배양물에 첨가하는 속도(유입 속도 또는 관주 속도)는 세포의 생존율 및 밀도에 영향을 미친다. 본 발명의 방법에 있어서, 세포 배양 배지 성분, 예컨대, 영양분 및/또는 세포 배양 배지는 예를 들어, 연속 유동, 반-연속 유동, 예를 들어, 단계적 유동 또는 시차제 유동으로 공급될 수 있다. 바람직하게는, 세포 배양 배지 성분, 예를 들어, 영양분 및/또는 세포 배양 배지는 연속 유동으로 첨가된다.
세포 배양 배지 성분, 예컨대, 완전한 세포 배양 배지 및/또는 영양분은 원칙적으로 방법을 수행하는 동안에 임의의 시점에서 반응기로 공급될 수 있다. 바람직하게는, 공급물은 기질, 예컨대, 글루타민 및 글루코스가 세포 생장이 중단되게 할 만큼 낮은 수준에 도달되기 전에 개시되거나, 억제 대사물질, 예컨대, 락테이트 또는 암모니아가 세포 생장을 중단시킬 만큼 높은 수준에 도달하기 전에 개시된다. 뿐만 아니라, 세포 배양 배지 성분, 예컨대, 영양분 및/또는 완전한 세포 배양 배지는 바람직하게는 기질 수요가 충족되는 속도로 반응기에 공급된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 하기 수학식 1의 공급속도로 첨가된다:
Figure pat00001
상기 식에서,
공급속도는 ℓ/일로 표시되고,
SFR은 비공급속도(Specific Feed Rate), 즉 세포 배양 배지가 생존 세포 및 단위 시간 당 첨가된 배지의 부피로 표시되는 세포 배양물에 공급되는 속도이고,
생존 세포 밀도는 단위 시간 및 부피 당 생존 세포의 수이다.
생존 세포의 수는 예를 들어, 트립판 블루 배제 방법을 통해 당업자에 의해 측정될 수 있다. 비공급속도는 바람직하게는 0.01 내지 0.3 nℓ/(세포·일), 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.2 nℓ/(세포·일)이 되도록 선택된다.
공급속도를 조절할 때 추가 파라미터, 예컨대, 배양물로 공급되는 글루코스의 양 및/또는 산소 섭취 속도를 고려하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, PER.C6의 경우 세포 배양 배지 및/또는 영양분의 공급속도는 바람직하게는 글루코스 농도가 3 내지 20 mmol/ℓ, 보다 바람직하게는 5 내지 15 mmol/ℓ로 유지되도록 선택된다. 바람직하게는, 글루코스 농도는 3 mmol/ℓ 이상, 보다 바람직하게는 5 mmol/ℓ 이상 내지 바람직하게는 20 mmol/ℓ 이하, 보다 바람직하게는 15 mmol/ℓ 이하이다.
본 발명의 특별 실시양태에서, (세포, 생물학적 물질 및 세포 배양 배지를 포함하는) 세포 배양물은 반응기로부터 1회 이상 제거되고, 액체, 예컨대, 세포 배양 배지 또는 영양분 공급물은 세포 배양물 제거를 보충하기 위해 반응기에 첨가된다. 세포 배양물 제거는 높은 세포 생존율과 함께 높은 세포 밀도에서 공정 시간을 연장시켜 보다 높은 생산성을 이끌어낼 수 있다. 세포 배양물은 연속적으로 또는 단계적으로 제거될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, (세포, 세포 배양 배지 및 생물학적 물질을 포함하는) 세포 배양물은 원하는 세포 밀도, 예컨대, 10×106 생존 세포/㎖ 이상, 바람직하게는 20×106 생존 세포/㎖ 이상, 보다 바람직하게는 30×106 세포/㎖ 이상 내지 예를 들어, 200×106 생존 세포/㎖ 이하의 세포 밀도가 도달하는 즉시 반응기로부터 제거되고, 액체, 예를 들어, 세포 배양 배지 또는 영양분 공급물은 세포 배양물 제거를 보충하기 위해 반응기로 공급된다. 바람직하게는, 세포 배양물은 세포 밀도가 원하는 세포 밀도 범위에 있게 하는 속도로 제거된다. 본 발명의 이 실시양태는 보편적인 회분식 또는 유가배양식 방법에 비해 매우 유리한데, 이는 상기 실시양태가 더 오래 유지될 수 있는 높은 생존율을 본 발명의 방법의 이점과 조합물시켜 훨씬 더 높은 총 부피 생산성을 현실화시킬 수 있기 때문이다. "부피 생산성"은 반응기 부피 및 단위 시간 당 생성된 생물학적 물질의 양을 의미하고 통상적으로 g·ℓ-1·일-1로 표시된다. 또한, 본 발명의 이 실시양태는 본 발명의 방법의 이점과 높은 농도의 생물학적 물질을 갖는 세포 배양물 제거 스트림을 조합물시키기 때문에 보편적인 관주 방법에 비해 매우 유리하다. 세포 배양물 중의 높은 농도의 생물학적 물질은 세포 배양물로부터 생물학적 물질을 회수할 수 있다는 점에서 상업적으로 관심을 끈다. 세포 배양물이 제거되는 보편적인 관주 방법에서는 세포 배양물 제거 스트림이 상업적인 면에서 생물학적 물질을 회수할 가치가 있게 할 만큼 충분한 생물학적 물질을 함유하지 않으므로, 세포 배양물 제거 스트림은 통상 폐기물로서 간주된다. 따라서, 본 발명의 상기 실시양태에서, 이론적으로 생성된 모든 생물학적 물질이 직접적 및 경제적으로 실행가능한 단순한 방식으로 회수될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 조건은 세포 생장 속도 및/또는 세포의 비생산성이 제한되지 않도록, 보다 바람직하게는 세포 배양 배지의 성분들 중 하나 이상, 예컨대, 글루코스 또는 글루타민의 농도가 일정하도록 선택되고, 세포 배양물은 원하는 세포 밀도가 도달하는 즉시 반응기로부터 1회 이상 제거되고, 액체, 예컨대, 세포 배양 배지는 세포 배양물 제거를 보충하기 위해 반응기에 첨가된다.
바람직하게는, 유출 속도는 하나 이상의 세포 배양 배지 성분, 예컨대, 영양분 및/또는 세포 배양 배지의 첨가 속도로부터 최적 세포 배양 제거 속도를 뺀 값과 실질적으로 동일하도록 선택된다.
생물학적 물질을 생성하는 세포는 예를 들어, 그 생물학적 물질을 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 세포이다. 생물학적 물질을 코딩하는 유전자를 발현할 수 있는 세포는 예를 들어, 생물학적 물질을 코딩하는 유전자 및 적절한 선별 마커를 코딩하는 유전자, 예를 들어, 네오마이신 내성을 코딩하는 유전자(Neo 마커 유전자)를 함유하는 플라스미드로 세포를 형질감염시켜 제조할 수 있다. 그 다음, 안정하게 형질감염된 세포는 선별 압력, 예를 들어, Neo 마커 유전자의 경우 G418(제네리신)의 존재 하에서 형질감염된 세포를 배양하고 생물학적 물질의 높은 발현 수준을 나타내는 세포에 대해 즉각적인 세포 스크리닝을 수행함으로써 선별될 수 있다. 단백질을 발현하는 E1-불멸화 HER 세포의 클론을 제조하는 방법, 및 단백질을 생성하도록 상기 세포를 배양하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 미국특허 제6,855,544호에서 발견될 수 있다.
세포에 의해, 예를 들어, 생물학적 물질을 코딩하는 (재조합물) 유전자의 발현에 의해 생성될 수 있는 생물학적 물질은 예를 들어, (재조합물) 단백질, 특히 수용체, 효소, 융합 단백질, 혈액 단백질 예컨대, 혈액 응고 캐스케이드로부터의 단백질, 다기능성 단백질 예컨대, 에리트로포이에틴, 예를 들어, 백신에서 사용되는 경우 바이러스 또는 박테리아 단백질; 항체와 같은 면역글로불린, 예를 들어, IgG 또는 IgM 등이고, 바람직하게는 단백질, 보다 바람직하게는 항체가 세포에 의해 생성된다. 바람직하게는, 세포에 의해 생성되는 생물학적 물질 예컨대, 단백질 또는 백신은 약학 제제 중의 활성 성분으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 내용에 있어서, 용어 "생성물"과 "생물학적 물질"은 상호교환가능하다.
본 발명의 골격 내에서, 약학 제제는 약제로서, 특히 인간 약제로서 사용될 수 있는 임의의 제제를 의미한다. 이러한 약제는 예를 들어, 진단 또는 예방 목적 예컨대, 백신으로서 사용될 수 있고/있거나 치료 목적 예컨대, 환자에서 결핍된 효소 또는 단백질, 또는 원치않는 세포를 사멸시킬 항체로서 사용될 수 있다. 약학 제제는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 함유할 수 있고, 상기 담체 또는 부형제의 예는 당업자에게 잘 공지되어 있다.
PER.C6 세포주는 생물학적 물질, 예컨대, E1-결실 아데노바이러스(예를 들어, 미국특허 제6,994,128호; 및 문헌(Nichols et al, 2002, Propagation of adenoviral vectors: use of PER.C6 cells. In: Curiel D, Douglas J.T., editors. Adenoviral vectors for gene therapy. San Diego: Elsevier. p 129-167) 참조), 다른 바이러스(예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 01/38362호 참조), 또는 재조합물 단백질(예를 들어, 미국특허 제6,855,544호; 및 문헌(Yallop et al, 2005, PER.C6 cells for the manufacture of biopharmaceutical proteins, Modern Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, 4 Volumes, 779-807, Jorg Knablein (Editor)) 참조)의 제조에 사용될 수 있다.
약학 제제 중의 활성 성분으로서 사용될 수 있는 단백질의 예(상표명이 병기됨)로는 테넥테플라즈(Tenecteplase)(TN Kase™), (재조합물) 항혈우병 인자(ReFacto™), 림프모구 인터페론 α-n1(Wellferon™), (재조합물) 응고 인자(NovoSeven™), 에타네르셉트(Etanercept)(Enbrel™), 트라스투주마브(Trastuzumab)(Herceptin™), 인플릭시마브(Infliximab)(Remicade™), 팔리비주마브(Palivizumab)(Synagis™), 바실릭시마브(Basiliximab)(Simulect™), 댁클리주마브(Daclizumab)(Zenapaz™), 리툭시마브(Rituximab)(Rituxan™), (재조합물) 응고 인자 IX(Benefix™) 및 인터페론 β-1a(Avonex™)를 들 수 있다.
약학 제제 중의 활성 성분으로서 사용될 수 있는 백신의 예로는 단리된 단백질 항원을 들 수 있고, 단리된 단백질 항원의 예로는 경구용 4가 로타바이러스 생백신(RotaShield™), 광견병 백신(RanAvert™), 인플루엔자 백신 및 불활성화 A형 간염 백신(VAQTA™)을 들 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
세포 배양 배지의 pH, 온도, 용존 산소 농도 및 삼투압은 원칙적으로 그다지 중요하지는 않으며 선택된 세포의 종류에 달려 있다. 바람직하게는, 상기 pH, 온도, 용존 산소 농도 및 삼투압은 세포의 생장 및 생산성에 대해 최적이 되도록 선택된다. 당업자는 배양을 위한 최적 pH, 온도, 용존 산소 농도 및 삼투압을 찾는 방법을 인식하고 있다(예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 04/099396호 참조). 바람직하게는, E1-불멸화 HER 세포를 사용하는 경우 본 발명의 방법에서, pH는 6.6 내지 7.6이 되도록 선택되고/되거나, 온도는 30 내지 39℃가 되도록 선택되고/되거나, 삼투압은 260 내지 400 mOsm/kg이 되도록 선택된다. 최적 공정 조건이 유지되도록, 공정 조건을 조절하는 자동화가 요구된다. 공정 조건을 최적화하기 위해, 예를 들어, 증가한 세포 생산성을 위한 생장 정지를 얻기 위해, 배양 과정 동안에 배양 조건을 변화시킬 수 있다. 이것은 예를 들어, 온도 변화(예컨대, 37℃에서 32℃로의 변화), pH 변화 또는 삼투압 변화에 의해 확립될 수 있다.
본 발명의 방법은 원칙적으로 세포 배양에 적합한 임의의 종류의 세포 배양 배지 중에서 수행될 수 있다. 세포 배양 배지 및 세포 배양 조건을 선택하기 위한 지침서는 잘 공지되어 있고 예를 들어, 문헌(Freshney, R.I. Culture of animal cells (a manual of basic techniques), 4th edition 2000, Wiley-Liss and in Doyle, A., Griffiths, J.B., Newell, D.G. Cell & Tissue culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons)의 제8장 및 제9장에 제공되어 있다.
예를 들어, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지 성분으로서 예컨대, 탄수화물 공급원, 염 및/또는 아미노산 및/또는 비타민 및/또는 지질 및/또는 세제 및/또는 완충제 및/또는 성장 인자 및/또는 호르몬 및/또는 사이토카인 및/또는 미량 원소를 포함할 수 있다. 탄수화물 공급원의 예로는 글루코스, 프럭토스, 갈락토스 및 피루베이트를 들 수 있다. 염의 예로는 마그네슘 염, 예를 들어, MgCl2·6H2O, MgSO4 및 MgSO4·7H2O; 철 염, 예컨대, FeSO4·7H2O; 칼륨 염, 예를 들어, KH2PO4 및 KCl; 나트륨 염, 예를 들어, NaH2PO4 및 Na2HPO4; 및 칼슘 염, 예를 들어, CaCl2·2H2O를 들 수 있다. 아미노산의 예로는 단백질을 구성하는 모든 공지된 아미노산, 예를 들어, 히스티딘, 글루타민, 트레오닌, 세린, 메티오닌을 들 수 있다. 비타민의 예로는 아스코르베이트, 바이오틴, 콜린·Cl, 미요-이노시톨, D-판토테네이트, 리보플라빈을 들 수 있다. 지질의 예로는 지방산, 예컨대, 리놀레산 및 올레산을 들 수 있고, 세제의 예로는 트윈(Tween?) 80 및 플루로닉(Pluronic?) F68을 들 수 있다. 완충제의 예로는 HEPES 및 Na2CO3을 들 수 있다. 성장 인자/호르몬/사이토카인의 예로는 IGF(인슐린-유사 성장 인자), 하이드로코티존(hydrocortisone) 및 (재조합물) 인슐린을 들 수 있다. 미량 원소의 예는 당업자에게 공지되어 있고 Zn, Mg 및 Se를 포함한다. 세포 배양 배지는 예를 들어, 다른 세포 배양 배지 성분, 예컨대, 대두 펩톤 또는 에탄올 아민 또한 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 생물학적 물질을 제조하는 경우, 특히 생물학적 물질이 약학 제제 중의 활성 성분으로서 사용되어야 하는 경우, 혈청 무함유 배지가 혈청 공급원을 함유하는 배지보다 바람직하다. 이는 혈청 공급원 함유 배지가 바이러스로 오염되어 있을 수 있고, 프리온 감염의 위험이 존재하며, 생물약제의 하류 처리공정(즉, 세포 배양물로부터 생물학적 물질의 추가 정제)에 있어서 주된 문제가 될 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 방법은 바람직하게는 인간을 비롯한 동물 공급원으로부터 유래된 혈청을 포함하지 않는 세포 배양 배지 중에서 수행된다. 포유동물 공급원으로부터 유래된 화합물은 감염 위험도 존재하기 때문에, 세포 배양 배지는 바람직하게는 포유동물 공급원을 함유하지 않는다(즉, 세포 배양 배지는 포유동물 공급원으로부터 유래된 혈청 또는 성분을 포함하지 않는다). 보다 바람직하게는, 세포 배양 배지는 동물 공급원을 함유하지 않는다(즉, 세포 배양 배지는 인간을 비롯한 동물 공급원으로부터 유래된 혈청 또는 성분을 포함하지 않는다). PER.C6 세포의 배양에 사용될 수 있는 혈청 무함유 배지의 예로는 시판되는 배지, 예컨대, EX Cell™ VPRO 배지(SAFC), HyQ? CDM4Retino™(하이클론), IS ProVec CD(이어빈 사이언티픽), 293-SFM II(인비트로겐)를 들 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 생성된 생물학적 물질은 내용물이 반응기 내에 유지되거나 바람직하게는 반응기로 다시 공급되는 유동, 또는 반응기로부터 제거되는 세포 배양물, 또는 상기 유동 및 세포 배양물 둘다로부터 회수된다. 본 발명의 방법에서 생성된 생물학적 물질은 그 자체가 당업자에게 잘 공지되어 있는 방법 중에서 생물학적 물질에 따라 선택된 방법을 이용하여 소위 하류 처리공정에서 세포 배양물로부터 추가로 회수할 수 있다. 하류 처리공정은 통상적으로 다양한 조합물 및 순서로 여러 정제 단계를 포함한다. 하류 처리공정에서 정제 단계의 예는 (예를 들어, 친화 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 수성 2상 시스템에 의한 추출, 및/또는 예컨대, 황산암모늄에 의한 침전에 의한) 분리 단계, (예를 들어, 한외여과 또는 정용여과에 의한) 생물학적 물질의 농축 단계, 완충제 교환 단계, 및/또는 (예를 들어, 바이러스 여과, pH 변화 또는 용매 세제 처리에 의한) 바이러스 제거 또는 불활성화 단계이다.
한 측면에서, 본 발명은 50x106 세포/㎖ 이상, 바람직하게는 60x106 세포/㎖ 이상, 특히 90x106 세포/㎖ 이상의 생존 세포 밀도로 포유동물 세포, 바람직하게는 E1-불멸화 HER 세포, 보다 바람직하게는 PER.C6 세포를 포함하고 5 g/ℓ 이상, 보다 바람직하게는 10 g/ℓ 이상, 특히 11 g/ℓ 이상의 농도로 생물학적 물질을 포함하는 세포 배양물에 관한 것이다. 원칙적으로, 생물학적 물질의 농도는 생물학적 물질의 가용성이 허용하는 만큼 높을 수 있다. 생존 세포의 농도는 전형적으로 200x106 세포/㎖ 이하, 바람직하게는 80x106 내지 150x106 세포/㎖의 범위 내에 있다.
예를 들어, 생존 세포 밀도는 예컨대, 이노바티스(Innovatis)로부터 시판되는 세포 계수기(세덱스 세포 계수기)를 사용함으로써 트립판 블루 배제 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
세포 배양물은 세포 배양 배지, 세포 및 생물학적 물질을 포함하는 액체를 의미하고, 상기 액체는 세포 배양 배지 중의 세포를 반응기에서 배양하는 방법의 결과물이고, 이때 상기 세포는 생물학적 물질을 생성한다.
이하, 본 발명은 하기 실시예에 의해 설명될 것이나 이 실시예로 한정되지 않는다.
[실시예]
실시예 1: 회분식 방법, 유가배양식 방법 및 본 발명에 따른 방법의 비교
본 실시예에서, 본 발명에 따른 방법의 성능을 회분식 방법 및 유가배양식 방법과 비교하였다.
도 1은 방법 A(회분식), B(유가배양식) 및 C1(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 생존 세포 밀도 Y(106 ㎖-1)를 보여준다.
도 2는 방법 A(회분식), B(유가배양식) 및 C1(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 반응기 내의 IgG 농도 Z(방법 A에서의 IgG 농도에 비교할 때 %)를 보여준다.
모든 발효는 온도를 36.5℃로 조절하고, pH를 6.8 내지 7.2로 조절하며 용존 산소 농도를 50% 대기 포화 및 200 rpm으로 조절하는 사르토리우스 바이오스타트(Sartorius Biostat) B 조절기를 이용하여 수행하였다. 동일한 IgG를 생성하는 PER.C6 세포주(국제특허출원 공개 제WO 04/099396호 참조)를 모든 실험에서 사용하였다.
회분식 방법 A
회분식 방법을 사르토리우스 B5 용기 내에서 4 ℓ 작동 부피로 수행하였다. 세포를 6 mM L-글루타민으로 보충된 VPRO 배지(SAFC) 중에 3x105 세포/㎖ 밀도로 접종한 후 17일 동안 배양하였다.
유가배양식 방법 B
유가배양식 방법을 사르토리우스 B5 용기 내에서 4 ℓ 작동 부피로 수행하였다. 세포를 6 mM L-글루타민으로 보충된 VPRO 배지(SAFC) 중에 3x105 세포/㎖ 밀도로 접종하였다. 배양하는 동안에 글루코스 및 글루타민을 각각 15 mM 및 1 mM 이상의 농도가 유지되도록 첨가하였다. 아미노산 및 펩티드를 5일째 날부터 첨가하여 소모된 아미노산을 보충하였다.
본 발명의 방법 C1
본 발명의 방법은 2 ℓ 애플리콘 용기 내에서 수행하였다. ATF-2 시스템(리파인 테크놀로지)이 장착된 ATF 유동 모드로 작동되는 100 kDa MWCO 중공 필터 막(GE로부터 입수됨)을 사용하여 세포 및 IgG 생성물을 보유하였다. 6 mM L-글루타민으로 보충된 VPRO 배양 배지(SAFC) 중에서 3x105 세포/㎖ 밀도로 배양을 개시하였다. 6 mM L-글루타민으로 보충된 VPRO 배양 배지(SAFC)를, 0.05 내지 0.2 nℓ/(세포·일)의 SFR을 이용하는 현탁 세포 배양을 통해 관주하였다. 수득된 최대 생성물 농도는 1.4 g/ℓ이었다.
도 1 및 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법은 상기 배양 모드에 비해 생존 세포 밀도 및 생성물 농도를 보다 짧은 시간 내에 증가시켰다.
실시예 2: 회분식 방법, 유가배양식 방법 및 본 발명에 따른 방법의 비교
본 실시예에서 본 발명의 방법을 회분식 방법 및 유가배양식 방법과 다시 비교하였는데, 방법 C2에서 CO2 압력을 조절하고 50 kDa 분리 시스템을 사용하였다.
도 3은 방법 A(회분식), B(유가배양식) 및 C2(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 생존 세포 밀도 Y(106 ㎖-1)를 보여준다.
도 4는 방법 A(회분식), B(유가배양식) 및 C2(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 반응기 내의 IgG 농도 Z(방법 A에서의 IgG 농도에 비교할 때 %)를 보여준다.
모든 발효는 온도를 36.5℃로 조절하고, pH를 6.8 내지 7.2로 조절하며 용존 산소 농도를 50% 대기 포화 및 200 rpm으로 조절하는 사르토리우스 바이오스타트 B 조절기를 이용하여 수행하였다. 동일한 IgG(약 150 kDa)를 생성하는 PER.C6 세포주(국제특허출원 공개 제WO 04/099396호 참조)를 모든 실험에서 사용하였다.
회분식 방법 A
회분식 방법을 사르토리우스 B5 용기 내에서 4 ℓ 작동 부피로 수행하였다. 세포를 6 mM L-글루타민으로 보충된 VPRO 배지(SAFC) 중에 3x105 세포/㎖ 밀도로 접종한 후 17일 동안 배양하였다.
유가배양식 방법 B
유가배양식 방법을 사르토리우스 B5 용기 내에서 4 ℓ 작동 부피로 수행하였다. 세포를 6 mM L-글루타민으로 보충된 VPRO 배지(SAFC) 중에 3x105 세포/㎖ 밀도로 접종하였다. 배양하는 동안에 글루코스 및 글루타민을 각각 15 mM 및 1 mM 이상의 농도가 유지되도록 첨가하였다. 아미노산 및 펩티드를 5일째 날부터 첨가하여 소모된 아미노산을 보충하였다.
본 발명의 방법 C2
본 발명의 방법은 2 ℓ 애플리콘 용기 내에서 수행하였다. ATF-2 시스템(리파인 테크놀로지)이 장착된 ATF 유동 모드로 작동되는 50 kDa MWCO 중공 필터 막(GE)을 사용하여 세포 및 IgG 생성물을 보유하였다. 6 mM L-글루타민으로 보충된 VPRO 배양 배지(SAFC) 중에서 3x105 세포/㎖ 밀도로 배양을 개시하였다. 6 mM L-글루타민으로 보충된 VPRO 배양 배지(SAFC)를, 0.05 내지 0.2 nℓ/(세포·일)의 SFR을 이용하는 현탁 세포 배양을 통해 관주하였다. CO2 압력을 15% 미만으로 조절하였다.
도 3 및 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 동일하거나 보다 짧은 시간 내에(회분식 방법의 시간에 비해 100%; 유가배양식 방법의 시간에 비해 81%) 생존 세포 밀도 및 생성물 밀도를 유의하게 증가시켰다(회분식 방법의 수율에 비해 2415%; 유가배양식 방법의 수율에 비해 690%).
본 발명의 방법의 총 생산성 증가(g·ℓ-1·일-1로 표시됨)는 회분식 생산성(g·ℓ-1·일-1로 표시됨)의 23.9배이고 유가배양식 생산성(g·ℓ-1·일-1로 표시됨)의 8.5배이다. 본 발명의 방법 C2에서, 11.1 g 생성물/ℓ이 생성되었다. 보유 장치의 응괴는 17일 동안 일어나지 않았으며 매우 높은 세포 밀도에서 조차도 일어나지 않았다.
실시예 3: 회분식 방법, 유가배양식 방법 및 본 발명에 따른 방법의 비교
본 실시예에서, 세포 배양물 제거 단계를 갖는 본 발명에 따른 방법의 성능을 회분식 방법 및 유가배양식 방법과 다시 비교하였는데, 방법 C3에서 세포 배양물이 제거되었다.
도 5는 방법 A(회분식), B(유가배양식) 및 C3(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 생존 세포 밀도 Y(106 ㎖-1)를 보여준다.
도 6은 방법 A 및 C3에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 반응기 내의 IgG 농도 Z(방법 A3에서의 IgG 농도에 비교할 때 %)를 보여준다.
도 7은 방법 A(회분식), B(유가배양식) 및 C3(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 축적 수율 Q(방법 A에서의 반응기의 수율과 비교할 때 반응기 부피(ℓ) 당 %)를 보여준다.
모든 발효는 온도를 36.5℃로 조절하고, pH를 6.8 내지 7.2로 조절하며 용존 산소 농도를 50% 대기 포화 및 200 rpm으로 조절하는 사르토리우스 바이오스타트 B 조절기를 이용하여 수행하였다. 동일한 IgG(약 150 kDa)를 생성하는 PER.C6 세포주(국제특허출원 공개 제WO 04/099396호 참조)를 모든 실험에서 사용하였다.
회분식 방법 A
회분식 방법을 사르토리우스 B5 용기 내에서 4 ℓ 작동 부피로 수행하였다. 세포를 6 mM L-글루타민으로 보충된 VPRO 배지(SAFC) 중에 3x105 세포/㎖ 밀도로 접종한 후 17일 동안 배양하였다.
유가배양식 방법 B
유가배양식 방법을 사르토리우스 B5 용기 내에서 4 ℓ 작동 부피로 수행하였다. 세포를 6 mM L-글루타민으로 보충된 VPRO 배지(SAFC) 중에 3x105 세포/㎖ 밀도로 접종하였다. 배양하는 동안에 글루코스 및 글루타민을 각각 15 mM 및 1 mM 이상의 농도가 유지되도록 첨가하였다. 아미노산 및 펩티드를 5일째 날부터 첨가하여 소모된 아미노산을 보충하였다.
본 발명의 방법 C3
본 발명의 방법은 2 ℓ 애플리콘 용기 내에서 수행하였다. ATF-2 시스템(리파인 테크놀로지)이 장착된 ATF 유동 모드로 작동되는 100 kDa MWCO 중공 필터 막(GE)을 사용하여 세포 및 IgG 생성물을 보유하였다. 6 mM L-글루타민으로 보충된 VPRO 배양 배지(SAFC) 중에서 3x105 세포/㎖ 밀도로 배양을 개시하였다. 6 mM L-글루타민으로 보충된 VPRO 배양 배지(SAFC)를, 0.05 내지 0.2 nℓ/(세포·일)의 SFR을 이용하는 현탁 세포 배양을 통해 관주하였다. 세포 배양물은 10x106 세포/㎖ 밀도 이상에서 1일 당 상기 작동 부피의 10% 만큼 제거되었고, 생존 세포 밀도가 30x106 세포/㎖를 초과하는 경우 1일 당 상기 작동 부피의 30% 만큼 제거되었다.
결과
도 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법에서 보다 높은 생존 세포 밀도가 신속히 도달된다. 나아가, 도 5는 방법 C3이 거의 40일의 기간에 걸쳐 작동 상태로 유지되었기 때문에 세포의 생존율이 본 발명의 방법에서 더 길게 유지될 수 있음을 보여주는데, 이는 보유 장치의 응괴가 높은 세포 밀도에서조차도 일어나지 않았기 때문이다.
도 6은 본 발명의 방법의 생성물 농도가 회분식 방법의 생성물 농도보다 훨씬 더 높음을 보여준다. 생성물을 함유하는 생성물 유동물은 회분식 방법 A에서의 최종 농도의 약 200% 내지 300% 배만큼 방법 C3으로부터 회수되었다.
도 7은 대부분의 생성물이 본 발명의 방법에 의해 형성되고 본 발명의 방법이 회분식 방법 A 또는 유가배양식 방법 B보다 더 오래 유지될 수 있음을 보여준다. 17일째 날, 방법 C3의 축적 수율은 회분식 방법 A3의 축적 수율의 8.1배이고 유가배양식 방법 B의 축적 수율의 2.1배이다. 또한, 17일째 날, 회분식 방법이 종결되었다. 21일째 날, 방법 C3의 축적 수율은 유가배양식 방법 B의 축적 수율의 3.0배이다. 21일째 날, 유가배양식 방법이 종결되었다. 39일째 날, 방법 C3의 총 축적 수율은 회분식 방법 A의 축적 수율의 25배이고 유가배양식 방법 B의 수율의 6배이다.
본 실험으로부터 본 발명의 방법에서 원하는 생물학적 물질의 총 수율이 세포 밀도가 높은 일정 수준을 초과하는 경우 세포 배양물의 제거 단계를 적용함으로써 더 개선될 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 4: CHO 세포를 사용한 배양 및 생산
본 실시예에서, 본 발명의 방법은 IgG를 생성하는 CHO 세포주를 사용하여 수행하였고 세포 생장을 감소시키기 위한 온도 하강 단계를 포함한다.
도 8은 C4(본 발명의 방법)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 세포 수 Y(106 ㎖-1)를 보여준다.
도 9는 방법 C4(본 발명의 방법의 한 실시양태)에 대한 공정 시간 X(일)에 대해 작도된 반응기 내의 IgG 농도 Z(도달된 최대 IgG 농도에 비교할 때 %)를 보여준다.
모든 발효는 온도를 36.5℃로 조절하고, pH를 6.9 내지 7.1로 조절하며 용존 산소 농도를 40% 대기 포화 및 100 rpm으로 조절하는 사르토리우스 바이오스타트 B 조절기를 이용하여 수행하였다. 온도는 5일째 날에 32℃까지 하강하였다.
본 발명의 방법 C4
본 발명의 방법은 2 ℓ 애플리콘 용기 내에서 수행하였다. ATF-2 시스템(리파인 테크놀로지)이 장착된 ATF 유동 모드로 작동되는 50 kDa MWCO 중공 필터 막(GE)을 사용하여 세포 및 IgG 생성물을 보유하였다. MTCM-49 배양 배지(하이클론) 중에서 5x105 세포/㎖ 밀도로 배양을 개시하였다. 상기 배지를, 0.1 내지 0.4 nℓ/(세포·일)의 SFR을 이용하는 현탁 세포 배양을 통해 관주하였다. CO2 압력을 15% 미만으로 조절하였다.
결과
데이타는 본 발명의 방법이 단백질 생성 CHO 세포주를 사용하는 경우에도 작동됨을 보여준다. 달성된 세포 밀도 및 생성물 농도는 회분식 배양에 비해 증가하였다. 또한, 데이타는 본 발명의 방법에서 세포 생장이 (예를 들어, 온도 하강에 의해) 정지될 수 있는 반면, 배양 시스템 중의 생성물 축적은 계속됨을 보여준다.
실시예 5: 골수종 세포주를 사용하여 수행한 본 발명의 방법
본 발명에 따른 방법은 골수종 세포주에도 적용될 수 있다. 이를 위해, 온도를 36.5℃로 조절하고, pH를 6.8 내지 7.2로 조절하며 용존 산소 농도를 40% 대기 포화 및 100 rpm으로 조절하는 사르토리우스 바이오스타트 B 조절기를 이용하여 발효를 수행하였다. 5 ℓ 사르토리우스 용기 내의 SFM4Mab 배양 배지(하이클론) 중에서 3x105 세포/㎖ 밀도로 골수종 세포를 접종함으로써 세포 배양을 개시하였다. 세포 및 생성물 보유 장치는 ATF-4 시스템(리파인 테크놀로지)이 장착된 ATF 유동 모드로 작동되는 30 kDa MWCO 중공 필터 막(GE)이다. SFM4Mab 배양 배지(하이클론)를, 0.1 내지 0.4 nℓ/(세포·일)의 SFR을 이용하는 현탁 세포 배양을 통해 관주하였다. CO2 압력을 15% 미만으로 조절하였다.
실시예 6: MDCK 세포주를 사용하여 수행한 본 발명의 방법
본 발명에 따른 방법은 형질전환된 MDCK 세포주에도 적용될 수 있다. 이를 위해, 온도를 36.5℃로 조절하고, pH를 6.8 내지 7.2로 조절하며 용존 산소 농도를 40% 대기 포화 및 100 rpm으로 조절하는 사르토리우스 바이오스타트 B 조절기를 이용하여 발효를 수행하였다. 5 ℓ 사르토리우스 용기 내의 VP-SFM 배양 배지(인비트로겐) 중에서 3x105 세포/㎖ 밀도로 형질전환된 MDCK 세포를 접종함으로써 세포 배양을 개시하였다. 세포 및 생성물 보유 장치는 ATF-4 시스템(리파인 테크놀로지)이 장착된 ATF 유동 모드로 작동되는 30 kDa MWCO 중공 필터 막(GE)이다. VP-SFM 배양 배지(인비트로겐)를, 0.1 내지 0.4 nℓ/(세포·일)의 SFR을 이용하는 현탁 세포 배양을 통해 관주하였다. CO2 압력을 15% 미만으로 조절하였다.

Claims (29)

  1. (a) 세포 배양 배지;
    (b) 세포 배양 배지 중 50x106 현탁 세포/㎖ 이상의 생존 세포 밀도를 갖는 동물 세포; 및
    (c) 세포 배양 배지 중 5 g/L 이상의 농도를 갖는 생물학적 물질
    을 포함하는 세포 배양물.
  2. 제1항에 있어서,
    세포 배양물이 반응기로부터의 세포 배양 제거 스트림인, 세포 배양물.
  3. 제1항에 있어서,
    동물 세포가 세포 배양 배지 중 80x106 현탁 세포/㎖ 이상의 생존 세포 밀도를 갖는, 세포 배양물.
  4. 제1항에 있어서,
    동물 세포가 세포 배양 배지 중 150x106 현탁 세포/㎖ 이상의 생존 세포 밀도를 갖는, 세포 배양물.
  5. 제1항에 있어서,
    생물학적 물질의 농도가 10 g/L 이상인, 세포 배양물.
  6. 제1항에 있어서,
    동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 골수종 세포, 인간 배아 망막(HER) 세포, 마우스 세포 및 PER.C6 세포로 이루어진 군에서 선택되는, 세포 배양물.
  7. 제1항에 있어서,
    생물학적 물질이 단백질인, 세포 배양물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 단백질이 재조합물 단백질인, 세포 배양물.
  9. 제1항에 있어서,
    2리터 이상의 세포 배양 배지를 포함하는, 세포 배양물.
  10. 제9항에 있어서,
    동물 세포가 세포 배양 배지 중 80x106 현탁 세포/㎖ 이상의 생존 세포 밀도를 갖는, 세포 배양물.
  11. 제9항에 있어서,
    동물 세포가 세포 배양 배지 중 150x106 현탁 세포/㎖ 이상의 생존 세포 밀도를 갖는, 세포 배양물.
  12. 제9항에 있어서,
    생물학적 물질의 농도가 10 g/L 이상인, 세포 배양물.
  13. 제9항에 있어서,
    동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 골수종 세포, 인간 배아 망막(HER) 세포, 마우스 세포 및 PER.C6 세포로 이루어진 군에서 선택되는, 세포 배양물.
  14. 제9항에 있어서,
    생물학적 물질이 단백질인, 세포 배양물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 단백질이 재조합물 단백질인, 세포 배양물.
  16. (a) (i) 세포 배양 배지; (ii) 세포 배양 배지 중 50x106 현탁 세포/㎖ 이상의 생존 세포 밀도를 갖는 동물 세포; 및 (iii) 세포 배양 배지 중 5 g/L 이상의 농도를 갖는 생물학적 물질을 포함하는 세포 배양물; 및
    (b) 반응기
    를 포함하는 조합물으로서, 세포 배양물이 반응기 내에 있는, 조합물.
  17. 제16항에 있어서,
    동물 세포가 세포 배양 배지 중 80x106 현탁 세포/㎖ 이상의 생존 세포 밀도를 갖는, 조합물.
  18. 제16항에 있어서,
    동물 세포가 세포 배양 배지 중 150x106 현탁 세포/㎖ 이상의 생존 세포 밀도를 갖는, 조합물.
  19. 제16항에 있어서,
    생물학적 물질의 농도가 10 g/L 이상인, 조합물.
  20. 제16항에 있어서,
    동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 골수종 세포, 인간 배아 망막(HER) 세포, 마우스 세포 및 PER.C6 세포로 이루어진 군에서 선택되는, 조합물.
  21. 제16항에 있어서,
    생물학적 물질이 단백질인, 조합물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 단백질이 재조합물 단백질인, 조합물.
  23. 제16항에 있어서,
    세포 배양물이 2리터 이상의 세포 배양 배지를 포함하는, 조합물.
  24. 제23항에 있어서,
    동물 세포가 세포 배양 배지 중 80x106 현탁 세포/㎖ 이상의 생존 세포 밀도를 갖는, 조합물.
  25. 제23항에 있어서,
    동물 세포가 세포 배양 배지 중 150x106 현탁 세포/㎖ 이상의 생존 세포 밀도를 갖는, 조합물.
  26. 제23항에 있어서,
    생물학적 물질의 농도가 10 g/L 이상인, 조합물.
  27. 제23항에 있어서,
    동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 골수종 세포, 인간 배아 망막(HER) 세포, 마우스 세포 및 PER.C6 세포로 이루어진 군에서 선택되는, 조합물.
  28. 제23항에 있어서,
    생물학적 물질이 단백질인, 조합물.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 단백질이 재조합물 단백질인, 조합물.
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