ES2709994T3

ES2709994T3 - Métodos de recolección en cultivos de células de mamífero

Info

Publication number: ES2709994T3
Application number: ES15730015T
Authority: ES
Inventors: Chetan Goudar; Sean Cole; Nicole Sabo; Henry Lin; Jonathan Lull; Tharmala Tharmalingam
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2014-06-04
Filing date: 2015-06-04
Publication date: 2019-04-22
Anticipated expiration: 2035-06-04
Also published as: KR102391259B1; EA202192126A3; IL249150A0; WO2015188009A9; AU2019203538A1; DK3152317T3; EP3926051B1; KR20170015464A; PL3152317T3; US20170114381A1; EP4372078A2; US11384378B2; SG11201610143VA; BR112016028285B1; JP7097404B2; EA039148B1; CN106687575A; JP6695814B2; CA2951046A1; US20220136025A1

Abstract

Un método para la recolección de una proteína recombinante que comprende: i. el establecimiento de un cultivo celular inoculando un biorreactor con células de mamífero que expresan una proteína recombinante, ii. el mantenimiento del cultivo celular perfundiendo el cultivo celular con medio de cultivo celular fresco formulado o suplementado para que alcance una concentración de al menos 5 g/l de un copolímero en bloque no iónico, iii. el pasaje del cultivo celular a través de un filtro de fibras huecas que tiene un tamaño de poro o corte de peso molecular que no retenga la proteína recombinante en el biorreactor, y iv. la recolección de un permeado que contiene la proteína recombinante.

Description

DESCRIPCION

Metodos de recoleccion en cultivos de celulas de mamftero

Campo de la invencion

La invencion proporciona un metodo y materiales para el cultivo de celulas de mairnfero y la recoleccion de protemas recombinantes.

Antecedentes de la invencion

Como la demanda de grandes cantidades de protemas recombinante terapeuticas continua creciendo, se ha puesto mucho empeno en la optimizacion del procedimiento, particularmente en metodos y estrategias para el cultivo, alimentacion y mantenimiento de la produccion de cultivos celulares que tienen un impacto positivo en la viabilidad celular y la recuperacion de protemas. El desarrollo de los procedimientos de fabricacion de protemas recombinantes es un empeno complejo en el que se tienen que equilibrar muchas variables. Esto es particularmente cierto para los procedimientos corriente arriba, en los que cada elemento del procedimiento de cultivo celular tiene un gran impacto sobre los ultimos estadios de la produccion, particularmente la recoleccion y el procesamiento corriente abajo.

Un cultivo celular tfpico experimenta una fase de crecimiento, este es un periodo de crecimiento exponencial en el que la densidad celular aumenta. La fase de crecimiento continua con una fase de transicion en el que el crecimiento celular exponencial se enlentece y la produccion de protema comienza a aumentar. Esto marca el inicio de la fase estacionaria, una fase de produccion, en la que la densidad celular normalmente baja de nivel y el tftulo de producto aumenta. En los sistemas de recoleccion por lotes, en los que el cultivo celular se mantiene durante un numero fijo de dfas seguido por la recoleccion de todo el cultivo a la vez, la mayona del producto se puede producir en los ultimos pocos dfas antes de la recoleccion cuando el cultivo celular normalmente ha alcanzado su mayor rendimiento. Si bien esto puede resultar en una unica recoleccion con un tftulo alto, es a expensas de un tiempo de respuesta no productivo para iniciar la siguiente ejecucion y el tiempo de demora para alcanzar nuevamente la produccion maxima.. En los sistemas de recoleccion continua, en los que el permeado que contiene el producto se recolecta del cultivo celular en una base continua a lo largo de la fase de produccion, la duracion del cultivo celular se extiende, pero a expensas de tftulos de producto menores y mayores volumenes de residuos del fluido de cultivo celular con los que hay que lidiar durante los estadios de recoleccion y purificacion.

El desarrollo del procedimiento de cultivo celular y recoleccion es en ultimo termino un ejercicio en proceso de optimizacion, tratando variables tales como la velocidad de procesamiento para el tftulo de producto y la calidad del producto. Los desaffos incluyen, por ejemplo, el mantenimiento de la viabilidad celular, la consecucion de un tftulo de producto con el que se pueda trabajar, y equilibrar el rendimiento del procesamiento corriente arriba con el que pueda manejarse la recoleccion y los procesamientos corriente abajo.

Son valiosos los nuevos metodos de procesamiento que proporcionan incluso mejoras crecientes en la produccion y recuperacion de protemas recombinantes, dado el coste de los procedimientos de cultivo celular a gran escala y la creciente demanda de mayores cantidades y menores costes de productos biologicos. Se necesitan mejoras en los procedimientos de cultivo celular que puedan dar lugar a una mayor recuperacion de producto, reduciendo por esto los costes asociados con la fabricacion de protemas terapeuticas. La invencion cumple con estas necesidades proporcionando dichos metodos y materiales para extender la duracion del cultivo celular mientras se aumenta la recuperacion de protemas.

Sumario de la invencion

La invencion proporciona un metodo para extender una recoleccion periodica que comprende el establecimiento de un cultivo celular inoculando un biorreactor con celulas de mamftero que expresan una protema recombinante, manteniendo el cultivo celular perfundiendo medio de cultivo celular fresco en el biorreactor, pasando el cultivo celular a traves de un filtro y recolectando un permeado, en el que se recolecta inicialmente un permeado nulo hasta que se alcanza un primer parametro predeterminado, a cuyo momento se recolecta una cosecha durante un tiempo predeterminado, seguido por una recoleccion alteradamente de un permeado nulo hasta que se alcanza un segundo parametro predeterminado, recolectando entonces un permeado de cosecha durante un tiempo predeterminado, en el que la recoleccion alternante de permeado nulo y permeado de cosecha continua hasta que se termina el cultivo celular.

En una realizacion el parametro predeterminado se selecciona de entre el tiempo, la densidad celular viable, volumen celular empaquetado o tftulo.

En una realizacion, el primer parametro predeterminado es al menos de 12 horas a 25 dfas despues del establecimiento del cultivo celular. En una realizacion, el primer parametro predeterminado es al menos de 24 a 72 horas despues del establecimiento del cultivo celular. En una realizacion, el primer parametro predeterminado es al menos de 4 dfas despues del establecimiento del cultivo celular. En una realizacion, el primer parametro predeterminado es al menos de 5 o mas dfas despues del establecimiento del cultivo celular. En una realizacion, el primer parametro predeterminado es al menos de 25 dfas despues del establecimiento del cultivo celular. En una realizacion, el primer parametro predeterminado es al menos de 5 a 25 dfas despues del establecimiento del cultivo celular. En una realizacion, el primer parametro predeterminado es al menos de 10 a 12 dfas despues del establecimiento del cultivo celular.

En una realizacion, el segundo parametro predeterminado es al menos de 12 a 72 horas despues de la recoleccion del permeado de cosecha. En una realizacion, el segundo parametro predeterminado es al menos de 24 a 72 horas despues del permeado de cosecha. En una realizacion, el segundo parametro predeterminado es al menos de 24 a 48 horas despues de la recoleccion del permeado de cosecha.

En una realizacion el tiempo predeterminado es al menos de 12 a 72 horas. En una realizacion, el tiempo predeterminado es al menos de 24 a 72 horas. En una realizacion, el tiempo predeterminado es al menos de 24 a 48 horas.

En una realizacion, el permeado nulo se recolecta inicialmente durante al menos 24 horas a 25 dfas, en cuyo tiempo se recolecta el permeado de cosecha durante 12 a 72 horas, seguido por la recoleccion de manera alterna de un permeado nulo durante al menos 24 horas a 25 dfas, recolectando entonces un permeado de cosecha durante 12 a 72 horas.

En una realizacion, cuando se recolecta el permeado nulo, el filtro es un filtro de fibras huecas que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular (Molecular Weight Cut Off, MWCO) que retiene la protema recombinante en el biorreactor. En una realizacion relacionada el corte de peso molecular es de 300 kDa o menos. En una realizacion relacionada el filtro de fibra hueca es un ultrafiltro.

En una realizacion en la que el permeado de cosecha se recolecta, el filtro es un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular (MWCO) que no retiene la protema recombinante en el biorreactor. En una realizacion relacionada el corte de peso molecular es al menos de 500 kDa. En una realizacion relacionada el filtro de fibra hueca es un microfiltro.

En una realizacion, el filtro es un sistema de filtro de una sola unidad. En una realizacion relacionada en la que el sistema de filtro de una sola unidad comprende al menos un componente de filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular (MWCO) que retiene la protema recombinante en el biorreactor y al menos un componente de filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular (MWCO) que no retiene la protema recombinante en el biorreactor. En una realizacion relacionada el corte de peso molecular de al menos un componente de filtro de fibra hueca que retiene la protema recombinante en el biorreactor es de 300 kDa o menos. En una realizacion relacionada el corte de peso molecular de al menos un componente de filtro de fibra hueca que no retiene la protema recombinante en el biorreactor es al menos de 500 kDa. En una realizacion relacionada al menos un componente de filtro de fibra hueca que retiene la protema recombinante en el biorreactor es un ultrafiltro y al menos un componente de filtro de fibra hueca que no retiene la protema recombinante en el biorreactor es un microfiltro. En una realizacion relacionada, el sistema de filtro de una sola unidad esta contenido en una carcasa. En una realizacion relacionada el sistema de filtro de una sola unidad comprende adicionalmente un espaciador entre al menos dos componentes del filtro de fibras huecas.

En una realizacion cuando se recolecta el permeado nulo se extrae desde al menos un componente de filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular (MWCO) que retiene la protema recombinante en el biorreactor.

En una realizacion cuando el permeado de cosecha se recolecta, se extrae desde al menos un componente de filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular (MWCO)que no retiene la protema recombinante en el biorreactor.

En una realizacion cuando el permeado se recolecta de un filtro que es un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor, el medio de cultivo celular reciente se formula con o se suplementa para conseguir al menos 5 g/l de un copolfmero en bloque no ionico. En una realizacion relacionada el copolfmero en bloque no ionico es un copolfmero en bloque de polioxipropilenopolioxietileno. En una realizacion relacionada el copolfmero en bloque no ionico es poloxamer 188.

En una realizacion el metodo anterior comprende adicionalmente la toma de muestras durante el procedimiento de cultivo celular, evaluando las muestras para controlar cuantitativa y/o cualitativamente las caractensticas de la protema recombinante y/o el procedimiento de cultivo celular. En una realizacion relacionada las muestras se controlan cuantitativa y/o cualitativamente utilizando tecnicas de procesamiento analttico.

En una realizacion la perfusion es una perfusion continua. En una realizacion la velocidad de perfusion es constante. En una realizacion la perfusion se lleva a cabo a una velocidad de menos de o igual a 1,0 volumenes de trabajo por dfa. En una realizacion la perfusion se consigue mediante una bomba peristaltica, una bomba de doble diafragma, una bomba de bajo cizallamiento o de flujo tangencial alternante. En una realizacion relacionada la perfusion se consigue por flujo tangencial alternante.

En una realizacion el metodo anterior comprende adicionalmente someter el cultivo celular a un cambio de temperatura en el que las celulas se cultivan a) a una primera temperatura durante un primer periodo de tiempo y b) a una segunda temperatura durante un segundo periodo de tiempo. En una realizacion relacionada el cambio de temperatura se produce en la transicion entre la fase de crecimiento y la fase de produccion. En una realizacion relacionada el cambio de temperatura se produce durante la fase de produccion. En una realizacion relacionada el cambio de temperatura es en respuesta a un parametro predeterminado. En una realizacion relacionada el cambio de temperatura es en repuesta a un parametro predeterminado en el que la consecucion del parametro predeterminado se determina utilizando una sonda de biomasas basada en la capacitancia.

En una realizacion el cultivo celular se establece inoculando el biorreactor con al menos 0,1 x 106 celulas viables/ml. En una realizacion relacionada el inoculo se cultiva por medio de un procedimiento de perfusion utilizando filtracion de flujo tangencial alternante.

En una realizacion antes de la entrada en el biorreactor, el medio de cultivo celular se trata utilizando nanofiltracion, alta temperatura en corto tiempo (HTST), o UV en combinacion con la filtracion.

En una realizacion, el biorreactor es un biorreactor de produccion. En una realizacion relacionada el biorreactor tiene una capacidad de al menos 500 l. En una realizacion relacionada el biorreactor tiene una capacidad de al menos 500 l a 2000 l. En una realizacion relacionada el biorreactor tiene una capacidad de al menos 1000 l a 2000 l.

En una realizacion, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular libre de suero. En una realizacion el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular definido qmmicamente libre de suero. En una realizacion el medio de cultivo es un medio de cultivo celular de perfusion.

En una realizacion, las celulas de mamffero son celulas de Ovario de Hamster Chino (CHO). En una realizacion, la protema recombinante se selecciona de entre el grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico, una protema de fusion recombinante o una citocina.

En una realizacion, la protema recombinante se purifica del permeado de cosecha mediante uno o mas de entre floculacion, precipitacion, centrifugacion, filtracion profunda, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de intercambio anionico modo mixto, cromatograffa de interaccion hidrofoba o cromatograffa en hidroxiapatita. En una realizacion el metodo anterior comprende adicionalmente la toma de muestras durante el procedimiento de purificacion, la evaluacion de las muestras para controlar cuantitativa y/o cualitativa las caractensticas de la protema recombinante y el procesamiento de purificacion.

En una realizacion, la protema recombinante se formula en una formulacion farmaceuticamente aceptable. En una realizacion se proporciona una protema recombinante producida por el metodo anterior.

La invencion tambien proporciona un metodo para la recoleccion de una protema recombinante que comprende el establecimiento de un cultivo celular inoculando un biorreactor con celulas de marnffero que expresan una protema recombinante, manteniendo el cultivo celular perfundiendo el cultivo celular con medio de cultivo celular reciente formulado o suplementado para alcanzar una concentracion de al menos 5 g/l de un copoffmero en bloque no ionico y pasando el cultivo celular a traves de un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular (MWCO) que no retiene la protema recombinante en el biorreactor y recolectando un permeado que contiene la protema recombinante.

En una realizacion el corte de peso molecular es al menos de 500 kDa. En una realizacion el filtro de fibra hueca es un microfiltro.

La invencion tambien proporciona un metodo para recolectar una protema recombinante que comprende el establecimiento de un cultivo celular inoculando un biorreactor con celulas de marnffero que expresan una protema recombinante, el mantenimiento del cultivo celular perfundiendo el cultivo celular con medio de cultivo celular reciente formulado o suplementado para alcanzar una concentracion de al menos 1 g/l de un copoffmero en bloque no ionico y pasando el cultivo celular a traves de un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular (MWCO) que retiene la protema recombinante en el biorreactor, y recolectar un permeado, una vez que se alcanza un parametro predeterminado perfundiendo el cultivo celular con medio de cultivo celular reciente formulado o suplementado para alcanzar una concentracion de al menos 5 g/l de un copoffmero en bloque no ionico y pasando el cultivo celular a traves de un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular (MWCO) que no retiene la protema recombinante en el biorreactor y recolectar un permeado que contiene la protema recombinante.

En una realizacion el corte de peso molecular del filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retiene la protema recombinante en el biorreactor es de 300 kDa o menos. En una realizacion, el filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retiene la protema recombinante en el biorreactor es un ultrafiltro.

En una realizacion el corte de peso molecular del filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular (MWCO) que no retiene la protema recombinante en el biorreactor es al menos de 500 kDa. En una realizacion el filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor es un microfiltro.

En una realizacion el filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retiene la protema recombinante en el biorreactor y el filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor son componentes de un sistema de filtro de solo una unidad.

En una realizacion, el copoffmero en bloque no ionico es un copoffmero en bloque de polioxipropileno-polioxietileno. En una realizacion el copoffmero en bloque no ionico es poloxamer 188.

En una realizacion el metodo anterior comprende adicionalmente la toma de muestras durante los procedimientos de cultivo celular, evaluando las muestras para controlar cuantitativa y/o cualitativamente las caractensticas de la protema recombinante y/o el procedimiento de cultivo celular. En una realizacion, las muestras se controlan cuantitativa y/o cualitativamente utilizando tecnicas de procesamiento anafftico.

En una realizacion la perfusion es una perfusion continua. En una realizacion la velocidad de perfusion es constante. En una realizacion la perfusion se lleva a cabo a una velocidad menor o igual a 1,0 volumenes de trabajo por dfa. En una realizacion la perfusion se consigue mediante una bomba peristaltica, una bomba de doble diafragma, una bomba de bajo cizallamiento o de flujo tangencial alternante. En una realizacion, la perfusion se consigue por flujo tangencial alternante.

En una realizacion el metodo anterior comprende adicionalmente someter el cultivo celular a un cambio de temperatura en el que las celulas se cultivan a) a una primera temperatura durante un primer periodo de tiempo y b) a una segunda temperatura durante un segundo periodo de tiempo. En una realizacion relacionada, el cambio de temperatura se produce en la transicion entre la fase de crecimiento y la fase de produccion. En una realizacion relacionada el cambio de temperatura se produce durante la fase de produccion. En una realizacion relacionada el cambio de temperatura es en respuesta a un parametro predeterminado. En una realizacion relacionada el cambio de temperatura es en repuesta a un parametro predeterminado en el que la consecucion del parametro predeterminado se determina utilizando una sonda de biomasas basada en la capacitancia.

En una realizacion el cultivo celular se establece inoculando el biorreactor con al menos 0,1 x 106 celulas viables/ml. En una realizacion, el inoculo se cultiva por medio de un procedimiento de perfusion utilizando filtracion de flujo tangencial alternante.

En una realizacion, las celulas de mairnfero son celulas de Ovario de Hamster Chino (CHO).

En una realizacion, la protema recombinante se selecciona de entre el grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico, una protema de fusion recombinante o una citocina.

En una realizacion, la protema recombinante se purifica del permeado de cosecha mediante uno o mas de entre floculacion, precipitacion, centrifugacion, filtracion profunda, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de intercambio anionico modo mixto, cromatograffa de interaccion hidrofoba o cromatograffa en hidroxiapatita.

En una realizacion el metodo anterior comprende adicionalmente la toma de muestras durante el procedimiento de purificacion, la evaluacion de las muestras para controlar cuantitativa y/o cualitativa las caractensticas de la protema recombinante y el procesamiento de purificacion.

En una realizacion la protema recombinante se formula en una formulacion farmaceuticamente aceptable.

En una realizacion, se proporciona una protema recombinante producida por el metodo anterior.

La invencion tambien proporciona un sistema de filtro de una sola unidad que comprende dos o mas componentes del filtro de fibras huecas de diferentes tamanos de poro o cortes de peso molecular (MWCO), en el que los componentes del filtro de fibras huecas se aseguran entre ellos en serie de manera que se mantiene una via de flujo entre las fibras huecas individuales y los componentes del filtro de fibras huecas de diferentes tamanos de poro o cortes de peso molecular se afslan ente ellos con respecto a sus lados de cubierta hueca de los que se retira el permeado, de manera que el permeado se puede retirar independiente de cada componente de filtro de fibra hueca respectiva.

En una realizacion al menos un componente de filtro de fibra hueca tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retiene la protema recombinante en el biorreactor y al menos un componente de filtro de fibra hueca que tiene un filtro con un tamano de poro que es un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor. En una realizacion relacionada al menos un componente de filtro de fibra hueca tiene un corte de peso molecular de 399 kDa o menos y al menos un componente de filtro de fibra hueca tiene un corte de peso molecular de al menos 500 kDa. En una realizacion relacionada al menos un componente de fibra hueca es un ultrafiltro y al menos un componente de filtro de fibra hueca es un microfiltro. En una realizacion relacionada el sistema de filtro de una sola unidad esta contenido en una carcasa. En una realizacion, el filtro de una sola unidad comprende un espaciador entre al menos dos de los componentes del filtro de fibras huecas.

El metodo tambien proporciona un metodo para cultivar las celulas que expresan una protema recombinante que comprende el establecimiento de un cultivo celular inoculando un biorreactor con celulas de mairnfero que expresan una protema recombinante, manteniendo el cultivo celular perfundiendo un medio de cultivo celular reciente en el biorreactor, pasando el cultivo celular a traves de un sistema de filtro de una sola unidad y recolectando un permeado, en el que el sistema de filtro de una sola unidad se unen al biorreactor y el cultivo celular se extrae del biorreactor y se mete en el sistema de filtro de una sola unidad por un unico sistema de bombeo, en el que el cultivo celular pasa a traves del lado de la luz de las fibras huecas del sistema de filtro de una sola unidad y vuelve al biorreactor y se retira un permeado de uno o mas de los componentes del filtro de fibras huecas.

En una realizacion el metodo anterior comprende adicionalmente la toma de muestras durante el procedimiento de cultivo celular, evaluando las muestras para controlar cuantitativa y/o cualitativamente las caractensticas de la protema recombinante y/o el procedimiento de cultivo celular. En un procedimiento relacionado las muestras se controlan cuantitativa y/o cualitativamente utilizando tecnicas de procesamiento analttico.

En una realizacion la perfusion es una perfusion continua. En una realizacion la velocidad de perfusion es constante. En una realizacion la perfusion se lleva a cabo a una velocidad de menos de o igual a 1,0 volumenes de trabajo por dfa.

En una realizacion la perfusion se consigue mediante una bomba peristaltica, una bomba de doble diafragma, una bomba de bajo cizallamiento o de flujo tangencial alternante. En una realizacion relacionada la perfusion se consigue por flujo tangencial alternante.

En una realizacion el metodo anterior comprende adicionalmente someter el cultivo celular a un cambio de temperatura en el que las celulas se cultivan a) a una primera temperatura durante un primer periodo de tiempo y b) a una segunda temperatura durante un segundo periodo de tiempo. En una realizacion el cambio de temperatura se produce en la transicion entre la fase de crecimiento y la fase de produccion. En una realizacion relacionada el cambio de temperatura se produce durante la fase de produccion. En una realizacion relacionada el cambio de temperatura es en repuesta a un parametro predeterminado donde la consecucion del parametro predeterminado se determina utilizando una sonda de biomasas basada en la capacitancia.

En una realizacion, el biorreactor es un biorreactor de produccion. En una realizacion relacionada el biorreactor tiene una capacidad de al menos 500 l. En una realizacion relacionada el biorreactortiene una capacidad de al menos 500 l a 2000 l. En una realizacion relacionada el biorreactor tiene una capacidad de al menos 1000 l a 2000 l.

En una realizacion el metodo anterior comprende adicionalmente la toma de muestras durante el procedimiento de purificacion, la evaluacion de las muestras para controlar cuantitativa y/o cualitativa las caracteffsticas de la protema recombinante y el procesamiento de purificacion.

En una realizacion la protema recombinante se formula en una formulacion farmaceuticamente aceptable. En una realizacion, se proporciona una protema recombinante producida por el metodo anterior.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1. Vista esquematica de un sistema de filtro de una sola unidad, que tiene una unica abertura por donde entre el fluido de cultivo celular y sale a traves de una unica abertura. Los filtros pueden estar en cualquier orientacion, se muestra un microfiltro de fibras huecas seguido por un ultrafiltro de fibras huecas.

Figura 2. Tftulo del proceso de recoleccion periodica extendida, n = 2 (cuadrados vados) comparado con el procedimiento de ultrafiltracion, n = 4 (drculos rellenos).

Figura 3. Densidad celular viable del proceso de recoleccion periodica extendida, n = 2 (cuadrados vados) en comparacion con el procedimiento de ultrafiltracion, n = 4 (drculos rellenos).

Figura 4. Porcentaje de viabilidad del proceso de recoleccion periodica extendida, n = 2 (cuadrados vados) en comparacion con el procedimiento de ultrafiltracion, n = 4 (drculos rellenos).

Figura 5. Porcentaje de viabilidad de los reactores equipados con un filtro de 750 kDa (drculos vados) y de reactores equipados con filtros de 30 kDa (drculos rellenos). El porcentaje de viabilidad disminma hasta el 80 % el dfa 6 en los reactores equipados con filtros de 750 kDa. El porcentaje de viabilidad de los reactores equipados con los filtros de 30 kDa se mantuvo a >80 % durante 14 dfas.

Figura 6. Concentraciones de Lutrol® F68 medidas en el sobrenadante (drculos rellenos) y el permeado (cuadrados vados) de reactores con una unidad de filtro de fibras huecas de 30 kDa o 750 kDa. El sobrenadante de 30 kDa muestra una acumulacion de Lutrol® F68 sobre los dfas 9-13.

Figura 7A. Densidad celular viable normalizada para las lmeas celulares A y B con cada concentracion de Lutrol® F68 (2 g/l-5 g/l) en comparacion con 1 g/l, dando la relacion de densidad celular. Se hicieron comparaciones utilizando ensayos t de Student entre los datos de todos los pasajes comparados con el de 1 g/l. Significacion estadfstica * <0,0001; ** <0,001; *** <0,01; **** <0,05.

Figura 7B. Porcentaje de viabilidad para las lmeas celulares A y B con cada concentracion de Lutrol® F68 (2 g/l-5 g/l) en comparacion con 1 g/l. Se hicieron las comparaciones utilizando ensayos t de Student entre los datos de todos los pasajes comparados con el de 1 g/l. Significacion estadfstica * <0,0001; ** <0,001; *** <0,01; **** <0,05. Figura 7C. Diametro celular para las lmeas celulares A y B con cada concentracion de Lutrol® F68 en comparacion con el diametro de la celula a 1 g/l de Lutrol® F68. Se hicieron las comparaciones utilizando ensayos t de Student entre los datos de todos los pasajes comparados con el de 1 g/l. Significacion estadfstica * <0,0001; ** <0,001; *** <0,01; **** <0,05.

Figura 8. Porcentaje de viabilidad celular para las lmeas celulares A y B a 1 g/l de Lutrol® F68 (cuadrados vados) y 5 g/l de Lutrol® F68 (drculos llenos). La viabilidad se mantuvo a >90 % durante >30 dfas cuando la concentracion de Lutrol® F68 se aumentaba a 5 g/l.

Figura 9. El efecto de la concentracion de pluronic sobre la viabilidad de las celulas cultivadas en reactores de 2 l con un filtro ATF de 750 kDa con perfusion de medios que conteman 1 g/l de Lutrol® F68 (cuadrados llenos) o 5 g/l de Lutrol® F68 (drculos vados).

Figura 10 El efecto del aumento de la concentracion de Lutrol® F68 (hasta 5 g/l) sobre la recuperacion de viabilidad de celulas en cultivo con 1 g/l de Lutrol® F68 en reactores de 2 l con un filtro ATF de 750 kDa. Medio A: drculos llenos. Medio B: drculo vado. La flecha indica cuando se aumento la concentracion de Lutrol® F68. Figura 11. Cuantificacion por GCMS de glucosa y manosa. (A) TIC para la separacion por GC de hexosas y (B) patron de fragmentacion de espectro de masas tipico que se encuentra en los picos de hexosa que conteman tanto 12C-hexosa como 13C-hexosa de referencia interna. (C) Ensayo de linealidad para la cuantificacion de glucosa y manosa.

Figura 12. El efecto de manosa sobre la glicosilacion con manosa alta de IgG. (A) celulas CHO cultivadas con cantidades crecientes de manosa; (B) celulas CHO cultivadas con cantidades crecientes de manosa y a diferentes concentraciones de glucosa. El aumento lineal de glicosilacion con manosa alta es independiente de la concentracion de glucosa.

Figura 13. Vista esquematica del bucle de retroalimentacion PAC. Los elementos clave del procedimiento PAC necesarios para los atributos de suministro de una calidad de producto predefinida son los QTPP, un sistema PAT que incluye la toma de muestras automatica y atribuye analtticas espedficas, un modelo de control para modificar el procesamiento y un procedimiento con palancas de control conocidas para ajustar los niveles de atributo.

Figura 14. Se utilizo una unica ejecucion del reactor para calcular los parametros modelo mediante regresion de cuadrados mmimos. Los sfmbolos son mediciones utilizadas para encontrar los parametros modelo mediante regresion de cuadrados mmimos. Las lmeas sombreadas son los resultados que resultan del modelo. Las lmeas de puntos son los ajustes del modelo utilizando los parametros de cultivo que se utilizaron para MPC. Las lmeas rojas continuas de las figuras A y B muestran la alimentacion de manosa utilizada para generar estos datos de entrenamiento. A) % con manosa alta; B) Concentracion de manosa en el reactor; C) Densidad celular (volumen calculado escalado arbitrariamente); D) Concentracion del producto.

Figura 15. Demostracion del control de % con manosa alta mediante el Control de Modelo Predictivo. En todas las figuras los sfmbolos son valores medidos, pero solo los sfmbolos vados se utilizaron para el Control de Modelo Predictivos. La lmea de puntos es el resultado del modelo que da las mediciones y la accion de control que se tomo. Las lmeas continuas rojas de las figuras A y B muestran la alimentacion con manosa determinada por MPC. A) % con manosa alta; B) Concentracion de manosa en el reactor; C) Densidad celular como volumen calculado escalado arbitrariamente (SCV); D) Concentracion de producto.

Figura 16. Comparacion de datos del PAC y no PAC. Los datos de % con manosa alta se obtuvieron mediante el ensayo HILIC.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion proporciona un metodo de recoleccion periodica extendida que ofrece la ventaja de mantener un cultivo celular continuo en su pico de produccion mientras que se obtiene un alto tttulo de permeado. La invencion proporciona un metodo para una recoleccion periodica extendida que comprende el establecimiento de un cultivo celular inoculando un biorreactor con celulas de mairnfero que expresan un producto proteico recombinante, manteniendo el cultivo celular perfundiendo medio de cultivo celular reciente en el biorreactor, pasando el cultivo celular a traves de un filtro y recolectando un permeado, en el que se recolecta inicialmente un permeado nulo hasta que se alcanza un primer parametro predeterminado, en cuyo momento se recolecta un permeado de cosecha durante un tiempo predeterminado, esto continua recolectando de manera alterna un permeada nulo hasta que se alcanza un segundo parametro predeterminado, recolectando entonces un permeado de cosecha durante un tiempo predeterminado, en el que la recoleccion alternante del permeado nulo y el permeado de cosecha continua hasta que se termina el cultivo celular.

Los parametros predeterminados se pueden alcanzar consiguiendo algunas caractensticas deseadas, atributos o cumplimiento de una meta del cultivo celular; tal como una densidad celular viable, volumen o tftulo celular empaquetado o momento. En una realizacion, el parametro predeterminado se puede alcanzar cuando la densidad celular viable es mayor o igual a 1 x 106 celulas viables/ml. En una realizacion, el parametro predeterminado se puede alcanzar cuando la densidad celular viable sea al menos de 20 x 106 celulas viables/ml a 30 x 106 celulas viables/ml. En una realizacion, el parametro predeterminado se puede alcanzar cuando el volumen celular empaquetado es menor o igual al 35 %. En una realizacion, el parametro predeterminado se puede alcanzar cuando el volumen celular empaquetado es menor o igual al 30 %.

El parametro predeterminado puede basarse en un tiempo determinado. El tiempo determinado se puede medir en horas, d^as, semanas, o meses despues de un evento o accion desencadenante. Un evento o accion desencadenante puede ser horas o dfas en cultivo, horas o dfas despues de un evento tal como alcanzar una densidad celular viable, volumen celular empaquetado, tttulo, inoculacion del biorreactor o recoleccion de un permeado de cosecha. En una realizacion, el parametro predeterminado se puede alcanzar en 12 horas a 25 dfas despues del evento o accion desencadenante. En una realizacion, el parametro predeterminado se puede alcanzar en 4 dfas despues del evento o accion desencadenante. En una realizacion, el parametro predeterminado se puede alcanzar en 5 dfas despues del evento o accion desencadenante. En una realizacion, el parametro predeterminado se puede alcanzar en 24 a 72 horas despues de un evento o accion desencadenante. En una realizacion, el parametro se puede alcanzar al menos 25 dfas despues del evento o accion desencadenante. En una realizacion, el primer parametro predeterminado se puede alcanzar en 5 a 25 dfas despues de la inoculacion del biorreactor. En una realizacion, el primer parametro predeterminado se puede alcanzar en 10 a 12 dfas despues de la inoculacion del biorreactor. En una realizacion, un segundo parametro predeterminado se puede alcanzar en 12 a 72 horas despues de la recoleccion de un permeado de cosecha. En una realizacion, un segundo parametro predeterminado se puede alcanzar en 24 a 72 horas despues de la recoleccion de un permeado de cosecha. En una realizacion, un segundo parametro predeterminado se puede alcanzar en 24 a 48 horas despues de la recoleccion de un permeado de cosecha.

Una vez que el parametro predeterminado se haya alcanzado se puede recolectar un permeado de cosecha durante un tiempo predeterminado. En una realizacion el tiempo predeterminado es al menos 12 a 72 horas. En una realizacion el tiempo predeterminado es 24 a 72 horas. En una realizacion el tiempo predeterminado es de 24 a 48 horas.

En una realizacion, el filtro es un sistema de filtro de una sola unidad. En una realizacion relacionada el sistema de filtro de una sola unidad comprende al menos un componente de filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular (MWCO) que retiene la protema recombinante en el biorreactor y al menos un componente de filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor. En otra realizacion el corte de peso molecular de al menos un componente de filtro de fibra hueca que retiene la protema recombinante en el biorreactor es de 300 kDa o menos. En otra realizacion el corte de peso molecular de al menos un componente de filtro de fibra hueca que no retiene la protema recombinante en el biorreactor es al menos de 500 kDa. En otra realizacion al menos un componente de filtro de fibra hueca que retiene la protema recombinante en el biorreactor es un ultrafiltro y al menos un componente de filtro de fibra hueca que no retiene la protema recombinante en el biorreactor es un microfiltro. En otra realizacion relacionada, el sistema de filtro de una sola unidad esta contenido en una carcasa. En una realizacion relacionada el sistema de filtro de una sola unidad esta contenido en una carcasa. En otra realizacion el sistema de filtro de una sola unidad comprende adicionalmente un espaciador entre al menos dos componentes del filtro de fibras huecas.

En una realizacion cuando el permeado nulo se recolecta utilizando un sistema de filtro de una sola unidad se extrae de al menos un componente de filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retiene a protema recombinante en el biorreactor. En una realizacion cuando el permeado de cosecha que se recolecta utilizando un sistema de filtro de una sola unidad se extrae de al menos un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor. En una realizacion el permeado se recolecta de un filtro que es un filtro de vibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor, el medio de cultivo reciente se formula o suplementa para alcanzar al menos 5 g/l de un copolfmero en bloque no ionico. En una realizacion relacionada el copolfmero en bloque no ionico es un copolfmero en bloque de polioxipropileno-polioxietileno. En otra realizacion relacionada el copolfmero en bloque no ionico es poloxamer 188.

La invencion tambien proporciona un metodo para la recoleccion de una protema recombinante que comprende el establecimiento de un cultivo celular inoculando un biorreactor con celulas de mairnfero que expresan una protema recombinante, manteniendo el cultivo celular perfundiendo el cultivo celular con medio de cultivo celular reciente formulado o suplementado para alcanzar una concentracion de al menos 5 g/l de un copolfmero en bloque no ionico y pasando el cultivo celular a traves de un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor y recolectando el permeado que contiene la protema recombinante. En una realizacion el corte de peso molecular es al menos de 500 kDa. En una realizacion el filtro de fibra hueca es un microfiltro.

La invencion tambien proporciona un metodo para la recoleccion de una protema recombinante que comprende el establecimiento de un cultivo inoculando un biorreactor con celulas de mamffero que expresan una protema recombinante, manteniendo el cultivo celular perfundiendo el cultivo celular con medio de cultivo celular reciente formulado o suplementado para alcanzar una concentracion de al menos 1 g/l de un copolfmero en bloque no ionico y pasando el cultivo celular a traves de un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retiene la protema recombinante en el biorreactor, y recolectando un permeado; una vez que se alcanza un parametro predeterminado, perfundiendo el cultivo celular con medio de cultivo celular reciente formulado o suplementado para alcanzar una concentracion de al menos 5 g/l de un copolfmero en bloque no ionico y pasando el cultivo celular a traves de un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor y recolectando un permeado que contienen la protema recombinante. En una realizacion el corte de peso molecular del filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retiene la protema recombinante en el biorreactor es de 300 kDa o menos. En una realizacion relacionada el filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retiene la protema recombinante en el biorreactor es un ultrafiltro. En una realizacion el corte de peso molecular del filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor es al menos de 500 kDa. En una realizacion relacionada el filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor es un microfiltro. En una realizacion el filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retiene la protema recombinante en el biorreactor y el filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en biorreactor son componentes de un sistema de filtro de una sola unidad. En una realizacion relacionada el copolfmero en bloque no ionico es un copolfmero en bloque polioxipropilenopolioxietileno. En otra realizacion relacionada el copolfmero en bloque no ionico es poloxamer 188.

La invencion tambien proporciona un sistema de filtro de una sola unidad que comprende dos o mas componentes de fibra hueca de diferentes tamanos de poro o corte de peso molecular, en el que los componentes del filtro de fibras huecas estan asegurados entre ellos en serie de manera que se mantiene la via de flujo esteril entre las fibras huecas individuales y los componentes del filtro de fibras huecas de diferentes tamanos de poro o cortes de peso molecular se afslan entre ellos con respecto a los lados de su cubierta hueca de la que el permeado se retira, de manera que el permeado se puede retirar independientemente de cada componente de filtro de fibra hueca. En una realizacion, al menos un componente del filtro de fibra hueca tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retiene la protema en el biorreactor y al menos un componente de filtro de fibra hueca tiene un tamano de poro de filtro que es un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor. En una realizacion, al menos un componente de filtro de fibra hueca tiene un corte de peso molecular de 300 kDa o menos y al menos un componente de filtro de fibra hueca tiene un corte de peso molecular de 500 kDa. En una realizacion al menos un componente de filtro de fibra hueca es un ultrafiltro y al menos un componente de filtro de fibra hueca es un microfiltro. En una realizacion, el sistema de filtro de una sola unidad esta contenido en una carcasa. En una realizacion, el sistema de filtro de una sola unidad comprende adicionalmente un espaciador entre al menos dos de los componentes del filtro de fibras huecas.

En una realizacion relacionada, la invencion proporciona un metodo para el cultivo de celulas y/o recoleccion de una protema recombinante que comprende la expresion de una protema recombinante que comprende el establecimiento de un cultivo celular inoculando un biorreactor con celulas de mairnfero que expresan una protema recombinante, manteniendo el cultivo celular perfundiendo medio de cultivo celular reciente en el biorreactor, pasando el cultivo celular a traves de un sistema de filtro de una sola unidad y recolectando un permeado, en el que el sistema de filtro de una sola unidad se une al biorreactor y el cultivo celular se extrae del biorreactor y se mete en el sistema de filtro de una sola unidad mediante un unico sistema de bombeo, en el que el cultivo celular pasa a traves del lado de la luz de las fibras huecas del sistema de filtro de una sola unidad y vuelve al biorreactor y una permeado se retira de uno o mas de los componentes de filtros de fibras huecas.

En una realizacion relacionada los metodos de la invencion comprenden adicionalmente la toma de muestra durante los procedimientos de cultivo celular, la evaluacion de muestras para controlar cuantitativa y/o cualitativamente las caractensticas de la protema recombinante y/o el procedimiento de cultivo celular. En una realizacion relacionada las muestras se controlan cuantitativa y/o cualitativamente utilizando tecnicas de procesamiento analftico.

En una realizacion relacionada de los metodos de la invencion la perfusion es una perfusion continua. En una realizacion la velocidad de perfusion es constante. En una realizacion la perfusion se lleva a cabo a una velocidad menor o igual a 1,0 volumen de trabajo por dfa. En una realizacion, la perfusion se consigue mediante una bomba peristaltica, una bomba de doble diafragma, una bomba de baja cizalladura o de flujo tangencial alternante. En una realizacion, la perfusion se consigue mediante flujo tangencial alternante.

En una realizacion relacionada, los metodos de la invencion comprenden adicionalmente someter el cultivo celular a un cambio de temperatura en el que las celulas se cultivan a) a una primera temperatura durante un primer periodo de tiempo y B) a una segunda temperatura durante un segundo periodo de tiempo. En una realizacion, el cambio de temperatura se produce en la transicion entre la fase de crecimiento y la fase de produccion. En una realizacion, el cambio de temperatura se produje durante la fase de produccion. En una realizacion el cambio de temperatura es en respuesta a un parametro predeterminado en el que se determina la consecucion del parametro predeterminado utilizando una sonda de biomasa basada en la capacitancia. En una realizacion el cambio de temperatura es en respuesta a un parametro predeterminado en el que se determina la consecucion del parametro predeterminado utilizando una sonda de biomasa basada en la capacitancia.

En una realizacion relacionada de los metodos de la invencion el cultivo celular se establece inoculando el biorreactor con al menos 0,1 x 106 celulas viables/ml. En una realizacion el inoculo se cultivo por medio de un proceso de perfusion utilizando filtracion de flujo tangencial alternante. En una realizacion, antes de la entrada en el biorreactor, el medio de cultivo celular se trata utilizando nanofiltracion, alta temperatura en corto tiempo (HTST), o UV en combinacion con filtracion.

En una realizacion relacionada de los metodos de la invencion el biorreactor es un biorreactor de produccion. En una realizacion, el biorreactor tiene una capacidad de al menos 500 l. En una realizacion, el biorreactor tiene una capacidad de al menos 500 l a 2000 l. En una realizacion, el biorreactor tiene una capacidad de al menos 1000 l a 2000 l.

En una realizacion relacionada de los metodos de la invencion, el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular definido qmmicamente libre de suero. En una realizacion, el medio de cultivo es un medio de cultivo celular de perfusion. En una realizacion, las celulas de marnffero son celulas de Ovario de Hamster Chino (CHO). En una realizacion, la protema recombinante se selecciona de entre el grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimerico, una protema de fusion recombinante, o una citocina.

En una realizacion relacionada de los metodos de la invencion, la protema recombinante se purifica del permeado de cosecha por uno o mas de entre floculacion, precipitacion, centrifugacion, filtracion profunda, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de intercambio anionico modo mixto, cromatograffa de interaccion hidrofoba o cromatograffa en hidroxiapatita. En una realizacion el metodo anterior comprende adicionalmente la toma de muestras durante el procedimiento de purificacion, la evaluacion de las muestras para controlar cuantitativa y/o cualitativa las caractensticas de la protema recombinante y el procesamiento de purificacion. En una realizacion las muestras se controlan cuantitativa y/o cualitativamente utilizando tecnicas de procesamiento anafftico. En una realizacion, la protema recombinante se formula en una formulacion farmaceuticamente aceptable.

Cultivo celular

Por “cultivo celular” o “cultivo” se quiere decir el crecimiento y propagacion de celulas fuera de un organismo multicelular o tejido. Las condiciones de cultivo adecuadas para las celulas de mamffero se conocen en la tecnica. Vease, por ejemplo, Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992). Las celulas de mamffero se pueden cultivar en suspension o mientras estan unidas a un sustrato solido. Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “medio de cultivo celular” (tambien llamado “medio de cultivo” , “medio de cultivo tisular”) se refiere a cualquier solucion nutritiva utilizada para el cultivo de celulas, por ejemplo, celulas animales o de mamffero, y que proporciona en general al menos uno o mas componentes de entre los siguientes: una fuente de energfa (habitualmente en forma de un carbohidrato como la glucosa); uno o mas de todos los aminoacidos esenciales, y en general los veinte aminoacidos basicos, mas cistema; vitaminas y/u otros compuestos organicos necesarios normalmente a bajas concentraciones; ffpidos o acidos grasos libres; y elementos traza, por ejemplo, compuestos inorganicos o elementos de origen natural que normalmente se necesitan a muy bajas concentraciones, normalmente en el intervalo micromolar.

La solucion nutritiva puede suplementarse opcionalmente con componentes adicionales para optimizar el crecimiento de las celulas, tales como hormonas y otros factores de crecimiento, tales como insulina, transferrina, factor de crecimiento epidermico, suero y similares; sales, tales como de calcio, magnesio y fosfatos, y tampones, por ejemplo, HEPES; nucleotidos y bases, tales como adenosina, timidina, hipoxantina; y protemas e hidrolizados tisulares, tales como protemas animales o vegetales hidrolizadas (peptona o mezclas de peptona, que se pueden obtener de subproductos animales, gelatina purificada o material vegetal); antibioticos tales como gentamicina; poliaminas, tales como putrescina, espermidina, y espermina (vease, Publicacion WIPO N.° WO 2008/154014) y piruvato (vease la Patente de EE. UU. N.° 8053238), compuestos anti-apoptoticos, por ejemplo, MDL 28170, cipermetrina, ciclosporina A, BBMP, acido Bongkrekico, difumerato S-15176, pifitrina-a dclica, pifitrina mu, BI-6C9, NSCI, NS3694 o Necrostatina-1 (vease, la Publicacion WIPO N.° WO 2014/022102) dependiendo de las necesidades de las celulas que se van a cultivar y/o los parametros del cultivo celular deseados.

Tambien se pueden anadir tensioactivos no ionicos al medio de cultivo celular. Ejemplos de tensioactivos no ionicos incluyen, pero no se limitan a, alcohol polivimlico, polietilenglicol, tensioactivos copoffmeros en bloque. Tambien se incluyen oxido de alquilpolietileno, copoffmeros de oxido polietileno) y poli(oxido de propileno (copoffmeros en bloque EO-PO), poli(vinilpirrolidona), alquil poliglucosidos (tal como monoestearato de sacarosa, lauril diglucosido o monolaurato de sorbitan, octil glucosido y decil maltosido), alcoholes de acidos grasos (alcohol cefflico o alcohol olefflico, o cocamidas (cocamida MEA, cocamida DEA y cocamida TEA).

Tambien se incluyen copoffmeros en bloque basados en oxido de etileno y oxido de propileno, a los que tambien se hace referencia como copoffmeros en bloque de polioxipropileno-polioxietileno. Estas moleculas son copoffmeros en tribloque no ionicos que tienen una cadena hidrofoba central de polioxietileno (oxido de poli(propileno)) flanqueado por dos cadenas hidrofilas de polioxietileno (oxido de poli(etileno)). De particular interes son los que tienen 70 unidades de polioxipropileno y 30 unidades de cada una de las cadenas de polioxietileno. En una realizacion preferida el copoffmero en bloque es poloxamer 188 (CAS n° 90003-11-6 con un peso molecular medio de 8,4 kd, BASF Chemical, Washington, NJ) que se vende con distintos nombres comerciales tales como Pluronic® F68, Kolliphor® P-188, Lutrol® F68, y Lutrol® 188.

Estos copoUmeros en bloque polioxipropileno-polioxietileno se utilizan para proteger las celulas de la muerte inducida por las burbujas debido al salpicado y la espuma en el reactor. Como se describe en el presente documento, el nivel de poloxamer 188 que se utiliza normalmente en el medio de cultivo celular (1 g/l) puede no ser suficiente para proteger las celulas de las fuertes fuerzas de cizalladura en un sistema de perfusion de flujo tangencial alternante (ATF) cuando los cultivos celulares se exponen a microfiltracion. Como se ha descrito en el presente documento, la adicion de un copolfmero en bloque de polioxipropileno-polioxietileno, tal como poloxamer 188, a concentraciones mas altas, tales como de 5 g/l, tema un impacto positivo sobre la viabilidad celulas, que hada posible una duracion mas larga del cultivo en condiciones de perfusion ATF.

El medio de cultivo celular incluye los que se emplean normalmente y/o se conocen por su uso en cualquier procedimiento de cultivo celular, tal como, pero no limitados a, cultivo de celulas por lotes, lotes extendidos, semicontinuo y/o de perfusion o continuo.

Un medio de cultivo o medio de alimentacion “base” (o lote) se refiere a un medio de cultivo celular que se utiliza normalmente para iniciar un cultivo celular y es suficientemente completo para completar el soporte del del cultivo celular.

Un medio de cultivo o medio de alimentacion de “crecimiento” se refiere a un medio de cultivo celular que se utiliza normalmente en los cultivos celulares durante un periodo de crecimiento exponencial, una “fase de crecimiento”, y es suficientemente completo para soportar el cultivo celular durante esta fase. Un medio de cultivo celular de crecimiento tambien puede contener agentes de seleccion que confieren resistencia o supervivencia a los indicadores geneticos incorporados en la lmea celular huesped. Dichos agentes de seleccion incluyen, pero no se limitan a geneticina (G41l8), neomicina, higromicina B, puromicina, zeocina, metionina sulfoximina, metotrexato, medio de cultivo celular libre de glutamina, medio de cultivo celular que carece de glicina, hipoxantina y timidina, o solo timidina.

Un medio de cultivo celular o medio de alimentacion de “produccion” se refiere a un medio de cultivo celular que se utiliza normalmente en cultivos celulares durante la transicion cuando termina el crecimiento exponencial y durante las fases posteriores de transicion y/o produccion cuando la produccion de protema tiene lugar. Dicho medio de cultivo es suficientemente completo para mantener una densidad celular, viabilidad y/o tttulo de producto deseados durante esta fase.

Un medio de cultivo celular o medio de alimentacion de “perfusion” se refiere a un medio de cultivo celular que se utiliza normalmente en cultivos celulares que se mantienen por perfusion o metodos de cultivo continuo y es suficientemente completo para soportar el cultivo celular durante este proceso. Las formulaciones de medio de cultivo celular de perfusion pueden ser mas ricas o mas concentradas que las formulaciones de medio de cultivo celular base para acomodarse el metodo que se utilice para retirar el medio gastado. El medio de cultivo celular de perfusion puede utilizarse en las fases tanto de crecimiento como de produccion.

Los componentes del medio de cultivo celular pueden estar completamente molidos en una formulacion de medio en polvo; parcialmente molidos con adicion de suplementos lfquidos al medio de cultivo celular segun se necesite; o anadidos en forma completamente lfquida al cultivo celular.

Los cultivos celulares se pueden suplementar con medio de alimentacion concentrado que contiene los componentes, tales como nutrientes y aminoacidos, que se consumen durante el curso de la fase de produccion del cultivo celular. El medio de cultivo celular concentrado puede contener algunos o todos los nutrientes necesarios para mantener el cultivo celular; en particular, el medio concentrado puede contener nutrientes identificados o que se sabe que se consumen durante el curso de la fase de produccion del cultivo celular. El medio concentrado puede basarse en justo aproximadamente cualquier formulacion de medio de cultivo celular. El medio de alimentacion concentrado puede contener algunos o todos los componentes del medio de cultivo celular, por ejemplo, con aproximadamente 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100X, 200X, 400X, 600X, 800X, o incluso aproximadamente 1000X su cantidad normal.

Los cultivos celulares tambien se pueden suplementar con alimentaciones concentradas independientes de nutrientes particulares que pueden ser diffciles de formular o se agotan rapidamente en los cultivos celulares. Dichos nutrientes pueden ser aminoacidos tales como tirosina, cistema y/o cistina (vease, por ejemplo, la publicacion WIPO N.° 2012/145682). En una realizacion, se alimenta con una solucion concentrada de tirosina y cistina independientemente al cultivo celular que se va a cultivar en un medio de cultivo celular que carece de tirosina y cistina o cistema. Las alimentaciones independientes pueden comenzar antes de o al inicio de la fase de produccion. Las alimentaciones independientes se pueden conseguir por alimentacion por lotes del medio de cultivo el mismo o diferentes dfas como medio de alimentacion concentrado. Dichas alimentaciones independientes se pueden anadir al medio de cultivo celular despues de uno o mas dfas, y tambien se pueden anadir repetidamente durante el curso de la fase de produccion, de manera que se evite el agotamiento de tirosina, cistema y cistina.

Se pueden emplear metodos para alimentar continuamente un cultivo de celulas de mairnfero, tal como los que no empelan un control de retroalimentacion (vease la Publicacion WIPO N.° WO 2013/040444).

El medio de cultivo celular, en ciertas realizaciones, esta libre de suero y/o libres de productos o ingredientes de origen animal. El medio de cultivo celular, en ciertas realizaciones, esta definido qmmicamente, donde todos los componentes qmmicos se conocen.

Las celulas animales o de mairnfero se cultivan en un medio adecuado para celulares particulares que se cultivan y que se pueden determinar por el experto en la tecnica sin mayor experimentacion. Se pueden utilizar medios disponibles en el mercado e incluyen, pero no se limitan a, Medio de Dulbecco modificado de Iscove, RPMI1640, Medio Esencial Mmimo alfa (MEM-alfa), Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), DME/F12, MEM alfa, Medio basal de Eagle con BSS de Earle, DMEM alto en glucosa, con glutamina, DMEM lato en glucosa, sin glutamina, DMEM bajo en glucosa, sin glutamina, DMEM-F121:1, con glutamina, GMEM (MEM de Glasgow), GMEM con glutamina, Medio de insectos completo de Grace, Medio de insectos de Grace, sin FBS, F-10 de Ham, con glutamina F-12 de Ham, con glutamina, IMDM con HEPES y glutamina, IMDM con HEPES y sin glutamina, medio de insecto IP41, 15 (Leibovitz) (2X), sin glutamina o Rojo Fenol, 15 (Leibovitz) sin glutamina, Medio modificado 5A de McCoy, Medio 199, MEM Eagle, sin glutamina o Rojo Fenol (2X), MEM Eagle - BSS de Earle, con glutamina, MEM Eagle-BSS de Earle, sin glutamina, MEM Eagle-BSS de Hanks, sin glutamina, NCTC-109, con glutamina, Medio CM de Richter, con glutamina, RPMI 1640 con HEPES, Glutamina y/o penicilina-estreptomicina, RPMI 1640, con glutamina, RPMI 1640, sin glutamina, Medio de insecto de Schneider o cualquier otro medio conocido por el experto en la tecnica, que se formula para un tipo de celula en particular. A los medios anteriores ejemplares se pueden anadir componentes suplementarios o ingredientes, que incluyen componentes opcionales, en concentraciones o cantidades apropiadas, segun sea necesario o se dese, y como se conoce y practica por los expertos en la tecnica utilizando tecnicas de rutina.

Tratamientos del medio

El medio de cultivo celular se puede tratar utilizando metodos o dispositivos para esterilizar o desinfectar el medio antes de la adicion al biorreactor y/o cultivo celular. En una realizacion, el medio de cultivo celular se trata utilizando lata temperatura en corto tiempo (HTST) (vease, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 7.420.183). En una realizacion, el medio de cultivo celular se trata utilizando UV en combinacion con filtracion (vease, por ejemplo, las Publicaciones WIPO WO 2008/157247; WO 2012/115874; WO 2013/063298 y WO 2013/138159). En otra realizacion, el medio de cultivo celular se somete a nanofiltracion (vease, por ejemplo, Liu et al, (2000) Biotechnol. Prog. 16:425-434). En otra realizacion, el medio de cultivo celular se trata con productos qmmicos que inactivan virus, tales como disolventes, detergentes, psoraleno o beta-propiolactona.

Celulas

Las lmeas celulares (a las que tambien se hace referencia como “celulas” o “celulas huesped”) que se utilizan en la invencion estan modificadas geneticamente para expresar un polipeptido de interes comercial o cientffico. Las lmeas celulas res se derivan normalmente de un linaje que aparece a partir de un cultivo primario que se puede mantener en cultivo durante un tiempo ilimitado. Las celulas pueden contener introducido, por ejemplo, mediante transformacion, transfeccion, infeccion o inyeccion, vectores (construcciones) de expresion, tales como plasmidos y similares, que llevan secuencias codificantes, o partes de las mis, que codifican las protemas para la expresion y produccion en el procedimiento de cultivo. Dichos vectores de expresion contienen los elementos necesarios para la transcripcion y la traduccion de la secuencia codificante insertada. Los metodos que son bien conocidos y practicados por los expertos en la tecnica se pueden utilizar para construir vectores de expresion que contienen secuencias que codifican las protemas y polipeptidos producidos, asf como, los elementos de control de la transcripcion y traduccion apropiados. Estos metodos incluyen tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas, y recombinacion genetica in vivo. Dichas tecnicas se describen en J. Sambrook et al, 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4a edicion Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. o cualquiera de las ediciones previas; F. M. Ausubel et al, 2013, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, o cualquiera de las ediciones previas; Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture. 1990, todos los cuales se incorporan en el presente documento con cualquier fin.

Las celulas animales, celulas de mairnfero, celulas cultivadas, celulas animales o de mairnfero huesped, celulas huesped, celulas recombinantes, celulas huesped recombinantes, y similares, son todas expresiones para las celulas que se pueden cultivar de acuerdo con los procedimientos de la presente invencion. Dichas celulas son normalmente lmeas celulares que se obtienen o derivan de mairnferos y son capaces de crecer y sobrevivir cuando se colocan en un cultivo monocapa o en cultivo en suspension en un medio que contiene nutrientes apropiados y/u otros factores, tales como los que se describen en el presente documento. Las celulas se seleccionan normalmente entre las que puedan expresar y secretar protemas, o que se puedan modificar molecularmente para que expresen y secreten grandes cantidades de una protema en particular, mas particularmente, una glicoprotema de interes, en el medio de cultivo. Se entendera que la protema producida por una celula huesped puede ser endogena u homologa de la celula huesped. De manera alternativa, la protema es heterologa, es decir, ajena a la celula huesped, por ejemplo, una protema humana producida y secretada por una celula huesped de ovario de hamster chino (CHO). Adicionalmente, las protemas de mairnfero, es decir, las obtenidas originalmente o derivadas de un organismo mairnfero se consiguen por los metodos de la presente invencion y se pueden secretar por las celulas en el medio de cultivo.

Las composiciones de la presente invencion se pueden utilizar para cultivar una variedad de celulas. En una realizacion, las celulas cultivadas son celulas eucariotas tales como celulas vegetales y/o animales. Las celulas pueden ser celulas de mairnfero, celulas de peces, celulas de insecto, celulas de anfibio o celulas de ave. Una amplia variedad de lmeas celulares de m ai^ero adecuadas para su crecimiento en cultivo esta disponible en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (Manassas, Va.) y otros depositarios, asf como vendedores comerciales. La celula que se puede utilizar en los procedimientos de la invencion incluye, pero no se limitan a celulas MK2.7, celulas PER-C6, celulas de ovario de hamster chino (CHO), tales como cHo-K l (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin et al, 1986, Som. Cell Molec. Genet, 12:555-556; Kolkekar et al, 1997, Biochemistry, 36:10901-10909; y documento WO 01/92337 A2), celulas CHO negativas a dihidrofolato reductasa (CHO/-DHFR, Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216), y celulas dpl2.CHO (Pat. de EE. UU. N.° 5.721.121); celulas de rinon de mono (CV1, ATCC CCL-70); celulas CV1 de rinon de mono transformadas por SV40 (celulas COS, COS-7, ATCC CRL-1651); celulas HEK 293, y celulas Sp2/0, celulas de hibridoma 5L8, celulas Daudi, celulas EL4, celulas HeLa, celulas HL-60, celulas K562, celulas Jurkat, celulas THP-1, celulas Sp2/0, celulas epiteliales primarias (por ejemplo, queratinocitos, celulas epiteliales cervicales, celulas epiteliales bronquiales, celulas epiteliales traqueales, celulas epiteliales renales y celulas epiteliales retinianas) y lmeas celulares establecidas y sus cepas (por ejemplo, celulas de rinon embrionario humano (por ejemplo, celulas 293, o celulas 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspension, Graham et al, 1977, J. Gen. Virol, 36:59); celulas de rinon de hamster recien nacido (BHK, ATCC CCL-10); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251); celulas de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL-2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CCL-34); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL-75); celulas de hepatoma humano (HEP-G2, HB 8065); celulas de tumor mamario de raton (MMT 060562, ATCC CCL-51); celulas hepaticas de rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442); celulas TRI (Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68); celulas MCR 5; celulas FS4; celulas retinianas PER-C6, celulas MDBK (NBL-1), celulas 911, celulas CRFK, celulas MDCK, celulas BeWo, celulas Chang, celulas Detroit 562, celulas HeLa 229, celulas HeLa S3, celulas Hep-2, celulas KB, celulas LS 180, celulas LS 174T, celulas NCI-H-548, celulas RPMI 2650, celulas SW-13, celulas T24, celulas WI-28 VA13, 2RA, celulas WTSH, celulas BS-C-T, celulas LLC-MK2, Clon de celulas M-3, celulas 1-10, celulas RAG, celulas TCMK-1, celulas Y-l, celulas LLC-PK1, celulas PK(15), celulas GH1, celulas GH3, celulas L2, celulas LLC-RC 256, celulas MH1C1, celulas XC, celulas MDOK, celulas VSW, y celulas TH-I, B1, o derivadas de las mismas), celulas fibroblastos de cualquier tejido u organo (incluyendo pero sin limitarse a corazon, fngado, rinon, colon, intestinos, esofago, estomago, tejido neural (cerebro, medula espinal), pulmon, tejido vascular (arteria, vena, capilar), tejido linfoide, (ganglio linfoide, adenoide, tonsila, medula osea y sangre), bazo, y lmeas celulares de fibroblastos o tipo fibroblastos (por ejemplo, celulas TRG-2, celulas IMR-33, celulas Don, celulas GHK-21, celulas de citrulinemia, celulas de Dempsey, celulas Detroit 551, celulas Detroit 510, celulas Detroit 525, celulas Detroit 529, celulas Detroit 532, celulas Detroit 539, celulas Detroit 548, celulas Detroit 573, celulas HEL 299, celulas IMR-90, celulas MRC-5, celulas WI-38, celulas WI-26, celulas Midi, celulas CV-1, celulas COS-1, celulas COS-3, celulas COS-7, celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); celulas DBS-FrhL-2, celulas BALB/3T3, celulas F9, celulas SV-T2, celulas M-MSV-BALB/3T3, celulas K-BALB, celulas BLO-11, celulas NOR-10, celulas C3H/IOTI/2, celulas HSDMiCs, KLN205, celulas McCoy, celulas Mouse L, celulas de la cepa 2071 (Mouse L), celulas de la cepa L-M (Mouse L), celulas L-MTK (Mouse L), celulas NCTC clones 2472 y 2555, celulas SCC-PSA1, celulas Swiss/3T3, celulas muntac Indias, celulas SIRC, celulas Cn, y celulas Jensen, o derivados de las mismas) o cualquier otro tipo celular conocido por el experto en la tecnica.

Las celulas pueden ser adecuadas para el cultivo adherente, monocapa y/o en suspension, transfeccion, y expresion de protemas, por ejemplo, anticuerpos. Las celulas se pueden utilizar, por ejemplo, con metodos de cultivo por lotes, semi-continuos y de perfusion o continuos.

Tipos de cultivos celulares

Para los fines de comprension, aunque sin limitacion, sera apreciado por el facultativo experto que los cultivos celulares y rondas de cultivo para la produccion proteica pueden incluir el cultivo por lotes, cultivo semi-continuo, cultivo de perfusion, o combinaciones de los mismos. En el cultivo por lotes, las celulas si cultivan inicialmente en el medio y este medio no se retira, sustituye ni suplementa, es decir, las celulas no se “alimentan” con medio reciente, durante o antes del final de la ejecucion de cultivo. El cultivo celular completo se recolecta al final de la ejecucion de cultivo.

Para los cultivos semi-continuos (fed-batch culture), el tiempo de ejecucion del cultivo aumenta suplementando el medio de cultivo periodica o continuamente con medio reciente durante la ejecucion, es decir, las celulas se “alimentan” con medio nuevo (“medio de alimentacion”) durante la ejecucion del cultivo. Los cultivos semi-continuo pueden incluir los distintos regfmenes de alimentacion y los tiempos como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, diariamente, dfa sf dfa no, cada dos dfas, etc., mas de una vez al dfa, o menos de una vez al dfa, y asf. Adicionalmente, los cultivos semi-continuos se pueden alimentar continuamente con el medio de alimentacion. El producto deseado se recolecta entonces al final de la ejecucion del cultivo.

El cultivo de perfusion, a veces conocido como cultivo continuo, es uno en el que el cultivo celular recibe la adicion de medio reciente (“medio de perfusion”) y el medio gastado se retira del biorreactor. La perfusion puede ser continua, por etapas, intermitente, o una combinacion de todos y cada uno de estos. Las velocidades de perfusion pueden ser menores que un volumen de trabajo a muchos volumenes de trabajo al d^ a. La expresion “caudal de perfusion” es la cantidad de medio que pada a traves (anadido o removido) de un biorreactor, normalmente se expresa como una parte o un multiplo del volumen de trabajo, en un tiempo determinado. “Volumen de trabajo” se refiere a la cantidad de volumen de biorreactor utilizado para el cultivo celular. En una realizacion el caudal de perfusion es un volumen de trabajo o menos por dfa. El medio de alimentacion de perfusion se puede formular para maximizar la concentracion de nutrientes de perfusion para minimizar la tasa de perfusion.

Preferentemente, las celulas se retienen en el cultivo y el medio gastado que se retira esta sustancialmente libre de celulas o tiene significativamente menos celulas que el cultivo celular. Las protemas recombinantes expresadas por el cultivo celular pueden retenerse o retirarse del cultivo celular, dependiendo del sistema de retencion utilizado. A veces es preferible que las celulas huesped y las protemas recombinantes expresadas permanezcan en el retenido del biorreactor y para el permeado que sea sustancialmente libre o tenga significativamente menos de cualquiera (“permeado nulo”). Otras veces es preferible retener las celulas, pero permitir que las protemas expresadas pasen al permeado (“permeado de cosecha”).

La perfusion se puede conseguir por varios medios que incluyen centrifugacion, sedimentacion, o filtracion, vease, por ejemplo, Voisard et al, (2003), Biotechnology and Bioengineering 82:751-65. En una realizacion se utiliza un metodo de filtracion. Los filtros incluyen filtros de membrana, filtros ceramicos y filtros metalicos y pueden tener cualquier forma, incluyendo enrollado en espiral o tubular o en forma de lamina. Se pueden conectar uno o mas filtros, en comunicacion fluida con un biorreactor juntos o independientemente, en serie o en paralelo.

Los filtros de fibra hueca se utilizan en el cultivo de perfusion de celulas de mairnfero para la retencion de celulas y/o producto proteico recombinante. Cuando el cultivo celular, incluyendo el medio de cultivo celular, las celulas (completas o lisadas), las protemas recombinantes solubles expresadas, protemas de las celulas huesped, productos de desecho y similares, se introducen en el filtro, dependiendo del tamano de poro o corte de peso molecular (MWCO) el material de fibra hueca puede retener ciertos componentes del cultivo celular en el lado de la luz (interior) y permitir que ciertos componentes pasen a traves del filtro (permeado) basandose en el tamano de poro o corte de peso molecular del material de fibra hueca. El material que se retiene (retenido) se devuelve al biorreactor. La perfusion medio de cultivo reciente se anade al biorreactor y el permeado se retira del filtro a intervalos predeterminados o continuamente para mantener un volumen de biorreactor constante o deseado. El permeado puede desecharse, almacenarse en contenedores de mantenimiento, bolsas o bolsos o se transfiere directamente a otra unidad de operacion, tal como filtracion, centrifugacion y/u otro metodo de purificacion corriente abajo o similares. Las fibras huecas para la microfiltracion normalmente tienen un tamano de poro que vana de 0,1 pm a 5-10 pm o un corte de peso molecular de 500 kDa o mas y se puede utilizar para permitir que la protema pase a traves del permeado. Las fibras huecas de ultrafiltracion normalmente tienen un tamano de poro de 0,01 pm a 0,1 pm o un corte de peso molecular de 300 kDa o menos, y puede utilizarse para retener la protema deseada en el retenido y devolverlo al biorreactor. Esto se puede utilizar, por ejemplo, para concentrar el producto proteico recombinante para la recoleccion. Dichos filtros estan disponibles en el mercado, tal como Xampler UFP-750-E-4MA, Xampler UFP-30-E-4MA, (GE Healthcare, Pittsburg, PA) y Midikros TC Modules T02-E030-10, T02-050-10, T02-E750-05, T02-M10U-06 (Spectrum Laboratories, Tnc, Dominguez, CA).

La invencion proporciona que cuando se recolecta el permeado nulo, el filtro es un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no permite que el producto proteico recombinante pase en el permeado y en vez de eso se retiene en el biorreactor. La invencion tambien proporciona que cuando se recolecta el permeado de cosecha, el filtro es un filtro de fibra hueca que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que permite a la protema recombinante pasar a traves de la fibra hueca.

El cultivo celular se extrae del biorreactor y en el filtro por un sistema de bombeo, que pasa el cultivo celular a traves del lado de la luz de la fibra hueca. Ejemplos de sistemas de bombeo celular incluyen bombas peristalticas, bombas de diafragma doble, bombas de baja cizalladura (Levitronix® pumps, Zurich, Suiza) y sistemas de flujo tangencial alternante (ATF™, Refine Technology, Pine Brook, NJ, vease, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 6.544.424; Furey (2002) Gen. Eng. News. 22 (7), 62-63.). El permeado puede extraerse de los filtros mediante el uso de bombas peristalticas.

Sistema de Filtro de una sola unidad

La invencion proporciona un sistema de filtro de una sola unidad que comprende dos o mas componentes del filtro de fibras huecas de diferentes tamanos de poro o cortes de peso molecular combinados en serie en un sistema de filtro de una sola unidad, opcionalmente contenido en una carcasa, que se puede operar mediante un unico dispositivo de bombeo celular. Esto mite la recoleccion en un modo de retencion de producto (retirando el permeado nulo) o un modo de recoleccion de producto (retirando el permeado de cosecha) mediante un sistema de un filtro (Figura 1). El sistema de filtro de una sola unidad ofrece las ventajas de retirar las protemas de la celula huesped y otros desechos del cultivo celular durante los ciclos de cosecha, prolongando la duracion del cultivo celular. El sistema de filtro de una sola unidad tiene potencialmente menos suciedad del filtro y por tanto una mayor eficacia de recoleccion. El sistema de filtro de una sola unidad puede proporcionar un permeado en multiples lotes mas pequenos para una carga mas facil y eficaz de las columnas de purificacion corriente abajo. El sistema de filtro de una sola unidad se puede utilizar como parte de un procedimiento de fabricacion continuo.

La configuracion del sistema de filtro de una sola unidad incluye dos o mas componentes de filtro de fibra hueca que tienen diferentes tamanos de poro o cortes de peso molecular, configurados en serie, de manera que todos los filtros estan en comunicacion fluida entre ellos y el biorreactor y se pueden operar por un unico dispositivo de bombeo. Dichos componentes del filtro de fibras huecas estan disponibles en GE Healthcare y Spectrum Laboratories, Inc., por ejemplo. Mientras el cultivo celular fluye a traves de todos los filtros, se puede retirar selectivamente el permeado de uno o mas filtros a la vez. El permeado (nulo o de cosecha) se retira retirando el permeado del componente de fibra hueca adecuado basandose en su tamano de poro o corte de peso molecular. El permeado nulo y el permeado de cosecha se retiran por separado e independientemente mediante el uso de bombas peristalticas individuales. La duracion y velocidad de la recoleccion del permeado se puede controlar mediante sus bombas peristalticas separadas.

Los componentes individuales de filtro de fibras huecas se pueden alinear en cualquier configuracion que sea adecuada para la aplicacion. En una realizacion los componentes del filtro de fibras huecas que tienen un tamano de poro o corte de peso molecular de manera que se retiene el producto de protema recombinante del cultivo celular en el retenido del biorreactor de cultivo celular se coloca de manera que sea el primero en recibir el flujo del cultivo celular del biorreactor.

La configuracion del sistema de filtro de una sola unidad permite que el permeado de cosecha y el permeado nulo se retiren del biorreactor de una manera segregada y de tal manera que la relacion volumetrica relativa y el tiempo de retirada se pueda controlar como se desee. El permeado se recolecta desde el sistema de filtro de una sola unidad a la misma velocidad que la velocidad de perfusion.

Ademas de utilizar componentes de filtro de fibras huecas disponibles en el mercado, el material de fibras huecas se puede construir para que tenga dos zonas separadas en un solo filtro que esten aisladas entre ellas por una zona de retencion. Tambien se pueden unir las fibras huecas separadas que tienen un tamano de poro o corte de peso molecular diferente mediante una zona conectora en medio del area de retencion para aislar los dos lados de permeado. Cada dominio de tamano de poro, a lo largo de la fibra hueca, tendna los lados de cubierta correspondientes aislados de los lados de las cubiertas de los otros dominios de tamano de poro de manera que el permeado se pueda retirar de cada lado de cubierta del dominio de tamano de poro independientemente de los otros.

Los filtros se pueden asegurar entre ellos por cualquier metodo que permita la comunicacion fluida entre los componentes del filtro de fibras huecas. Los componentes del filtro se pueden pegar o soldar entre ellos. Los filtros se pueden mantener unidos mediante una abrazadera, tal como una abrazadera tri clamp, u otro dispositivo mecanico que asegure juntas las unidades de filtro y permita la comunicacion fluida entre los filtros. La carcasa del filtro se puede proporcionar con regiones internas y externas roscadas que se van a usar para unir las unidades del filtro, sea directamente o mediante un acoplador de rosca. Los filtros tambien se pueden conectar por cualquier tipo de mecanismo de cierre.

El posicionamiento de dos filtros directamente extremo con extremo puede crear una union apretada o un ligero mal alineamiento entre las fibras huecas que puede que impida el flujo celular y produzca un dano celular debido al cizallamiento. Como resultado, podna haber una cafda de la viabilidad debido al alineamiento de los filtros. Se puede utilizar un espaciador o acoplador que proporciona alguna distancia entre las unidades de filtro adyacentes, permitina el flujo de las celulas con una transicion mas facil entre la luz de un filtro y la luz de la siguiente fibra hueca entre las unidades de filtro. El espaciador separa las unidades de filtro individuales entre ellas, permitiendo una via de flujo esteril entre las fibras huecas individuales a la vez que tambien se mantiene el aislamiento de los respectivos lados de cubierta hueca de los que se retira el permeado.

Dichos espaciadores se pueden fabricar de cualquier material que produzca una conexion segura y esteril entre los filtros y permita una comunicacion fluida entre los filtros. Dichos espaciadores pueden ser autosellantes de los filtros. Los espaciadores pueden pegarse o soldarse para que los filtros se mantengan unidos. El espaciador se puede asegurar a los filtros por un dispositivo mecanico que asegure el espaciador a los filtros tales como una abrazadera. El espaciador se puede proporcionar con regiones roscadas internas o externas para usarse para asegurar el espaciador a los filtros directamente o mediante un acoplador roscado. El espaciador tambien se puede conectar por cualquier tipo de mecanismo de cierre.

El sistema de filtro de una sola unidad se puede incluir opcionalmente en una carcasa externa para facilitar su uso, especialmente cuando se configuran mas de dos filtros en serie. La carcasa externa puede estar fabricada de plastico u otro material adecuado que mantenga una barrera esteril para el material de dentro de la unidad de filtro. La carcasa puede ser una segunda cubierta hecha para ajustarse sobre los filtros de fibras huecas disponibles en el mercado, o se puede fabricar la carcasa como la carcasa primaria para los filtros de fibras huecas conectados. La carcasa debena tener suficientes aberturas para permitir la introduccion y recoleccion de alimentacion y retenido, asf como al menos un puerto de permeado para cada filtro de fibras huecas que tenga diferente tamano de poro o corte de peso molecular.

El sistema de filtro de una sola unidad se puede utilizar en conjuncion con un unico sistema de bombeo celular que pasa el cultivo celular a traves del lado de la luz de la fibra hueca con un caudal constante, como se ha descrito anteriormente.

Procedimiento de cultivo celular

El cultivo celular se puede llevar a cabo en condiciones que se acomoden a la produccion a pequena a gran escala de protemas recombinantes utilizando recipientes de cultivo y/o aparatos de cultivo que se empelan convencionalmente para el cultivo de celulas animales o de mai^ero. Para el cultivo a mayor escala, se puede utilizar un equipamiento tal como sistemas de botellas rotatorias, sistemas de cultivo tipo lecho empaquetado, biorreactores de contenedor tipo fermentador, biorreactores de tipo de elevacion de aire, biorreactores de lecho fluidificado, biorreactores de celdas inmovilizadas, biorreactores de fibras huecas, biorreactores de contenedor con agitado, biorreactores multiestadio, biorreactores con centnfuga o cualquier otro dispositivo apropiado conocido por el experto en la tecnica. El equipamiento de bioprocesamiento de un solo uso, tal como los biorreactores de un solo uso tambien se pueden utilizar. Tambien se pueden utilizar microportadores con sistemas de biorreactor. Los sistemas se pueden operar en modo lotes, semi-continuo o de perfusion/continuo. Ademas,los recipientes de cultivo se pueden equipar con aparatos adicionales tales como separadores celulares utilizando filtros, gravedad, la fuerza centnfuga y similares.

La expresion “fase de crecimiento” de un cultivo celular se refiere al periodo de crecimiento celular exponencial (es decir, la fase logantmica) en el que las celulas en general se dividen rapidamente. Las celulas se mantienen en la fase de crecimiento durante un periodo de aproximadamente un dfa, o aproximadamente dos dfas, o aproximadamente tres dfas, o aproximadamente cuatro dfas, o mas de cuatro dfas. La duracion de tiempo en el que las celulas se mantienen en fase de crecimiento variara basandose en el tipo de celulas, la tasa de crecimiento de las celulas y/o las condiciones del cultivo, por ejemplo.

La expresion “fase de transicion” se refiere al periodo entre la fase de crecimiento y la fase de produccion. En general, la fase de transicion es el tiempo durante el cual las condiciones del cultivo se pueden controlar para que soporten un cambio de la fase de crecimiento a la fase de produccion. Se pueden controlar o modificar distintos parametros del cultivo celular para controlar el cambio, incluyendo, pero sin limitarse a uno a mas de entre la temperatura, osmolalidad, concentraciones de vitaminas, aminoacidos, azucares, amonio, acido lactico y sales o similares.

La expresion “fase de produccion” se refiere al periodo de tiempo en el que el crecimiento celular se aplana. El crecimiento celular logantmico normalmente desciende antes o durante esta fase, y la produccion de protema sube. Los procedimientos de cultivo celular semicontinuos y de perfusion suplementan el medio de cultivo celular o proporcionan medio reciente durante esta fase para conseguir y/o mantener la densidad celular, viabilidad y/o tftulo de producto proteico recombinante deseados. Una fase de produccion se puede llevar a cabo a gran escala. Los cultivos celulares a gran escala se pueden mantener en un volumen de al menos aproximadamente 100, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 8000, 10.000, 15.000, 20.000 litros o mas. En una realizacion preferida la fase de produccion se lleva a cabo en biorreactores de 500 l, 1000 l, y/o 2000 l.

La produccion de protemas recombinantes se puede llevar a cabo en multiples fases. En un procedimiento de multiples fases, las celulas se cultivan en dos o mas fases distintas. Normalmente, las celulas se cultivan primero en una o mas fases de crecimiento, en condiciones ambientales para maximizar la proliferacion y viabilidad celular, despues tienen una transicion a una fase de produccion, en condiciones ambientales que maximizan la produccion proteica. En un procedimiento comercial para la produccion de protemas recombinantes por celulas de mairnfero, hay comunmente multiples, por ejemplo, al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas fases de crecimiento que se producen en diferentes recipientes de cultivo (N-x a N-1) precediendo el final del cultivo de produccion. Las fases de crecimiento y produccion pueden estar precedidas, o separadas por una o mas fases de transicion. Una fase de produccion se puede llevar a cabo a gran escala. El metodo de acuerdo con la presente invencion se puede utilizar para extender la fase de produccion de un cultivo celular.

Cuando se preparan para la produccion comercial de una protema recombinante, los cultivos celulares que preceden el final de un cultivo de produccion normalmente discurren por medio de dos procesamientos, una serie de siembra y una serie de inoculo. La fase de la serie de siembra (N-X) tiene lugar a pequena escala en la que las celulas se expanden en numero rapidamente. En la fase de la serie de inoculo (N-1), las celulas se expanden adicionalmente para generar el inoculo para el biorreactor de produccion. Las series de siembra y N-1 se pueden producir por cualquier metodo de cultivo, normalmente cultivos por lotes. Densidades celulares N-1 de >15 x 106 celulas/ml son tfpicas para la siembra de biorreactores de produccion. Densidades de celulas N-1 mayores y/o que se ajusten al medio de cultivo celular pueden disminuir o incluso eliminar el tiempo necesario para alcanzar una densidad celular deseada en el biorreactor de produccion. En una realizacion, se consiguen densidades de celulas N-1 mayores mediante perfusion del cultivo utilizando una filtracion de flujo tangencial alternante. Un cultivo de celulas N-1 cultivado por medio de un procedimiento de perfusion utilizando filtracion de flujo tangencial alternante puede proporcionar celulas con cualquier densidad deseada, se pueden conseguir facilmente altas densidades celulares tales como densidades de >90 x 106 celulas/ml o mas. El cultivo celular N-1 se puede utilizar para generar un cultivo de inoculacion de unica embolada o se puede utilizar como un cultivo de reserva de siembra rotatorio que se mantiene para inocular multiples biorreactores de produccion. La densidad de inoculacion puede tener un impacto positivo en el nivel de protema recombinante producida. Los niveles de producto de protema recombinante tienen tienden a aumentar con el aumento de la densidad de inoculacion. La mejora del tttulo esta unida no solo a la mayor densidad de inoculacion, sino que probablemente esta influenciada por el estado metabolico y el ciclo celular de las celulas que se colocan en la produccion. Durante el procedimiento N-1 se puede permitir que el cultivo celular entre en la fase de produccion antes de la inoculacion en el biorreactor de produccion. Dicha inoculacion permite que la produccion comience inmediatamente en el biorreactor de produccion.

La expresion “densidad celular” se refiere al numero de celulas en un volumen determinado de medio de cultivo. “Densidad celular viable” se refiere al numero de celulas vivas en un volumen determinado de medio de cultivo, como se determina por ensayos de viabilidad convencionales (tales como el metodo de exclusion por tincion con azul tripano). La expresion “volumen celular empaquetado” (PCV), al que tambien se hace referencia como “porcentaje de volumen celular empaquetado” ( %PCV), es la relacion de volumen ocupado por las celulas, respecto al volumen total de cultivo celular, expresado como un porcentaje (vease Stettler, et al, (2006) Biotechnol Bioeng. Dec 20:95(6): 1228-33). El volumen celular empaquetado es una funcion de la densidad celular y el diametro celular; el aumento del volumen celular empaquetado aumenta con el incremento de la densidad celular o diametro celular o ambos. El volumen celular empaquetado es una medida del contenido solido del cultivo celular. Como las celulas huesped variaran de tamano y los cultivos celulares tambien contienen celulas muertas y moribundas y otros desechos celulares, el volumen celular empaquetado puede describir con un grado mayor de precision el contenido solido en un cultivo celular. Por ejemplo, un cultivo de 2000 l que tiene una densidad celular de 50 x 106 celulas/ml tendna volumenes celulares empaquetados muy diferentes dependiendo del tamano de las celulas. Ademas, algunas celulas aumentaran de tamano, tal como cuando estan en un estado de crecimiento detenido, de manera que los volumenes celulares empaquetados antes de la detencion del crecimiento y despues de la detencion del crecimiento seran probablemente diferentes debido al aumento en la biomasa como resultado del aumento de tamano celular. Un volumen celular empaquetado menor durante la fase de produccion ayuda a mitigar los problemas de salpicaduras con oxfgeno disuelto que dificultar los cultivos de perfusion con densidad celular mas alta. El volumen celular empaquetado menor tambien permite un volumen de medio menos que permita el uso de recipientes de almacenamiento de medio menores y puede combinarse con caudales mas lentos. El volumen celular empaquetado menor tambien tiene menos impacto sobre la recoleccion y procesamiento corriente abajo, en comparacion con cultivos de biomasa celular mayor. Todo lo cual reduce los costes asociados con la fabricacion de protemas terapeuticas recombinantes.

En una realizacion el metodo comprende adicionalmente que el volumen celular empaquetado durante una fase de produccion es menor o igual al 35 %. En una realizacion relacionada, el volumen celula empaquetado es menor o igual al 30 %.

En una realizacion la densidad celular viable del cultivo de celulas de mairnfero con un volumen celular empaquetado menor o igual al 35% es de 10 x 106 celulas/ml a 80 x 106 celulas viables/ml. En una realizacion relacionada la densidad celular viable del cultivo de celulas de m ai^ero es de 20 x 106 celulas viables/ml a 30 x 106 celulas viables/ml.

Controles del cultivo celular

Las condiciones del cultivo celular adecuadas para los metodos de la presente invencion son los que se emplean normalmente y se conocen para el cultivo de celulas por lotes, semi-continuo, o de perfusion (continuo) o cualquier combinacion de estos metodos, prestando atencion al pH, oxfgeno disuelto (O2), y dioxido de carbono (CO2), agitado y humedad, y temperatura. Durante la produccion de protema recombinante es deseable tener un sistema controlado en el que las celulas se cultivan durante un tiempo deseado o con una densidad deseada y entonces se cambia el estado fisiologico de las celulas a un crecimiento limitado o detenido, un estado de alta productividad en el que las celulas utilizan la energfa y sustratos para producir la protema recombinante en favor del aumento de la densidad celular. Para el cultivo celular a escala comercial y la fabricacion de productos terapeuticos biologicos, la capacidad para limitar o detener el crecimiento celular y ser capaz de mantener las celulas en un estado de crecimiento limitado o detenido durante la fase de produccion es muy deseable. Dichos metodos incluyen, por ejemplo, cambios de temperatura, uso de inductores qmmicos de produccion proteica, limitacion o privacion de nutrientes e inhibidores del ciclo celular, sean solos o en combinacion.

Uno de dichos mecanismos para limitar o detener el crecimiento es cambiar la temperatura durante el cultivo celular. Por ejemplo, una fase de crecimiento puede producirse a una temperatura mas alta, el cambio a una temperatura mas baja puede iniciar y/o mantener una fase de produccion. Por ejemplo, una fase de crecimiento puede producirse a un primer punto fijado de temperatura de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 38 °C, una fase de produccion se puede producir a un segundo punto fijado de temperatura de aproximadamente 29 °C a aproximadamente 37 °C, opcionalmente desde aproximadamente 30 °C a aproximadamente 36 °C o desde aproximadamente 30 °C a aproximadamente 34 °C.

El cambio del punto fijado de temperatura se puede hacer manualmente o se puede hacer automaticamente haciendo uso de los sistemas de control del biorreactor. El punto fijado de temperatura se puede cambiar en un momento predeterminado o en repuesta a uno o mas parametros del cultivo celular, tal como la densidad celular, tftulo, o concentracion de uno o mas de los componentes del medio. Uno de dichos metodos utiliza una herramienta de control de biomasa en lmea integrada en el sistema de control de biorreactor para desencadenar el tiempo del punto fijado de temperatura cuando se alcanza una densidad celular deseada. Por ejemplo, se puede utilizar una sonda de biomasa basada en la capacitancia para la estimacion de la densidad celular en lmea y los datos de las mediciones en lmea se pueden utilizar para desencadenar un cambio en la temperatura del biorreactor. Dichas sondas basadas en la capacitancia incluyen el sensor de capacitancia Fogale (DN12-200) (Nimes, Francia).

Ademas, se pueden anadir inductores qmmicos de la produccion proteica, tal como cafema, butirato, y/o hexametileno bisacetamida (HMBA), al mismo tiempo, antes, o despues del cambio de temperatura. Si se anaden inductores despues de un cambio de temperatura, se pueden anadir desde una hora a cinco dfas despues del cambio de temperatura, opcionalmente de uno a dos dfas despues del cambio de temperatura. Los cultivos celulares se pueden mantener durante dfas o incluso semanas mientras las celulas producen las protemas deseadas.

Otro metodo para mantener las celulas en un estado fisiologico deseado es inducir la detencion del crecimiento celular por la exposicion del cultivo celular a condiciones de L-asparagina baja y/o privacion de asparagina (vease, por ejemplo, la Publicacion WIPO N.° WO 2013/006479). La detencion del crecimiento celular se puede conseguir y mantener mediante un medio de cultivo que contenga una concentracion limitante de L-asparagina y manteniendo una concentracion baja de L-asparagina en el cultivo celular. El mantenimiento de la concentracion de L-asparagina a 5 mM o menos se puede utilizar para inducir y mantener celulas en un estado de detencion del crecimiento, aumentando de esta manera la productividad.

Los inhibidores del ciclo celular, compuestos conocidos o que se sospecha que regulan la progresion del ciclo celular y los procesos asociados a la transcripcion, reparacion de ADN, diferenciacion, senescencia y apoptosis relacionados con esto, tambien son utiles para detener el crecimiento celular. Los inhibidores del ciclo celular que interaction con la maquinaria del ciclo, como las quinasas dependientes de ciclina (CDK), son utiles, al igual que las moleculas que interaction con protemas de otras vfas (pathways), como AKT, mTOR y otras vfas que afectan, directa o indirectamente, al ciclo celular.

Recoleccion y purificacion

Las protemas recombinantes que se expresan se pueden secretar en el medio de cultivo del que se pueden recuperar y/o recolectar. Las protemas recombinantes se pueden someter entonces en una o mas etapas de procesamiento que incluyen la recoleccion, purificacion, inactivacion/filtracion de endotoxinas y/o virus, ultrafiltracion/diafiltracion en una formulacion farmaceutica adecuada y/o almacenamiento.

Las protemas recombinantes expresadas se pueden capturar en el permeado de cosecha. Las protemas se pueden purificar, o purificarse parcialmente, a partir de los permeados de cosecha utilizando procedimientos y productos disponibles en el mercado conocidos en la tecnica y/o disponibles en vendedores comerciales. Dichos metodos incluyen floculacion; centrifugacion; precipitacion; metodos de filtracion tales como filtracion profunda; metodos de cromatograffa que incluye, cromatograffa de afinidad, cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de intercambio anionico de modo mixto, cromatograffa de interaccion hidrofoba y cromatograffa con hidroxiapatita, entre otros metodos disponibles.

Las protemas purificadas pueden entonces “formularse”, que significa intercambiar el tampon, esterilizadas, empaquetadas en volumen, y/o empaquetados para un usuario final. Las formulaciones adecuadas para las composiciones farmaceuticas incluyen los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Tecnicas de procesamiento anafftico

Las tecnologfas del procesamiento anafftico y los metodos estan disponibles para controlar y evaluar las muestras que se toman durante el cultivo celular y los procedimientos de purificacion para controlar cuantitativa y/o cualitativamente las caractensticas de la protema recombinante y el procedimiento de produccion. Esta informacion en tiempo real o en lmea se puede utilizar para verificar y/o controlar el producto y los parametros de produccion, tal como el fftulo, densidad celular; atributos de calidad de producto tal como modificaciones de la traduccion; variabilidad del producto o procesamiento tal como impurezas y similares, para tomar decisiones a punto y modificar los procesamientos segun sea necesario. Por ejemplo, los atributos de calidad del producto tal como distribucion de especies de glicano, niveles de oxidacion o desamidacion se pueden verificar y/o controlar.

Cada etapa de un procesamiento de cultivo celular corriente arriba o un procedimiento de purificacion corriente abajo se puede controlar para proporcionar la informacion acerca de la cantidad de un atributo de calidad de producto particular (PQA) y para controlar este PQA con una diana e intervalo determinados.

Las muestras se pueden tomar intermitentemente, a frecuencias deseadas, o continuamente. Las muestras se pueden analizar en tiempo real o casi en tiempo real o almacenarse para su analisis posterior. Esta informacion se puede utilizar para hacer cambios durante los procedimientos corriente arriba y corriente abajo.

La deteccion de un atributo de calidad de producto se puede hacer utilizando una espectrometna de masas, cromatograffa Kquida con UV y/o deteccion espectrometrica y electroforesis de capilaridad y similares.

Estos procesamientos son adaptables para el control continuo con ajustes manuales o automaticos del procedimiento tales como las alimentaciones, temperatura, duracion del procedimiento como se determina por el nivel de un atributo de calidad del producto especificado.

El analisis de masa intacta para detectar la presencia de modificaciones postraduccionales tales como el procesamiento de aminoacidos y la glicosilacion se puede hacer utilizando una columna de polihidroxietil aspartamida operada en modo de exclusion por tamano y acoplada con una ESI-MS (Brady et al, (2008) J Am Soc Mass Spectro, 19: 502-509).

Control del elrndo en tiempo real de la cromatograffa de intercambio ionico controlando una relacion LS/UV normalizada para cada fraccion utilizando un detector de dispersion de luz laser y una absorbancia de UV, vease la Publicacion de patente de EE. UU. N.° 2013-0303732.

Los metodos multi atributo utilizan cromatograffa lfquida/ espectrometna de masas (LC/MS) para buscar y caracterizar los datos de MS en tandem utilizando distintas plataformas de busqueda y bases de datos tales como Sequest (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA), X! Tandem (The Global Proteome Machine Organization) o Mascot (Matrix Science, Boston, MA). Las muestras se pueden desnaturalizar a pH alto o mantener las isoformas disulfuro y proteger las variantes succinimida, a pH bajo. La muestra se reduce y se alquila entonces seguido por la digestion con tripsina. La muestra se inyecta entonces en una MS (tal como un Espectrometro de Masas Iffbrido Orbitrap-Tetrapolar, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) y se lleva a cabo el analisis utilizando el software Pinpoint (Thermo Fischer Scientific). Los atributos que se pueden identificar, cuantificar y controlar incluyen la isomerizacion, desaminacion, reduccion de disulfuro, contaminacion con protemas de la celula huesped, mutaciones, malas incorporaciones, hidroxilisina, tioeter, cadenas pesadas no glicosiladas, amidacion del extremo C, Protema A residual, caracterizar glicanos y proporcionar una identidad de molecula. La precision de masa de cada atributo controlado se puede fijar a menos de 5 ppm de la masa prevista. La identificacion del peptido/atributo se confirma por metodos de fragmentacion MS2 y caracterizacion ortogonal (HILIC-MS para la glicosilacion, por ejemplo). La distribucion isotopica experimental debe tener un punto de puntuacion del producto mejor de 0,95 cuando se compara con la distribucion isotopica teorica. Se fija una ventana de tiempo de retencion para cada atributo y se consideran todos los estados de carga detectables para cada atributo para la cuantificacion. Se definen criterios que detectaran cambios en el atributo. Por ejemplo, se puede controlar la desaminacion determinado un valor de desaminacion (peptido desaminado dividido por la suma del peptido desaminado y el peptido parental sin modificar multiplicado por 100. La glicosilacion se puede controlar comparando cada glicano espedfico con la suma de todos los glicanos detectables.

En algunas realizaciones las tecnologfas de procesamiento analffico pueden incluir tambien el “control de atributos del producto” (PAC). El PAB combina multiples elementos PAT con un modelo del bioprocesamiento para actuar como un control de retroalimentacion en tiempo real de uno o mas CQA. Este nuevo procedimiento de PAC es un ejemplo de la implementacion de la produccion QbD de biofarmaceuticos. El procedimiento PAC se basa en el uso de una palanca de control que puede tener impacto sobre el CQA. La palanca de control se incorpora en un bucle de control basado en un modelo para mantener el CQA en la diana deseada como se especifica en el QTPP. Espedficamente, una palanca de control es un ajuste de un parametro del procesamiento que tiene un impacto sobre un CQA de una manera que se puede modelar matematicamente. Por ejemplo, los niveles de un inhibidor o activador se pueden ajustar dinamicamente para regular la actividad de la glicosilacion enzimatica para regular el perfil de glicosilacion de un producto, a condicion de que su impacto se pueda modelar matematicamente. Al igual se podna ajustar la temperatura o el pH durante una ejecucion a condicion de que su impacto sobre los CQA tambien se pueda modelar de manera fiable.

Protemas

Como se utiliza a lo largo del presente documento “peptido”, “polipeptido” y “protema” se utilizan de manera intercambiable y se refiere a una molecula que comprende dos o mas restos de aminoacidos unidos entre ellos por enlaces pepffdicos. Los peptidos, polipeptidos y protemas tambien incluyen las modificaciones que incluyen, pero no se limitan a, glicosilacion, union de lfpidos, sulfacion, gamma-carboxilacion de restos de acido glutamico, hidroxilacion y ADP- ribosilacion.

Las protemas pueden ser de interes cienfffico o comercial, incluyendo los farmacos basados en protemas. Las protemas incluyen, entre otras cosas, anticuerpos, protemas de fusion, y citocinas. Los peptidos, polipeptidos y protemas pueden producirse por lmeas celulares procariotas o eucariotas utilizando metodos de cultivo celular y se puede hacer referencia a los mismos como “peptido recombinante”, “polipeptido recombinante”, “protema recombinante”, “producto proteico recombinante” y “producto”. Las protemas expresadas se pueden producir intracelularmente o se secretan en el medio de cultivo del que se recuperan y/o recolectan.

Ejemplos no limitantes de protemas de mairnfero que se pueden producir ventajosamente por los metodos de la presente invencion incluyen las protemas que comprenden secuencias de aminoacidos identicas o sustancialmente similares en todo o en parte de las siguientes protemas: factor de necrosis tumoral (TNF), ligando flt3 (documento WO 94/28391), eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, IL-2, angiopoyetina-2 (Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322): 55-60), ligando del activador receptor de NF-kappa B (RANKL, WO 01/36637), ligando inducido por apoptosis relacionada con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL, WO 97/01633), linfopoyetina derivada del estroma tfmico, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitosmacrofagos (GM-CSF, Patente australiana N.° 588819), factor de crecimiento de mastocitos, factor de crecimiento de celulas madre (Patente de EE. UU. N.° 6.204.363), factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de desarrollo y crecimiento de megacariocitos, RANTES, protema 2 tipo fibrinogeno humano (FGL2; n° de registro de NCBI NM_00682; Riiegg y Pytela (1995), Gene 160:257-62), hormona de crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento tipo insulina, hormona paratiroidea, interferones incluyendo, interferones a, interferones y e interferones de consenso (Patentes de EE. UU. N.° 4.695.623 y 4.897.471), factor de crecimiento de nervios, factor neurotrofico derivado del cerebro, protemas tipo sinaptotagmina (SLP 1-5), neurotrofina-3, glucagon, interleucinas, factores estimulantes de colonias, linfotoxina-p, factor inhibidor de leucemia, y oncostatina-M. Las descripciones de las protemas que se pueden producir de acuerdo con los metodos inventivos se pueden encontrar en, por ejemplo, Citocinas Humanas: Handbook for Basic and Clinical Research, Volumenes 1 3 (Aggarwal y Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Factores de Crecimiento: A Practical Approach (McKay y Brown, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1998) todas las ediciones; y The Cytokine Handbook, Vols. 1 y 2 (Thompson y Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003).

De manera adicional, los metodos de la invencion senan utiles para producir protemas que comprenden toda o parte de la secuencia de aminoacidos de un receptor para cualquiera de las protemas mencionadas anteriormente, un antagonista de dicho receptor o cualquiera de las protemas mencionadas anteriormente y/o protemas sustancialmente similares a dichos receptores o antagonistas. Estos receptores y antagonistas incluyen: ambas formas del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR, a los que se hace referencia como p55 y p75, Patente de EE. UU. N.° 5.395.760 y Patente de EE. UU. N.° 5.610.279), receptores de Interleucina-1 (IL-1) (tipos I y II; Patente EP No. 0460846, Patente de EE. UU. N.° 4.968.607, y Patente de EE. UU. N.° 5.767.064,), antagonistas del receptor IL-1 (Patente de EE. UU. N.° 6.337.072), antagonistas o inhibidores de la IL-1 (Patente de EE. UU. N.° 5.981.713, 6.096.728, y 5.075.222) receptores de la IL-2, receptores de la IL-4 (Patente EP N.° 0367566 y Patente de EE. UU. N.° 5.856.296), receptores de la IL-15 , receptores de la IL-17 , receptores de la IL-18 , receptores de Fc , receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos, receptor del factor estimulante de colonias, receptor del factor estimulantes de colonias de granulocitos, receptores para la oncostatina-M y factor inhibidor de leucemia, receptor del activador del NF-kappa B (RANK, documento WO 01/36637 y Patente de EE. UU. N.° 6.271.349), osteoprotegerina (Patente de EE. U^u. N.° 6.015.938), receptores para TRAIL (incluyendo los receptores de TRAIL 1, 2, 3, y 4), y receptores que comprenden dominios de muerte tal como Fas o el receptor inductor de apoptosis (Apoptosis Inducing Receptor, AIR).

Otras protemas que se pueden producir utilizando la invencion incluye protemas que comprenden tas o parte de las secuencias de aminoacidos de antfgenos diferenciacion (a los que se hace referencia como protemas CD) o sus ligandos o protemas sustancialmente similares a cualquiera de estas. Dichos antfgenos se desvelan en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the Vlth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japon, 1996). De manera similar, las protemas CD se desvelan en talleres posteriores. Ejemplos de dichos antfgenos incluyen CD22, CD27, CD30, Cd 39, CD40, y ligandos de los mismos (ligando de CD27, Ligando de C30, etc.). Varios de los antfgenos CD son miembros de la familia del receptor de NTF, que tambien incluyen 41BB y OX40. Los ligandos son a menudo miembros de la familia del TNF, como son el ligando 41BB y OX40.

Las protemas enzimaticamente activas o sus ligandos tambien se pueden producir utilizando la invencion. Ejemplos incluyen las protemas que comprenden todo o parte de una de las siguientes protemas o sus ligandos o una protema sustancialmente similar a una de estas: una desintegrina y miembros de la familia con un dominio de metaloproteinasa incluyendo la enzima convertidora del TNF-alfa, distintas cinasas, glucocerebrosidasa, superoxido dismutasa, activador del plasminogeno tisular, Factor VIII, Factor IX, apolipoprotema A-I, globinas, un antagonista de IL-2, antitripsina alfa-1, ligando de cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente, y otras numerosas enzimas y sus ligandos.

El termino “anticuerpo” incluye la referencia a inmunoglobulinas glicosiladas y no glicosiladas de un isotipo o subclase o una region de union al antfgeno que compite con el anticuerpo intacto por la union espedfica, a menos de que se especifique otra cosa, incluyendo humanos, humanizados, quimericos, multiespedficos, monoclonales, policlonales, y oligomeros o fragmentos de union al antfgeno de los mismos. Tambien se incluyen protemas que tienen un fragmento de union al antfgeno o region tal como Fab, Fab', F(ab')2, Fv, diacuerpos, Fd, dAb, maxicuerpos, moleculas de anticuerpo de cadena sencilla, fragmentos de la region determinante de complementariedad (CDR), scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y polipeptidos que contiene al menos una porcion de una inmunoglobulina que sea suficiente para conferir una union espedfica del antfgeno a un polipeptido diana. El termino “anticuerpo” es inclusivo, pero no se limita a, los que se preparan, expresan, crean o afslan por medos recombinantes, tales como los anticuerpos aislados de una celula huesped transfectada para expresar el anticuerpo.

Ejemplos de anticuerpos incluyen, por no se limitan a, los que reconocen una cualquiera o una combinacion de protemas que incluyen, pero no se limitan a, las protemas mencionadas anteriormente y/o los siguientes antigenos: CD2, CD3, CD4, CD8, CD 11 a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, subunidades del receptor de la IL-2, receptor de la IL-4, receptor de la IL-6, receptor de la IL-13, receptor de la IL-18, FGL2, PDGF-p y analogos del mismo (vease Patente de EE. UU. N.° 5.272.064 y 5.149.792), VEGF, TGF, TGF-p2, TGF-pi, EGF receptor (vease Patente de EE. UU. N.° 6.235.883) receptor del VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, ligando de osteoprotegerina, interferon gama, estimulador de linfocitos B (BlyS, tambien conocido como BAFF, THANK, TALL-1, y zTNF4; vease Do y Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25), complemento C5, IgE, antigeno tumoral CA125, antigeno tumoral MUC1, antigeno PEM, LCG (que es un producto genetico que se expresa en asociacion con el cancer de pulmon), HER-2, HER-3, una glicoprotema asociada a tumores TAG-72, el antigeno SK-1, epftopos asociados con tumores que estan presentes con niveles elevados en el suero de pacientes con cancer de colon y/o pancreatico, epftopos asociados con el cancer o protemas que se expresan en celulas cancerosas de mama, colon, celulas escamosas, prostata, pancreas, pulmon, y/o rinon y/o celulas de melanoma, glioma o neuroblastoma, el centro necrotico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, receptores TRAIL 1, 2, 3, y 4, RANK, ligando RANK, TNF-a, la molecula de adhesion VAP-1, molecula de adhesion celular epitelial (EpCAM), molecula-3 de adhesion intercelular (ICAM-3), adhesina leucointegrina, glicoprotemas de plaquetas gp Ilb/NIa, cadena pesada de miosina cardfaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un inhibidor del factor tisular Vila), MHC I, anftgeno carcinoembrionario (CEA), alfa-fetoprotema (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un anftgeno asociado a linfocitos T citotoxicos), receptor Fc-y-1, HLA-DR 10 beta, antfgeno HLA-DR, esclerostina, L-selectina, Virus sincitial respiratorio, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de hepatitis B (VHB), Streptococcus mutatis, y Staphylococcus aureus. Ejemplos espedficos de anticuerpos conocidos que se pueden producir utilizando los metodos de la invencion incluyen, pero no se limitan a, adalimumab, bevacizumab, infliximab, abciximab, alemtuzumab, bapineuzumab, basiliximab, belimumab, briakinumab, canakinumab, certolizumab pegol, cetuximab, conatumumab, denosumab, eculizumab, gemtuzumab ozogamicin, golimumab, ibritumomab tiuxetan, labetuzumab, mapatumumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, muromonab-CD3, natalizumab, nimotuzumab, ofatumumab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, rovelizumab, tocilizumab, tositumomab, trastuzumab, ustekinumab, vedolizomab, zalutumumab, y zanolimumab.

La invencion tambien se puede utilizar para producir protemas de fusion que comprenden, por ejemplo, cualquiera de las protemas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, protemas de fusion recombinantes que comprenden una de las protemas mencionadas anteriormente mas un dominio de multimerizacion, tal como una cremallera de leucina, un superenrollamiento, una parte Fc o una inmunoglobulina, o una protema sustancialmente similar, se pueden producir utilizando los metodos de la invencion. Vease, por ejemplo, el documento WO 94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262:1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83; Hakansson et al. (1999), Structure 7:255-64. Espedficamente se incluyen entre dichas protemas de fusion recombinantes protemas en los que una parte de un receptor se fusiona con una porcion Fc de un anticuerpo tal como el etanercept (un p75 TNFR: Fc) y belatacept (CTLA4: Fc). Las protemas y polipeptidos quimericos, asf como los fragmentos o porciones, o mutantes, variantes, o analogos de cualquiera de las protemas y polipeptidos mencionados anteriormente tambien se incluyen entre las protemas, polipeptidos y peptidos adecuados que se pueden producir por los metodos de la presente invencion.

Aunque la terminologfa utilizada en la presente solicitud es convencional en la tecnica, se proporcionan en el presente documento definiciones de ciertos terminos para asegurar la claridad y definicion del significado de las reivindicaciones. Las unidades, prefijos y sfmbolos se pueden denotar en su forma del SI aceptada. Los intervalos numericos mencionados en el presente documento son inclusivos de los numeros que definen el intervalo e incluyen y comprenden cada uno de los numeros enteros en el intervalo definido. Los metodos y tecnicas descritos en el presente documento se llevan a cabo de acuerdo con metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y como se describe en distintas referencias generales y mas espedficas que se citan y exponen a lo largo de la presente especificacion a menos de que se indique otra cosa. Vease, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1995), y Greenfield, Antibodies: A Laboratory Manual 2a ed„ Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2013), o cualquier edicion anterior.

Ejemplos

Ejemplo 1

Procedimiento de cultivo celular periodico extendido

Este experimento describe un procedimiento de cultivo celular con recoleccion periodica extendida (X-PH) en comparacion con un procedimiento de cultivo con ultrafiltracion (UF). Para el procedimiento periodico extendido, se llevo a cabo la perfusion utilizando un sistema de filtro de una sola unidad que comprendfa un ultrafiltro que tema un tamano de poro o MWCO de manera que el producto proteico recombinante del cultivo celular se retema en el retenido del biorreactor de cultivo celular conectado a un microfiltro que tema un tamano de poro o corte de peso molecular de manera que la protema recombinante de interes se llevaba en el permeado y se recolectaba como producto cosechado. La perfusion se llevo a cabo extrayendo el permeado libre de protema, o permeado nulo, del componente de ultrafiltro hasta que se alcanzaba un parametro determinado, en este caso dfas de cultivo, en cuyo momento se llevo a cabo la perfusion extrayendo el permeado que contema la protema recombinante, o permeado de cosecha, del componente de microfiltro, durante un tiempo predeterminado. Despues de que el tiempo predeterminado terminaba, se repetfa el procedimiento. Este ciclo de retencion y recoleccion del producto proteico se repetfa hasta que terminaba el cultivo.

Para el procedimiento de ultrafiltracion del cultivo, se cultivaron las celulas en un sistema de perfusion utilizando un ultrafiltro con un tamano de poro o corte de peso molecular de manera que el producto proteico recombinante se retema en el retenido del biorreactor de cultivo celular y se recolectaba un permeado libre de protema recombinante. El producto proteico recombinante se recuperaba como una cosecha del biorreactor cuando se terminaba el cultivo. Procedimiento de cultivo con recoleccion periodica extendida (X-PH)

El dfa 0, se inocularon celulas CHO que expresaban un anticuerpo recombinante en dos biorreactores de 2 litros (Applikon, Foster City, CA) a 1 x 106 celulas viables/ml en un volumen de trabajo de 1500 ml de un medio por lotes definido qmmicamente libre de suero. Los cultivos se mantuvieron a 36 °C, una DO a 48,0 mm de Hg, agitado a 350 RPM.

Los cultivos celulares se iniciaron en modo de lotes, se comenzo la perfusion el dfa 2 utilizando un sistema de filtracion de flujo tangencial alternante ATF-2™ (Refine Technologies, Hanover, NJ) utilizando un filtro de fibras huecas de 30 cm 20 kDa (Xampler UFP-30-E-4MA, GE Healthcare, Pittsburg, PA) conectado en serie con un filtro de fibras huecas 30 cm con 750 kDa (Xampler UFP-750-E-4MA, GE Healthcare). Los filtros se unieron con una pieza conectora de bobina sanitaria de aproximadamente 2,5 cm de longitud utilizando abrazaderas sanitarias. El medio era un medio de perfusion definido qmmicamente libre de suero que contema 1,5 g/l de pluronic (Kolliphor P188 SAFC Biosciences, ST. Louis, MO).

La velocidad de perfusion se aumento gradualmente desde 0,5 a 1,0 volumenes de trabajo del biorreactor/dfa durante la ejecucion del cultivo celular y era uniforme a traves de la unidad de filtro. Se recolectaron los permeados nulos y de cosecha, mediante bombas de perfusion independientes, a la misma velocidad que la velocidad de perfusion. Se tomaron muestras diarias del biorreactor para evaluar el cultivo. La densidad celular viable (VCD) y la viabilidad se determinaron utilizando Vi-Cell (Beckman Coulter, Brea, CA). El tftulo se midio por analisis HPLC. Para el analisis de glicanos, se recolectaron muestras que conteman protema y se purificaron por Protema A. Las muestras purificadas se trataron con PNGasa-F y se incubaron a 37 °C durante 2 horas para liberar los glicanos unidos a N. Los glicanos liberados enzimaticamente se marcaron con acido 2-aminobenzoico (2-AA) a 80 °C durante 75 minutos. El escaso de marcador 2-AA se retiro con un cartucho Glycoclean S. Las muestras se evaporaron durante una noche y el aglomerado seco resultante se reconstituyo con agua para el analisis HILIC (cromatograffa ftquida de interaccion hidrofila) posterior. Los glicanos se inyectaron y unieron a la columna en condiciones organicas altas y se eluyeron con un gradiente creciente de un tampon de formato amonico. La deteccion de fluorescencia se utilizo para controlar la elucion de glicano y se calculo el porcentaje relativo de las especies de glicano mayores y menores.

Antes del dfa 11, el permeado nulo, o permeado que no contema producto, se recolecto continuamente extrayendo el permeado desde el ultrafiltro de 75 kDa utilizando una bomba peristaltica (Watson Marlow 120U/DV Falmouth, Cornwall, RU) y se desecho. Debido al tamano del filtro, el producto proteico del cultivo celular se retuvo en el retenido del biorreactor de cultivo celular.

El permeado de cosecha, o permeado que contiene el producto, se recolecto en cinco veces separadas predeterminadas durante la ejecucion del cultivo celular, de acuerdo con la programacion proporcionada en la Tabla 1. El permeado de cosecha se recolecto extrayendo el permeado del microfiltro de 30 kDa utilizando una bomba peristaltica (Watson Marlow 120U/DV Falmouth, Cornwall, RU). El producto proteico del cultivo celular se llevaba en el permeado y se recolecto como parte del permeado de cosecha. El permeado de cosecha se evaluo en cuanto al tftulo y calidad del producto como se ha descrito anteriormente. El permeado de cosecha se almaceno en bolsas de permeado (RCBB-300, RIM Bio Inc., Seattle, WA).

T l 1. Pr r m i n r l i n l rm h

Inmediatamente despues de completar la recoleccion de cada uno de los permeados de cosecha, se recolecto de nuevo un permeado nulo continuamente desde el filtro ultrafiltro de 750 kDa y se desecho. El cultivo se termino despues de la recoleccion del permeado de cosecha el dfa 24.

Procedimiento de cultivo ultrafiltro (UF)

El dfa 0, se inocularon celulas CHO que expresaban el mismo anticuerpo recombinante como anteriormente en cuatro biorreactores de 2 litros (Applikon, Foster City, CA) a 1 x 106 celulas viables/ml en un volumen de trabajo de 1500 ml de un medio por lotes definido qmmicamente libre de suero. Los cultivos se mantuvieron a 36 °C, una DO a 48,0 mm de Hg, agitado a 350 RPM.

Los cultivos celulares se iniciaron en modo de lotes, se comenzo la perfusion el dfa 2 utilizando un sistema de filtracion de flujo tangencial alternante ATF-2™ (Refine Technologies, Hanover, NJ) equipado con un filtro de fibras huecas de 60 kDa (Xampler UFP-30-E-4MA, GE Healthcare, Pittsburg, PA). El medio era un medio de perfusion definido qmmicamente libre de suero que contema 1 g/l de pluronic (Kolliphor P188 SAFC Biosciences, ST. Louis, MO).

La velocidad de perfusion se aumento gradualmente desde 0,5 a 1,0 volumenes de trabajo M a durante la ejecucion del cultivo celular. Se tomaron muestras diarias para evaluar el cultivo. La densidad celular viable (VCD) y la viabilidad se determinaron utilizando Vi-Cell (Beckman Coulter, Brea, CA). El tftulo se midio por analisis HPLC. El permeado se recolecto a la misma velocidad que la velocidad de perfusion. Debido al tamano del filtro, el producto proteico del cultivo celular se retuvo en el retenido en el biorreactor de cultivo celular hasta la recoleccion cuando el cultivo se termino el dfa 15.

El perfil de tftulo del procedimiento X-PH era consistente con el tftulo del procedimiento de cultivo UF hasta el dfa 11 (Figura 2). Los perfiles de tftulo separados cuando el primer ciclo de cosecha de 750 kDa se introduce en el procedimiento X-PH. Se observo una correspondencia similar en la densidad celular viable (Figura 3) y el % de viabilidad (Figura 4).

Se utilizo un periodo de produccion en el biorreactor de cincuenta y un dfas para permitir la comparacion del procedimiento X-PH con el procedimiento UF con un periodo de carga y descarga asignado de tres dfas del biorreactor de produccion entre ejecuciones. Con este criterio, se hanan dos ejecuciones de procedimiento X-PH de 24 dfas y tres ejecuciones de procedimiento UF en un periodo comparable de cincuenta y un dfas.

El procedimiento X-PH proporcionana un 98 % mas de producto recuperado en comparacion con el procedimiento UF durante un periodo de produccion de 51 dfas (Tabla 2). Esto comprende principalmente un 26 % de aumento en la densidad celular viable integrada (IVCD) y un 46 % de aumento en la productividad espedfica. El procedimiento X-PH utilizana un 27 % mas de medio en dos ejecuciones con respecto a las tres ejecuciones del procedimiento UF, pero esto se traduce en un ~36 % de reduccion de las necesidades de medio (coste del medio) por gramo de producto producido por el procedimiento X-PH en comparacion con el procedimiento UF.

Tabla 2. Producto recuperado durante el periodo de fabricacion de 51 dfas en un biorreactor de 2 l con un volumen r 1 l

La calidad del producto del procedimiento X-PH se evaluo por mapeo de glicano por HILIC y se comparo con una referencia generada utilizando un procedimiento UF de 15 dfas (Tabla 3). Los atributos del mapa de glicano del procedimiento X-PH son consistentes con la referencia que utiliza el procedimiento UF.

T l . An li i li n r HILI

Ejemplo 2

El presente experimento compara el impacto de concentraciones bajas y altas del copolfmero polioxipropilenopolioxietileno, Lutrol® F68, y filtros de 30 kDa frente a 750 kDa en un sistema de cultivo de perfusion.

El dfa 0, se inoculo una lmea celular CHO que expresaba un anticuerpo recombinante en cuatro biorreactores de 2 l (Applikon Biotechnology, Foster City, CA) a 2 x 106 celulas viables/ml en un volumen de trabajo de 1500 ml de un medio de perfusion definido qmmicamente que conterna 1 g/l de Lutrol® F68 (BASF, Mt Olive, NJ). Los cultivos se manternan a 36 °C, concentracion de oxfgeno disuelto del 48 %, pH 6,9, agitado a 350 RPM.

Las ejecuciones de cultivo celular se iniciaron en modo por lotes; la perfusion comenzo el dfa 2 cuando las densidades celulares alcanzaban 4-5 x 106 celulas/ml. La perfusion se consiguio utilizando un sistema de filtracion y perfusion de flujo tangencial alternante ATF-2™ (Refine Technologies, Hanover, NJ). Se hada circular al cultivo celular continuamente a traves del lado de la luz de un filtro externo orientado verticalmente, entrando por la parte superior. El permeado se retiraba continuamente mediante una bomba peristaltica. Se equiparon dos reactores con filtros de fibras huecas de 30 kDa (Xampler UFP-30-E-4MA, GE Healthcare, Pittsburg, PA). Se equiparon dos reactores con filtros de fibras huecas de 750 kDa (Xampler UFP-750-E-4MA, GE Healthcare, Pittsburg, PA).

La velocidad de perfusion se aumentaba gradualmente de 0,5 a 3 ml/minuto durante la ejecucion del cultivo celular. Las muestras de permeado se recolectaron a la misma velocidad que la velocidad de perfusion. Las muestras se tomaron una vez al dfa del biorreactor y la lmea de permeado. La densidad celular, viabilidad y diametro celular se midieron mediante CEDEX (Roche, Nutle, NJ) despues de la dilucion con solucion salina de tampon de fosfato para obtener una densidad celular de <107 celulas/ml. El pH y la presion parcial de CO2 (pCO2) y O2 (pO2) se midieron utilizando un analizador de gases sangumeos; concentracion de glucosa, lactato, glutamina, amonio y concentraciones de iones de K y Una se mantuvieron con un instrumento NovaFLEX (Nova Biomedical, Waltham, MA).

En los reactores equipados con un filtro de 750 kDa, la viabilidad celular disminrna hasta el 80 % el Dfa 6. La disminucion no era tan pronunciada en los reactores equipados con los filtros de 30 kDa en los que la viabilidad se mantema por encima del 80 % durante 14 dfas (Figura 5).

Se vefa una acumulacion de hasta 7 g/l de Lutrol® F68 en el sobrenadante de los reactores equipados con el filtro de fibras huecas de 30 kDa. En estas condiciones el Lutrol® F68 era menor que los niveles detectables en las muestras de permeado. En los reactores equipados con el filtro de 750 kDa, los niveles de Lutrol® F68 en el sobrenadante del biorreactor y el permeado se mantema relativamente constante y similar a los niveles en el medio de perfusion, varando de 1-1,5 g/l, sugiriendo que no habfa acumulacion (Figura 6). La masa molar media de Lutrol® F68 es de 8.400 Da y teoricamente debena fluir a traves del filtro de 30 kDa. La formacion de micelas de Lutrol® F68 puede producirse a concentraciones muchos menores de 1 g/l (0,04 mM a 20-25 °C, de acuerdo con el fabricante). Es probable que la concentracion de Lutrol® F68 aumentaba debido a la formacion de micelas en el reactor o el filtro.

Estudios de toxicidad de Lutrol® F68

Para ensayar el efecto de la toxicidad de la alta concentracion de Lutrol® F68 sobre las celulas, se llevaron a cabo 10 pasajes (de 3 dfas por pasaje) con dos lmeas celulares de CHO (Lmea celula A y Lmea celular B) que expresaban diferentes anticuerpos monoclonales , con una densidad de siembra inicial de 8 x 105 celulas/ml en recipientes de 250 ml con agitado con un medio de cultivo que contema 1,2, 3, 4 o 5 g/l de Lutrol® F68.

Se observo un aumento total de la densidad celular (3,4-6,5 x 106 celulas/ml) despues de 3 dfas. La densidad celular viable se normalizo a la condicion de 1 g/l para hacer posible la comparacion entre las diferentes concentraciones de Lutrol® F68.

Las celulas credan en un medio que contema 3, 4, o 5 g/l de Lutrol® F68 eran consistentemente mayores sobre los pasajes, en los cuales se midio un aumento del 10 % de densidad celular en comparacion con la condicion de 1 g/l (p<0,01) (Figura 7A). La viabilidad tambien era mayor para los cultivos con Lutrol® F68 mas alto (media >95%) (Figura 7B). Tambien se descubrio que el diametro celular habfa aumentado ligeramente en todas las condiciones en comparacion con la condicion de 1 g/l (15,42 pM) (p<0,05) (Figura 7C). La variacion de la densidad celular viable, % de viabilidad y diametro en las condiciones de Lutrol® F68 mas alto eran debidas a un cambio de caractensticas sobre el pasaje continuo.

El efecto de la toxicidad de la alta concentracion de Lutrol® F68 en las celulas tambien se llevo a cabo en un cultivo semi-continuo de 2 l utilizando dos lmeas celulares de CHO que expresaban anticuerpos monoclonales. De nuevo, el Lutrol® F68 alto no tema un impacto en la densidad celular viable, viabilidad, diametro celular o tftulo (Figura 8). Suplementacion de cultivos de perfusion de ATF con 5 g/l de Lutrol® F68

Se llevo a cabo un experimento que comparaba 1 g/l y 5 g/l de Lutrol® F68. El dfa 0, se inoculo una lmea celular de CHO que expresaba un anticuerpo recombinante en seis biorreactores de 2 l (Applikon Biotechnology, Foster City, CA) a 2 x 106 celulas viables/ml en un volumen de trabajo de 1500 ml. Dos reactores recibieron un medio de perfusion definido libre de suero que contema 1 g/l de Lutrol® F68 y dos reactores recibieron un medio de perfusion definido libre de suero que contema 5 g/l de Lutrol® F68. Los cultivos se mantuvieron a 36 °C, una concentracion de oxfgeno disuelto al 48 %, pH 6,9, y agitado a 350 RPM.

Las ejecuciones de cultivo celular se iniciaron en modo de lotes; la perfusion comenzo el dfa 2. La perfusion se consiguio utilizando un sistema de flujo tangencial alternante ATF-2™ (Refine Technologies, Hanover, NJ) equipado con filtros de fibras huecas de 750 kDa (Xampler UFP-750-E-4MA, ^gE Healthcare, Pittsburg, PA). La velocidad de perfusion era de 3 volumenes de trabajo/dfa.

Se tomaron muestras una vez al dfa del biorreactor y la lmea de permeado y se ensayaron como se ha descrito anteriormente.

El aumento de la concentracion de Lutrol® F68 a 5 g/l daba como resultado una viabilidad extendida de >95 % durante 14 dfas y >90 % hasta el dfa 25 (Figura 9).

Recuperacion de baja concentracion de Lutrol® F68 en cultivos con Lutrol® F68 alta

El dfa 0, se inoculo una lmea celular de CHO que expresaba un anticuerpo recombinante en cuatro biorreactores de produccion (Applikon Biotechnology, Foster City, CA) a 2 x 106 celulas/ml en un volumen de trabajo de 1500 ml. Las ejecuciones de cultivo celular se iniciaron en modo por lotes; la perfusion comenzo el dfa 2. La perfusion se consiguio utilizando un sistema de filtracion de flujo tangencial alternante ATF-2™ (Refine Technologies, Hanover, NJ) equipado con filtros de fibras huecas de 750 kDa (Xampler UFP-750-E-4MA, GE Healthcare, Pittsburg, PA). Los reactores se dividieron en dos grupos de dos, recibiendo cada grupo una formulacion de medio de cultivo celular de perfusion diferente (Medio A y Medio B). Ambas formulaciones de medio conteman 1 g/l de Lutrol® F68. Los cultivos se mantuvieron a 36 °C, con una concentracion de oxfgeno disuelto del 48 %, pH 6,9, y agitado a 350 RPM. Los cultivos se mantuvieron en estas condiciones hasta que el porcentaje de viabilidad celular cafa hasta el 80 %. En este momento, los medios de ambos grupos se suplementaron con 4 g/l de Lutrol® F68 adicionales (para dar un total de 5 g/l). Los cultivos se mantuvieron en estas condiciones altas en pluronic hasta el dfa 30. La recuperacion de la viabilidad celular por adicion de una concentracion mas alta de Lutrol® F68 se muestra en la Figura 10. Despues de la suplementacion, el porcentaje de viabilidad aumento hasta en un 15%. El efecto protector de la mayor concentracion de pluronic en un cultivo con una disminucion de la viabilidad celular fue evidente independientemente de la formulacion del medio del cultivo celular.

Ejemplo 3

Este experimento demuestra la aplicacion satisfactoria a escala piloto de elementos de calidad multiple por diseno (QbD) en un procedimiento PAC para suministrar un perfil de producto diana de calidad (QTPP) predefinida. El CQA controlado en este experimento era la glicosilacion unida a N con manosa alta sobre el dominio Fc de un anticuerpo monoclonal (“con manosa alta”).

El nivel de manosa alta en el producto se controlo por la adicion o retirada de manosa (la palanca de control) al medio de cultivo celular. Sin embargo, se podnan utilizar tambien precursores de metabolitos, inhibidores metabolicos, moleculas pequenas, cofactores enzimaticos y promotores inducibles. Estudios recientes han de mostrado que los diferentes azucares pueden tener un impacto sobre el nivel de manosa alta en un producto de anticuerpo. Espedficamente, la alimentacion con manosa ha demostrado aumentar el nivel de manosa alta sin tener un impacto en la productividad del cultivo. A traves de estudios empmcos, se ha desarrollado un entendimiento del impacto de la concentracion de manosa en el medio de cultivo celular sobre los niveles de IgG con manosa alta y se estudio su relacion con el procedimiento de cultivo celular. El conocimiento adquirido de los estudios a pequena escala y una ejecucion de produccion de entrenamiento a escala piloto se incorporo para desarrollar un algoritmo de PAC basado en el principio de Modelo de control predictivo (MPC). El MPC es un esquema de control en que se utiliza un modelo matematico del procedimiento para predecir su trayectoria futura. La naturaleza transitoria de un procedimiento de biorreactor con CHO tfpico, la probabilidad de interacciones entre CQA multiples y sus palancas de control, y las decafdas asociadas con la analttica compleja pueden proporcionar una fuerte motivacion para el MPC. Las tecnologfas PAT incluyendo la analttica por espectrometna de masas casi en tiempo real combinada con el control del biorreactor convencional se utilizaron para proporcionar datos puntuales para informar al modelo utilizado por el MPC. Los datos de multiples ensayos se incorporaron en el sistema MPC que determinaban la cantidad de manosa a anadir al biorreactor para mantener el CQA con manosa alta en el intervalo diana.

Ensayo en placas de cultivo celular de la relacion de glucosa respecto a manosa

La lmea celular era una lmea celular de CHO recombinante que expresaba un anticuerpo monoclonal. Las celulas se sembraron a 7,5e5 celulas/ml en un medio definido qmmicamente (CD) que contema 12 g/l de glucosa en un volumen de trabajo de 2 ml en placas de pocillos profundos. Las celulas se incubaron en un agitador orbital a 36,0 °C y un 5 % de CO2 a 220 rpm (diametro orbital de 50 mm). Los dfas 3-4, se midio la concentracion de glucosa mediante un Ensayo en Placa de Reactivo de Glucosa Polychem (MedTest DX, Canton, MI) y los cultivos se centrifugaron para reponer un 26 % del medio gastado con medio CD nuevo. De manera similar, el dfa 5, se repuso el 100% del medio gastado con medio CD nuevo que no contema glucosa. La concentracion de hexosa total se ajusto posteriormente a 10 g/l utilizando diferentes relaciones de glucosa respecto a manosa mediante la adicion a partir de soluciones de hexosa de reserva. Las celulas se dejaron crecer durante 24 horas. Se retiraron los sobrenadantes, se purifico la IgG y se midio el % con manosa alta mediante un ensayo de cromatograffa lfquida de interaccion hidrofila (HILIC).

Ensayo de GC-MS de hexosas

Se cuantificaron las concentraciones de glucosa y manosa en el medio de cultivo celular por GC-MS Una muestra de 1 ml del cultivo celular se centrifugo para aglomerar las celulas y se filtro el sobrenadante (0,2 pM). El sobrenadante filtrado se diluyo 1 a 10 en agua DI y se anadieron 10 |jl de esta dilucion a 1,5 j l en un tubo de centnfuga. Se anadio una aKcuota de 5 j l de una solucion de hexosa de referencia interna que contema 10 mM de D-[UL-13C6] manosa al 99,9 % (Omicron Biochemicals) y 10 mM de D-[U-13C6] glucosa al 99,9 % (Cambridge Isotope Labs). La muestra se seco (SpeedVac) durante 30 min. Las hexosas se derivaron por adicion de 20 j l de piridina anhidra y 30 j l de N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida (MSTFA) con un 1 % de trimetilclorosilano (TMCS) incubados a 40 °C durante 30 min. Inmediatamente despues de la derivacion, se analizaron las muestras en un sistema Agilent GC 6890N MSD 5973. Una muestra de 1 j l se inyecto en una columna Agilent DB-35 GC (30 m x 0,32 mm x 0,25 um) con una division de 1 en 50. Se mantuvo Helio a un flujo constante de 1 ml/min. Se mantuvo la temperatura del horno a 190 °C durante 2 min y se aumento hasta 202 °C a una velocidad de 4 °C/min.

La temperatura se aumento adicionalmente hasta 280 °C a una velocidad de 60 °C/min. El tiempo de ejecucion total era de 6,3 min. Cada hexosa dio dos picos que representaban ambas formas isomericas abierta y cerrada. La manosa se elrna a los 2,7 min y 3,34 min; la glucosa se elrna a los 3,5 min y 4,18 min (Figura 11(A)). El area del pico de 3,34 min se utiliza para la cuantificacion de manosa y el pico de 4,18 min para la cuantificacion de glucosa. Las hexosas se cuantificaron utilizando la caractenstica TMS del fragmento de carbohidrato m/z = 20416 y la dilucion del isotopo de referencia en el que el area del pico m/z = 204 del azucar de 12 C se comparo con el area del pico de m/z = 206 del azucar de 13C (Figura 11 (B)).

Ensayo MS-PAT de proteolisis limitada IdeS (FabRICATOR®)

Las muestras de medio de cultivo celular filtrado se analizaron sin una purificacion adicional. Aproximadamente 60 jg de cada muestra se digirio con 60 unidades de la enzima IdeS (FabRICATOR, Genovis, Lund, Suecia) a 37 °C durante 30 minutos. Las muestras digeridas se redujeron entonces en 4 M de hidrocloruro de guanidina con 50 mM de Ditiotreitol (DTT) a 55 °C durante 10 minutos. Despues, las muestras digeridas y reducidas se analizaron mediante RP-HPLC/MS.

Se llevo a cabo el analisis RP-HPLC/MS utilizando la cromatograffa lfquida de altas prestaciones Waters Acquity (UPLC) (Milford, MA) acoplado a un espectrofotometro de masas con tiempo de vuelo (TOF) MST Agilent (Santa Clara, CA). Las muestras preparadas se separaron en una columna de fenilo BEH Waters de fase invertida (1,7 jm, 2,1 z 150 mm; Milford, mA) mantenida a 80 °C. Los picos se controlaron por UV a 220 nm y TOF-MS. Los datos de masa se extrajeron de la corriente ionica total (TIC) de los picos, seguido por desconvolucion y cuantificacion utilizando un software MassHunter.

Ensayo de mapeo de glicano por cromatografia de interaccion hidrofila (HILIC)

Se digirieron 100 jg de anticuerpo purificado con PNGase F (New England Biolabs) seguido por la adicion de 50 j l de solucion marcadora fluorescente que contema 12 mg/ml de acido 2-aminobenzoico (2-AA) con 0,04 M de cianoborohidruro. Esta mezcla se incubo a 80 °C durante 75 minutos. Los glicanos marcados se analizaron por una UPLC Acquity equipado con un detector de fluorescencia (Milford, MA). Aproximadamente 3 j l de glicanos marcados se inyectaron en una columna de glicano BEH UPLC Acquity (n° 186004741, Milford, MA) seguido por el detector de fluorescencia utilizando una emision a 360 nm y una deteccion a 425 nm. Las especies de glicano marcados con 2AA se identificaron mediante una tecnica de MS/MS.

La generacion de datos para ajustarse a los parametros modelo, y la demostracion posterior del MPC para el control del % con manosa alta se llevaron a cabo en biorreactores. Se anadio manosas (Sigma M6020) el primer dfa de cultivo hasta una concentracion en el cultivo de 1 g/l utilizando una solucion de reserva del 25 %. Se inicio la perfusion el dfa dos de cultivo. El medio de perfusion se suministro en volumenes crecientes desde 0,5 a 1,0 volumenes de biorreactor por dfa. El biorreactor se controlo utilizando un automatismo Delta V (Emerson). La toma de muestras del biorreactor se llevo a cabo cada cuatro horas utilizando la valvula MAST SP200 de toma de muestras automatica (Bend Research) para la medicion del tttulo, hexosa y producto de glicano. Despues de la recoleccion de muestras automaticas, las muestras se centrifugaron manualmente y se filtro con 0,2 um para retirar las celulas y desechos. Las muestras diarias para las mediciones de crecimiento, viabilidad, osmolalidad y lactato se recolectaron manualmente o utilizando la MAT SP200. La densidad celular viable (VCD) y el % de viabilidad del cultivo se midieron utilizando Nova CDV (Nova Biomedical). Las concentraciones de lactato se determinaron utilizando un analizador Nova Bioprofile Basic (Nova Biomedical).

Modelo de control predictivo

La programacion para el modelo de control predictivo (MPC) y para ajustar los parametros modelo se hicieron en MATLAB (version R2014a, Mathworks) y el codigo esta disponible en los materiales suplementarios. Los parametros modelo se determinado por regresion de mmimos cuadrados de las ecuaciones modelo para los datos de una unica ejecucion de entrenamiento en el biorreactor. Para el control de manosa alta por las alimentaciones con manosa (mediante MPC) el cambio de velocidad de cada dfa se calculo mediante las siguientes etapas:

1. Calculo de la compensacion del modelo actual. La historia operativa del reactor combinada con los valores medidos diariamente (si estan disponibles) se utilizaron como entradas para generar una solucion numerica de las ecuaciones del modelo diferencial. La diferencia entre el modelo y la medicion mas reciente se podna calcular entonces. Esta diferencia se utilizo como una estimacion de la compensacion futura.

Hk - valor del modelo en el momento k = f(tk)

H'k = valor medido en el momento k

Hk+1 = valor previsto ajustado en el momento k+1 = F(tk+1) (Hk-H'k)

2. Determinacion de las velocidades optimas futuras mediante MPC. Se utilizo el metodo 17 de alejamiento de horizonte de MPC de referencia cada dfa una vez que se inicio el control. El conjunto optimo de cinco cambios de velocidad se determino minimizando la suma del error cuadrado entre el perfil de calidad del producto previsto por el modelo y el nominal de la diana. Aunque se calcularon cinco cambios de velocidad, solo se utilizo el primero. En el momento de que se tuviera que implementar el siguiente cambio de velocidad, estaban disponibles nuevos datos que se utilizaban entonces para recalcular el conjunto optimo de velocidades optimas. La velocidad de la alimentacion con manosa se encontro tratandola como la variable independiente en la minimizacion de la funcion objetivo (que en este caso es la suma de cuadrados de la diferencia entre el nivel con manosa alta en la molecula y que se encontro mediante integracion de las ecuaciones diferenciales gobernantes). Las ecuaciones anteriores se comportaban suficientemente bien para que la solucion obtenida por los disolventes MATLAB era suficiente para controlar a+/- un 1 % de especies con manosa alta en el anticuerpo. El metodo para controlar la manosa alta es un apoyo de que la adicion de manosa al reactor aumenta el % con manosa alta en el anticuerpo. La reduccion de produccion de % con manosa alta se consigue reduciendo la concentracion de manosa (mediante dilucion por perfusion despues de disminuir la velocidad de alimentacion con manosa).

Cuantificacion de hexosa por GC-MS

La cuantificacion en tiempo real de manosa era una entrada necesaria para el MPC. Se utilizo una GC-MS para distinguir las hexosas (glucosa y manosa) en el medio de cultivo celular. Las hexosas se cuantificaron por dilucion de isotopo como se ha descrito anteriormente. La Figura 118A) muestra la separacion basal por GC de manosa del medio de cultivo celular durante una ejecucion tfpica. La Figura 11 (B) muestra el patron de fragmentacion de hexosa (identico entre manosa y glucosa), en el que el pico de m/z 204 se cuantifico utilizando el pico de m/z 206 de la referencia interna marcada de 13C. El lfmite de deteccion para la glucosa y la manosa era de 0,02 g/l y se demostro un alineamiento para la cuantificacion de hasta 6 g/l de hexosa (Figura 11(C)).

Ensayo de las relaciones de glucosa respecto a manosa en placa de cultivo celular

Las celulas se cultivaron con una hexosa total de 10 g/l pero aumentando la concentracion de manosa para dar lugar a relaciones glucosa: manosa de 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8 y 0:10. Las celulas se cultivaron durante 24 horas con las diferentes relaciones de hexosa. Los sobrenadantes se retiraron, la IgG se purifico y se midio el % con manosa alta por un ensayo HILIC. La Figura 12(A) demuestra una relacion lineal entre la concentracion de manosa en el medio de cultivo celular y el nivel total con manosa alta, en el que la manosa alta era como mmimo del 10 % en el medio que contema solo glucosa y como maximo del 37 % en el medio que contema solo manosa.

Para establecer si el aumento en manosa alta era debido al aumento de concentracion en azucar manosa o la disminucion de concentracion en azucar glucosa, las celulas se cultivaron como en el primer experimente en placa, con la excepcion del dfa 5, en el que el medio se intercambio por medio nuevo que contema 1, 3, 5, 7 o 10 g/l de manosa. Se anadieron cinco concentraciones diferentes de glucosa (1, 3, 5, 7 o 9 g/l) se anadieron a cada uno de los cultivos que conteman manosa. Esto hace un total de 25 cultivos diferentes siendo la menor cantidad de hexosa de 2 g/l (1 g/l de glucosa y 1 g/l de manosa, Figura 12(B)) y la mayor 19 g/l (9 g/l de glucosa y 10 g/l de manosa; Figura 12 (B)). Se permitio que las celulas crecieran durante 24 horas. Los sobrenadantes se retiraron entonces, se purifico la IgG y se midio el % con manosa alta por el ensayo HILIC. La Figura 12 (B) indica que el aumento lineal de manosa alta es independiente de la concentracion de glucosa y solo depende de la concentracion de manosa en el medio. Esta relacion se utilizo para desarrollar un bucle de control MPC.

Desarrollo del bucle de control: Modelo de control predictivo

Para el desarrollo del bucle de control, el biorreactor se conecto al dispositivo de toma de muestras automatico MAST SP200 y una bomba de alimentacion de solucion de manosa ademas de los controles de rutina del biorreactor y las analfticas fuera de lmea (Figura 13). Se llevo a cabo una ejecucion de perfusion en el biorreactor de 15 dfas para generar los datos de entrenamiento para desarrollar el bucle de retroalimentacion de MPC para un control apoyado de manosa alta utilizando alimentaciones de manosa. Los datos para el % con manosa alta (Figura 14(A)), la concentracion de manosa en el reactor (Figura 14(B)), crecimiento celular (Figura 14 (C)) y acumulacion de tftulo (Figura 14 (D)) se recolectaron a intervalos de tiempo de 4 horas con la excepcion de los datos de glicano que no se recolectaron durante los dfas 9-11. El modelo MPC se desarrollo a partir de este conjunto de datos, excepto los parametros de crecimiento que, debido a un error, se calcularon a partir de una ejecucion similar. Las predicciones del modelo utilizando ambos conjuntos de parametros de crecimiento se muestran en la Figura 14 y son virtualmente identicas.

Desarrollo del bucle de control: Ecuaciones del modelo

Las ecuaciones diferenciales ordinarias se construyeron para describir la velocidad de cambio del numero de celulas, producto, concentracion de manosa, y especies con manosa alta.

Aqu N es la densidad celular, p es la velocidad de crecimiento maxima, y Nm es la densidad celular maxima. La densidad celular puede ser en celulas/volumen o volumen celular/volumen. En este trabajo se calculo un volumen escalado y calculado arbitrariamente a partir del recuento celular y el diametro medico en el Nova CDV. Para el tftulo se asumio que la productividad era constante y la retencion del producto variable (que depende del filtro de perfusion utilizado) se tiene en cuenta por:

La concentracion del producto es P, y qp es la productividad espedfica, S es el coeficiente de filtrado que es la fraccion de producto que pasa a traves del filtro de perfusion, y D es la velocidad de perfusion en volumenes del reactor/dfa. La velocidad de cambio de manosa:

La concentracion de manosa en el reactor es M, Mr es la concentracion efectiva de manosa en el medio de perfusion y qM es la velocidad de consumo de manosa espedfica. Se asume que la velocidad de consumo de manosa sigue la cinetica de Michaelis-Menton:

La tasa de reaccion maxima es Vm y la Km es la constante de Michaelis-Menton. Los datos de las placas de cultivo celular sugenan que la tasa de produccion relativa de especies con manosa alta era proporcional a la concentracion de manosa (Figura 12(B)):

Aqu H es la concentracion de especies con manosa alta y F^hes el factor de proporcionalidad de manosa alta. El examen de los datos previos (no mostrados) sugenan que Fh variaba con la densidad celular de manera que se utilizo la siguiente ecuacion puramente empftica para Fh:

Kⁱy K2 son constantes empfticas. Finalmente, la velocidad de cambio de manosa alta se encuentra mediante la regla de cadena:

Todos los parametros del modelo se determinaron mediante regresion de mmimos cuadrados de los datos de entrenamiento que se muestran en la Figura 14. Los parametros se encontraron ajustando el perfil de crecimiento celular que se muestra en la Figura 14(C). El valor para qp se encontro por ajuste de la curva de tftulo que se muestra en la Figura 14 (D). El declive del tftulo despues del dfa 12 es debido a un cambio de una membrana de ultrafiltracion (para cuyo coeficiente de filtrado, S, es cero) a una membrana de microfiltracion (que da un coeficiente de filtracion en el intervalo de 0,76 a 0,78. Los parametros restantes se encontraron ajustando las ecuaciones a los datos de la Figura 14(A) y Figura 14(B) simultaneamente.

Los valores de los parametros utilizados en el modelo y sus ftmites del 95 % de confianza se muestran en la Tabla 4. Los valores numericos de los parametros del modelo y los ftmites de confianza obtenidos a partir de los datos de entrenamiento y que se utilizaron para los Graficos MPC del ajuste del modelo resultante a los datos de entrenamiento se muestran en la Figura 14 (lmeas discontinuas A-D), mientras que los ajustes con los parametros de crecimiento utilizados para el MPC son lmeas de puntos. El parametro ajustado para la manosa, constante de Michaelis-Menton, Km, es mucho mayor que las concentraciones utilizadas, de manera que la cinetica de consumo de manosa eran eficazmente de primer orden. Los datos de entrenamiento y la demostracion posterior de MPC se llevo a cabo en identicas condiciones con la excepcion de que la concentracion de manosa que sema como la palanca de control para la manosa alta.

Tabla 4. Valores numericos de parametros del modelo y lfmites de confianza obtenidos a partir de los datos de entrenamiento y utilizados para el MPC

Demostracion de MPC para el control del nivel con manosa alta

Posteriormente a la derivacion de los valores del parametro, se utilizo el bucle de vuelta Teed en una ejecucion de biorreactor para controlar activamente el nivel de % con manosa lata a un 6 % /- 1 % para el Anticuerpo A. La perfusion y alimentacion con manosa se inicio el dfa 2 del cultivo de produccion. La alimentacion inicial con manosa se fijo a una velocidad que mantendna su concentracion mas o menos constante en el reactor. Esta velocidad de alimentacion con manosa inicial se estimo basandose en la experiencia previa con el proceso y no era parte del bucle de control. El bucle de control se comenzo el dfa 5 de produccion. Se tomaron muestras diariamente y se analizaron para determinar las entradas en el modelo MPC. La disminucion ente la muestra del reactor y el cambio de velocidad variaba entre 5 y 14 horas, con una media de 8,5 horas. Una vez que todos los datos necesarios estuvieron disponibles, se introdujeron manualmente en el modelo MATLAB para calcular la siguiente velocidad de alimentacion con manosa. La trayectoria resultante del % con manosa alta, las demas cantidades modeladas, y las concentraciones de alimentacion basadas en el MPC resultante (calculado a partir de las velocidades de alimentacion) se muestran en la Figura 15. Una vez que se inicio el control, el % con manosa alta, medido y modelado aumentaba rapidamente y se mantuvo en el 1% del 6% diana (Figura 15(A)). Los perfiles de concentracion de manosa modelados y medidos aumentaban y cafan como se esperaba en respuesta a la alimentacion con manosa (Figura 15(B)). El crecimiento celular segrna sobre todo la curva logfstica asumida con la excepcion de desviaciones claramente significativas los dfas 6 y 12 (Figura 15 (C)). El tftulo medido coincidfa con el modelo, aunque las discontinuidades en los ultimos dfas del cultivo eran una prueba de que el modelo estaba bajo la estimacion de produccion proteica (Figura 15(D)). El ajuste del estado del modelo MPC para las mediciones coincidentes hacfa posible un buen control de la manosa alta a pesar de las desviaciones observadas. En la Figura 16 se muestra una comparacion entre el procedimiento PAC y las ejecuciones historicas en planta piloto. Se llevaron a cabo las ejecuciones historicas utilizando un procedimiento convencional que es similar en diseno y ejecucion al procedimiento PAC, pero sin el bucle de control activo. En vez de esto, el proceso convencional depende de parametros del procedimiento estaticos para ejecucion con un margen de error para cada lote para suministrar el producto deseado, que necesitara pasar un control de calidad para su almacenamiento. Con el procedimiento PAC, se mide la PQ casi en tiempo real y, debido al control activo durante la ejecucion de produccion, no sera necesario una caracterizacion analftica posterior antes del almacenamiento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para la recoleccion de una protema recombinante que comprende:

i. el establecimiento de un cultivo celular inoculando un biorreactor con celulas de mairnfero que expresan una protema recombinante,

ii. el mantenimiento del cultivo celular perfundiendo el cultivo celular con medio de cultivo celular fresco formulado o suplementado para que alcance una concentracion de al menos 5 g/l de un copolfmero en bloque no ionico,

iii. el pasaje del cultivo celular a traves de un filtro de fibras huecas que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retenga la protema recombinante en el biorreactor, y

iv. la recoleccion de un permeado que contiene la protema recombinante.

2. Un metodo para la recoleccion de una protema recombinante que comprende:

i. el establecimiento de un cultivo celular inoculando un biorreactor con celulas de marnffero que expresan una protema recombinante,

ii. el mantenimiento del cultivo celular perfundiendo el cultivo celular con medio de cultivo celular reciente formulado o suplementado para que alcance una concentracion de al menos 1 g/l de un copolfmero en bloque no ionico y el pasaje del cultivo celular a traves de un filtro de fibras huecas que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retenga la protema recombinante en el reactor, y recolectar el permeado,

iii. una vez que se alcanza un parametro predeterminado la perfusion del cultivo celular con medio de cultivo celular reciente formulado o suplementado para que alcance una concentracion de al menos 5 g/l de un copolfmero en bloque no ionico y el pasaje del cultivo celular a traves de un filtro de fibras huecas que tenga un tamano de poro o corte de peso molecular que no retenga la protema recombinante en el biorreactor, y iv. recolectar un permeado que contenga la protema recombinante.

3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en el que el filtro de fibras huecas que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retiene la protema recombinante en el biorreactor y el filtro de fibras huecas que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor son componentes de un sistema de filtro de una sola unidad.

4. El metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, en el que el filtro de fibras huecas que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que no retiene la protema recombinante en el biorreactor es un microfiltro.

5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que el corte de peso molecular del microfiltro es al menos de 500 kDa.

6. El metodo de la reivindicacion 4, en el que el corte de peso molecular del microfiltro es de 750 kDa.

7. El metodo de la reivindicacion 4, en el que el tamano de poro del microfiltro es desde 0,1 micrometros a 10 micrometros.

8. El metodo de las reivindicaciones 2-3, en el que el filtro de fibras huecas que tiene un tamano de poro o corte de peso molecular que retiene la protema recombinante en el biorreactor es un ultrafiltro.

9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que el corte de peso molecular del ultrafiltro es de 300 kDa o menos.

10. El metodo de la reivindicacion 8, en el que el corte de peso molecular del ultrafiltro es de 30 kDa.

11. El metodo de la reivindicacion 8, en el que el tamano de poro del ultrafiltro es desde 0,01 micrometres a 0,1 micrometros.

12. El metodo de la reivindicacion 3, en el que el sistema de filtro de una sola unidad esta contenido en una carcasa.

13. El metodo de la reivindicacion 3, en el que el sistema de filtro de una sola unidad comprende ademas un espaciador entre al menos dos de los componentes de filtro de fibras huecas.

14. El metodo de las reivindicaciones 1-3, en el que el copolfmero en bloque no ionico es un copolfmero en bloque de polioxipropileno-polioxietileno.

15. El metodo de las reivindicaciones 1-3, en el que el copolfmero en bloque no ionico es poloxamer 188.

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