JP5894929B2 - 接着細胞の培養方法 - Google Patents
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Description
・ 生産された細胞バッチは、それらがすべて同数の細胞継代を有するとは限らないので、ある種の不均一性を示す;
・ 各移動操作時に培養液中に「フィーダー」細胞のストックを保持することにより、必ず、細胞継代の回数と直接関係する細胞の「老化」が生じ、その結果、既に記載された規制上の理由のために限られた期間のみ使用することができる。
a.培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入すること、
b.同培養容器中にて連続細胞継代を行うことによって該細胞を増幅すること(ここで、1回目の細胞継代の後の各細胞継代は、
i.先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を、細胞をマイクロキャリアから脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後に使用すること、および
ii.培養培地および漸増量のマイクロキャリアを導入すること
によって行われる)、および
c.最終細胞継代の間に生産された細胞集団を回収すること(細胞をマイクロキャリアから脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後であってもよい)
による、接着細胞の生産方法。
a.培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入すること、
b.同培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって該細胞を増殖させること(ここで、1回目の細胞継代の後の各細胞継代は、
i.先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を、細胞をマイクロキャリアから脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後に使用すること、および
ii.培養培地および漸増量のマイクロキャリアを導入すること
によって行われる)、
c.最終細胞継代の間に生産された細胞集団を、生物学的作用物質を生産するように処理すること(ここで、この処理は、細胞を増殖させるために使用した培養培地と同じ培養培地にて行われる)、および
d.生物学的作用物質を回収すること
による、接着細胞によって生産された生物学的作用物質の生産方法。
a.接着細胞のストックを解凍すること、次いで、
b.解凍した接着細胞に本発明の方法の実施態様の1つを施すこと
による、接着細胞の生産方法に関する。
a.細胞をマイクロキャリアから脱離させるために細胞集団を酵素処理した後に回収した細胞集団を第2の培養容器に移すこと(ここで、この第2の培養容器は、より大きな作業容積を有し、第1の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に存在したマイクロキャリアの量よりも多いマイクロキャリアを含有する培養培地を含有する)、および
b.この第2の容器中にて、本発明の方法の実施態様の1つが行われること
による、接着細胞の生産方法に関する。
本発明は、細胞を増幅して、細胞の工業バッチを形成するために、同一の細胞培養容器中にて連続細胞継代が数回行われる、接着細胞の生産方法に関する。この方法によって、使用されるべき培養容器の数は減少し、生産された細胞のバッチは、それらが同数の細胞継代を有するので均一である。
− 培養培地中にてマイクロキャリアと接触させられた細胞がマイクロキャリアに接着する、マイクロキャリア・コロニー形成期;
− マイクロキャリア上で細胞が増幅して、コロニー形成されたマイクロキャリアの利用可能な表面の70%超、好ましくは80%超が細胞によって覆われるまでの期間に相当する、マイクロキャリアに接着した細胞の増幅期(該細胞がコロニー形成マイクロキャリアの利用可能な表面の70%超が細胞によって覆われた場合、「実質的にコンフルエント」であるかまたは「コンフルエンスの段階」に達したと見なされる);および
− 細胞の最大数(一般的には80%より多く、好ましくは90%より多く)が短時間で(一般的には30分未満で、しばしば20分未満で)それらの支持体から脱離するように酵素処理することによる実質的にコンフルエントな細胞のマイクロキャリアからの脱離期。
a.培養培地、マイクロキャリアおよび接着細胞を培養容器に導入する工程、
b.細胞をマイクロキャリアに接着させて増殖させることを可能にする培養条件下に細胞をおく工程、
c.酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させる(細胞の一部を培養容器から取り出してもよい)工程、
d.導入されるマイクロキャリアの量が前に導入されたマイクロキャリアの量よりも多くなるように培養培地およびマイクロキャリアを再度導入する工程、
e.再度、細胞をマイクロキャリアに接着させて増殖させることを可能にする培養条件下に細胞をおく工程、および
f.得られた細胞集団を回収する工程(酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させた後であってもよい)、
ここで、工程a)〜e)は同一の培養容器中にて行われる。
a.培養培地、マイクロキャリアおよび接着細胞を培養容器に導入する工程、
b.細胞をマイクロキャリアに接着させて増殖させることを可能にする培養条件下に細胞をおく工程、
c.酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させる(細胞の一部を培養容器から取り出してもよい)工程、
d.新しく導入されるマイクロキャリアの量が前に導入されたマイクロキャリアの量よりも多くなるように培養培地およびマイクロキャリアを再度導入する工程、
e.再度、細胞をマイクロキャリアに接着させて増殖させることを可能にする培養条件下に細胞をおく工程、
f.得られた細胞集団を生物学的作用物質を生産するように処理する工程、および
g.得られた細胞集団を回収する工程、
ここで、工程a)〜f)は同一の培養容器中にて行われる。
Logηrel/C=75K0 2/(1+1.5K0C)+K0
K=1000K0
Cは、PVP濃度を培地100mlあたりのgで表す。
ηrelは、溶媒の粘度と比較した溶液の粘度である。
・慣用的に連続細胞継代を行うために使用され得る1つ以上の培養容器に移すこと、すなわち、各細胞継代後に、得られた細胞バイオマスを別のより大きな培養容器に移すこと、または、より有利には、
・より大きな作業容積を有する(第1の容器よりも、一般的には少なくとも10倍大きい、最も一般的には10〜50倍大きい)第2の培養容器に移し、この第2の容器に移された細胞を本発明の方法に適用すること。このように該方法を行うことによって、細胞の工業的バッチを生産するために使用されるべき培養容器の数および必要な空間は、より有意に減少する。
a.接着細胞を、培養培地中にマイクロキャリアを含有する第1の培養容器に導入する工程;
b.この第1の培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって細胞を増幅する工程(ここで、1回目の細胞継代の後の各細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部であって酵素処理によって細胞がマイクロキャリアから脱離したものを使用して行われ、また、毎回、培養培地および増加量のマイクロキャリアを添加して行われる);
c.この第1の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に得られた細胞集団を、酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させた後に回収する工程;
d.回収した細胞集団を、より大きな作業容積を有し、かつ、第1の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に存在していたマイクロキャリアの量よりも多量のマイクロキャリアを含有する培養培地を含有している第2の培養容器に移す工程;
e.この第2の培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって、細胞を増幅する工程(ここで、1回目の細胞継代の後の各細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部であって酵素処理によって細胞がマイクロキャリアから脱離したものを使用して行われ、また、毎回、培養培地および増加量のマイクロキャリアを添加して行われる);
f.この第2の培養容器中にて行われる最終細胞継代の間に得られた細胞集団を、所望により酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させた後、回収する工程;
g.さらに大きな作業容積を有する第3の培養容器中にて、工程dからfを再度繰り返す工程
による方法。
a.接着細胞を、培養培地中にマイクロキャリアを含有する第1の培養容器に導入する工程;
b.この第1の培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって細胞を増幅する工程(ここで、1回目の細胞継代の後の各細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に生産された細胞集団の全部または一部であって酵素処理によって細胞がマイクロキャリアから脱離したものを使用して行われ、また、毎回、培養培地および増加量のマイクロキャリアを添加して行われる);
c.この第1の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に得られた細胞集団を、酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させた後に回収する工程;
d.回収した細胞集団を、より大きな作業容積を有し、かつ、第1の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に存在していたマイクロキャリアの量よりも多量のマイクロキャリアを含有する培養培地を含有している第2の培養容器に移す工程;
e.この第2の培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって、細胞を増幅する工程(ここで、各新細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に生産された細胞集団の全部または一部であって酵素処理によって細胞がマイクロキャリアから脱離したものを使用して行われ、また、毎回、培養培地および増加量のマイクロキャリアを添加して行われる);
f.この第2の培養容器中にて行われる最終細胞継代の間に得られた細胞集団を、生物学的作用物質を生産するように処理する工程(ここで、この工程fは、工程dおよびeを行うために使用して培養容器と同じ培養容器中にて行われる);および
g.生物学的作用物質を回収する工程
による方法。
この実施例では、初期マイクロキャリア濃度、培養培地中の血清の存在または不在、および細胞保護剤の性質のようなさまざまなパラメーターの細胞増殖に対する役割を研究した。
バイオリアクター:
Cellready(Mobius)の名称の下にMilliporeによって販売されている2.4リットルの容量を有する使い捨てバイオリアクター中にて、この実験を行った。それらは、pHプローブ、pO2プローブおよび温度プローブならびにマリーンプロペラ撹拌パドルを装備している。
GE Healthcareによって供給されたCytodex 1マイクロビーズを使用した。各細胞継代を行うのに必要な量を取り出した後、リン酸緩衝液(1×C PBS、、約pH7.4)中にて24時間水和化した。次いで、それらを同緩衝液で3回リンスし、次いで、オートクレーブによって滅菌した。バイオリアクターへの導入直前に、マイクロビーズを沈殿させた後、該滅菌緩衝液を等量の培養培地と取り換えた。マイクロビーズ1gは、約4400cm2の接着表面を有する。
VPSFM/K30: 血清を含まず、動物由来の生成物を含まず、ISPによって供給された0.1%w/vのポリビニルピロリドン(PVP)K30を添加した、VPSFM培地(Invitrogen)。
VPSFM/F68: 血清を含まず、動物由来の生成物を含まず、BASFによって供給された0.1%w/vのポロキサマー188を添加した、VPSFM培地(Invitrogen)。
VPSFM/K30/SVF: 4%脱補体ウシ胎仔血清を添加したVPSFM/K30。
細胞を冷凍するための管(Nunc tube ref:430663、5ml)中にて10%ジメチルスルホキシドを含有する血清不含培地中50×106細胞/mlの冷凍形態で貯蔵した細胞のバンクに由来するベロ細胞。
これら2つのパラメーターを研究するために同じ操作プロトコール用いた。
ベロ細胞増殖に対する1回目の細胞継代の間の非常に低いマイクロキャリア濃度の効果を評価するために、0.1g/lおよび0.3g/lの濃度を試験した。
7.2〜7.5のpH、37℃の温度および約25%のpO2のようなバイオリアクターのレギュレーションパラメーターを調節した後、マイクロキャリア0.6gを含有するVPSFM/K30培地2リットル中66×106細胞をバイオリアクター1(bio1)に導入した(接着表面1cm2あたり25000細胞と等価であり、初期マイクロビーズ濃度0.3g/lを表す)。
マイクロキャリア0.2gを含有するVPSFM/K30培地2リットル中22×106細胞をバイオリアクター2(bio2)に導入した(接着表面1cm2あたり25000細胞と等価であり、初期マイクロビーズ濃度0.1g/lを表す)。
3日目に、以下のプロトコールに従って、細胞をトリプシンで処理した:
マイクロビーズを沈殿させた後、VPSFM/K30培養培地約300mlをバイオリアクター中に放置し、次いで、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝液中に組換えトリプシン(ref:Roche 04618734)600mgを含有する0.025Mクエン酸ナトリウム約300mlを添加した。該培地を適度な撹拌下に保持した。試験サンプルによって細胞が実際に脱離したことを確認した後(一般に、この脱離は、15〜30分間で生じた)、1mg/mlのトリプシン阻害剤(ref:Sigma T6522)を含有するVPSFM/K30の溶液約300mlを添加することによってトリプシンの作用を停止した。細胞をカウントした後、細胞懸濁液の一部を取り出して、2回目の細胞継代を行うために総量2リットルの培養培地中のマイクロキャリア2.4g(bio1)またはマイクロキャリア0.6g(bio2)を導入した後に接着表面1cm2あたり約25×103細胞となるように細胞の残量を調節した。次いで、レギュレーションパラメーターを1回目の細胞継代の間と同様に再度調節した。4〜6時間後、この培地を新しい培養培地と取り換え、次いで、所望により24〜48時間の培養の後に2回目の取り換えを行った。7日目に、3日目に使用したプロトコールと同じプロトコールに従って細胞を再度トリプシン処理した。細胞をカウントした後、細胞懸濁液の一部を取り出して、3回目の細胞継代を行うために総量2リットルの培養培地中のマイクロキャリア6g(bio1)またはマイクロキャリア2.4g(bio2)を導入した後に接着表面1cm2あたり約25×103細胞となるように細胞の残量を調節した。次いで、バイオリアクターのレギュレーションパラメーターを再度調節した。4〜6時間後、該培地を新しい培養培地と取り換え、次いで、所望により24〜48時間の培養の後に2回目の取り換えを行った。10日目に、培養容器中の初期マイクロキャリア濃度に従って細胞増幅の程度を評価するために細胞を回収した。
以下の特徴をもって、セクション1.2に記載したものと同じ操作プロトコールを使用した:
− VPSFM/K30/SVF培地を使用した。
− 初期マイクロキャリア濃度は0.3g/lであった。
− 5日目および8日目にトリプシン処理を行った。各トリプシン処理前に、血清を除去するために、リンス、沈殿、およびリンス緩衝液の除去を含む一連の工程によって、マイクロビーズの懸濁液をリンス緩衝液(リン酸緩衝液(1×C PBS))600mlで3回「リンス」した。
細胞増殖について研究した様々なパラメーターの役割を評価するために、Nucleocounter(Chemometec(登録商標))カウンティングシステムを使用して一定間隔で細胞濃度を測定し、累積細胞世代数を算出した。毎回、マイクロビーズ懸濁液の2つのサンプルを採取した。示された値は、各分析時に採取した2つのサンプルの平均値を表す。
*:トリプシン処理前。
**:トリプシン処理、および接着表面1cm2あたり25×103細胞への細胞濃度調節後。
***:累積世代数の算出のため、連続細胞継代の間に行われた可能な細胞濃度調節を考慮し、下記一般式を使用した:
初期[細胞]:0日目の初期細胞濃度に相当する。
「一体型法」に従って行われたかまたは「ビーズ間移動」技法を使用して行われた2連続細胞継代の後の細胞生産を比較した。
「一体型法」について、セクション1.2に記載したものと同じ原理が以下の特徴とともに適用された:
− 使用した培養培地は、VPSFM/K30培地であった。
− 培養培地の量は、2連続細胞継代の間、一定に保たれており、4リットルであった。
− 1回目の細胞継代を、0.3g/lのマイクロビーズ濃度を使用し、接着表面1cm2あたり50000細胞となる量の細胞を導入することによって行った。
− 3日目に、培養培地を取り換えた。
− 4日目に、セクション1.2に記載の方法と同様に細胞をトリプシンで処理した。該細胞のトリプシン処理およびカウンティングの後、細胞集団の2/3の量を取り出し、2回目の細胞継代を行うために総量4リットルの培養培地中のマイクロビーズ4.8g(すなわち、1.2g/lの濃度)を導入した後、残りの細胞を接着表面1cm2あたり25000細胞に調節した。
− 培養培地を2回取り換えた:1回目は、マイクロビーズ導入の4〜6時間後であり、2回目は、6日目であった。
− 8日目に、細胞を回収し、細胞増幅の程度を評価するためにカウントした。マイクロビーズの細胞による被覆の程度を評価するためにマイクロビーズ懸濁液のアリコートを分析した。
4日目に細胞をトリプシンで処理しなかったことを除いて、セクション2.1に記載の操作プロトコールを適用した。4日目に、同じ割合の細胞およびマイクロビーズを取り出すようにマイクロビーズ懸濁液の量の2/3を取り出して、「一体型」法において使用した培養条件下においた。次いで、総量4リットルの細胞培養培地中にcytodex 14.8g(すなわち、1.2g/lの濃度)を含有するマイクロビーズ懸濁液を導入した。次いで、操作プロトコールは、セクション2.1に記載と同じであった。
試験した2つの方法の細胞増殖を比較するために、セクション1.4に記載の手順に従って、一定間隔で細胞濃度を測定した。
3.1)使用した材料
バイオリアクター:
Nucleo−20の名称の下にATMIよって販売されている使い捨てバッグの形態の20リットルのバイオリアクターを使用した。pHプローブ、pO2プローブおよび温度プローブを、較正し、オートクレーブによって滅菌した後、標準的なATMIプロトコールに従ってプローブホルダーバッグによってバッグに取り付けた:他方、一端をバッグに取り付け、他端をプローブホルダーに取り付けるKleenpak(登録商標)コネクションを接続し、次いで、このようにして得られた連結を介してプローブをバイオリアクターに導入した。
マイクロキャリア: GE Healthcareによって供給されたcytodex 1マイクロビーズ(セクション1.1を参照)。
培養培地:VPSFM/K30培地(セクション1.1を参照)。
VPSFM/K30培養培地6リットルをNucleo−20に導入し、次いで、cytodex 1(4g)を含有するマイクロビーズ懸濁液1リットル(細胞の添加後の初期マイクロビーズ濃度0.5g/lを表す)を添加した。
37℃の温度、7.2〜7.4のpHおよび約25%のpO2のようなNucleo−20の内部のレギュレーションパラメーターを調節し、培地を適度に撹拌して培養培地にビーズを再懸濁させた後、解凍した後にVPSFM/K30培養培地1リットルに入れた500×106細胞をNucleoに導入した。培養培地を取り換えるためまたは培養培地の量を減らすために行われるマイクロビーズ沈殿期の間を除いて操作プロトコールの期間の全体にわたって、培養培地を撹拌し続けた。
撹拌、pH調整およびpO2調整を停止した。温度調整だけを維持した。マイクロビーズの沈殿後、VPSFM/K30培養培地約3リットルをバイオリアクター中に残し、次いで、組換えトリプシン(ref:Roche 04618734)600mgを含有する0.025Mクエン酸ナトリウム溶液約3リットルを添加した。次いで、培地を再度適度に撹拌した。試験サンプルによって細胞が実際に脱離したことを確認した後(一般に、この分離は、15〜30分間に生じる)、1mg/mlのトリプシン阻害剤(ref:Sigma T6522)を含有するVPSFM/K30の溶液約3リットルを添加することによって、トリプシンの作用を停止した。次いで、cytodex 1(28g)を含有するマイクロビーズ懸濁液を添加し、これは、培養培地の量をVPSFM/K30培養培地で20リットルに調節した後の培地中約1.4g/lのマイクロビーズ濃度であった。次いで、Nucleo−20の内部のレギュレーションパラメーターを、1回目の細胞継代の間と同様に再度調節した。マイクロビーズの導入の4〜6時間後、培地を新しい培養培地と取り換えた。7日目に、この培養培地の新しい培養培地との2回目の取り換えを行った。9日目に、細胞は、実質的にコンフルーエントであった。次いで、それらを、5日目に使用したプロトコールと同じプロトコールによってトリプシン処理した。2細胞継代が同一バイオリアクター中にて行われた後に得られた細胞増幅のレベルを、得られた細胞懸濁液から決定した。
得られた細胞増幅のレベルを測定するために、セクション1.4に記載の手順と同様の手順で一定間隔で細胞濃度を測定した。
4.1)使用した材料
使用した材料は、実施例3に記載に材料と同じである。
以下の変更をともなってセクション3.2に記載のプロトコールと同じプロトコールに従って細胞継代を行った。
− 1回目の継代を、cytodex 1マイクロビーズ2gを含有するVPSFM/K30培養培地8リットルに250×106細胞を導入することによって行った(0.25g/lのマイクロビーズ濃度となる);
− 5日目に、1回目のトリプシン処理の後、2回目の細胞継代を行うために、cytodex 1(14g)を含有するマイクロビーズ懸濁液を添加して、培養培地の量をVPSFM/K30培養培地で13リットルに調節した後のマイクロビーズ濃度を約1.07g/lとした;
− 9日目に、2回目のトリプシン処理の後、3回目の細胞継代を行うために、cytodex 1(60g)を含有するマイクロビーズ懸濁液を添加して、培養培地の量をVPSFM/K30培養培地で20リットルに調節した後のマイクロビーズ濃度を約3g/lとした。
5.1)操作プロトコール
実施例4に記載のプロトコールに従って、かつ、冷凍細胞のバンクから直接得た初期量250×106細胞を使用して、20リットルの単一のバイオリアクター中にて3連続細胞継代を行うか、または、3連続細胞継代を異なるステンレス鋼製バイオリアクター(1回目は2リットルのバイオリアクター、2回目は7リットルのバイオリアクター、3回目は28リットルのバイオリアクター)中にて行う。使用した慣用の方法の実験条件は以下のとおりである:
試験した2つの方法の間の細胞増殖をモニターするために、セクション1.4に記載の手順と同じ手順で細胞濃度を一定間隔で測定した。
**:表示した値は、行われた3つの異なる実験で得られた平均値である。
6.1)使用した材料
バイオリアクターが、今回、Nucleo−20の名称の下にATMIによって販売されている200リットルの使い捨てバッグであること以外、使用した材料は、実施例3に記載の材料と同じである。
使用したプロトコールは、以下の変更を伴って、実施例3に記載のものと同様であった。
ベロ細胞を、解凍した後、接着表面1cm2あたり40×103細胞の割合で2つのCell Factory(CF10)において予め培養下においた(1つのCF10につき培養培地2リットル)。5日間の培養の後、トリプシン処理工程の後に細胞集団を回収し、次いで、これを使用してNucleo−200に播いた。
培養の間に観察された細胞の量および濃度を下記表に示す。
**:トリプシン処理および細胞の接着後。
***:トリプシン処理、および、細胞集団の、接着表面1cm2あたり20000細胞の濃度への調節後。
実施例6に記載したプロトコールと同じプロトコールを使用して、細胞のバッチを生産した。
Claims (27)
- 接着細胞の生産方法であって、
a.培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入すること;
b.この同培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって該細胞を増幅すること(ここで、1回目の細胞継代の後の各細胞継代は、
i.先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を、マイクロキャリアから細胞を脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後に使用し、
ii.培養培地および増加量のマイクロキャリアを導入する
ことによって行われる);
c.最終細胞継代の間に生産された細胞集団を回収すること(該回収前に、マイクロキャリアから細胞を脱離させるために細胞集団を酵素処理してもよい)
による、方法。 - 接着細胞によって生産された生物学的作用物質の生産方法であって、
a.培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入すること;
b.この同培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって該細胞を増幅すること(ここで、1回目の細胞継代の後の各細胞継代は、
i.先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を、マイクロキャリアから細胞を脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後に使用し、
ii.培養培地および増加量のマイクロキャリアを導入する
ことによって行われる);
c.最終細胞継代の間に生産された細胞集団を、生物学的作用物質を生産するように処理すること(ここで、この処理は、細胞を増幅するために使用したものと同じ培養容器中にて行われる);および
d.生物学的作用物質を回収すること
による、方法。 - 生物学的作用物質が感染病原体であり、工程cにおける細胞集団の処理が、感染培地中にて細胞集団を該感染病原体に感染させることによって行われる、請求項2に記載の方法。
- 感染病原体が狂犬病ウイルスである、請求項3に記載の方法。
- 感染培地が動物由来の生成物を含まない、請求項3または4に記載の方法。
- 同じ培養容器中で行われる細胞継代の回数が2回、3回または4回である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 1回目の細胞継代の間の培養培地中のマイクロキャリアの濃度が1g/l未満である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 1回目の細胞継代の間の培養培地中のマイクロキャリアの濃度が0.5g/l以下である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 酵素処理がタンパク質分解酵素を含有する溶液を使用する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質分解酵素がトリプシンである、請求項9に記載の方法。
- 各次細胞継代が培養培地の量を増加させることによって行われる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 1回目の細胞継代が培養容器の作業容積の1/5〜半分である量の培養培地中にて行われる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 培養培地が動物由来の血清を含まない、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 培養培地が動物由来の生成物を含まない、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 培養培地中のタンパク質濃度が15mg/l以下である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 培養培地がさらに細胞保護剤を含有する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞保護剤がポリビニルピロリドンまたはポロキサマーである、請求項16に記載の方法。
- 培養容器が、3〜3000リットルの作業容積を有するバイオリアクターである、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 培養容器が、20〜1000リットルの作業容積を有するバイオリアクターである、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 培養容器が、20〜500リットルの作業容積を有するバイオリアクターである、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 培養容器が使い捨てバイオリアクターである、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 接着細胞がベロ細胞である、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 工程cにおいて回収される細胞集団が、工程aにおいて最初に導入された細胞の数の少なくとも60倍の細胞を含有する、請求項1および6〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 接着細胞の生産方法であって、
a.接着細胞のストックを解凍すること、次いで
b.この解凍した接着細胞に請求項1および6〜23のいずれか1項に記載の方法を施すこと
による、方法。 - さらに、
a.マイクロキャリアから細胞を脱離させるために細胞集団を酵素処理した後に回収した細胞集団を第2の培養容器に移すこと(ここで、この第2の培養容器は、より大きい作業容積を有し、第1の培養容器中で行われた最終細胞継代の間じゅう存在していたマイクロキャリアの量よりも多量のマイクロキャリアを含有する培養培地を含有する);および
b.この第2の容器中にて、請求項1および6〜24のいずれか1項に記載の方法の工程bおよびcを行うこと
による、請求項1および6〜24のいずれか1項に記載のマイクロキャリアに対する接着細胞の生産方法。 - 請求項25の工程aおよびbを第3の培養容器中にて再度繰り返す(ここで、この第3の培養容器は、第2の培養容器の作業容積よりも大きい作業容積を有する)、請求項25に記載の方法。
- 請求項1および7〜23のいずれか1項に記載の方法であって、単一の培養容器中にて連続細胞継代を行うことにより、生産された細胞の量が60倍以上増加する、方法。
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