PL196042B1 - Sposób przygotowania komórek linii komórkowej MDCK do wytwarzania preparatów wirusowych - Google Patents
Sposób przygotowania komórek linii komórkowej MDCK do wytwarzania preparatów wirusowychInfo
- Publication number
- PL196042B1 PL196042B1 PL98341401A PL34140198A PL196042B1 PL 196042 B1 PL196042 B1 PL 196042B1 PL 98341401 A PL98341401 A PL 98341401A PL 34140198 A PL34140198 A PL 34140198A PL 196042 B1 PL196042 B1 PL 196042B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- production
- batch
- production batch
- approximately
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 69
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 138
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 4
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 3
- 238000010923 batch production Methods 0.000 claims description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000353621 Eilat virus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013190 sterility testing Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Sposób przygotowania komórek linii komórkowej MDCK (komórki psiej nerki Madin Darby) do wytwarzania preparatów wirusowych przez hodowanie komórek MDCK przytwierdzonych do podloza, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie do uzyskania zadanej objetosci partii przedprodukcyjnej i po powtórzonym, nieciaglym procesie: a) w przyblizeniu 80-90% komórek z partii przedprodukcyjnej stosuje sie do przygotowania co najmniej jednej partii produkcyjnej, i b) w przyblizeniu 10-20% komórek partii przedprodukcyjnej stosuje sie jako zaszczep do przy- gotowania co najmniej jednej kolejnej partii przedprodukcyjnej. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w powtórzonym, nieciaglym procesie: a) w przyblizeniu 80-90% komórek partii przedprodukcyjnej przenosi sie w celu uzycia do przy- gotowania co najmniej jednej partii produkcyjnej, i b) w przyblizeniu 10-20% komórek partii przedprodukcyjnej przenosi sie w celu uzycia jako za- szczep do przygotowania co najmniej jednej kolejnej partii przedprodukcyjnej. PL PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób przygotowania komórek linii komórkowej MDCK (komórki psiej nerki Madin Darby) do wytwarzania preparatów wirusowych.
Do wytwarzania preparatów biologicznych, na przykład linii komórkowych, niezbędne będzie przygotowanie dużych ilości komórek w bioreaktorach przy zastosowaniu procedury powiększania skali.
W patencie amerykańskim nr 5017490 ujawniono taką procedurę powiększania skali, przy której uzyskuje się korzyść związaną z niskim ryzykiem przenoszenia zanieczyszczeń. Sposób ten jednakże nie jest odpowiedni w przypadku komórek przyczepno-zależnych (zatem nie dla komórek, które wzrastają jedynie wtedy, gdy są przytwierdzone do podłoża) lub komórek zamkniętych w substracie (na przykład w nośniku porowatym).
W patencie amerykańskim nr 4644 912 ujawniono sposób przygotowania komórek przyczepnozależnych do wytwarzania preparatów biologicznych (tzn. wirusów), w którym zaczyna się od zaszczepu roboczego i kolejne pasaże przeprowadza się w bioreaktorach o wzrastającej objętości 1 l, 5l, 25 l, 150 l, a w końcu w bioreaktorze o objętości 1000 l lub w wielu bioreaktorach o objętości 150 l. Między każdym z pasaży komórki uwalniane są z nośników przy użyciu rozcieńczonego roztworu proteinazy. W końcowym pasażu przeprowadza się zaszczepienie wirusem.
Przy założeniu, że średni czas trwania średniego cyklu komórkowego wynosi około 20-24 godzin, przerwy między pasażami mogą wynosić około 3-5 dni. Zatem, w celu zwiększenia ilości komórek z MWCS (bank producencki komórek roboczych) do wystarczająco dużych kultur pełna procedura powiększania skali może trwać kilka tygodni, w zależności od objętości końcowego bioreaktora.
W powyższych sposobach przygotowania komórek, każda z końcowych partii produkcyjnych musi być przygotowana z MWCS. Do wytwarzania dużych ilości preparatów biologicznych niezbędne jest wykorzystanie kilku równoległych linii hodowlanych aż do zapełnienia reaktorów o największej objętości.
Taka procedura wytwarzania jest więc czasochłonna i wymaga obsługiwania bardzo dużej liczby bioreaktorów, zarówno do wytwarzania komórek, jak i wytwarzania preparatów biologicznych.
Celem obecnego wynalazku jest opracowanie dużo szybszego przygotowania komórek linii MDCK do wytwarzania preparatów biologicznych.
Sposób przygotowania komórek linii MDCK do wytwarzania preparatów wirusowych według wynalazku przez hodowanie komórek MDCK przytwierdzonych do podłoża polega na tym, że hodowlę prowadzi się do uzyskania żądanej objętości partii przedprodukcyjnej i po powtórzonym, nieciągłym procesie:
a) w przybliżeniu 80-90% komórek z partii przedprodukcyjnej stosuje się do przygotowania co najmniej jednej partii produkcyjnej; i
b) w przybliżeniu 10-20% komórek partii przedprodukcyjnej stosuje się jako zaszczep do przygotowania co najmniej jednej kolejnej partii przedprodukcyjnej.
Korzystnie pierwszą partię przedprodukcyjną przygotowuje się z zapasu zaszczepu roboczego przez co najmniej jeden etap pasażowania.
Korzystnie w powtórzonym, nieciągłym procesie:
a) w przybliżeniu 80-90% komórek partii przedprodukcyjnej przenosi się w celu użycia do przygotowania co najmniej jednej partii produkcyjnej; i b) w przybliżeniu 10-20% komórek partii przedprodukcyjnej przenosi się w celu użycia jako zaszczepu do przygotowania co najmniej jednej kolejnej partii przedprodukcyjnej.
Bardziej korzystnie w procesie pierwszą partię przedprodukcyjną przygotowuje się z zapasu zaszczepu roboczego przez co najmniej jeden pasaż, a przed każdym przeniesieniem komórki uwalnia się od ich podłoża.
W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku przygotowane komórki są komórkami przyczepno-zależnymi. W tym przypadku na ogół jest konieczne, aby komórki rosły na podłożu. Tak więc, wskazane jest dodanie kolejnej porcji podłoża w czasie powtarzanego procesu za każdym razem, gdy część partii jest użyta do przygotowania nowej partii.
W korzystnym wykonaniu za każdym razem przed dodaniem podłoża co najmniej część komórek jest najpierw uwalniana od ich pierwotnego podłoża.
Stosowane tu wyrażenie „partia produkcyjna” oznacza hodowlę komórkową używaną do wytwarzania preparatu biologicznego.
PL 196 042 B1
Stosowane tu wyrażenie „partia przedprodukcyjna” oznacza hodowlę komórek stosowanych w sposobie według obecnego wynalazku do przygotowania co najmniej jednej partii produkcyjnej (jak określona powyżej) i jednej kolejnej partii przedprodukcyjnej.
Stosowane tu wyrażenie „preparat biologiczny” oznacza dowolną substancję lub organizm, który może być wytworzony z hodowli komórkowej.
Przykładami „preparatów biologicznych” są wirusy i białka, takie jak enzymy.
Stosowane tu wyrażenie „zapas zaszczepu roboczego” oznacza ilość pewnego typu komórek o określonym pochodzeniu przechowywanych w celu ich użycia jako zaszczepu, z którego wszystkie otrzymane hodowle komórek są tego samego rodzaju.
Wyrażenie „komórki przyczepno-zależne” oznacza komórki, które dla właściwego wzrostu i/lub propagacji muszą być zamocowane do podłoża, jak tu określono.
Wyrażenie „podłoże” oznacza dowolną rozdrobnioną substancję nadającą się do zamocowania komórek.
Stosowane tu wyrażenie „etap pasażowania” oznacza ciąg czynności w procesie propagacji (rozmnażania) i produkcji komórek, obejmujący co najmniej przeniesienie odpowiedniej ilości komórek i odpowiedniej ilości pożywki hodowlanej do naczynia produkcyjnego, inkubację komórek w tym naczyniu w odpowiednich warunkach i przez czas wystarczający do ich efektywnego wzrostu i propagacji (rozmnażania).
Ewentualnie, etap pasażowania może obejmować oddzielenie komórek od pożywki hodowlanej i/lub oddzielenie od podłoża po czasie wystarczającym do efektywnego wzrostu i propagacji (namnażania) komórek.
Dla specjalisty jasne jest, że sposób według niniejszego wynalazku różni się zasadniczo od sposobów znanych ze stanu techniki, w których komórki są produkowane w procesie ciągłym, a nie jak w obecnym wynalazku, w procesie nieciągłym. Według publikacji patentowych EP 0 417 531 i W089/08701 ciągłe systemy hodowli mogą być również zastosowane do produkcji wirusów. Najpierw komórki rosną w pierwszym bioreaktorze, a po osiągnięciu pewnej gęstości w sposób ciągły zasilają drugi bioreaktor. W drugim bioreaktorze wirusy rosną na komórkach, a następnie są odbierane w sposób ciągły z drugiego bioreaktora.
Podstawowym sposobem pracy zgodnie z obecnym wynalazkiem jest stosowanie matecznego bioreaktora, z którego zasilane są komórkami bioreaktory produkcyjne. Gdy są to komórki przyczepnozależne, po każdym pasażu korzystnie wymagają odłączenia od podłoża. W tym celu, w dużym bioreaktorze może być przeprowadzony proces trypsynizacji.
Komórki produkcyjne są określone do specyficznej i charakterystycznej liczby pasaży do tzw. ECB (rozszerzony bank komórek). Opisany sposób pozwala na zwiększenie produkcji, ponieważ procedura zwiększenia skali z WCS do komórek produkcyjnych może być znacznie skrócona, a ilość bioreaktorów zmniejszona, ponieważ równoległe linie produkcyjne nie są już konieczne.
Różne wykonania obecnego wynalazku są przedstawione na fig. 1.
W korzystnym wykonaniu komórki namnaża się z jednej ampułki MWCS do poziomu pierwszej partii przedprodukcyjnej w jednym lub więcej pasażach. Objętość bioreaktora użytego do takiej przedprodukcyjnej partii może sięgać od kilku do kilkuset litrów objętości roboczej. Następnie, część na przykład 10-20% tak namnożonych komórek (na przykład pasaż X) użyto do ponownego namnożenia w bioreaktorze do wytworzenia kolejnej partii przedprodukcyjnej (będącej pasażem nr X + 1) podczas gdy masa komórkowa jest przenoszona (pasaż X lub X + 1) do większego bioreaktora w celu bezpośredniego rozpoczęcia produkcji lub wcześniejszego namnożenia i rozpoczęcia produkcji.
W konwencjonalnych liniach do produkcji seryjnej liczba podwajania się komórek pochodzących z MWCS w momencie zbierania jest w pewnym zakresie znana z góry. Maksymalna, dostępna liczba generacji w systemie produkcji jest ustalona na początku.
W sposobie według wynalazku maksymalna liczba pasaży komórek może być określona przez ECB. Zatem liczba pasaży produkcyjnych (liczba pasaży komórek użytych uprzednio do wytwarzania produktu biologicznego) nie jest związana z ograniczeniami ustanowionymi przez ECB. W konsekwencji, maksymalna liczba pasaży powinna być utrzymana w zakresie ustalonych przepisów.
W wyniku tego, konkretna partia preparatów biologicznych jest bezpośrednim produktem jednej procedury zwiększania skali.
W celu zweryfikowania, czy specyfikacje komórek na etapie ECB w produkcji są podobne do specyfikacji komórek z MCB (macierzysty bank komórek) konieczne jest przeprowadzenie swoistej walidacji z uwzględnieniem charakterystycznych cech wzrostu, wolnego dostępu do dodatkowych
PL 196 042 B1 czynników zewnętrznych i wewnętrznych na różnych etapach, kariologicznej analizy izoenzymów itd. Gdy ECB jest w pełni scharakteryzowane, specjalista może wytworzyć produkt z komórek z pasażu o dowolnym numerze między MCB i ECB, ponieważ można przyjąć, że właściwości komórek nie ulegają zmianom w międzyczasie. Zatem testy na MWCS mogą być ograniczone do testowania jałowości. Jest to szczególną zaletą sposobu według obecnego wynalazku.
Dzięki ustalonej maksymalnej liczbie pasaży, specjalista może zastosować komórki z któregokolwiek dowolnego etapu.
Stąd w celu dalszego ograniczenia czasu potrzebnego do namnożenia komórek z MCWS do bioreaktora produkcyjnego byłoby korzystne umożliwienie namnożenia się dużej ilości komórek.
Można to zrobić przykładowo jednym z następujących sposobów:
- komórki mogą być unieruchamiane przy określonej liczbie pasaży podczas dłuższych przerw w temperaturze otoczenia (17-32°C) i rewitalizowane do logarytmicznej fazy wzrostu przez podniesienie temperatury i zmianę pożywki lub
-masa komórkowa może być zamrożona (w temperaturze poniżej -80°C) i rozmrożona przed przeniesieniem do bioreaktora o uprzednio ustalonej objętości, skutkiem czego znacząco zmniejsza się konieczna procedura zwiększenia skali.
Sposób według obecnego wynalazku może być przeprowadzony z kulturami komórek zwierzęcych, a bardziej konkretnie z komórkami przyczepno-zależnymi.
Odpowiednimi typami komórek są na przykład komórki chomika (CHO, BHK-1), komórki małpy (Vero), komórki bydlęce (MDBK), komórki psie (MDCK), komórki ludzkie (CaCo, A431) lub komórki kurcząt (CEF).
Jako bioreaktor według niniejszego wynalazku może być zastosowana jedna z wielu jednostek, na przykład fermentor mieszadłowy, fermentor z nieruchomym złożem, fermentor ze złożem fluidalnym, fermentor typu „air lift” lub reaktory typu „hollow fibre”.
Komórki z powyższych pasaży są hodowane po zamocowaniu na stałym podłożu, jak mikronośniki lub makronośniki w zawiesinie, na przykład w nieruchomym złożu, w złożu fluidalnym lub w zawiesinie na nośnikach typu „hollow fibers”. Komórki mogą być również uwięzione w nośniku (na przykład w nośniku porowatym).
W trakcie postępowania zgodnego ze sposobem według niniejszego wynalazku, w którym stosuje się stałe podłoże, komórki mają być uwolnione z tegoż podłoża. Można to przeprowadzić dowolnym sposobem przydatnym do odłączania komórek od stałego podłoża. Korzystnie, do tego celu można zastosować roztwór enzymu proteolitycznego. Ewentualnie, ten etap enzymatycznego uwalniania komórek może być poprzedzony przez jeden lub więcej niż jeden etap prekondycjonowania, na przykład traktowania PBS i/lub EDTA w celu zwiększenia wydajności proteolitycznej i/lub w celu zmniejszenia ilości wymaganego enzymu.
Przykład 1
Odłączenie i oddzielenie komórek od nośników przed przeniesieniem do następnego bioreaktora
Komórki przyczepno-zależne linii komórkowej MDCK hodowano w temperaturze 37°C na mikronośniku Cytodex-3 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) (5 g nośnika/litr) w 4-litrowym bioreaktorze mieszadłowym (reaktor macierzysty). Stosowano pożywkę wzrostową EpiSerf (Life Technologies, Paisly, Szkocja). Hodowlę prowadzono maksymalnie do 5x106 komórek/ml w hodowli.
Komórki odłączono od nośnika przez trypsynizację roztworem Trypsin-EDTA (Life Technologies, Paisly, Szkocja).
Po opadnięciu nośnika 80% odłączonych komórek przeniesiono do 3 innych bioreaktorów podobnego rozmiaru. Wszystkie te bioreaktory „produkcyjne” zawierają dodany uprzednio nośnik (substrat komórkowy). Komórki pozostawiono, aby namnożyły się na nośniku, a następnie użyto ich wbioreaktorach produkcyjnych.
Pozostałości komórek w „bioreaktorze macierzystym” pozwolono namnożyć się na nośniku Cytodex-3, po czym hodowano je do żądanej gęstości.
Przykład 2
Odłączenie komórek bez oddzielania ich od nośnika przed przeniesieniem do kolejnego bioreaktora
Hodowlę komórek prowadzono tak, jak to opisano w przykładzie 1, jednakże po trypsynizacji
80% odłączonych komórek, w tym nośnik, przeniesiono do 3 bioreaktorów produkcyjnych. Dodatkowo, do wszystkich bioreaktorów dodano odpowiednie nośniki.
PL 196 042 B1
Pr zy kł a d 3
Odłączenie komórek bez oddzielania ich od nośnika po przeniesieniu do kolejnego bioreaktora
Hodowlę komórek przeprowadzono tak jak to opisano w przykładzie 1, jednakże 80% komórek nadal przylegających przeniesiono do bioreaktora o podobnym rozmiarze, który następnie zastosowano bezpośrednio do wytwarzania produktu.
Komórki pozostałe na mikronośniku w bioreaktorze macierzystym odłączono następnie poprzez trypsynizację, po czym po dodaniu nowego nośnika pozostawiono je do namnożenia się na nośniku.
Pr zy kł a d 4
Początek procesu - z zamrożonej masy komórkowej
W tym doświadczeniu część hodowli zastosowano do odtworzenia partii fermentora macierzystego i kilku fermentorów potomnych a część hodowli zastosowano do zamrożenia masy komórkowej. Z zamrożonej masy komórkowej (ogólna liczba komórek 14,4 x 108) wyprowadzono kulturę wyjściową w 3 l fermentorze macierzystym zawierającym 5 g Cytodexu na litr i pożywkę EpiSerf, po czym inkubowano w temperaturze 37°C. Pozostałe środki zapobiegające zamarzaniu usunięto pierwszego dnia przez zmianę pożywki.
Drugiego dnia przeprowadzono trypsynizację, 50% masy komórkowej zamrożono, a pozostałe komórki inokulowano na mikronośniku w kolejnym fermentorze.
Na podstawie tabeli 1 wiadomo, że komórki między 2 a 3 dniem kontynuowały wzrost z normalną szybkością. W 4 dniu zawartość fermentora macierzystego poddano trypsynizacji i odtworzeniu na nowym mikronośniku (10 g/l) w dwóch innych fermentorach obok fermentora macierzystego. W 5 dniu wydajność hodowli na płytkach wyniosła około 85%.
T ab el a 1
| Dzień | 3-litrowy fermentor macierzysty | 3-litrowy fermentor | 3-litrowy fermentor |
| Komórki x 100,000/ml | Komórki x 100,000/ml | Komórki x 100,000/ml | |
| 0 | NOD | ||
| 1 | 6,6 | ||
| 2 | 14 | ||
| 3 | 15,5 | ||
| 4 | 30 | ||
| 5 | 5,5 | 10 | 10 |
| Wydajność powlekania | 85% | 85% | 85% |
Pr zy kł a d 5
Przeniesienie z małego fermentora macierzystego do dużego fermentora produkcyjnego
Komórki poddano procedurze zwiększania skali w fermentorach o objętościach 65 l i 550 l (objętość robocza odpowiednio 50 i 250 litrów) stosując gęstość mikronośnika 5 g Cytodexu na litr.
Jak widać z tabeli 2, 90% ogólnej liczby komórek przeniesiono do dużego fermentora z małego 50 l fermentora z 800000 komórek/ml, z których okazało się, że 69% było zdolnych do życia. To samo stwierdzono w przypadku 50 l fermentora macierzystego; okazało się, że około 69% ponownie namnożonych komórek było zdolnych do życia.
Sposób postępowania był następujący.
W dniu 0 50 l hodowlę pozostawiono do opadnięcia nośnika, po czym usunięto supernatant (pożywkę hodowlaną) i zastąpiono go PBS. Zawartość fermentora mieszano przez okres od 5-15 minut. Supernatant usunięto po ponownym opadnięciu nośnika. Etap ten może być powtórzony w razie potrzeby.
Następnie czynność powyższą powtórzono przy użyciu PBS/EDTA (0,4 g EDTA na litr PBS).
Hodowlę ponownie mieszano przez okres 5-15 min., po osadzeniu się nośnika usunięto supernatant i etap PBS/EDTA powtarzano do czasu, gdy komórki stały się okrągłe i można było przeprowadzić trypsynizację.
PL 196 042 B1
Następnie trypsynę (o stężeniu końcowym 0,025%) dodano do PBS/EDTA i inkubowano przez 5-15 min. Następnie przeniesiono albo supernatant zawierający komórki (po osadzeniu obecnie „nagiego” nośnika) albo mieszaninę komórek z nośnikiem (80% całości) (jak w przykładzie 9).
Po przeniesieniu komórek do 550 l fermentora pozostałość komórek (zatem 10% komórek zdolnych do życia) pozostawiono do namnożenia się na nośniku nadal obecnym w fermentorze po ponownym napełnieniu go 50 l pożywki. Około 70% komórek było zdolnych do życia.
Tabela 2
| Dzień | Hodowla 50-litrowa komórki x 100,000/ml | Hodowla 250-litrowa komórki x 100,000/ml |
| 0 | 8 (w sumie 400 x 108 komórek) | 1,1 (275 x 108 komórek żywotnych) |
| 1 | 0,8 | |
| 2 | 2,9 | |
| 3 | 3,4 | |
| 4 | 8,9 | |
| 5 | 18,0 |
Przykład 6
Podobnie jak w przykładzie 5, 80% hodowli komórek związanych z nośnikiem przeniesiono z bioreaktora macierzystego do bioreaktora produkcyjnego. Produkcja zaczęła się po dodaniu wirusa.
20% komórek i nośnika pozostałych w bioreaktorze matecznym poddano trypsynizacji i odłączono od podłoża, po czym po dodaniu nowego substratu do bioreaktora macierzystego komórki pozostawiono do ponownego namnożenia się w bioreaktorze macierzystym, podczas gdy produkcja nadal przebiegała w fizycznie oddzielonym bioreaktorze produkcyjnym.
Przykład 7
Hodowla na dużą skalę z zamrożonej masy komórkowej
Zamrożoną masę komórkową rozmrożono i zaszczepiono w 10 litrowym (objętość robocza) fermentorze (nośnik Cytodex o gęstości 5 g/l; pożywka hodowlana EpiSerf) o gęstości zaszczepienia 1x106 komórek/ml). Po związaniu, pożywkę hodowlaną wymieniono w celu usunięcia pozostałych środków zapobiegających zamarzaniu.
Po 1 dniu ilość komórek zdolnych do życia, związanych z nośnikiem wynosiła 0,45x 106 komórek/ml, które od tej chwili zaczęły rosnąć. Przy gęstości 2,8 x 106 komórek/ml komórki odłączono od nośnika na drodze trypsynizacji i 80% przeniesiono do fermentora o objętości roboczej 50 l (nośnik 5 g/l).
Z tabeli 3 można wywnioskować, że w 1dniu ilość komórek zdolnych do życia po zamrożeniu masy komórkowej wynosiła około 45%.
Po trypsynizacji ilość komórek zdolnych do życia wynosiła 71,4% całkowitej ilości przeniesionych komórek.
Tabela 3
| Dzień | Gęstość komórek w fermentorze (x 106/l) 5-litrowym | Gęstość komórek w fermentorze (x 106/l) 10-litrowym |
| 0 | 1/0 | |
| 1/2 | 0,45 | |
| 3/4 | 1/3 | |
| 5 | 2,6 | |
| 6 | 2,8 (w sumie 280 x 108) | |
| 6 | 0,6 (w sumie 60 x 108) | 0,28 (w sumie 140 x 108) |
| 7 | 0,4 (w sumie 200 x 108) |
PL 196 042 B1
Claims (4)
1. Sposób przygotowania komórek linii komórkowej MDCK (komórki psiej nerki Madin Darby) do wytwarzania preparatów wirusowych przez hodowanie komórek MDCK przytwierdzonych do podłoża, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się do uzyskania żądanej objętości partii przedprodukcyjnej i po powtórzonym, nieciągłym procesie:
a) w przybliżeniu 80-90% komórek z partii przedprodukcyjnej stosuje się do przygotowania co najmniej jednej partii produkcyjnej, i
b) w przybliżeniu 10-20% komórek partii przedprodukcyjnej stosuje się jako zaszczep do przygotowania co najmniej jednej kolejnej partii przedprodukcyjnej.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w powtórzonym, nieciągłym procesie:
a) w przybliżeniu 80-90% komórek partii przedprodukcyjnej przenosi się w celu użycia do przygotowania co najmniej jednej partii produkcyjnej, i b) w przybliżeniu 10-20% komórek partii przedprodukcyjnej przenosi się w celu użycia jako zaszczep do przygotowania co najmniej jednej kolejnej partii przedprodukcyjnej.
3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że pierwszą partię przedprodukcyjną przygotowuje się z zapasu zaszczepu roboczego przez co najmniej jeden etap pasażowania.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że przed każdym przeniesieniem komórki uwalnia się od ich podłoża.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97204110 | 1997-12-24 | ||
| PCT/EP1998/008522 WO1999033955A1 (en) | 1997-12-24 | 1998-12-17 | Preparation of cells for production of biologicals |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL341401A1 PL341401A1 (en) | 2001-04-09 |
| PL196042B1 true PL196042B1 (pl) | 2007-11-30 |
Family
ID=8229133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL98341401A PL196042B1 (pl) | 1997-12-24 | 1998-12-17 | Sposób przygotowania komórek linii komórkowej MDCK do wytwarzania preparatów wirusowych |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20070148753A1 (pl) |
| EP (2) | EP1060241B2 (pl) |
| JP (1) | JP4478328B2 (pl) |
| KR (1) | KR100683429B1 (pl) |
| CN (1) | CN1185339C (pl) |
| AT (2) | ATE507284T1 (pl) |
| AU (1) | AU758209B2 (pl) |
| BR (1) | BR9814490A (pl) |
| CA (1) | CA2316739C (pl) |
| CZ (1) | CZ299719B6 (pl) |
| DE (2) | DE69842245D1 (pl) |
| DK (2) | DK1060241T4 (pl) |
| ES (2) | ES2281148T5 (pl) |
| HK (1) | HK1030628A1 (pl) |
| HU (1) | HUP0100538A3 (pl) |
| ID (1) | ID26784A (pl) |
| IL (1) | IL136736A (pl) |
| NO (1) | NO329385B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ505371A (pl) |
| PL (1) | PL196042B1 (pl) |
| PT (2) | PT1060241E (pl) |
| RU (1) | RU2230784C2 (pl) |
| SK (1) | SK285971B6 (pl) |
| TR (1) | TR200001960T2 (pl) |
| UA (1) | UA72732C2 (pl) |
| WO (1) | WO1999033955A1 (pl) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112012015596B1 (pt) | 2009-12-23 | 2021-06-01 | Sanofi Pasteur | Processo de cultura de células aderentes |
| CA3087569A1 (en) | 2018-01-09 | 2019-07-18 | Synthetic Biologics, Inc. | Alkaline phosphatase agents for treatment of neurodevelopmental disorders |
| CA3094173A1 (en) | 2018-03-20 | 2019-09-26 | Synthetic Biologics, Inc. | Intestinal alkaline phosphatase formulations |
| EP3773686B1 (en) | 2018-03-20 | 2023-06-07 | Theriva Biologics, Inc. | Alkaline phosphatase agents for treatment of radiation disorders |
| US20190367858A1 (en) * | 2018-06-01 | 2019-12-05 | Lonza Ltd. | Midscale Model For Organic Growth and Phasing |
| US20220259554A1 (en) * | 2019-07-16 | 2022-08-18 | Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. | Cell culture method and application thereof based on high-density and continuous inoculation |
| EP4339274A1 (en) | 2022-09-13 | 2024-03-20 | Sartorius Stedim Biotech GmbH | Method for operating a bioprocess installation for production of a bioproduct |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60151458A (ja) | 1984-01-20 | 1985-08-09 | Nippon Piston Ring Co Ltd | カムシヤフト |
| US4664912A (en) * | 1984-10-01 | 1987-05-12 | Wiktor Tadeusz J | Process for the large scale production of rabies vaccine |
| DE3833925A1 (de) * | 1988-03-11 | 1989-09-21 | Inst Angewandte Biotechnologie | Verfahren und herstellung von virus und viralem antigen und vorrichtung hierzu |
| US5017490A (en) | 1989-03-10 | 1991-05-21 | Baxter International Inc. | Method for in vitro reproduction and growth of cells in culture medium |
| DE3930140A1 (de) * | 1989-09-09 | 1991-03-21 | Bayer Ag | Verfahren zur herstellung von biologischen materialien in zellkulturen und vorrichtungen |
| CA2098510A1 (en) * | 1990-12-13 | 1992-06-14 | Kenneth W. Culver | Sustained and continuous production of high titers of recombinant viral vectors and transduced target cells for use in gene therapy |
| DE19612966B4 (de) | 1996-04-01 | 2009-12-10 | Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg | MDCK-Zellen und Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren |
| KR100669716B1 (ko) * | 2004-07-14 | 2007-01-16 | 삼성에스디아이 주식회사 | 페닐카르바졸 화합물 및 이를 이용한 유기 전계 발광 소자 |
| KR100787425B1 (ko) * | 2004-11-29 | 2007-12-26 | 삼성에스디아이 주식회사 | 페닐카바졸계 화합물 및 이를 이용한 유기 전계 발광 소자 |
| US8188315B2 (en) * | 2004-04-02 | 2012-05-29 | Samsung Mobile Display Co., Ltd. | Organic light emitting device and flat panel display device comprising the same |
| KR100573137B1 (ko) * | 2004-04-02 | 2006-04-24 | 삼성에스디아이 주식회사 | 플루오렌계 화합물 및 이를 이용한 유기 전계 발광 소자 |
| JP4184332B2 (ja) * | 2004-11-22 | 2008-11-19 | 本田技研工業株式会社 | 可変気筒式内燃機関の制御装置 |
-
1998
- 1998-12-17 DE DE69842245T patent/DE69842245D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 DK DK98966693.8T patent/DK1060241T4/da active
- 1998-12-17 RU RU2000119783/13A patent/RU2230784C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 SK SK965-2000A patent/SK285971B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 AT AT07103139T patent/ATE507284T1/de active
- 1998-12-17 UA UA2000074455A patent/UA72732C2/uk unknown
- 1998-12-17 ES ES98966693T patent/ES2281148T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 AU AU24179/99A patent/AU758209B2/en not_active Ceased
- 1998-12-17 DE DE69837287T patent/DE69837287T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 DK DK07103139.7T patent/DK1801201T3/da active
- 1998-12-17 PL PL98341401A patent/PL196042B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 EP EP98966693A patent/EP1060241B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 TR TR2000/01960T patent/TR200001960T2/xx unknown
- 1998-12-17 PT PT98966693T patent/PT1060241E/pt unknown
- 1998-12-17 IL IL13673698A patent/IL136736A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 ES ES07103139T patent/ES2365631T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 ID IDW20001431A patent/ID26784A/id unknown
- 1998-12-17 CN CNB988126354A patent/CN1185339C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-17 PT PT07103139T patent/PT1801201E/pt unknown
- 1998-12-17 WO PCT/EP1998/008522 patent/WO1999033955A1/en active IP Right Grant
- 1998-12-17 EP EP07103139A patent/EP1801201B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-17 HU HU0100538A patent/HUP0100538A3/hu not_active Application Discontinuation
- 1998-12-17 NZ NZ505371A patent/NZ505371A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 CZ CZ20002343A patent/CZ299719B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 JP JP2000526613A patent/JP4478328B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-17 KR KR1020007007068A patent/KR100683429B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 BR BR9814490-1A patent/BR9814490A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-12-17 AT AT98966693T patent/ATE356197T1/de active
- 1998-12-17 CA CA2316739A patent/CA2316739C/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-06-21 NO NO20003215A patent/NO329385B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-03-06 HK HK01101591A patent/HK1030628A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-01-18 US US11/654,556 patent/US20070148753A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| USRE46897E1 (en) | Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same | |
| US6100061A (en) | Recombinant cell clone having increased stability in serum- and protein-free medium and a method of recovering the stable cell clone and the production of recombinant proteins by using a stable cell clone | |
| US20070148753A1 (en) | Preparation of cells for production of biologicals | |
| Birch et al. | Selecting and designing cell lines for improved physiological characteristics | |
| Hu | Quantitative and mechanistic analysis of mammalian cell cultivation on microcarriers | |
| MXPA00006339A (en) | Preparation of cells for production of biologicals | |
| Lee et al. | Monoclonal antibody production using free-suspended and entrapped hybridoma cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RECP | Rectifications of patent specification | ||
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20131217 |