ES2281148T3 - Preparacion de celulas para la produccion de material biologico. - Google Patents
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Abstract
Un método para la preparación de células para su uso en la producción de materiales biológicos, cultivando células hasta un volumen de células deseado de un lote de preproducción, en el que después en un proceso discontinuo repetido: a) parte de las células del lote de preproducción son usadas para la preparación de al menos un lote de producción, y b) la parte restante de las células del lote de preproducción es usada como una semilla para la preparación de al menos un lote de preproducción subsiguiente.
Description
Preparación de células para la producción de
material biológico.
El presente invento tiene que ver con un método
para la preparación de células para usar en la producción de
material biológico.
Para la producción de material biológico, por
ejemplo líneas celulares, se necesitará la preparación de cantidades
grandes de células usando un procedimiento de escalado en
bioreactores.
El documento de patente norteamericana Nº
5.017.490 describe tal procedimiento de escalado que proporciona en
particular la ventaja de un bajo riesgo de contaminación por
transferencia. Este método no es, sin embargo, adecuado para
células dependientes de anclaje (de ahí que, no sea para células que
sólo crecen si están fijadas a un sustrato) o células embebidas en
un sustrato (por ejemplo vehículos porosos).
El documento de patente norteamericana Nº
4.644.912 describe un método para la preparación de células
dependientes de anclaje para la producción de material biológico
(es decir, virus) comenzando con una semilla de células de trabajo,
y con subsiguientes pases efectuados en volúmenes crecientes
consecutivos de bioreactores de 1 litro, 5 litros, 25 litros, 150
litros, y finalmente bien en un bioreactor de 1000 litros o en
reactores múltiplos de 150 litros. Entre cualquiera de estas
etapas de pases las células fueron liberadas de sus vehículos con
una disolución de proteasa diluida. En el pase final la inoculación
por virus fue efectuada.
Asumiendo tiempos de ciclo celular promedio de
alrededor de 20 a 24 horas los intervalos de pases pueden ser de
alrededor de 3-5 días. Por lo tanto, para expandir
las células a cultivos lo suficientemente grandes a partir de un
MWCS^{1} el procedimiento total de escalado puede
llevar varias semanas, dependiendo del volumen del bioreactor
final.
En los métodos anteriores para la preparación de
células cada uno de los lotes de producción finales tiene que ser
preparado a partir de MWCS. Para la producción de grandes cantidades
de material biológico será necesario utilizar varias líneas de
cultivo en paralelo hasta los volúmenes del recipiente más grande.
Tal procedimiento de preparación, por consiguiente, consume mucho
tiempo y necesita la operación de un número muy considerable de
bioreactores para la preparación de las células así como para la
producción de material biológico.
Es un objeto del presente invento proporcionar
una producción más rápida en la preparación de células para la
producción de material biológico.
Por consiguiente, el presente invento se refiere
a un método para la preparación de células para usar en la
producción de material biológico, cultivando células hasta un
volumen celular deseado de un lote de preproducción, en el que
después en un proceso discontinuo repetitivo:
- a)
- parte de las células del lote de preproducción es usada para la preparación de al menos un lote de preproducción, y
- b)
- la parte restante de las células del lote de preproducción es usada como una semilla para la preparación de al menos un lote de preproducción subsiguiente.
Más en particular, el presente invento se
refiere a un método para la preparación de células para usar en la
producción de material biológico, cultivando células hasta un
volumen celular deseado de un lote de preproducción, en el que
después en un proceso discontinuo repetitivo:
- a)
- parte de las células del lote de preproducción es transferida para ser usada para la preparación de al menos un lote de preproducción, y
- b)
- la parte restante de las células del lote de preproducción es transferida para ser usada como una semilla para la preparación de al menos un lote de preproducción subsiguiente.
En una realización preferida del presente
invento el primer lote de preproducción es preparado a partir de un
patrón de semilla de trabajo mediante al menos una etapa de
pases.
En una realización adicional preferida del
presente invento las células que son preparadas son dependientes de
anclaje. En el último caso generalmente será necesario que las
células sean hechas crecer sobre un sustrato. Será entonces
recomendable durante el proceso repetido cada vez cuando parte del
lote es usado para la preparación de un nuevo lote añadir una
cantidad adicional de sustrato. En una realización preferida, cada
tiempo previo a la adición de sustrato al menos parte de las
células son primero liberadas de sus sustrato original.
\newpage
Como se usa aquí la expresión "producción en
lotes" significa un cultivo de células que es empleado para la
producción de material biológico.
Como se usa aquí, la expresión "preproducción
en lotes" significa un cultivo de células que es usado en el
proceso según el presente invento para la preparación de al menos un
lote de producción (como se define anteriormente) y un lote de
preproducción en lote subsiguiente.
Como se usa aquí la expresión "material
biológico" significa cualquier sustancia u organismo que puede
ser producido a partir de un cultivo celular. Ejemplos de
"material biológico" son virus y proteínas tales como
enzimas.
Como se usa aquí la expresión "patrón de
semillas de trabajo" significa una cantidad de cierto tipo de
células de ancestros definidos almacenadas para ser usadas como una
semilla a partir de la que todos los cultivos del mismo tipo de
células son derivados.
Como se usa aquí la expresión "células
dependientes de anclaje" significa células que para su propio
crecimiento y/o propagación necesitan estar unidas a un sustrato
como se define aquí.
Como se usa aquí la expresión "sustrato"
significa cualquier materia particulada útil para la unión de
células.
Como se usa aquí la expresión "etapa de
pases" significa una secuencia de actividades en la propagación y
producción de células que comprenden al menos la transferencia de
una cantidad adecuada de células y de una cantidad adecuada de
medios de cultivo en un recipiente de producción, la incubación del
recipiente en condiciones adecuadas para el crecimiento y
propagación de las células durante un tiempo suficiente para el
crecimiento eficaz y propagación de las células. Opcionalmente una
etapa de pases puede comprender la separación de las células a
partir del medio de cultivo y/o del sustrato después de un tiempo
suficiente para el crecimiento eficaz y propagación de las
células.
Quedará claro para el profesional experto en la
técnica que el método según el presente invento difiere
esencialmente de los métodos conocidos en la técnica en los que las
células son producidas en un proceso continuo más que en el proceso
discontinuo presente. Según las publicaciones de patentes EP0417531
y WO89/08701 los sistemas de cultivo continuos pueden ser empleados
también para la producción de virus. Primero las células son hechas
crecer en un primer bioreactor, y después de que se ha alcanzado una
cierta densidad celular son alimentadas de modo continuo desde
dicho primer bioreactor a un segundo bioreactor. En este segundo
bioreactor los virus son hechos crecer sobre células y
subsiguientemente estos virus son retirados de modo continuo a
partir de este segundo bioreactor.
El método básico de trabajo según el presente
invento es usar un bioreactor madre desde el que el/los
bioreactor/es de producción es/son alimentado/s con células. Cuando
las células son dependientes de anclaje, después de cada etapa de
pases las células necesitan preferiblemente ser liberadas de sus
sustratos.
Un procedimiento de tripsinización sobre grandes
bioreactores ha sido desarrollado para este propósito. Las células
de producción son definidas hasta un número de pases específico y
característico para el así llamado ECB^{2} . El método descrito permite
una producción de alto rendimiento puesto que la ruta de escalado
desde WCS hasta las células de producción puede ser acortado en
gran medida y muchos menos bioreactores son necesarios puesto que
las líneas de producción en paralelo ya no son necesarias.
Varias realizaciones del presente invento son
descritas en la Figura 1.
En una realización preferida las células son
expandidas de una ampolla de un MWCS hasta el nivel del primer lote
de preproducción a través de una o más etapas de pases. El tamaño
del bioreactor usado para tal lote de preproducción puede oscilar
desde varios litros de volumen de trabajo hasta varios cientos de
litros. A continuación, una parte, por ejemplo
10-20% de las células así expandidas (por ejemplo
pase X) son usadas para repoblar un bioreactor para la producción
de una lote de preproducción subsiguiente (siendo el pase número X
+ 1), mientras que el grueso de las células es transferido (pase X o
X+1) a una tamaño de bioreactor mayor para comenzar la producción
directamente o para primero repoblar, y subsiguientemente comenzar
la producción.
En líneas de producción en serie clásicas el
número de duplicaciones de las células derivadas del MWCS en el
momento de la recogida es conocido de antemano con ciertos límites.
Un número de generaciones máximo permitido es seleccionado en el
sistema de producción al comienzo.
En el método según el presente invento el número
máximo de pases celulares puede ser definido por el ECB. El número
de pases de producción (el número de pases celulares usados
previamente a la producción del producto biológico), es por tanto,
irrelevante dentro de los límites establecidos por el ECB. Como
consecuencia, tal número máximo de pases ha de ser obedecido en
vista de las restricciones reguladoras. Como resultado del
particular lote de productos biológicos en el producto final de una
ruta de escalado directo.
\newpage
Para verificar si las especificaciones de las
células en el estadío de ECB en la producción son similares al
MCB^{3} se necesita llevar a cabo una validación
específica para este propósito con respecto a las características
de crecimiento, libertad de agentes adventicios, externos o
endógenos en las diferentes etapas, análisis cariológicos de
isoenzimas y así sucesivamente. Una vez tal ECB es totalmente
caracterizado se puede permitir producir el producto con células a
cualquier número de pases entre MCB y ECB, puesto que se puede
asumir que las células no han cambiado entretanto en sus
especificaciones. Como resultado, los ensayos en los MWCS por lo
tanto pueden limitarse a ensayos de esterilidad. Esto es una
ventaja particular del método según el presente invento.
Con el número de pases máximo establecido se
pueden usar células en cualquier estadio intermedio. A partir de
aquí, para minimizar adicionalmente el tiempo necesario para
expandir las células desde MWCS hasta el bioreactor de producción
sería una ventaja permitir un comienzo de masa de células. Esto
puede ser hecho por ejemplo en uno de los siguientes modos.
- \bullet
- las células pueden ser dejadas en un cierto número de pases durante intervalos mayores a temperatura ambiente (17-32ºC) y ser reactivadas hasta crecimiento en expansión log mediante el aumento de la temperatura y cambiando el medio de cultivo, o
- \bullet
- las células pueden ser congeladas (Temp < -80ºC) en masa y descongeladas previamente a transferirlas a un bioreactor de volumen preestablecido, reduciendo de este modo la necesidad de escalar hacia arriba la ruta de modo significativo.
El método según el presente invento puede ser
llevado a cabo con cultivos de células animales y más en particular
con células dependientes de anclaje. Tipos de células adecuados son
por ejemplo células de hámster (CHO, BHK-1),
células de mono (Vero), células bovinas (MDBK), células caninas
(MDCK), células humanas (CaCo, A431) o células de pollo (CEF).
Como bioreactor según los inventos presentes
puede ser usado una unidad única o una pluralidad de unidades de
por ejemplo fermentadores agitados, fermentadores de lecho fijo,
fermentadores de lecho fluido, fermentadores de aire, o reactores
de fibra hueca.
Las células de los tiempos anteriores pueden y
algunas deberían incluso ser cultivadas cuando se fijan a un
soporte sólido, como microvehículos o macrovehículos en suspensión,
por ejemplo en un lecho fijo, un lecho fluido o en suspensión, o
como fibras huecas. Las células pueden también ser embebidas en un
vehículo (por ejemplo vehículo poroso).
En el transcurso del método según el presente
invento, en particular cuando su usa un soporte sólido, las células
han de ser liberadas de su soporte sólido, Esto puede ser efectuado
mediante cualquier método útil para liberar las células de un
soporte sólido. Ventajosamente, para este fin se puede hacer uso de
una disolución de enzimas proteolíticas. Opcionalmente, esta etapa
de liberación enzimática puede ser precedida por una o más etapas
de preacondicionamiento, por ejemplo, mediante tratamiento con PBS
y/o EDTA, para potenciar la eficacia proteolítica, y/o para reducir
la cantidad de enzima proteolítica requerida.
Células dependientes de anclaje de la línea
celular MDCK^{4} fueron cultivadas a 37ºC en
Cytodex-3 microvehículos (Pharmacia, Uppsala,
Suecia) (5 g de vehículo/l) en un bioreactor agitado de 4 litros
("bioreactor madre"). El medio de crecimiento fue EpiSerf
(Life Technologies, Paisly, Escocia). El crecimiento fue continuado
hasta un máximo de 5 x 10^{6} células/ml de cultivo.
Las células fueron liberadas de los vehículos
mediante tripsinización en una disolución
tripsina-EDTA (Life Technologies, Paisly,
Escocia).
Tras liberarse de los vehículos el 80% de las
células liberadas fueron transferidas a otros 3 reactores de tamaño
similar. Los bioreactores de "producción" últimos tienen todos
los vehículos (sustratos celulares) añadidos a ellos de antemano.
Se permitió que las células repoblaran los vehículos y usadas
subsiguientemente para la producción en estos bioreactores de
producción.
Se dejó que el resto de las células en el
"bioreactor madre" repoblaran los vehículos
Cytodex-3 restantes y fueron cultivadas hasta la
densidad celular deseada.
\newpage
El cultivo de células fue llevado a cabo como se
describe en el Ejemplo 1, sin embargo tras la tripsinización el 80%
de las células liberadas incluyendo los vehículos son transferidas a
los 3 bioreactores de producción. Adicionalmente, los vehículos
adecuados fueron añadidos a todos los bioreactores.
El cultivo de células fue llevado a cabo como se
describe en el Ejemplo 1, sin embargo, el 80% de las células aún
adheridas fueron transferidas a un bioreactor de tamaño similar que
fueron a continuación usadas directamente para la generación del
producto.
Las células restantes en microvehículos en el
fermentador madre fueron a continuación liberadas mediante
tripsinización, a las que después se añadieron nuevos vehículos y
las células fueron dejadas que repoblaran los sustratos.
En este experimento parte del cultivo fue usado
para reprocesar el fermentador madre y algunos fermentadores hijos
y parte del cultivo fueron usada para congelar células en masa. Las
células en masa congeladas (total 14,4 x 10^{8} células) fueron
inoculados en un cultivo de inicio en un fermentador madre de 3
litros que contenía 5 g de Cytodex por litro y medio de EpiSerf, y
a continuación incubadas a 37ºC. Los crioconservantes residuales
fueron eliminados mediante un cambio de medio a día 1. A día 2 la
tripsinización fue llevada a cabo, el 50% de las células fueron
cultivadas en masa y el resto de las células fueron inoculadas sobre
los microvehículos en un fermentador subsiguiente.
A partir de la Tabla 1 se puede deducir que las
células continúan creciendo a una velocidad normal entre día 2 y día
3.
A día 4 el contenido del fermentador madre fue
liberado con tripsina y reprocesado sobre nuevos microvehículos (10
g/l) en otros dos fermentadores junto con el fermentador madre.
A día 5 la eficacia de crecimiento en placa
resultó ser de alrededor del 85%.
Las células fueron escaladas hasta una escala
mayor en fermentadores de 65 litros y de 550 litros (50 litros y
250 litros de volumen de trabajo, respectivamente) usando un
microvehículo de densidad de 5 g de Cytodex por litro. Como se
puede observar a partir de la Tabla 2, el 90% del total de las
células es transferido a un fermentador a gran escala desde un
cultivo en fermentador de 50 litros con 800.000 células/ml de las
cuales 69% demostraron ser viables.
Lo mismo se encontró en el fermentador madre de
50 litros, alrededor de 69% de las células repropagantes resultaron
ser viables.
El procedimiento fue el siguiente:
A día 0, los vehículos se dejaron fijar en el
cultivo de 50 litros, en el que después el sobrenadante (medio de
cultivo)fue retirado y remplazado por PBS. El contenido del
fermentador fue agitado durante 5-15 minutos. El
sobrenadante fue eliminado después de liberarse de los vehículos.
Esta etapa puede ser repetida si es necesario.
La siguiente etapa fue repetida con PBS/EDTA
(0,4 gramos EDTA/litro PBS). De nuevo el cultivo fue agitado
durante 5-15 minutos, los vehículos se dejaron
asentar, el sobrenadante fue eliminado, y la etapa de PBS/EDTA fue
repetida hasta que las células se hubieron vuelto redondas y
estuvieron listas para ser liberadas con tripsina.
Luego la tripsina (0,025% de concentración
final) fue añadida al PBS/EDTA e incubada durante
5-15 minutos. A continuación bien el sobrenadante
que contenía las células (tras la eliminación de los ahora vehículos
"desnudos") fue transferido (como en el ejemplo 9) o bien la
mezcla de las células mas los vehículos fue transferida (80% total
de la mezcla total).
Tras la transferencia de las células a un
fermentador de 550 litros el resto de las células (por tanto, el
10% de las células viables) se dejó que repoblaran los vehículos aún
presentes en el fermentador tras rellenar el fermentador de 50 l con
medio de cultivo.
Alrededor del 70% de las células demostraron ser
viables.
Análogo al ejemplo 5, sin embargo, el 80% del
cultivo de las células unidas al vehículo fueron transferidas desde
el bioreactor madre al bioreactor de producción. La producción fue
comenzada tras la adición del virus.
El 20% de las células y vehículos restantes en
el bioreactor madre fueron tripsinizadas y liberadas y tras la
adición de nuevo sustrato en el bioreactor madres se dejó que
repoblaran el bioreactor madre mientras que la producción estaba en
marcha en el bioreactor de producción separado físicamente.
Las células en masa congeladas fueron
descongeladas e inoculadas en un fermentador de 10 litros (volumen
de trabajo) (densidad del vehículo Cytodex 5 g/l; medio de cultivo
EpiSerf) a una densidad de inoculación de 1 x 10^{6} células/ml.
Tras la liberación, el medio de cultivo fue remplazado para eliminar
los crioconservantes residuales.
Tras el día 1 la cantidad de células viables
unidas a los vehículos fue 0,45 x 10^{6} células/ml que a partir
de entonces comenzaron el crecimiento. A una densidad de 2,8 x
10^{6} células/ml las células fueron liberadas de sus vehículos
mediante tripsinización y el 80% fue transferido a un fermentador de
volumen de trabajo de 50 litros (vehículos 5 g/l).
Como se puede deducir de la Tabla 3, a día 1 la
cantidad de células tras congelación en masa de las células fue
alrededor del 45%.
De la cantidad total de células transferidas, la
viabilidad tras la liberación por tripsina fue de 71,4%.
Claims (6)
1. Un método para la preparación de células
para su uso en la producción de materiales biológicos, cultivando
células hasta un volumen de células deseado de un lote de
preproducción, en el que después en un proceso discontinuo
repetido:
- a)
- parte de las células del lote de preproducción son usadas para la preparación de al menos un lote de producción, y
- b)
- la parte restante de las células del lote de preproducción es usada como una semilla para la preparación de al menos un lote de preproducción subsiguiente.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que en el proceso discontinuo repetido:
- a)
- parte de las células del lote de preproducción es transferido para ser usado para la preparación de al menos un lote de preproducción, y
- b)
- la parte restante de las células del lote de preproducción es transferido para ser usado como una semilla para la preparación de al menos un lote de preproducción subsiguiente.
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque un primer lote de preproducción es
preparado a partir de un patrón de semilla de trabajo mediante al
menos una etapa de pases.
4. Un método según la reivindicación
1-3, caracterizado porque las células son
células dependientes de anclaje que para su crecimiento y/o
propagación necesitan estar unidas a un sustrato.
5. Un método según la reivindicación 2,
caracterizado porque las células son células dependientes de
anclaje que para su crecimiento y/o propagación necesitan estar
unidas a un sustrato, las células son crecidas sobre dicho sustrato,
y previamente a cada etapa de transferencia las células son
liberadas de dicho sustrato.
6. Un método según la reivindicación
1-5, caracterizado porque el material
biológico de interés es un virus.
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