ES2558430T3

ES2558430T3 - Medio de crecimiento para Clostridium histolyticum sin ingredientes de fuentes de mamífero

Info

Publication number: ES2558430T3
Application number: ES09007502.9T
Authority: ES
Inventors: Werner Hoelke; Artur Hoffmann; Thomas Marx; Kirsten Sonn; Bernhard Suppmann; Johann-Peter Thalhofer
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2008-06-11
Filing date: 2009-06-06
Publication date: 2016-02-04
Anticipated expiration: 2029-06-06
Also published as: JP2009297028A; EP2133415B1; SG179458A1; US8236356B2; JP5583927B2; CN101603020B; SG158025A1; CA2668353A1; CN101603020A; US20100086971A1; KR101157437B1; HK1139705A1; CA2668353C; EP2133415A1; KR20090129362A

Abstract

Un medio líquido para el cultivo de Clostridium histolyticum, comprendiendo el medio agua, una gelatina de pescado y una peptona vegetal, seleccionándose la fuente de la peptona del grupo que consiste en soja, haba, guisante, patata, y una mezcla de los mismos, en el cual la concentración de agregado de la peptona o peptonas vegetales en el medio es entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 10 % en peso por volumen, y por lo cual en el medio la concentración de gelatina de pescado es entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 10 %, indicando el porcentaje peso por volumen cuando al gelatina de pescado aislada es materia seca y volumen por volumen cuando la gelatina de pescado aislada es materia líquida.

Description

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DESCRIPCION

Medio de crecimiento para Clostridium histolyticum sin ingredientes de fuentes de mai^ero

La presente invencion se incluye en el campo de la microbiologfa. Particularmente, la invencion se refiere a la optimizacion de medios de cultivo para Clostridium histolyticum.

Antecedentes de la invencion

El genero Clostridium abarca bacterias Gram-positivas con forma de varilla que son anaerobios obligados capaces de producir endosporas. Clostridium incluye bacterias libres habituales, asf como patogenos importantes que incluyen C. botulinum, C. difficile, C. perfringens, C. tetani, y C. histolyticum. La ultima especie es conocida por que produce colagenasas que son exotoxinas y actuan como factores de virulencia, facilitando, por ejemplo, la propagacion de gangrena gaseosa. Las colagenasas normalmente se dirigen al tejido conectivo en celulas musculares y otros organos corporales. Debido a la potente actividad hidrolftica hacia el tejido conectivo, se usan colagenasas y otras proteinasas tales como termolisina para la disociacion tisular in vitro.

C. histolyticum puede aislarse del suelo. Sin embargo, no es habitual encontrar la bacteria en heridas. C. histolyticum no es estrictamente anaerobico y puede crecer debilmente en medios incubados de forma aerobica. En cultivo, las protemas y peptidos son la fuente principal de carbono de C. histolyticum que secreta una diversidad de enzimas capaces de hidrolizar enlaces peptfdicos.

Para aplicaciones tecnicas, las colagenasas de C. histolyticum, es decir, la colagenasa de tipo I y tipo II, son de particular importancia, por ejemplo, para la disociacion de tejido organico in vitro. De manera significativa, la digestion con colagenasa de tejido pancreatico se usa actualmente en la preparacion y aislamiento de celulas humanas de los islotes. Sin embargo, se han aislado otros varios tipos diferentes de tipos celulares espedficos del tejido conectivo auxiliar, incluyendo celulas grasas de tejido adiposo, hepatocitos del hugado, condrocitos de cartflago, miocitos del corazon, y osteoblastos del hueso.

Una ventaja practica es que C. histolyticum puede cultivarse en grandes cantidades en medios lfquidos simples, y produce de forma regular cantidades de enzimas proteolfticas que se secretan en el medio de cultivo.

El documento RO 51768 describe un medio para cultivar Clostridium histolyticum para producir colagenasa, en el cual el medio contema peptona y aceite de parafina.

El documento RU 2180002 describe un medio para la fermentacion y purificacion de colagenasa de Clostridium histolyticum que comprende casema e hidrolizado de torta de aceite de soja. Los ingredientes adicionales fueron dihidrogenofosfato sodico monohidrato, hidrogenofosfato potasico dihidrato, piridoxina, riboflavina, bromuro de tiamina, acido folico, pantotenato de calcio, acido nicotmico, acido lipoico, y biotina.

El documento WO 2003/025136 describe un medio de fermentacion basado en gelatina para la produccion de celulosa y colagenasa de Clostridium collagenovorans.

El documento WO 2007/089851 describe composiciones de medios y procesos utiles para la fermentacion de C. histolyticum. Los constituyentes proteicos de los medios inclrnan peptona fitona, extracto de levadura, peptona proteosa, triptona y diversos extractos vegetales. Se descubrio que una peptona proteosa derivada de porcino estimulaba el crecimiento de las cepas de C. histolyticum que en estas condiciones secretaba enzimas colagenasa en el caldo de cultivo. El medio de cultivo con peptona proteosa se optimizo para reducir el contenido de la proteasa clostripama co-secretada.

Sin relacion con los medios de cultivo microbiologico, Kunz W. et al. Curr. Opin. Colloid and Interface Science 9 (2004) 19-37 describen "isinglass", una gelatina preparada a partir de las camaras de aire de peces, y el comportamiento (incluyendo la gelificacion y precipitacion) de isinglass en presencia de diferentes sales acidas y basicas.

El cultivo de C. histolyticum ha requerido historicamente el uso de productos derivados de animales tales como infusion de cerebro-corazon (por ejemplo, Jozwiak, J., et al., Enzyme and Microbial Technology 39 (2006) 28-31). Sin embargo, la necesidad de material proteico de origen de mairnfero en el medio da lugar a preocupaciones sobre la posible contaminacion del medio. En particular, la preocupacion de que el medio pueda contaminarse con cualquier agente causante de encefalopatfa espongiforme transmisible (TSE) u otras infecciones y agentes daninos, restringe la utilidad de cualquier factor derivado de dichos cultivos, especialmente en aplicaciones terapeuticos.

Por tanto, el medio de cultivo para C. histolyticum del estado de la tecnica tiene ciertas desventajas. En vista de esto, un objetivo de la invencion es proporcionar composiciones alternativas para los medios para estimular el crecimiento de C. histolyticum. Una prioridad particular de la invencion es la provision de medios de crecimiento libres de ingredientes derivados de marnffero. Ademas, la invencion procura proporcionar medios lfquidos que sean

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utiles para la fermentacion de C. histolyticum. Ademas, un objetivo de la invencion es proporcionar medios que estimulen la secrecion de enzimas con actividad colagenasa en el medio de cultivo, y preferiblemente en cantidades que permitan la purificacion economica de las enzimas desde el sobrenadante de cultivo a gran escala.

Los inventores han descubierto sorprendentemente que la combinacion de gelatina de pescado y peptonas derivadas de fuentes no de mairnfero resuelve el problema tecnico anterior.

Sumario de la invencion

Un primer aspecto de la invencion es un medio lfquido para el cultivo de Clostridium histolyticum, comprendiendo el medio agua, una gelatina de pescado y una peptona vegetal, seleccionandose la fuente de la peptona entre el grupo que consiste en soja, haba, guisante, patata, y una mezcla de los mismos, en el cual la concentracion de agregado de la peptona o peptonas vegetales en el medio es entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 10 % en peso por volumen, y mediante lo cual en el medio la concentracion de gelatina de pescado es entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 10 %, indicando el porcentaje peso por volumen cuando la gelatina de pescado aislada es materia seca y volumen por volumen cuando la gelatina de pescado aislada es materia lfquida. Un aspecto adicional de la invencion es un medio lfquido esterilizado de acuerdo con la invencion. Ademas, un aspecto adicional de la invencion es el uso de un medio de acuerdo con la invencion para cultivar Clostridium histolyticum y secretar a partir del mismo una proteasa con actividad colagenasa. Ademas, un aspecto adicional de la invencion es un metodo para producir un sobrenadante de un cultivo lfquido de Clostridium histolyticum, conteniendo el sobrenadante una o mas proteasas con actividad colagenasa, comprendiendo el metodo las etapas de (a) proporcionar un medio esterilizado de acuerdo con la invencion con un inoculo de bacterias Clostridium histolyticum; (b) hacer crecer y cultivar (= preparar un cultivo, preferiblemente un cultivo discontinuo) las bacterias, en el cual las bacterias secretan la una o mas proteasas con actividad colagenasa en la fase lfquida; (c) separar la materia celulary otra materia particulada de la fase lfquida; produciendo de ese modo el sobrenadante de cultivo con una o mas proteasas con actividad colagenasa. Ademas, un aspecto adicional de la invencion es un metodo para producir una o mas proteasas purificadas con actividad colagenasa de Clostridium histolyticum, que comprende las etapas de (a) proporcionar un medio esterilizado de acuerdo con la invencion con un inoculo de bacterias Clostridium histolyticum; (b) hacer crecer y cultivar las bacterias, en el cual las bacterias secretan la una o mas proteasas con actividad colagenasa en la fase lfquida; (c) separar la materia celular y otra materia particulada de la fase lfquida, obteniendo de este modo un sobrenadante de cultivo; (d) aislar la una o mas proteasas con actividad colagenasa del sobrenadante de cultivo; produciendo de ese modo la una o mas proteasas purificadas con actividad colagenasa de Clostridium histolyticum.

Descripcion detallada de la invencion

Se usan ciertos terminos con significado particular, o se definen por primera vez, en esta descripcion de la presente invencion. Para los propositos de la presente invencion, los terminos usados se definen por sus definiciones aceptadas en la tecnica, cuando existen, excepto cuando esas definiciones entran en conflicto o conflicto parcial con las definiciones expuestas a continuacion. En el caso de un conflicto en definicion, el significado de un termino se define por primera vez por cualquiera de las definiciones expuestas a continuacion.

La presente invencion se refiere a las colagenasas de C. histolyticum (EC 3.4.24.3) de tipo I y tipo II como se ha dado previamente en Bond, M., D., van Wart, H., E., Biochemistry 23 (1984), 3077-3085 y Bond, M., D., van Wart, H., E., Biochemistry 23 (1984), 3085-3091.

El termino "que comprende" se usa en la descripcion de la invencion y en las reivindicaciones para indicar "que incluye, pero no se limita necesariamente a".

Los artfculos "un" y "una" se usan en este documento para referirse a uno o a mas de uno (es decir a al menos uno) del objeto gramatical del artfculo. A modo de ejemplo, "un compuesto" significa un compuesto o mas de un compuesto.

Cuando se designa un intervalo de valores numericos tales como un intervalo de concentracion, el intervalo se indica por la palabra "entre", seguido de un primer valor n1 y un segundo valor n2. Se entiende que el lfmite inferior del intervalo designado es el valor igual a o mayor que el primer valor. Se entiende que el lfmite superior del intervalo designado es el valor igual a o menor que el segundo valor. Por tanto, un intervalo designado de un valor x se da por n1 < x < n2.

Si no se indica de otro modo, se entiende que el termino "aproximadamente" y el caracter "~" en combinacion con un valor numerico n ("aproximadamente n", "~n") indica un valor x en el intervalo dado por el valor numerico ±5 % del valor, es decir n - 0,05 * n < x < n + 0,05 * n. En caso de que el termino "aproximadamente" o el caracter "~" en combinacion con un valor numerico n describa una realizacion preferida de la invencion, el valor de n es el mas preferido, si no se indica de otro modo.

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"Crecimiento" bacteriano es la division de una bacteria en dos celulas hijas identicas durante un proceso llamado fision binaria. Por tanto, sucede la duplicacion local de la poblacion bacteriana. Ambas celulas hijas procedentes de la division no necesariamente sobreviven. Sin embargo, si la cantidad de supervivientes excede la unidad en promedio, la poblacion bacteriana experimenta crecimiento exponencial. La medicion de una curva de crecimiento bacteriano exponencial en cultivo discontinuo puede controlarse usando la practica bien conocida, tal como enumeracion bacteriana (recuento de celulas) por metodos directos e individuales (microscopfa, citometna de flujo), directos y en volumen (biomasa), indirectos e individuales (recuento de colonias), o indirectos y en volumen (cantidad mas probable, turbidez, captacion de nutrientes). El crecimiento bacteriano en cultivo discontinuo puede modelarse con cuatro fases diferentes: fase de retardo (A), fase exponencial o log (B), fase estacionaria (C), y fase de muerte (D).

(A) Durante la "fase de retardo", las bacterias se adaptan ellas mismas a las condiciones de crecimiento. Es el periodo donde las bacterias individuales estan madurando y aun no son capaces de dividirse. (B) La fase "exponencial" (a veces tambien llamada fase "logantmica" o "log") es un periodo caracterizado por la duplicacion celular. La cantidad de bacterias nuevas que aparecen por unidad de tiempo es proporcional a la poblacion presente. Si no se limita el crecimiento, continuara la duplicacion a una velocidad constante de modo que se duplique tanto la cantidad de celulas como la velocidad de aumento de la poblacion con cada periodo consecutivo de tiempo. La velocidad real de crecimiento depende de las condiciones de crecimiento, que afectan a la frecuencia de los eventos de division celular y la probabilidad de que ambas celulas hijas sobrevivan. El crecimiento exponencial no puede continuar indefinidamente, sin embargo, porque el medio pronto se agota de nutrientes y se enriquece con desechos. (C) Durante la "fase estacionaria", la velocidad de crecimiento se ralentiza como resultado del agotamiento de nutrientes y la acumulacion de productos toxicos. Esta fase se alcanza segun las bacterias empiezan a agotar los recursos que estan disponibles para ellas. (D) En la fase de muerte, las bacterias se quedan sin nutrientes y mueren. Las especies que forman esporas experimentan esporulacion en esta fase.

En la realidad, incluso en cultivo discontinuo, las cuatro fases no estan bien definidas. Las celulas no se reproducen en sincroma sin desencadenamiento explfcito y continuo y su crecimiento en fase logantmico a menudo no siempre es una velocidad constante, sino en su lugar una velocidad lentamente decadente, una respuesta estocastica constante a las presiones tanto para reproducirse como para quedar latente frente a las concentraciones decrecientes de nutrientes y las concentraciones crecientes de desechos.

Se entiende que una "peptona" es una mezcla de cualquiera de diversos compuestos solubles en agua que se forman como intermedios durante la hidrolisis de protemas en aminoacidos. Una peptona se obtiene frecuentemente por digestion enzimatica o hidrolisis acida de productos naturales, tales como tejidos animales, leche, plantas o cultivos microbianos. Existe una gran cantidad de peptonas y extractos disponibles que pueden promover y sostener el crecimiento de la mayona de los organismos. Una peptona comprende fragmentos de protemas y la composicion de los fragmentos depende de la composicion de protemas presentes al inicio de la hidrolisis.

Frecuentemente la fuente de protemas para la produccion de una peptona es una forma residual que surge durante la produccion de productos carnicos y lacteos. Sin embargo, esta disponible una diversidad de peptonas de fuentes vegetales. Dependiendo del material fuente y cualquier procesamiento del mismo (tal como purificacion hasta un cierto grado de los componentes proteicos de la fuente) antes del tratamiento hidrolttico, varios compuestos diferentes a los peptidos o aminoacidos pueden ser parte de una peptona.

Las peptonas pueden obtenerse, por ejemplo, de leche o carne animal digerida por una o mas enzimas proteolfticas. Ademas de contener peptidos pequenos, el material secado por pulverizacion resultante puede incluir grasas, metales, sales, vitaminas y muchos otros compuestos biologicos. Otro ejemplo para un medio que contiene peptona es caldo de infusion de cerebro-corazon, tambien mencionado en este documento como "BHI". BHI es un medio de crecimiento altamente nutritivo de uso general que es particularmente util para microorganismos exigentes. Se prepara mediante la recuperacion de nutrientes de corazones y cerebros vacunos hervidos. Los factores solubles se liberan en el caldo durante el procedimiento de ebullicion. El caldo despues puede presentarse en polvo para una facil distribucion.

El termino "gelatina" se refiere a una sustancia solida o semi-solida extrafda de tejido conectivo que contiene colageno de animales multicelulares (metazoos). Las protemas de colageno, en este documento mencionadas colectivamente como "colageno", tienen una funcion estructural en la matriz extracelular. Se sabe que las protemas de colageno existen no solamente en animales superiores tales como mairnferos sino incluso en esponjas marinas muy primitivas.

El colageno es la protema estructural principal encontrada en la piel y los huesos de todos los animales. La molecula de colageno consiste en 3 cadenas polipeptfdicas individuales (cadenas alfa) que se enrollan unas alrededor de las otras en una conformacion de triple helice. Esta triple helice se estabiliza por enlaces de hidrogeno entre las moleculas de colageno, lo que sucede segun envejece el animal. Una molecula de colageno de tres cadenas alfa medina 3000 Angstrom de longitud (0,3 micrometres) y 15 Angstrom de diametro. Cada cadena alfa tiene aproximadamente 1050 aminoacidos conectados juntos. Existen veinte diferentes aminoacidos en cada cadena alfa, y para cada tipo animal de gelatina, estos aminoacidos estan en un patron repetido espedfico. La glicina, que

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representa un tercio del contenido de aminoacidos, esta en secuencia repetida con otros dos aminoacidos. Eso podna representarse como glicina-x-y. No es inusual que x sea prolina e y sea un resto de hidroxiprolina.

La gelatina es una forma hidrolizada de forma irreversible de protemas de colageno y se produce por hidrolisis parcial del colageno extrafdo de pieles, huesos, cartflago, tejidos conectivos, organos, y algunos intestinos. La composicion qmmica de la gelatina es similar a la del colageno. La gelatina se forma cuando los enlaces moleculares naturales entre hebras individuales de colageno se descomponen en una forma que se reordena mas facilmente. Por tanto, la gelatina se funde cuando se calienta y solidifica cuando se enfna de nuevo. Junto con el agua, forma un gel coloide semi-solido. Dependiendo de su concentracion, la gelatina puede formar una solucion de alta viscosidad en agua, que establece un gel con enfriamiento.

Ciertas formas de gelatina se usan como ingredientes en la industria alimentaria. Para este fin, se producen grandes cantidades de gelatina a partir de animales marnfferos tales como vacunos, cerdos y caballos. Sin embargo, se conoce gelatina de fuentes alternativas, por ejemplo gelatina de pescado. Los metodos para la extraccion de gelatina de pescado se han conocido desde hace algun tiempo. En dichos metodos, las pieles de los peces ricas en colageno (particularmente de especies de peces de agua templada) y a un menor grado, las vejigas natatorias, se tratan, para formar y extraer la gelatina. Los peces con aletas y escamas (pescado kosher) representan una fuente mas apetitosa para judfos ortodoxos, musulmanes y muchos vegetarianos.

En medios nutrientes para cultivar microorganismos tales como bacterias y hongos, las peptonas y gelatinas pueden servir como fuente organica, por ejemplo para carbono y/o nitrogeno.

En la industria de biotecnologfa, se producen varias enzimas tecnicas para su uso en procesos farmaceuticos en procesos de fermentacion a gran escala. Un ejemplo correspondiente son enzimas colagenasa de C. histolyticum para la disociacion de tejido organico y el posterior aislamiento de celulas diana del tejido organico disociado. Como el cultivo microbiano que produce las enzimas tecnicas utiliza componentes de los medios de crecimiento, es deseable desarrollar peptonas y extractos libres de agentes patogenicos de mairnfero. Existe una inquietud particular relacionada con la seguridad respecto a los priones y BSE.

Para la presente invencion, los autores de este documento evaluaron peptonas de fuentes no de mamffero como nutrientes en un medio para Clostridium histolyticum. El objetivo de este estudio fue proporcionar un medio lfquido que (i) soporte el crecimiento de las bacterias y (ii) que estimule la secrecion de enzimas con actividad colagenasa en el medio de cultivo. Los medios particularmente preferidos estimulaban una alta actividad volumetrica en el sobrenadante de cultivo. Para este fin, se usaron varios ingredientes derivados de plantas enumerados en la Tabla 1a (vease el Ejemplo 3) en diferentes concentraciones para preparar medios nutrientes basados en peptona enumerados en la Tabla 2. Las peptonas derivadas de plantas se compararon con BHI como peptona de referencia que ya se sabe que soporta el crecimiento de C. histolyticum y la secrecion de enzimas colagenasa. Los experimentos comparativos de cultivo se describe a continuacion en el Ejemplo 5 y los resultados con respecto a la densidad celular (medida como DO) y la actividad colagenasa en el sobrenadante tambien se dan en la Tabla 2.

Los cultivos se hicieron crecer hasta que se alcanzo la fase estacionaria. Los parametros anteriores se controlaron durante la fase de crecimiento (exponencial) de cada cultivo asf como en la fase estacionaria.

Aunque no fue muy sorprendente que un medio nutriente basado en peptona con BHI 3,7 % produjera los mejores resultados con respecto a la actividad volumetrica, un resultado sorprendente fue que los medios nutrientes con VG100 al 5 % (cultivo n.° 82) o SP6 al 2,5 %, VG100 al 2,5 % (cultivo n.° 185a) o SP6 al 1,5 %, VG100 al 1,5 % (cultivo n.° 195) o BP al 5 % (cultivo n.° 145) produjeran resultados muy similares, es decir una actividad volumetrica entre por encima de 400 U/l y aproximadamente 495 U/l. Por tanto, un aspecto de la presente descripcion es una composicion para soportar el crecimiento de C. histolyticum y la secrecion de colagenasa, comprendiendo la composicion agua y un nutriente de peptona de una fuente vegetal seleccionada entre el grupo que consiste en (a) peptona vegetal n.° 1 VG100 de guisante (VG100) a una concentracion del 5 % [p/v], (b) peptona de haba (BP) a una concentracion del 5 % [p/v], (c) la combinacion de VG100 y peptona de soja n.° 110 digeridas con papama (SP6) a una concentracion del 2,5 % [p/v] cada una, y la combinacion de VG100 y SP6 a una concentracion del 1,5 % [p/v] cada una. En una realizacion preferida de la presente descripcion, la composicion es una composicion lfquida. En una realizacion preferida adicional de la presente descripcion, la composicion tiene un pH entre aproximadamente 7,2 y aproximadamente 7,4 e incluso es mas preferido que la composicion no comprenda ingredientes adicionales. Dicha composicion proporciona una primera base para el cultivo economico de C. histolyticum en cultivo discontinuo y la produccion de enzimas con actividad colagenasa en ausencia completa de ingredientes derivados de animales.

Para optimizar la actividad volumetrica de colagenasa en el sobrenadante de cultivo adicionalmente, se ensayaron los medios en experimentos de crecimiento en los cuales se usaron combinaciones de nutrientes basados en peptona y diferentes gelatinas. Las gelatinas se enumeran en la Tabla 1b (vease el Ejemplo 3). Una combinacion de BHI al 3,7 % [p/v] y G1 al 3 % sirvio como referencia.

Muy sorprendentemente, se pudo demostrar que la gelatina de pescado potenciaba la actividad volumetrica de colagenasa en el sobrenadante de cultivo (vease el Ejemplo 6, Tabla 3). Por lo tanto, otro aspecto de la presente

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descripcion es el uso de gelatina de pescado en un medio nutriente para el cultivo de Clostridium histolyticum y la secrecion de enzimas con actividad colagenasa procedentes del mismo. Un aspecto adicional de la presente descripcion es una composicion que comprende agua, una peptona de una fuente no de mairnfero y una gelatina de pescado. En una realizacion preferida de la invencion, la composicion es un medio nutriente lfquido. Se entiende a este respecto que en la composicion de acuerdo con la invencion los compuestos, es decir la peptona o peptonas y la gelatina o gelatinas y cualquier otro ingrediente se disuelven en agua, es decir forman una solucion. Debido a cualquier ingrediente de gelatina, la viscosidad de la solucion puede ser mayor que el agua pura.

La gelatina de pescado diferente de las gelatinas convencionales de fuentes de marnffero con respecto a su contenido de aminoacidos. Aunque todas las gelatinas estan compuestas de los mismos 20 aminoacidos, la gelatina de pescado comprende una cantidad inferior de iminoacidos, prolina e hidroxiprolina, en comparacion con gelatinas de fuentes de mamffero. En una realizacion preferida de la invencion, el contenido de hidroxiprolina de la gelatina de pescado es entre aproximadamente el 78 % y aproximadamente el 56 % en comparacion con gelatina de piel de ternero. En otra realizacion preferida de la invencion, el contenido de prolina de la gelatina de pescado es entre aproximadamente el 93 % y aproximadamente el 74 % en comparacion con gelatina de piel de ternero.

Existen diferentes tipos de gelatina de pescado disponibles en el mercado que pueden usarse en los medios nutrientes de acuerdo con la invencion. En una realizacion muy preferida de la invencion, la gelatina de pescado se selecciona entre el grupo que consiste en (i) gelatina de pescado de alto peso molecular, (ii) gelatina de pescado lfquida, (iii) gelatina de una especie kosher de pescado, y una mezcla de las mismas. El pez debe tener aletas y escamas para ser kosher; el marisco, es decir invertebrados acuaticos tales como moluscos, crustaceos, equinodermos, y otra fauna acuatica que no es pescado no son kosher. Por tanto, en una realizacion preferida de la invencion la gelatina de una especie kosher de pescado es gelatina de una especie de pescado (peces) que tiene aletas y escamas.

En una realizacion muy preferida de la invencion, la concentracion de gelatina de pescado en la composicion de la invencion es entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 10 %, en la que el porcentaje indica peso por volumen cuando la gelatina de pescado aislada es materia seca y volumen por volumen cuando la gelatina de pescado aislada es materia lfquida. En una realizacion incluso mas preferida de la invencion, la concentracion de gelatina de pescado es entre aproximadamente el 3 % y aproximadamente el 8 %.

De acuerdo con la invencion, la peptona en la composicion nutriente es una peptona de una fuente no de mamffero. En una realizacion muy preferida de la invencion, la peptona es un producto vegetal. Incluso mas preferido, la peptona es de una fuente vegetal seleccionada entre el grupo que consiste en soja, haba, guisante, patata, y a mezcla de las mismas. Mucho mas preferido, la peptona se selecciona entre el grupo que consiste en peptona vegetal n.° 1 Oxoid VG100 de guisante (VG100), caldo de fosfato de peptona vegetal Oxoid VG200 de guisante (VG200), TSB CASO-Bouillion de Merck de origen no animal (TSB), peptona de soja n.° 110 de Invitrogen digerida con papama (SP6), peptona de haba Fluka (BP), peptona vegetal E1 de Organotechnie de patata (E1P), y una mezcla de las mismas.

Respecto a la configuracion del medio nutriente y la concentracion de peptona en particular, es una realizacion muy preferida de la invencion que la composicion de acuerdo con la presente descripcion comprenda dos o mas peptonas diferentes, en la cual la concentracion de agregado de las peptonas vegetales en la composicion sea entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 10 % en peso por volumen. Incluso mas preferido, la concentracion de agregado de las peptonas vegetales en la composicion es entre aproximadamente el 3 % y aproximadamente el 5 % en peso por volumen.

En otra realizacion muy preferida de la invencion, esta presente un unico tipo de peptona en la composicion nutriente de la invencion, en la cual la peptona se selecciona entre el grupo que consiste en BP, E1P, peptona de soja E110, VG100, y VG200, y en la cual la concentracion de la peptona en la composicion es aproximadamente del 5 % en peso por volumen. En otra realizacion mas muy preferida de la invencion, esta presente un unico tipo de peptona en la composicion nutriente de la invencion, en la cual la peptona es VG100, y en la cual la concentracion de la peptona en la composicion es de aproximadamente el 2 % en peso por volumen.

En una realizacion preferida de la presente descripcion, el pH de la composicion es entre pH 7 y pH 8. Incluso mas preferido es un pH entre aproximadamente pH 7,2 y aproximadamente pH 7,4.

En una realizacion preferida adicional, la composicion de acuerdo con la presente descripcion se esteriliza, es decir se hace que la composicion este libre de cualquier organismo de auto-replicacion. La esterilizacion puede realizarse con metodos convencionales conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, con tratamiento termico, tal como esterilizacion en autoclave.

La composicion de acuerdo con la presente descripcion es particularmente util para cultivar bacterias Clostridium histolyticum. Una realizacion mas preferida de la presente descripcion es, por lo tanto, una composicion de acuerdo con la presente descripcion que comprende adicionalmente un inoculo de bacterias Clostridium histolyticum. Es

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igualmente preferido a este respecto el uso de una composicion de acuerdo con la presente descripcion para cultivar Clostridium histolyticum y secretar a partir de la misma una proteasa con actividad colagenasa.

Por consiguiente, otro aspecto de la invencion es un metodo para producir una o mas proteasas purificadas con actividad colagenasa de Clostridium histolyticum, que comprende las etapas de (a) proporcionar una composicion esterilizada de acuerdo con la presente descripcion con un inoculo de bacterias Clostridium histolyticum; (b) hacer crecer y cultivar las bacterias, por lo cual las bacterias secretan la una o mas proteasas con actividad colagenasa en la fase lfquida; (c) separar materia celular y otra materia particulada de la fase lfquida, obteniendo de ese modo un sobrenadante de cultivo; (d) purificar la una o mas proteasas con actividad colagenasa del sobrenadante de cultivo; produciendo de ese modo la una o mas proteasas purificadas con actividad colagenasa de Clostridium histolyticum.

Ademas, otro aspecto de la presente descripcion es un sobrenadante de cultivo que comprende una o mas proteasas con actividad colagenasa de Clostridium histolyticum, que se puede obtener mediante el metodo de (a) proporcionar una composicion esterilizada de acuerdo con la presente descripcion con un inoculo de bacterias Clostridium histolyticum (b) hacer crecer y cultivar las bacterias, por lo cual las bacterias secretan la una o mas proteasas con actividad colagenasa en la fase lfquida; (c) separar la materia celular y otra materia particulada de la fase lfquida; obteniendo de ese modo el sobrenadante de cultivo que comprende una o mas proteasas con actividad colagenasa de Clostridium histolyticum. Un sobrenadante de cultivo de acuerdo con la presente descripcion es una mezcla compleja que comprende no solamente colagenasas sino tambien otras protemas secretadas. En una realizacion muy preferida de la presente descripcion el sobrenadante se obtiene de un cultivo lfquido en la fase estacionaria.

El sobrenadante de acuerdo con la presente descripcion puede usarse directamente para la purificacion de uno o mas ingredientes contenidos en el mismo. Como alternativa, el sobrenadante puede almacenarse, por ejemplo en forma congelada. Sin embargo, lo mas preferido es almacenar un liofilizado del sobrenadante. Por tanto, un aspecto adicional de la presente descripcion es un liofilizado del sobrenadante de acuerdo con la presente descripcion.

En aun mas detalle, los siguientes puntos representan realizaciones preferidas de la presente descripcion.

1. Una composicion lfquida que comprende agua, una peptona de una fuente no de mairnfero y una gelatina de pescado.

2. La composicion de acuerdo con el punto 1, caracterizada por que la gelatina de pescado se selecciona entre el grupo que consiste en gelatina de pescado de alto peso molecular, gelatina de una especie kosher de pescado, gelatina de pescado lfquida, y una mezcla de las mismas.

3. La composicion de acuerdo con el punto 2, caracterizada por que la gelatina de pescado se selecciona entre el grupo que consiste en gelatina de pescado de alto peso molecular, gelatina de pescado kosher, y una mezcla de las mismas.

4. La composicion de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 3, caracterizada por que la concentracion de gelatina de pescado en la composicion es entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 10 %, en la cual el porcentaje indica peso por volumen cuando la gelatina de pescado aislada es materia seca y volumen por volumen cuando la gelatina de pescado aislada es materia lfquida.

5. La composicion de acuerdo con el punto 4, caracterizada por que la concentracion de gelatina de pescado es entre aproximadamente el 3 % y aproximadamente el 8 %.

6. La composicion de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 5, caracterizada por que la peptona de fuente no de mamffero no es peptona de pescado.

7. La composicion de acuerdo con el punto 6, caracterizada por que la peptona de fuente no de mamffero es un producto vegetal.

8. La composicion de acuerdo con el punto 7, caracterizada por que la fuente vegetal de la peptona es de una fuente vegetal seleccionada entre el grupo que consiste en soja, haba, guisante, patata, y una mezcla de las mismas.

9. La composicion de acuerdo con el punto 8, caracterizada por que la peptona se selecciona entre el grupo que consiste en peptona vegetal n.° 1 VG100 de guisante (VG100), caldo de fosfato de peptona vegetal VG200 de guisante (VG200), TSB CASO-Bouillion de origen no animal (TSB), peptona de soja n.°110 digerida con papama (SP6), peptona de haba (BP), peptona vegetal E1 de patata (E1P), y una mezcla de las mismas.

10. La composicion de acuerdo con el punto 9, caracterizada por que la composicion comprende dos o mas peptonas diferentes, en la cual la concentracion de agregado de las peptonas vegetales en la composicion es entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 10 % en peso por volumen.

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11. La composicion de acuerdo con el punto 10, caracterizada por que la concentracion de agregado de las peptonas vegetales es entre aproximadamente el 3 % y aproximadamente el 5 % en peso por volumen.

12. La composicion de acuerdo con el punto 9, caracterizada por que la peptona se selecciona entre el grupo que consiste en BP, E1P, peptona de soja E110, VG100, y VG2O0, en la cual la concentracion de la peptona en la composicion es de aproximadamente el 5 % en peso por volumen.

13. La composicion de acuerdo con el punto 9, caracterizada por que la peptona es VG100, en la cual la concentracion de la peptona en la composicion es de aproximadamente el 2 % en peso por volumen.

14. La composicion de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 13, caracterizada por que el pH de la composicion es entre pH 7 y pH 8.

15. Una composicion esterilizada de acuerdo con cualquiera de los puntos 1 a 14.

16. La composicion de acuerdo con el punto 15, que comprende adicionalmente un inoculo de bacterias Clostridium histolyticum.

17. Uso de una composicion de acuerdo con el punto 15 o punto 16 para cultivar Clostridium histolyticum y secretar a partir de la misma una proteasa con actividad colagenasa.

18. Un metodo para producir un sobrenadante de un cultivo lfquido de Clostridium histolyticum, conteniendo el sobrenadante una o mas proteasas con actividad colagenasa, comprendiendo el metodo las etapas de

(a) proporcionar una composicion esterilizada con un inoculo de acuerdo con el punto 16;

(b) hacer crecer y cultivar las bacterias, por lo cual las bacterias secretan la una mas proteasas con actividad colagenasa en la fase lfquida;

(c) separar la materia celular y otra materia particulada de la fase lfquida, obteniendo de ese modo un sobrenadante de cultivo; produciendo de ese modo un sobrenadante de cultivo con una o mas proteasas con actividad colagenasa.

19. Un metodo para producir una o mas proteasas purificadas con actividad colagenasa de Clostridium histolyticum, que comprende las etapas de

(b) hacer crecer y cultivar las bacterias, por lo cual las bacterias secretan la una o mas proteasas con actividad colagenasa en la fase lfquida;

(c) separar la materia celular y otra materia particulada de la fase lfquida, obteniendo de ese modo un sobrenadante de cultivo;

(d) aislar una o mas proteasas con actividad colagenasa del sobrenadante de cultivo; produciendo de ese modo una o mas proteasas purificadas con actividad colagenasa de Clostridium histolyticum.

20. Un sobrenadante de cultivo que comprende una o mas proteasas con actividad colagenasa de Clostridium histolyticum, que se puede obtener por el metodo de

(c) separar la materia celular y otra materia particulada de la fase lfquida; obteniendo de ese modo el sobrenadante de cultivo que comprende una o mas proteasas con actividad colagenasa de Clostridium histolyticum.

Ejemplo 1

Condiciones generales de trabajo

Generalmente, todas las etapas de trabajo que implican bacterias o cultivos bacterianos se realizaron en condiciones esteriles aplicando la practica convencional de laboratorio en microbiologfa. Las cultivos anaerobios se mantuvieron en una atmosfera de nitrogeno en incubadoras a una temperatura of 30 °C. La transferencia del inoculo se realizo en atmosfera ambiente (es decir que contiene oxfgeno) en una campana de flujo laminar. Todos los medios descritos en este documento se esterilizaron en autoclave. Los ajustes del pH, en el intervalo de pH 7,2 - pH 7,4 si no se indica otra cosa, se hicieron antes de la esterilizacion en autoclave. Si no se indica otra cosa, se anadio CaCl21 mM por 1 l de cualquier medio respectivo. Las alfcuotas del medio sometido a esterilizacion en autoclave se comprobaron de forma rutinaria para cambios en el pH.

Ejemplo 2

Cultivo de siembra, banco de siembra y cultivo de partida de bacterias C. histolyticum

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Se uso Clostridium histolyticum cepa BMTU 1175 que es un derivado de ATCC 21000 como inoculo de un volumen de 100 ml de medio lfquido de crecimiento que consiste en un 3,7 % de BHI y un 3,0 % de G1 disueltos en agua con un pH ajustado a pH 7,2. El cultivo se incubo durante aproximadamente 26 h en condiciones anaerobias hasta que se alcanzo una densidad optica a 578 nm (= DO578nm) de 5,6. Se precintaron almuotas de 1 ml de este cultivo lfquido en ampollas, se congelaron y almacenaron en fase gaseosa de nitrogeno Kquido. Las almuotas sirvieron como banco se siembra primario para uso adicional como cultivos de partida.

Los cultivos de partida para experimentos de crecimiento en diferentes medios se prepararon inoculando 100 ml de un medio lfquido que contema un 5 % [p/v] de VG100 con los contenidos de una ampolla de banco de siembra de 1 ml, e incubando las bacterias en condiciones anaerobias a 30 °C durante una noche o a 37 °C durante aproximadamente 8 h. Los medios lfquidos (a una volumen de habitualmente 100 ml o 200 ml) como se describe adicionalmente a continuacion se inocularon cada uno con entre aproximadamente 2 - 4 ml de cultivo de partida.

Ejemplo 3

Cultivo de C. histolyticum en diferentes medios

Se evaluo el crecimiento de C. histolyticum en diferentes medios de crecimiento. Se incubaron los cultivos lfquidos en matraces sin agitacion. Si no se indica de otro modo, las incubaciones de los cultivos duraron 40 h. Durante cada experimento, se extrajeron una o mas muestras en diferentes puntos temporales del cultivo y se ensayaron la DO578nm del cultivo lfquido, el pH del sobrenadante de cultivo y la actividad proteolftica de colagenasa en el sobrenadante de cultivo (vease el Ejemplo 4).

Los medios lfquidos se prepararon usando los ingredientes enumerados en Tablas 1a y 1b. Si no se indica otra cosa, las concentraciones de ingredientes dadas como porcentaje indican % en peso por volumen [p/v], ajustado antes de la esterilizacion en autoclave. Por ejemplo, una concentracion del 3 % [p/v] de un compuesto dado corresponde a 3 g/100 ml de medio. En el caso de G4 que es un ingrediente lfquido, la concentracion dada como porcentaje indica % en volumen por volumen.

Los ajustes del pH, en el intervalo de pH 7,2 - pH 7,4 si no se indica de otro modo, se hicieron antes de la esterilizacion en autoclave. Si no se indica otra cosa, se anadio CaCl21 mM por 1 I de cualquier medio respectivo.

Tabla 1a

Compuestos de peptona disponibles en el mercado ensayados en medios de crecimiento

Abreviatura: Compuesto Fuente Proveedor, denominacion del producto o n° de catalogo

A2SC: Peptona de soja A2 SC Soja Organotechnie, 19649

A3SC: Peptona de soja A3 SC Soja Organotechnie, 19685

A482: Peptona de guisante A482 Pea Organotechnie, AI275

AM41: Peptona de soja AM41 Soja Organotechnie, AI230

BHI: Infusion de cerebro-corazon Bovino BD (Difco), 0037-8

BP: Peptona de haba Haba Fluka, 93491

E1: Peptona de trigo E1 Trigo Organotechnie, 19559

E110: Peptona de soja E110 Soja Organotechnie, AI885

E1P: Peptona vegetal E1 Patata Organotechnie, 19025

E430: Peptona de trigo E430 Trigo Organotechnie, AI233

ET1: Peptona vegetal ET1 Patata Organotechnie, 19725

YE: Extracto de levadura Levadura BD (Difco), 886-08-1

L85: Peptona proteosa Fuente de mairnfero Oxoid, LP0085

SP4: Peptona de soja Soja Biofac Dinamarca, 21

SP5: Peptona de harina de soja (digestion con papama) Soja Merck, 7212

SP6: Peptona de soja n.° 110 (digestion con papama) Soja Invitrogen, 152-90059

SP7: HyPep1510 Soja Kerry, 1510

SP8: HyPep 5603 Soja Kerry, 5603

T: Triptona Bacto Leche (bovino) BD (Difco), 123-08-4

TSB: TSB (CASO-Bouillion, origen no animal) Vegetal Merck, 525

VG100: Peptona vegetal n.° 1 Guisante Oxoid, VG0100

VG101: Caldo de peptona vegetal Guisante Oxoid, VG0101

VG200: Caldo de fosfato de peptona vegetal Guisante Oxoid, VG0200

VG300: Peptona de soja Veggietone Soja Oxoid, VG0300

Tabla 1b

Compuestos de gelatina disponibles en el mercado ensayados en medios de crecimiento

G1: Gelita-Sol D Porcino / bovino DGF Stoess, Gelita-Sol D

G2: Gelatina de pescado en polvo de alto peso molecular Pescado Kenney&Ross, HMWD

G3: Gelatina de pescado kosher en polvo Pescado Kenney&Ross, KD

G4: Gelatina de pescado ftquida Pescado Kenney&Ross, GELATINA LfQUIDA HIPURE (gelatina tecnica)

G2T: Digestion tnptica de G2 Pescado G2 se disolvio en agua; antes de la esterilizacion se anadio tripsina $ a una concentracion final de 70 mg/ml; la mezcla se incubo durante 1 h a 37 °C y despues de esto, se sometio a esterilizacion en autoclave.

G3T: Digestion tnptica de G3 Pescado G3 se disolvio en agua; antes de la esterilizacion se anadio tripsina $ a una concentracion final de 70 mg/ml; la mezcla se incubo durante 1 h a 37 °C y despues de esto se sometio a esterilizacion en autoclave.

$ tripsina producida de forma recombinante en Roche Applied Science (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania).

Ejemplo 4

5 Ensayo para determinar la actividad proteolftica de colagenasa

La actividad proteolftica de colagenasa se midio por un metodo convencional en unidades Wuensch (Wuensch, E., Heidrich, H., Z., Physiol. Chem. 333 (1963) 149-159) usando un sustrato peptidico sintetico. La actividad proteolftica de colagenasa cataliza la hidrolisis del sustrato modificado ("Wuensch") el peptido 4-fenilazo-benciloxicarbonil-Pro- 10 Leu-Gly-Pro-Arg (Bachem M1715) entre el resto Leu y el resto Gly. Una unidad (U) de actividad se define por la hidrolisis de 1 mM de peptido por minuto a 25 °C, pH 7,1.

El peptido de sustrato (tambien mencionado como "sustrato") se proporciono en una solucion y a una concentracion de 1 mg/ml. Primero se disolvieron 10 mg de peptido de sustrato en 0,2 ml de metanol. El volumen de la solucion se 15 aumento hasta 10 ml anadiendo TrisHCl 0,1 M, pH 7,1. Los agentes adicionales fueron una solucion 0,1 M de CaCl2 en agua y una mezcla de extraccion que consistfa en 5 partes en volumen de acetato de etilo y 1 parte en volumen de acido cftrico 0,025 M en agua. Se proporcionaron tubos de secado como tubos de ensayo que conternan 0,35-0,4 g de (NH4)2SO4. Antes de su uso cada tubo de secado se precinto con parafilm.

20 Las reacciones de control y muestra se elaboraron en tubos de ensayo de acuerdo con el siguiente esquema de pipeteo y flujo de trabajo:

Etapa Solucion Tubos de ensayo de control Tubo de ensayo de muestra

1 Peptido de sustrato 1 ml 1 ml

CaCl2 0,2 ml 0,2 ml

Mezclar, calentar hasta 25 °C

2 Materiales de muestra§ - 0,05 ml

TrisHCl 0,1 M, pH 7,1 0,05 ml -

Mezclar, incubar durante 15 min. a 25 °C; despues de incubacion se transfiere una aftcuota de la solucion incubada a una volumen de la mezcla de extraccion

3 Solucion de incubacion de la

etapa 2 0,5 ml 0,5 ml

Mezcla de extraccion 6 ml 6 ml

Mezclar inmediatamente por agitacion con vortice durante 20 s, transferir aproximadamente 3 ml de fase de acetato de etilo en un tubo de secado, mezclar por agitacion con vortice y transferir el sobrenadante a una cubeta; medir la extincion (A) a 320 nm, pato de luz de la cubeta = 1 cm.

4 Calcular la actividad volumetrica [U/ml] = A A * d * 0,794 A: Valor de extincion medido

d: factor de dilucion

AA = Amuestra - Acontrol

Etapa Solucion________________________Tubos de ensayo de control______Tubo de ensayo de muestra

§ una solucion que comprende una o mas enzimas con actividad proteolftica de colagenasa. Si fuera necesario, el material de muestra usado en el ensayo se preparaba diluyendo la solucion. Para cada medicion, el factor de dilucion respectivo (d) se ajusto y eligio para producir finalmente un valor de extincion entre 0,3 y 1,0. Sin embargo, el sobrenadante de cultivo habitualmente no diluido se elimino de las celulas bacterianas y se ensayaron los residuos. Adicionalmente, se ensayaron patrones con cantidades conocidas de actividad colagenasa y conocida como referencias.

En mezclas que conteman enzimas colagenasa tanto de tipo I como de tipo II, la actividad medida de colagenasa II es habitualmente mayor que la actividad de colagenasa I, cuando se realizan ensayos de actividad usando el peptido Wuensch como sustrato. Por tanto, en las condiciones aplicadas, cualquier actividad proteolftica medida 5 refleja principalmente la colagenasa tipo II.

Ejemplo 5

Crecimiento de C. histolyticum en diferentes medios: medios basados en peptona sin adicion de gelatina

10

La Tabla 2 proporciona varios medios para el cultivo de C. histolyticum. Cada entrada en la tabla muestra los ingredientes del medio respectivo. En algunos casos el pH se ajusto antes de la esterilizacion del medio y la inoculacion. En caso de no existir valor de pH en la tabla, el medio se inoculo despues del ajuste del pH con KOH hasta un valor entre pH 7,2 y pH 7,4, si no se indica otra cosa. Los cultivos se hicieron crecer en la fase estacionaria 15 correspondiente a una incubacion durante aproximadamente 40 h en condiciones convencionales. La densidad optica a 578 nm (tambien mencionada como "DO") se determino cuando el cultivo estaba terminado, sf como la actividad enzimatica de colagenasa en el sobrenadante de cultivo (vease el Ejemplo 4). En la tabla se da la actividad volumetrica en unidades Wuensch por litro de medio (tambien mencionadas como "U/I" en los datos tabulados).

20 Tabla 2

Composicion y pH de los medios ftquidos antes de la inoculacion, rendimiento de crecimiento de C. histolyticum y actividad colagenasa en el sobrenadante de cultivo; los medios se clasifican de acuerdo con la actividad volumetrica de colagenasa

Clasificacion: n° de cultivo Composicion (peptonas) pH (a 0 h) DO (~40 h) Actividad colagenasa en [U/l]

1: 98 3,7 % BHI 1,7 494

2: 9 3,7 % BHI 7,4 1,2 493

3: 17 3,7 % BHI 7,4 1,3 460

4: 82 5 % VG100 1,9 451

5: 185a 2.5 % SP6 2.5 % VG100 1,6 446

6: 195 1.5 % SP6 1.5 % VG100 0,6 443

7: 145 5 % BP 1,7 428

8: 175 2.5 % SP6 (Lote "B") 2.5 % VG100 7,4 1,6 409

9: 185b 2.5 % SP6 2.5 % VG100 1,9 403

10: 94 2.5 % VG100 2.5 % TSB 1,7 401

11: 171 1.25 % SP6 (Lote "B") 1.25 % VG100 1.25 % TSB 1.25 % BP 7,4 1,5 374

12: 90 5 % VG100 5 % TSB 3,5 341

13: 184 6 % VG100 7,5 2,0 323

14: 78 5 % SP6 1,9 308

15: 177 2.5 % SP6 (Lote "B") 512.5 % TSB 7,3 1,4 307

16: 173 2.5 % TSB 2.5 % BP 7,4 1,5 301

17: 135 5 % E1P 7,4 2,3 294

18: 167 5 % SP6 (Lote "B") 7,3 1,5 290

19: 159 2.5 % VG100 2.5 % BP 1,7 289

20: 72 5 % TSB 7,3 1,1 281

21: 28 5 % SP6 7,3 2,3 279

Composicion y pH de los medios Uquidos antes de la inoculacion, rendimiento de crecimiento de C. histolyticum y actividad colagenasa en el sobrenadante de cultivo; los medios se clasifican de acuerdo con la actividad volumetrica de colagenasa

22: 165 5 % SP6 (Lote "A") 7,4 1,5 275

24: 153 1.7 % BP 1.7 % TSB 1.7 % VG100 2,0 268

25: 169 5 % SP6 (Lote "C") 7,3 1,6 260

26: 183 4 % VG100 7,5 1,3 258

27: 179 2.5 % SP6 (Lote "B") 2.5 % BP 7,4 1,6 248

28: 25 4 % SP6 7,3 1,7 218

29: 71 5 % SP6 3 % T 7,3 3,1 218

30: 181 2 % VG100 7,5 0,4 197

31: 143 2.5 % VG200 2.5 % BP 7,4 1,5 186

32: 74 5 % VG100 7,3 2,0 177

33: 161 2.5 % VG101 2.5 % BP 2,1 177

34: 133 5 % E110 7,3 1,6 166

35: 21 3 % SP6 7,3 1,0 160

36: 125 5 % A482 7,3 2,6 160

37: 149 5 % BP 2,0 159

38: 155 1 % BP 1 % TSB 1 % VG100 1,0 159

39: 69 5 % SP6 3 % YE 7,3 3,2 142

40: 139 5 % ET1 7,3 13,0 137

41: 70 5 % SP6 1 % T 7,3 2,0 134

42: 15 2 % SP7 7,3 0,3 131

43: 14 2 % SP6 7,3 0,6 130

44: 68 5 % SP6 1 % YE 7,3 2,2 120

45: 157 2.5 % VG200 2.5 % TSB 1,7 119

46: 66 5 % SP6 7,3 1,7 110

47: 106 5 % VG300 1,6 107

48: 19 3 % SP4 7,3 0,8 105

49: 26 5 % SP4 7,3 1,5 104

50: 163 2.5 % VG101 2.5 % TSB 2,2 94

51: 13 2 % SP5 7,3 0,3 92

52: 29 5 % SP7 7,3 1,9 92

53: 65 5 % SP6 7,3 1,8 87

54: 129 5 % AM41 7,4 1,6 79

55: 121 5 % VG200 1,8 64

56: 137 5 % A2SC 7,4 1,5 62

57: 110 5 % BP 1,4 60

58: 141 5 % A3SC 7,3 1,5 60

59: 102 5 % VG101 1,9 46

60: 86 5 % TSB 1,0 28

61: 127 5 % E430 7,4 1,4 16

62: 131 5 % E1 7,4 1,2 9

Se aprecio que entre los medios que conteman peptonas solamente (es decir, sin ninguna gelatina anadida) BHI fue la mas eficaz en la estimulacion de la secrecion de colagenasa de C. histolyticum en el sobrenadante de cultivo. Tambien se descubrio que la actividad volumetrica de colagenasa no era simplemente una funcion de la DO del cultivo.

10

15

Ejemplo 6

Crecimiento de C. histolyticum en diferentes medios: medios basados en peptona con gelatina

Se anadieron diferentes tipos de gelatina de diferentes fuentes a los medios de peptona. La Tabla 3 proporciona varios medios para el cultivo de C. histolyticum. Cada entrada en la tabla muestra los ingredientes del respectivo medio. En algunos casos el pH se ajusto antes de la esterilizacion del medio y la inoculacion. En caso de no existir valor de pH en la tabla, el medio se inoculo despues del ajuste del pH con KOH hasta un valor entre pH 7,2 y pH 7,4, si no se indica otra cosa. Los cultivos se hicieron crecer en la fase estacionaria correspondiente a una incubacion durante aproximadamente 40 h en condiciones convencionales. La densidad optica a 578 nm (tambien mencionada como "DO") se determino cuando el cultivo estaba terminado, sf como la actividad enzimatica de colagenasa en el sobrenadante de cultivo (vease el Ejemplo 4). En la tabla se da la actividad volumetrica en unidades Wuensch por litro de medio (tambien mencionadas como "U/I" en los datos tabulados).

Tabla 3

Composicion y pH de los medios lfquidos antes de la inoculacion, rendimiento de crecimiento de C. histolyticum y actividad colagenasa en el sobrenadante de cultivo; los medios se clasifican de acuerdo con la actividad volumetrica de colagenasa

Clasificacion: n° de cultivo Composicion (peptonas) Composicion (gelatinas) pH (a 0 h) DO (~40 h) Actividad colagenasa en [U/l]

1: 199 1.5 % SP6 1.5 % VG100 5 % G2 5,5 1405

2: 198 1,5 % SP6 4 % G2 5,0 1064


: 1,5 % VG100

3: 190 2.5 % SP6 2.5 % VG100 10 % G2 9,8 980

4: 218 1 % VG100 1 % SP6 1 % TSB 1 % BP 1 % E1P 6 % G3 9,6 965

5: 113 5 % BP 3 % G3 5,7 944

6: 197 1.5 % SP6 1.5 % VG100 3 % G2 2,8 944

7: 220 0,6 % VG100 0,6 % SP6 0,6 % TSB 0,6 % BP 0,6 % E1P 6 % G3 8,1 933

8: 207 1 % VG100 1 % SP6 1 % TSB 6 % G3 8,8 928

9: 203 1.5 % SP6 1.5 % VG100 5 % G3 6,0 920

10: 204 1.5 % SP6 1.5 % VG100 10 % G3 11,5 913

11: 221 0,4 % VG100 0,4 % SP6 0,4 % TSB 0,4 % BP 0,4 % E1P 4 % G3 4,6 905

12: 215 1 % VG100 1 % SP6 1 % E1P 6 % G3 8,0 886

13: 212 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 8 % G3 14,0 885

14: 217 1 % VG100 1 % SP6 1 % TSB 1 % BP 1 % E1P 4 % G3 6,5 885

15: 151 5 % BP 3 % G2 § 5,6 870

16: 208 1 % VG100 1 % SP6 8 % G3 11,9 863


: 1 % TSB

Composicion y pH de los medios Kquidos antes de la inoculacion, rendimiento de crecimiento de C. histolyticum y actividad colagenasa en el sobrenadante de cultivo; los medios se clasifican de acuerdo con la actividad volumetrica de colagenasa

17: 147 5 % BP 3 % G2 $ 5,5 861

18: 174 2.5 % TSB 2.5 % BP 3 % G2 7,4 4,6 861

19: 112 5 % BP 3 % G2 5,0 857

20: 216 1 % VG100 1 % SP6 1 % E1P 8 % G3 12,0 856

21: 189 2.5 % SP6 2.5 % VG100 5 % G2 7,0 856

22: 222 0,4 % VG100 0,4 % SP6 0,4 % TSB 0,4 % BP 0,4 % E1P 6 % G3 7,3 834

23: 214 1 % VG100 1 % SP6 1 % E1P 4 % G3 6,0 830

24: 228 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 6 % G3 8,7 809

25: 211 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 6 % G3 8,7 806

26: 196 1.5 % SP6 1.5 % VG100 2 % G2 2,2 804

27: 148 5 % BP 3 % G3 $ 5,5 798

28: 219 0,6 % VG100 0,6 % SP6 0,6 % TSB 0,6 % BP 0,6 % E1P 4 % G3 5,2 792

29: 231 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 8 % G3 13,2 790

30: 233 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 8 % G3 13,4 785

31: 223 1 % TSB 1 % BP 1 % E1P 4 % G3 5,2 756

32: 229 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 6 % G3 8,9 740

33: 202 1.5 % SP6 1.5 % VG100 4 % G3 5,9 726

34: 224 1 % TSB 1 % BP 1 % E1P 6 % G3 6,7 719

35: 188 2.5 % SP6 2.5 % VG100 4 % G2 6,8 699

36: 136 5 % E1P 3 % G2 7,4 6,1 697

37: 230 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 6 % G3 9,0 693

38: 152 5 % BP 3 % G3 § 6,4 693

39: 232 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 8 % G3 14,0 692

40: 96 2.5 % VG100 2.5 % TSB 3 % G2 4,6 690

41: 182 2 % VG100 3 % G2 7,4 3,0 687

42: 194 2.5 % SP6 2.5 % VG100 5 % G3 8,4 685

43: 201 1.5 % SP6 1.5 % VG100 3 % G3 3,6 682

44: 210 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 4 % G3 6,6 662

45: 154 1.7 % BP 1.7 % TSB 1.7 % VG100 3 % G3 5,7 662

46: 225 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 4 % G3 6,5 643

47: 193 2.5 % SP6 2.5 % VG100 4 % G3 6,8 637

48: 92 5 % VG100 5 % TSB 3 % G2 6,4 635

49: 226 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 4 % G3 5,9 627

50: 213 1 % VG100 1 % SP6 1 % E1P 2 % G3 2,7 618

51: 123 5 % VG200 3 % G2 6,2 611

52: 186 2.5 % SP6 2.5 % VG100 2 % G2 3,8 608

53: 227 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 4 % G3 6,4 604

54: 323 1,5 % VG100 0,75 % SP6 0,75 % TSB 7,5 % G4 7,7 600

55: 93 5 % VG100 5 % TSB 3 % G3 6,9 600

56: 187 2.5 % SP6 2.5 % VG100 3 % G2 5,2 598

57: 321 1,5 % VG100 0,75 % SP6 0,75 % TSB 7,5 % G4 7,7 589

58: 317 1,5 % VG100 0,75 % SP6 0,75 % TSB 5,5 %G4 7,7 589

59: 205 1 % VG100 1 % SP6 1 % TSB 2 % G3 3,3 579

60: 322 1,5 % VG100 0,75 % SP6 0,75 % TSB 7,5 % G4 7,7 578

61: 318 1,5 % VG100 0,75 % SP6 0,75 % TSB 5,5 % G4 7,7 2,6 577

62: 319 1,5 % VG100 0,75 % SP6 0,75 % TSB 5,5 % G4 7,7 571

63: 100 3,7 % BHI 3 % G2 5,8 563

64: 77 3,7 % BHI 3 % G1 7,3 3,0 562

65: 209 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 2 % G3 3,3 559

66: 320 1,5 % VG100 0,75 % SP6 5,5 % G4 7,7 555


: 0,75 % TSB

67: 313 1,5 % VG100 0,75 % SP6 0,75 % TSB 4 % G4 7,7 549

69: 144 2.5 % VG200 2.5 % BP 3 % G2 7,4 5,7 549

70: 324 1,5 % VG100 0,75 % SP6 0,75 % TSB 7,5 % G4 7,7 3 540

71: 97 2.5 % VG100 2.5 % TSB 3 % G3 5,0 538

72: 314 1,5 % VG100 0,75 % SP6 0,75 % TSB 4 % G4 7,7 536

73: 242 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 8 % G3T 13,7 535

74: 156 1 % BP 1 % TSB 1 % VG100 3 % G3 4,2 527

75: 160 2.5 % VG100 2.5 % BP 3 % G3 5,0 516

76: 80 5 % SP6 3 % G2 4,3 516

77: 84 5 % VG100 3 % G2 4,5 515

78: 191 2.5 % SP6 2.5 % VG100 2 % G3 3,9 512

79
79: 5 % SP6 3 % G1 4,5 511

80: 240 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 8 % G3T 13,4 509

81: 238 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 6 % G3T 8,6 504

82: 235 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 4 % G3T 6,2 501

83: 315 1,5 % VG100 0,75 % SP6 0,75 % TSB 4 % G4 7,7 1,8 500

84: 101 3,7 % BHI 3 % G3 6,6 498

85: 192 2,5 % SP6 3 % G3 5,9 487


: 2,5 % VG100

86: 316 1,5 % VG100 0,75 % SP6 0,75 % TSB 4 % G4 7,7 476

87: 134 5 % E110 3 % G2 7,3 5,8 467

88: 241 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 8 % G3T 13,2 459

89: 239 1 % VG100 1 % SP6 1 % BP 6 % G3T 8,8 459

90: 99 3,7 % BHI 3 % G1 5,6 456

91: 124 5 % VG200 3 % G3 6,1 454

Composicion y pH de los medios lfquidos antes de la inoculacion, rendimiento de crecimiento de C. histolyticum y actividad colagenasa en el sobrenadante de cultivo; los medios se clasifican de acuerdo con la actividad

volumetrica de colagenasa

92: 126 5 % A482 3 % G2 7,4 6,0 451

§ pH ajustado con NH4OH § pH ajustado con KOH

Se aprecio que respecto a la actividad volumetrica de colagenasa, las composiciones con ciertas peptonas vegetales en combinacion con gelatina de pescado eran al menos iguales y en gran medida superiores al medio convencional que contiene un 3,7 % de BHI y un 3 % de G1 que son ambos de fuentes de mairnfero. Por tanto, se proporciona 5 una multitud de medios nuevos para hacer crecer y cultivar C. histolyticum y producir una o mas proteasas colagenasa a partir de los sobrenadantes de dichos cultivos.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

REIVINDICACIONES

1. Un medio Ifquido para el cultivo de Clostridium histolyticum, comprendiendo el medio agua, una gelatina de pescado y una peptona vegetal, seleccionandose la fuente de la peptona del grupo que consiste en soja, haba, guisante, patata, y una mezcla de los mismos, en el cual la concentracion de agregado de la peptona o peptonas vegetales en el medio es entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 10 % en peso por volumen, y por lo cual en el medio la concentracion de gelatina de pescado es entre aproximadamente el 2 % y aproximadamente el 10 %, indicando el porcentaje peso por volumen cuando al gelatina de pescado aislada es materia seca y volumen por volumen cuando la gelatina de pescado aislada es materia lfquida.
2. El medio de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que la gelatina de pescado se selecciona entre el grupo que consiste en gelatina de pescado de alto peso molecular, gelatina de una especie kosher de pescado, gelatina de pescado lfquida, y una mezcla de las mismas.
3. El medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que la concentracion de gelatina de pescado en el medio es entre aproximadamente el 3 % y aproximadamente el 8 %.
4. El medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que la peptona se selecciona entre el grupo que consiste en peptona vegetal n.° 1 Oxoid VG100 de guisante (= VG100), caldo de fosfato de peptona vegetal VG200 Oxoid de guisante (= VG200), TSB CASO-Bouillion de origen no animal de Merck (= TSB), peptona de soja n.°110 de Invitrogen digerida con papama (= SP6), peptona de haba Fluka (= BP), peptona vegetal E1 Organotechnie de patata (E1P), y una mezcla de las mismas.
5. El medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la peptona se selecciona entre el grupo que consiste en BP, E1P, peptona de soja E110, VG100, y VG200, por lo cual la concentracion de la peptona en el medio es aproximadamente el 5 % en peso por volumen.
6. El medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la peptona es VG100, por lo cual la concentracion de la peptona en el medio es aproximadamente el 2 % en peso por volumen.
7. El medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que el pH del medio es entre pH 7 y pH 8.
8. Un medio esterilizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. El medio de acuerdo con la reivindicacion 8, que comprende adicionalmente un inoculo de bacterias Clostridium histolyticum.
10. Uso de un medio de acuerdo con la reivindicacion 8 o reivindicacion 9 para hacer crecer y cultivar Clostridium histolyticum y secretar desde la misma una proteasa con actividad colagenasa.
11. Un metodo para producir un sobrenadante de un cultivo lfquido de Clostridium histolyticum, conteniendo el sobrenadante una o mas proteasas con actividad colagenasa, comprendiendo el metodo las etapas de

(a) proporcionar un medio esterilizado con un inoculo de bacterias Clostridium histolyticum de acuerdo con la reivindicacion 9;

(b) hacer crecer y cultivar las bacterias, por lo cual las bacterias secretan la una o mas proteasas con actividad colagenasa en la fase lfquida;

(c) separar la materia celular y otra materia particulada de la fase lfquida;

produciendo de ese modo el sobrenadante de cultivo con una o mas proteasas con actividad colagenasa.
12. Un metodo para producir una o mas proteasas purificadas con actividad colagenasa de Clostridium histolyticum, que comprende las etapas de

(a) proporcionar un medio esterilizado con un inoculo de bacterias Clostridium histolyticum de acuerdo con la reivindicacion 9;

(b) hacer crecer y cultivar las bacterias, por lo cual las bacterias secretan la una o mas proteasas con actividad colagenasa en la fase lfquida;

(c) separar la materia celular y otra materia particulada de la fase lfquida, obteniendo de ese modo un sobrenadante de cultivo;

(d) aislar la una o mas proteasas con actividad colagenasa del sobrenadante de cultivo;

produciendo de ese modo la una o mas proteasas purificadas con actividad colagenasa de Clostridium histolyticum.