CN101603020B - 无哺乳动物源成分的溶组织梭菌生长培养基 - Google Patents

无哺乳动物源成分的溶组织梭菌生长培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及无哺乳动物源成分的溶组织梭菌生长培养基。本发明提供了溶组织梭菌培养的改进的培养基以及用于胶原酶生物技术生产的培养物上清液。根据本发明的营养培养基包含一种或多种来自非哺乳动物源的蛋白胨，优选植物衍生的蛋白胨。该培养基可以另外包含鱼明胶。本发明提供了培养基、含有溶组织梭菌胶原酶的培养物上清液、以及产生所述胶原酶的方法。

Description

无哺乳动物源成分的溶组织梭菌生长培养基
技术领域
本发明在微生物学领域内。具体而言，本发明涉及溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)培养基最优化。
背景技术
梭菌属(Clostridium)包括杆状革兰氏阳性细菌，所述细菌为能够产生内生孢子的专性厌氧菌。梭菌属包括普通的自由生活的细菌和重要的病原体，其包括肉毒梭菌(C.botulinum)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、破伤风梭菌(C.tetani)和溶组织梭菌。已知后者产生胶原酶，所述胶原酶是外毒素，并且例如通过促进气性坏疽传播而起到毒力因子的作用。胶原酶通常靶向肌细胞和其他身体器官的结缔组织。由于对结缔组织的强力水解活性，将胶原酶和其他蛋白酶例如嗜热菌蛋白酶用于体外的组织解离。
可以从土壤分离溶组织梭菌。然而，在伤口中罕见细菌。溶组织梭菌不是严格厌氧的，并且可以在需氧温育的培养基中微弱生长。在培养中，蛋白质和肽是溶组织梭菌的主要碳源，所述溶组织梭菌分泌多种能够水解肽键的酶。
关于技术应用，来自溶组织梭菌的胶原酶即I型和II型胶原酶对于例如器官组织的体外解离特别重要。重要的是，胰组织的胶原酶消化目前用于人胰岛细胞的制备和分离。然而，许多其他不同的特定细胞类型也被从伴随的结缔组织分离，包括来自脂肪组织的脂肪细胞、来自肝的肝细胞、来自软骨的软骨细胞、来自心脏的肌细胞，以及来自骨的成骨细胞。
一个实用的优点是，可以在简单的液体培养基中大量培养溶组织梭菌，且其有规律地产生分泌到培养基中的大量蛋白水解酶。
RO51768公开了用于培养溶组织梭菌以产生胶原酶的培养基，其中培养基含有蛋白胨和石蜡油。
RU2180002公开了用于发酵和纯化溶组织梭菌胶原酶的培养基，所述培养基含有酪蛋白和大豆油饼水解产物。其他成分是磷酸二氢钠一水合物、磷酸氢钾二水合物、吡哆醇、核黄素、溴化硫胺素、叶酸、泛酸钙、烟酸、硫辛酸和生物素。
WO2003/025136公开了基于明胶的发酵培养基，用于从噬胶梭菌(Clostridium collagenovorans)产生纤维素和胶原酶。
WO2007/089851公开了用于溶组织梭菌发酵的培养基组合物和方法。该培养基的蛋白质成分包括植胨蛋白胨、酵母提取物、
Figure G2009101492290D00021
蛋白胨、胰蛋白胨和各种植物提取物。发现猪衍生的
Figure G2009101492290D00022
蛋白胨支持溶组织梭菌株的生长，所述溶组织梭菌株在这些条件下将胶原酶分泌到培养液中。为了减少共分泌的梭菌蛋白酶的含量，具有蛋白胨的培养基被最优化。
溶组织梭菌培养从历史上要求使用动物衍生的产物，例如脑心浸液(例如Jozwiak，J.等人，Enzyme and Microbial Technology 39(2006)28-31)。然而，对培养基中哺乳动物来源蛋白质材料的要求引起了对培养基可能污染的担忧。具体而言，对于培养基可能被任何传染性海绵状脑病(TSE)病原体或其他传染性和有害试剂所污染的担忧，限制了来源于这类培养物的任何因子的有用性，尤其是在治疗应用中的有用性。
因此，现有技术的溶组织梭菌培养基具有某些缺点。考虑到这一点，本发明的目的是提供培养基的备选组合物以支持溶组织梭菌的生长。本发明的特别焦点是提供不含哺乳动物衍生的成分的生长培养基。另外，本发明以提供可用于溶组织梭菌发酵的液体培养基为目标。此外，本发明目的是提供一种培养基，该培养基支持具有胶原酶活性的酶向培养基中的分泌、并且优选以允许从培养物上清液大规模经济地纯化该酶的量分泌。
发明人已惊讶地发现，鱼明胶和衍生自非哺乳动物源的蛋白胨的组合解决了上述技术问题。
发明内容
本发明的第一个方面是支持溶组织梭菌生长以及胶原酶分泌的液体组合物，该组合物含有水、非哺乳动物源蛋白胨以及鱼明胶。本发明的另一方面是根据本发明的灭菌的液体组合物。本发明的另一方面是根据本发明的组合物在培养溶组织梭菌并由此分泌具有胶原酶活性的蛋白酶中的用途。本发明的另一方面是产生溶组织梭菌液体培养物上清液的方法，该上清液含有一个或多个具有胶原酶活性的蛋白酶，该方法包括步骤(a)提供具有溶组织梭菌细菌接种物的根据本发明的灭菌的组合物；(b)生长并培养细菌(＝制备细菌培养物，优选分批培养)，从而细菌将一个或多个具有胶原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；(c)从液相分离细胞和其他特定物质；从而产生含有一个或多个具有胶原酶活性的蛋白酶的培养物上清液。本发明的另一方面是含有一个或多个来自溶组织梭菌的具有胶原酶活性的蛋白酶的培养物上清液，所述培养物上清液可以通过下述方法获得：(a)提供具有溶组织梭菌细菌接种物的根据本发明的灭菌的组合物；(b)生长并培养细菌，从而细菌将一个或多个具有胶原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；(c)从液相分离细胞和其他特定物质；从而获得含有一个或多个来自溶组织梭菌的具有胶原酶活性的蛋白酶的培养物上清液。本发明的另一方面是从溶组织梭菌产生一个或多个具有胶原酶活性的纯化的蛋白酶的方法，包括步骤(a)提供具有溶组织梭菌细菌接种物的根据本发明的灭菌的组合物；(b)生长并培养细菌，从而细菌将一个或多个具有胶原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；(c)从液相分离细胞和其他特定物质，从而获得培养物上清液；(d)从培养物上清液分离一个或多个具有胶原酶活性的蛋白酶；由此从溶组织梭菌产生一个或多个具有胶原酶活性的蛋白酶。
具体实施方式
在本发明描述中，某些术语以特定含义使用，或者初次定义。出于本发明目的，当术语的被本领域所接受的定义存在时，以其被本领域的接受的定义来定义使用的术语，除了当那些定义与下述定义冲突或部分冲突时之外。在定义冲突的情况下，术语的含义首先由下述任何定义所定义。
本发明涉及以前Bond，M.，D.，van Wart，H.，E.，Biochemistry 23(1984)，3077-3085和Bond，M.，D.，van Wart，H.，E.，Biochemistry 23(1984)，3085-3091中给出的I型和II型溶组织梭菌胶原酶(EC 3.4.24.3)。
本发明描述和权利要求中使用的术语“包括”表示“包括但不必要限于”的意义。
冠词“一个(a)”和“一种(an)”在此用于指该冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。例如，“一个化合物”指一个化合物或多于一个化合物。
当指定数值范围例如浓度范围时，以尾随第一个值n1和第二个值n2的词语“之间”表示该范围。将指定范围的下限理解为等于或高于第一个值的值。将指定范围的上限理解为等于或低于第二个值的值。因此，将指定的范围值x给定为n1≤x≤n2。
如果没有另外声明，应当理解术语“约”和字符“～”与数值n组合(“约n”、“～n”)指值x在该值数值±5％所给定的区间内，即n-0.05*n≤x≤n+0.05*n。如果没有另外指出，倘若术语“约”或字符“～”与数值n组合描述本发明的优选实施方案，那么值n是最优选的。
细菌“生长”是一个细菌在称为二分分裂的过程期间分裂为两个相同的子细胞。因此，出现细菌群体的局部加倍。分裂而来的两个子细胞都不必要存活。然而，如果存活数目平均超过一，那么细菌群体进行指数生长。可以使用广为人知的实践监控分批培养中指数细菌生长曲线的测量，所述实践例如通过直接和个别(显微镜、流式细胞术)、直接和大批(生物量)、间接和个别(菌落计数)、或间接和大批(最大可能数、混浊度、营养物摄取)方法的细菌枚举(细胞计数)。可以将分批培养的细菌生长构造成具有四个不同期的模型：滞后期(A)、指数或对数期(B)、稳定期(C)和死亡期(D)。
(A)在“滞后期”过程中，细菌自我适应生长条件。这是个别细菌成熟但尚不能分裂的时间段。(B)“指数期”(有时也称为“对数期”)是以细胞加倍为特征的时间段。每个单位时间出现的新细菌数与现有群体成比例。如果生长不受限制，加倍将在恒定速率继续，因此细胞数和群体增加速率随每个连续时间段加倍。实际生长速率取决于生长条件，所述生长条件影响细胞分裂事件的频率和两个子细胞存活的可能性。然而，指数生长不能无限地继续，因为培养基很快耗尽营养物，并且富集了废物。(C)在“稳定期”过程中，作为营养物耗尽及毒性产物积累的结果，生长速率减缓。当细菌开始耗尽其可获得的资源时，达到该期。(D)在死亡期，细菌用完营养物并且死亡。孢子形成物种在该期中经历孢子形成。
实际上，即使在分批培养中，这四个期也没有很好定义。细胞不在没有明确且连续刺激下同步繁殖，而其对数期生长通常不会总是恒定速率，而是缓慢衰减的速率，这是面对营养物浓度降低及废物浓度增加时对针对繁殖和休眠的压力的持续随机反应。
将“蛋白胨”理解为各种水溶性化合物的任一种的混合物，所述水溶性化合物作为蛋白质水解为氨基酸期间的中间物形成。经常通过酶促消化或酸水解自然产物例如动物组织、乳、植物或微生物培养物而获得蛋白胨。有大量可促进和维持大多数生物生长的可利用的蛋白胨和提取物。蛋白胨包含蛋白质片段，且该片段的组成取决于水解开始时存在的蛋白质组成。
用于蛋白胨生产的蛋白质来源通常是肉类和乳制品生产过程中出现的废物形式。然而，多种蛋白胨可以从植物来源获得。取决于来源材料及其水解处理前的任何加工(例如纯化到一定程度的该来源的蛋白质组分)，除了肽或氨基酸外，许多化合物可以是蛋白胨的部分。
蛋白胨可以例如来自由一个或多个蛋白水解酶消化的动物乳或肉类。除了含有小肽之外，产生的喷雾干燥材料可以包括脂肪、金属、盐、维生素和许多其他生物化合物。含蛋白胨培养基的另一个实例是脑心浸液肉汤(broth)，在此也称为“BHI”。BHI是高营养的多用途生长培养基，其尤其可用于需要复杂营养的微生物。其通过从煮沸的牛心和脑回收营养物而制备。可溶性因子在煮沸程序过程中被释放到肉汤中。然后可以将肉汤变成粉末以易于分发。
术语“明胶”指从含有胶原的多细胞动物(后生动物)结缔组织提取的固体或半固体物质。胶原蛋白质，在此统称为“胶原”，在细胞外基质中具有结构功能。已知胶原蛋白质不仅出现在例如哺乳动物的高等动物中，甚至也出现在非常原始的海洋海绵动物中。
胶原是在所有动物的皮肤和骨中发现的主要结构蛋白质。胶原分子由3个个别的多肽链(α链)组成，所述多肽链相互环绕以三螺旋构象缠绕。所述三螺旋由胶原分子之间的氢键稳定，这随着动物衰老而发生。三个α链的胶原分子测量为长度3000埃(0.3微米)及直径15埃。各α链具有大约1050个连接在一起的氨基酸。各α链中有20个不同的氨基酸，而且对于各种动物类型的明胶，这些氨基酸具有特定的重复模式。代表三分之一氨基酸内容物的甘氨酸位于含有其他两个氨基酸的重复序列中。可以将此表示为甘氨酸-x-y。x为脯氨酸且y为羟脯氨酸并非罕见的。
明胶是胶原蛋白质的不可逆水解形式，并且由从皮肤、骨、软骨、结缔组织、器官和一些肠提取的胶原的部分水解而产生。明胶的化学组成与胶原类似。当在个别胶原链之间的天然分子键断裂为更易重排的形式时，就形成明胶。因此，明胶在加热时熔化，并在再次冷却时固化。它和水一起形成半固体胶体凝胶。取决于其浓度，明胶可以在水中形成高粘度溶液，其在冷却后形成凝胶。
某些形式的明胶被用作食物工业的成分。为了这个目的，从例如牛、猪和马的哺乳动物生产大量明胶。然而，已知来自可选择的来源的明胶，例如鱼明胶。从鱼提取明胶的方法已为人所知一些年了。在这种方法中，处理富含胶原的鱼皮(尤其是暖水鱼物种)以及在较低程度上处理鳔，以形成并提取明胶。对于传统的犹太人、穆斯林和许多素食者，具有鳍和鳞的鱼(清洁可食的鱼(kosher fish))代表更美味的来源。
在生长例如细菌和真菌的微生物的营养培养基中，蛋白胨和明胶可以起到有机源例如碳和/或氮的作用。
在生物技术工业中，以大规模发酵方法生产许多用于药物程序的技术酶。因此一个实例是溶组织梭菌胶原酶，其用于解离器官组织以及继而从解离的器官组织分离靶细胞。因为产生技术酶的微生物培养物从生长培养基摄取组分，所以需要开发无哺乳动物病原试剂的蛋白胨和提取物。关于朊病毒和BSE尤其具有安全相关的顾虑。
关于本发明，该文件作者对来自非哺乳动物源的蛋白胨作为溶组织梭菌培养基中的营养物进行了评价。本研究的目标是提供液体培养基，所述液体培养基(i)支持细菌生长并且(ii)刺激具有胶原酶活性的酶向培养基中的分泌。特别优选的培养基刺激培养物上清液中的高体积活性。为了这个目的，以不同浓度使用表1a中列出的大量植物衍生的成分(见实施例3)以制备列于表2中的基于蛋白胨的营养培养基。将植物衍生的蛋白胨与BHI进行比较，所述BHI作为已知支持溶组织梭菌的生长及胶原酶的分泌的参考蛋白胨。在下文实施例5中描述了比较培养实验，且关于上清液中细胞密度(以OD测量)和胶原酶活性的结果也在表2中给出。
培养该培养物直至到达稳定期。在各培养物的生长(指数)期和稳定期期间监控前述参数。
尽管含有3.7％BHI的基于蛋白胨的营养培养基产生关于体积活性的最佳结果并不是非常令人惊讶的，但令人惊讶的结果是，含有5％VG100(培养号(culture no.)82)或2.5％SP6、2.5％VG100(培养号185a)或1.5％SP6、1.5％VG100(培养号195)或5％BP(培养号145)的营养培养基产生了非常类似的结果，即，超过400U/l至约495U/l之间的体积活性。因此，本发明的一个方面是支持溶组织梭菌生长和胶原酶分泌的组合物，该组合物包含水和来自植物来源的蛋白胨营养物，所述来自植物来源的蛋白胨营养物选自(a)浓度5％[w/v]的来自豌豆的VG100植物蛋白胨No.1(VG100)，(b)浓度5％[w/v]的蚕豆(Broad bean)蛋白胨(BP)，(c)VG100与大豆蛋白胨No110木瓜蛋白酶消化物(SP6)的组合，浓度各2.5％，以及VG100和SP6的组合，浓度各1.5％[w/v]。在本发明的优选实施方案中，该组合物是液体组合物。在本发明的另一个优选实施方案中，该组合物具有约7.2至约7.4之间的pH，而甚至更优选的是该组合物不包含其他成分。这样的组合物为在完全没有动物衍生的成分时经济地以分批培养生长溶组织梭菌并产生具有胶原酶活性的酶提供了首要基础。
为了进一步最优化培养物上清液中的胶原酶体积活性，在生长实验中测试培养基，由此使用基于蛋白胨的营养物与不同明胶的组合。明胶列于表1b中(见实施例3)。以3.7％[w/v]BHI和3％G1的组合作为参考。
非常令人惊讶的是，鱼明胶能够显示增强培养物上清液中的胶原酶体积活性(见实施例6，表3)。因此，本发明的另一方面是在营养培养基中使用鱼明胶用于培养溶组织梭菌，并由其分泌具有胶原酶活性的酶。本发明的另一方面是含有水、来自非哺乳动物源的蛋白胨和鱼明胶的组合物。在本发明的优选实施方案中，该组合物是液体营养培养基。在这一点，应当理解在根据本发明的组合物中，将化合物(即蛋白胨和明胶以及任何其他成分)溶于水中，即，形成溶液。由于任何明胶成分，该溶液的粘度可以高于纯水。
鱼明胶在其氨基酸含量方面不同于哺乳动物源的传统明胶。尽管所有明胶都由相同的20种氨基酸组成，但与来自哺乳动物源的明胶相比，鱼明胶含有较低量的亚氨基酸、脯氨酸和羟脯氨酸。在本发明的优选实施方案中，与小牛皮明胶相比，鱼明胶的羟脯氨酸含量在约78％到约56％之间。在本发明的另一个优选实施方案中，与小牛皮明胶相比，鱼明胶的脯氨酸含量在约93％到约74％之间。
可以通过商业途径获得不同类型的鱼明胶，其可用于本发明的营养培养基。在本发明的非常优选的实施方案中，鱼明胶选自(i)高分子量鱼明胶，(ii)液体鱼明胶，(iii)来自鱼的清洁可食物种的明胶，以及其混合物。鱼必须具有鳍和鳞才是清洁可食的；有壳的水生动物，即水生无脊椎动物例如软体动物、甲壳动物、棘皮动物和其他非鱼水生动物区系不是清洁可食的。因此，在本发明的优选实施方案中，来自鱼的清洁可食的物种的明胶是来自具有鳍和鳞的鱼物种(鱼纲(pisces))的明胶。
在本发明非常优选的实施方案中，鱼明胶在本发明组合物中的浓度在约2％至约10％之间，其中的百分比在分离的鱼明胶是干物质时指重量比体积，且在分离的鱼明胶是液体物质时指体积比体积。在本发明的甚至更优选的实施方案中，鱼明胶浓度在约3％至约8％之间。
根据本发明，营养组合物中的蛋白胨是来自非哺乳动物源的蛋白胨。在本发明的非常优选的实施方案中，蛋白胨是植物产物。甚至更优选的，该蛋白胨来自植物源，所述植物源选自大豆、蚕豆、豌豆、马铃薯及其混合物。最优选的，蛋白胨选自来自豌豆的Oxoid VG100植物蛋白胨No.1(VG100)、来自豌豆的Oxoid VG200植物蛋白胨磷酸盐肉汤(VG200)、Merck TSB CASO-Bouillion无动物(TSB)、Invitrogen大豆蛋白胨No110木瓜蛋白酶消化物(SP6)、Fluka蚕豆蛋白胨(BP)、来自马铃薯的Organotechnie植物蛋白胨E1(E1P)、及其混合物。
关于营养培养基的配置且特别是蛋白胨浓度，本发明非常优选的实施方案是根据本发明的组合物包括两种或更多种不同的蛋白胨，由此该组合物中植物蛋白胨的总浓度为重量比体积约2％至约10％之间。甚至更优选的，该组合物中植物蛋白胨的总浓度为重量比体积约3％至约5％之间。
在本发明另一个非常优选的实施方案中，在本发明的营养组合物中存在单个类型的蛋白胨，其中蛋白胨选自BP、E1P、大豆蛋白胨E110、VG100和VG200，且其中组合物中蛋白胨浓度约为重量比体积5％。在本发明另一个非常优选的实施方案中，在本发明的营养组合物中存在单个类型的蛋白胨，其中蛋白胨是VG100，且其中组合物中该蛋白胨浓度约为重量比体积2％。
在本发明的优选实施方案中，该组合物的pH在pH 7至pH 8之间。甚至更优选的是pH在约pH 7.2至约pH 7.4之间。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的组合物经过灭菌，即，使该组合物不含任何自我复制的生物。可以通过本领域技术人员已知的标准方法实现灭菌，例如通过热处理比如高压灭菌。
根据本发明的组合物尤其对于培养溶组织梭菌细菌有用。本发明最优选的实施方案因此是额外包含溶组织梭菌细菌接种物的根据本发明的组合物。在此方面一样优选的是使用根据本发明的组合物用于培养溶组织梭菌并由其分泌具有胶原酶活性的蛋白酶。
因此，本发明的另一方面是从溶组织梭菌产生一种或多种纯化的具有胶原酶活性的蛋白酶的方法，包括步骤(a)提供具有溶组织梭菌细菌接种物的根据本发明的灭菌的组合物；(b)生长和培养该细菌，其中细菌将一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；(c)从液相分离细胞和其他特定物质，从而获得培养物上清液；(d)从培养物上清液纯化一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶；从而从溶组织梭菌产生一种或多种纯化的具有胶原酶活性的蛋白酶。
本发明的另一方面是含有一种或多种来自溶组织梭菌、具有胶原酶活性的蛋白酶的培养物上清液，所述培养物上清液可通过下述方法获得：(a)提供具有溶组织梭菌细菌接种物的根据本发明的灭菌的组合物；(b)生长和培养该细菌，其中细菌将一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；(c)从液相分离细胞和其他特定物质；从而获得含有一种或多种来自溶组织梭菌、具有胶原酶活性的蛋白酶的培养物上清液。根据本发明的培养物上清液是不仅包含胶原酶而且也包含其他分泌的蛋白质的复杂混合物。在本发明非常优选的实施方案中，在稳定期从液体培养物获得上清液。
根据本发明的上清液可直接用于纯化其中含有的一种或多种成分。备选地，可将上清液以例如冷冻形式储存。然而，最优选的是储存上清液的冻干物(lyophilizate)。因此，本发明的另一方面是根据本发明的上清液的冻干物。
通过代表其优选实施方案的下列项目更加详细地描述本发明。
1.含有水、来自非哺乳动物源的蛋白胨和鱼明胶的液体组合物。
2.根据项目1的组合物，其特征在于鱼明胶选自高分子量鱼明胶、来自鱼的清洁可食物种的明胶、液体鱼明胶及其混合物。
3.根据项目2的组合物，其特征在于鱼明胶选自高分子量鱼明胶、来自鱼的清洁可食物种的明胶、及其混合物。
4.根据项目1至3任一项的组合物，其特征在于该组合物中鱼明胶浓度在约2％至约10％之间，其中百分比在分离的鱼明胶是干物质时指重量比体积，且在分离的鱼明胶是液体物质时指体积比体积。
5.根据项目4的组合物，其特征在于鱼明胶浓度在约3％至约8％之间。
6.根据项目1至5任一项的组合物，其特征在于非哺乳动物源蛋白胨不是鱼蛋白胨。
7.根据项目6的组合物，其特征在于非哺乳动物源蛋白胨是植物产物。
8.根据项目7的组合物，其特征在于蛋白胨的植物源是选自大豆、蚕豆、豌豆、马铃薯及其混合物的植物源。
9.根据项目8的组合物，其特征在于蛋白胨选自来自豌豆的VG100植物蛋白胨No.1(VG100)、来自豌豆的VG200植物蛋白胨磷酸盐肉汤(VG200)、TSB CASO-Bouillion无动物(TSB)、大豆蛋白胨No110木瓜蛋白酶消化物(SP6)、蚕豆蛋白胨(BP)、来自马铃薯的植物蛋白胨E1(E1P)及其混合物。
10.根据项目9的组合物，其特征在于该组合物包含两种或更多不同蛋白胨，其中该组合物中植物蛋白胨总浓度在重量比体积约2％至约10％之间。
11.根据项目10的组合物，其特征在于植物蛋白胨总浓度在重量比体积约3％至约5％之间。
12.根据项目9的组合物，其特征在于蛋白胨选自BP、E1P、大豆蛋白胨E110、VG100和VG200，且其中组合物中的蛋白胨浓度约为重量比体积5％。
13.根据项目9的组合物，其特征在于蛋白胨为VG100，其中组合物中的蛋白胨浓度约为重量比体积2％。
14.根据项目1至13任一项的组合物，其特征在于该组合物的pH在pH 7和pH 8之间。
15.根据项目1至14任一项的灭菌的组合物。
16.根据项目15的组合物，另外包含溶组织梭菌细菌接种物。
17.根据项目15或项目16的组合物在培养溶组织梭菌并由其分泌具有胶原酶活性的蛋白酶中的用途。
18.产生溶组织梭菌液体培养物上清液的方法，所述上清液含有一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶，所述方法包括步骤
(a)提供根据项目16的具有接种物的灭菌的组合物；
(b)生长并培养该细菌，从而细菌将一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；
(c)将细胞和其他特定物质从液相分离，由此获得培养物上清液；
从而产生具有一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶的培养物上清液。
19.从溶组织梭菌产生一种或多种纯化的具有胶原酶活性的蛋白酶的方法，包括步骤
(a)提供根据项目16的具有接种物的灭菌的组合物；
(b)生长并培养该细菌，从而细菌将一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；
(c)将细胞和其他特定物质从液相分离，由此获得培养物上清液；
(d)从培养物上清液分离一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶；
从而从溶组织梭菌产生一种或多种纯化的具有胶原酶活性的蛋白酶。
20.培养物上清液，包含一种或多种来自溶组织梭菌的具有胶原酶活性的蛋白酶，可通过下述方法获得
(a)提供根据项目16的具有接种物的灭菌的组合物；
(b)生长并培养细菌，从而该细菌将一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；
(c)将细胞和其他特定物质从液相分离；
从而获得包含一种或多种来自溶组织梭菌的具有胶原酶活性的蛋白酶的培养物上清液。
提供下列实施例以帮助对本发明的理解，其真实范围列举在附加的权利要求中。应当理解可以在不背离本发明的精神的情况下在所述程序中进行修饰。
实施例1
一般工作条件
通常，在采用微生物学标准实验室实践的无菌条件下实施涉及细菌或细菌培养的所有工作步骤。厌氧培养在培养箱中于30℃温度保持在氮气氛中。在环境(即含氧)气氛中于层流罩超净台下实施接种物的转移。在本文件中所述的所有培养基均以高压灭菌来灭菌。在高压灭菌之前调节pH，如果没有另外指出，所述pH在pH 7.2-pH 7.4范围内。如果没有另外指出，任何各自的培养基内均每1升加入1mM CaCl2。常规检查高压灭菌培养基等分试样的pH变化。
实施例2
溶组织梭菌细菌的种子培养、种子库和起子培养物
使用衍生自ATCC 21000的溶组织梭菌菌株BMTU 1175作为100ml体积的液体生长培养基的接种物，所述液体培养基由溶解于水中的3.7％的BHI和3.0％的G1组成，pH调节为pH 7.2。将培养物在厌氧条件下温育约26小时，直至578nm处光密度(＝OD578nm)达到5.6。将该液体培养物的1ml等分试样密封在安瓿中，冷冻并储存在液氮的气相中。将该等分试样作为以后用作起子培养物的最初种子库。
通过用1ml种子库安瓿内容物接种100ml含有5％[重量/体积]VG100的液体培养基，并将细菌在厌氧条件下于30℃温育过夜或在37℃温育约8小时，制备不同培养基中的生长实验起子培养物。用约2-4ml之间的起子培养物各自接种如下文进一步描述的液体培养基(通常为100ml或200ml体积)。
实施例3
不同培养基中的溶组织梭菌培养
评价溶组织梭菌在不同生长培养基中的生长。将液体培养物在瓶中无搅拌地温育。如果没有另外指出，培养物的温育持续40小时。在各个试验的过程中在不同时间点，从培养物取出一个或多个样品，且测定液体培养物的OD578nm、培养物上清液的pH、以及培养物上清液中的胶原酶蛋白水解活性(见实施例4)。
使用表1a和1b中列出的成分制备液体培养基。如果没有另外指出，以百分比给出的成分浓度指重量比体积[w/v]％，在高压灭菌前调整。例如，给定化合物的浓度3％[w/v]对应于3g/100ml培养基。对于液体成分G4的情况，以百分比给出的浓度指体积比体积％。
如果没有另外指出，在高压灭菌前将pH调整在pH 7.2-pH 7.4范围内。如果没有另外指出，任何各自的培养基中均每1升加入1mMCaCl2。
表1a
生长培养基中测试的可商业获得的蛋白胨化合物
Figure G2009101492290D00131
表1b
生长培养基中测试的可商业获得的明胶
Figure G2009101492290D00142
Roche Applied Science(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国)的重组产生的胰蛋白酶。
实施例4
确定胶原酶蛋白水解活性的测定
使用合成肽底物通过标准方法以Wuensch单位(Wuensch，E.，Heidrich，H.，Z.，Physiol.Chem.333(1963)149-159)测量胶原酶蛋白水解活性。胶原酶蛋白水解活性催化经过修饰的底物(“Wuensch”)肽4-苯偶氮基-苄氧羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg(Bachem M1715)在Leu和Gly残基之间的水解。将在25℃、pH 7.1下每分钟水解1μM肽定义为一个活性单位(U)。
将底物肽(也称为“底物”)在溶液中且以1mg/ml的浓度提供。首先将10mg底物肽溶解在0.2ml甲醇中。通过加入0.1M TrisHCl，pH 7.1将溶液体积增加到10ml。其他试剂是0.1M CaCl2水溶液和由5体积份乙酸乙酯和一体积份0.025M柠檬酸水溶液组成的提取混合物。作为含有0.35-0.4g(NH4)2SO4的试管提供干燥管。使用前以石蜡膜将干燥管密封。
根据下列移液方案和工作流程在试管中设立对照和样品反应：
步骤    溶液              对照试管    样品试管
1       底物肽            1ml         1ml
        CaCl2             0.2ml       0.2ml
混合，加温到25℃
2       样品材料
Figure G2009101492290D00151
            -           0.05ml
0.1M TrisHCl，pH 7.1      0.05ml      -
混合，于25℃温育15分钟；温育后，将温育的溶液的等
分试样转移到一个体积的提取混合物中
3    步骤2温育的溶液    0.5ml  0.5ml
     提取混合物         6ml    6ml
通过涡旋20秒立即混合，将约3ml乙酸乙酯相转移到干燥管中，通过涡旋混合并转移上清液到杯中；在320nm测量消光(A)，杯光程＝1cm。
4    计算体积活性[U/ml]＝ΔA*d*0.794
     A：测量的消光值
     d：稀释因子
     ΔA＝A样品-A对照
Figure G2009101492290D00152
含有一种或多种具有胶原酶蛋白水解活性的酶的溶液。如果需要，通过稀释该溶液制备用于测定中的样品材料。对于每次测量，为了最终导致在0.3至1.0之间的消光值，调整并选择各自的稀释因子(d)。然而，通常测定没有细菌细胞和碎片的未经稀释的培养物上清液。另外，测试具有已知量胶原酶和已知活性的标准作为参考。
当使用Wuensch肽作为底物实施活性测定时，在含有胶原酶I型和II型酶的混合物中，胶原酶II的测量的活性一般大于胶原酶I的活性。因此，在应用的条件下，任何测量的蛋白水解活性主要反映胶原酶II型。
实施例5
溶组织梭菌在不同培养基中的生长：不添加明胶的基于蛋白胨的培养基
表2提供了溶组织梭菌培养的许多培养基。该表每个条目显示各个培养基的成分。在一些情况下，在培养基灭菌和接种前调节pH。对于没有将pH值列表的情况，如果没有另外指出，以KOH调整pH至pH 7.2和pH 7.4之间的值后，接种培养基。将培养物培养到稳定期，对应于在标准条件下温育约40小时。在培养终止时确定578nm的光密度(也称为“OD”)，以及培养物上清液中的胶原酶酶促活性(见实施例4)。在表中以每升培养基的Wuensch单位给出体积活性(在列表数据中也称为“U/l”)。
表2
液体培养基接种前的组成和pH、溶组织梭菌生长得率和培养物上清液中胶原酶活性；根据胶原酶体积活性排列培养基
  排列   培养号   组成(蛋白胨)   pH(0h时)   OD(～40h)   胶原酶活性[U/l]
  1   98   3.7％BHI   1.7   494
  2   9   3.7％BHI   7.4   1.2   493
  排列   培养号   组成(蛋白胨)   pH(0h时)   OD(～40h)   胶原酶活性[U/l]
  3   17   3.7％BHI   7.4   1.3   460
  4   82   5％VG100   1.9   451
  5   185a   2.5％SP62.5％VG100   1.6   446
  6   195   1.5％SP61.5％VG100   0.6   443
  7   145   5％BP   1.7   428
  8   175   2.5％SP6(Lot“B”)2.5％VG100   7.4   1.6   409
  9   185b   2.5％SP62.5％VG100   1.9   403
  10   94   2.5％VG1002.5％TSB   1.7   401
  11   171   1.25％SP6(Lot“B”)1.25％VG1001.25％TSB1.25％BP   7.4   1.5   374
  12   90   5％VG1005％TSB   3.5   341
  13   184   6％VG100   7.5   2.0   323
  14   78   5％SP6   1.9   308
  15   177   2.5％SP6(Lot“B”)512.5％TSB   7.3   1.4   307
  16   173   2.5％TSB2.5％BP   7.4   1.5   301
  17   135   5％E1P   7.4   2.3   294
  18   167   5％SP6(Lot“B”)   7.3   1.5   290
  19   159   2.5％VG1002.5％BP   1.7   289
  20   72   5％TSB   7.3   1.1   281
  21   28   5％SP6   7.3   2.3   279
  22   165   5％SP6(Lot“A”)   7.4   1.5   275
  24   153   1.7％BP1.7％TSB1.7％VG100   2.0   268
  25   169   5％SP6(Lot“C”)   7.3   1.6   260
  26   183   4％VG100   7.5   1.3   258
  27   179   2.5％SP6(Lot“B”)2.5％BP   7.4   1.6   248
  28   25   4％SP6   7.3   1.7   218
  29   71   5％SP63％T   7.3   3.1   218
  30   181   2％VG100   7.5   0.4   197
  31   143   2.5％VG2002.5％BP   7.4   1.5   186
  32   74   5％VG100   7.3   2.0   177
  33   161   2.5％VG1012.5％BP   2.1   177
  34   133   5％E110   7.3   1.6   166
  排列   培养号   组成(蛋白胨)   pH(0h时)   OD(～40h)   胶原酶活性[U/l]
  35   21   3％SP6   7.3   1.0   160
  36   125   5％A482   7.3   2.6   160
  37   149   5％BP   2.0   159
  38   155   1％BP1％TSB1％VG100   1.0   159
  39   69   5％SP63％YE   7.3   3.2   142
  40   139   5％ET1   7.3   13.0   137
  41   70   5％SP61％T   7.3   2.0   134
  42   15   2％SP7   7.3   0.3   131
  43   14   2％SP6   7.3   0.6   130
  44   68   5％SP61％YE   7.3   2.2   120
  45   157   2.5％VG2002.5％TSB   1.7   119
  46   66   5％SP6   7.3   1.7   110
  47   106   5％VG300   1.6   107
  48   19   3％SP4   7.3   0.8   105
  49   26   5％SP4   7.3   1.5   104
  50   163   2.5％VG1012.5％TSB   2.2   94
  51   13   2％SP5   7.3   0.3   92
  52   29   5％SP7   7.3   1.9   92
  53   65   5％SP6   7.3   1.8   87
  54   129   5％AM41   7.4   1.6   79
  55   121   5％VG200   1.8   64
  56   137   5％A2SC   7.4   1.5   62
  57   110   5％BP   1.4   60
  58   141   5％A3SC   7.3   1.5   60
  59   102   5％VG101   1.9   46
  60   86   5％TSB   1.0   28
  61   127   5％E430   7.4   1.4   16
  62   131   5％E1   7.4   1.2   9
指出在仅含有蛋白胨(即没有加入任何明胶)的培养基中，BHI在刺激溶组织梭菌胶原酶向培养物上清液中的分泌是最有效的。也发现胶原酶的体积活性不仅仅是培养物OD的函数。
实施例6
溶组织梭菌在不同培养基中的生长：有明胶的基于蛋白胨的培养基
将来自不同来源的不同类型明胶加入蛋白胨培养基。表3提供了溶组织梭菌培养的许多培养基。该表每个条目显示各个培养基的成分。在一些情况下，在培养基灭菌和接种前调节pH。对于没有将pH值列表的情况，如果没有另外指出，以KOH调整pH至pH 7.2和pH 7.4之间的值后，接种培养基。将培养物培养到稳定期，对应于在标准条件下温育约40小时。在培养终止时确定578nm的光密度(也称为“OD”)，以及培养物上清液中的胶原酶酶活性(见实施例4)。在表中以每升培养基的Wuensch单位给出体积活性(在列表数据中也称为“U/l”)。
表3
液体培养基接种前的组成和pH、溶组织梭菌生长得率和培养物上清液中胶原酶活性；根据胶原酶体积活性排列培养基
  排列   培养号   组成(蛋白胨)   组成(明胶)   pH(0h时)   OD(～40h)   胶原酶活性[U/l]
  1   199   1.5％SP61.5％VG100   5％G2   5.5   1405
  2   198   1.5％SP61.5％VG100   4％G2   5.0   1064
  3   190   2.5％SP62.5％VG100   10％G2   9.8   980
  4   218   1％VG1001％SP61％TSB1％BP1％E1P   6％G3   9.6   965
  5   113   5％BP   3％G3   5.7   944
  6   197   1.5％SP61.5％VG100   3％G2   2.8   944
  7   220   0.6％VG1000.6％SP60.6％TSB0.6％BP0.6％E1P   6％G3   8.1   933
  8   207   1％VG1001％SP61％TSB   6％G3   8.8   928
  9   203   1.5％SP61.5％VG100   5％G3   6.0   920
  10   204   1.5％SP61.5％VG100   10％G3   11.5   913
Figure G2009101492290D00201
Figure G2009101492290D00211
  排列   培养号   组成(蛋白胨)   组成(明胶)   pH(0h时)   OD(～40h)   胶原酶活性[U/l]
  47   193   2.5％SP62.5％VG100   4％G3   6.8   637
  48   92   5％VG1005％TSB   3％G2   6.4   635
  49   226   1％VG1001％SP61％BP   4％G3   5.9   627
  50   213   1％VG1001％SP61％E1P   2％G3   2.7   618
  51   123   5％VG200   3％G2   6.2   611
  52   186   2.5％SP62.5％VG100   2％G2   3.8   608
  53   227   1％VG1001％SP61％BP   4％G3   6.4   604
  54   323   1.5％VG1000.75％SP60.75％TSB   7.5％G4   7.7   600
  55   93   5％VG1005％TSB   3％G3   6.9   600
  56   187   2.5％SP62.5％VG100   3％G2   5.2   598
  57   321   1.5％VG1000.75％SP60.75％TSB   7.5％G4   7.7   589
  58   317   1.5％VG1000.75％SP60.75％TSB   5.5％G4   7.7   589
  59   205   1％VG1001％SP61％TSB   2％G3   3.3   579
  60   322   1.5％VG1000.75％SP60.75％TSB   7.5％G4   7.7   578
  61   318   1.5％VG1000.75％SP60.75％TSB   5.5％G4   7.7   2.6   577
  62   319   1.5％VG1000.75％SP60.75％TSB   5.5％G4   7.7   571
  63   100   3.7％BHI   3％G2   5.8   563
  64   77   3.7％BHI   3％G1   7.3   3.0   562
  65   209   1％VG1001％SP61％BP   2％G3   3.3   559
  66   320   1.5％VG1000.75％SP60.75％TSB   5.5％G4   7.7   555
  排列   培养号   组成(蛋白胨)   组成(明胶)   pH(0h时)   OD(～40h)   胶原酶活性[U/l]
  67   313   1.5％VG1000.75％SP60.75％TSB   4％G4   7.7   549
  69   144   2.5％VG2002.5％BP   3％G2   7.4   5.7   549
  70   324   1.5％VG1000.75％SP60.75％TSB   7.5％G4   7.7   3   540
  71   97   2.5％VG1002.5％TSB   3％G3   5.0   538
  72   314   1.5％VG1000.75％SP60.75％TSB   4％G4   7.7   536
  73   242   1％VG1001％SP61％BP   8％G3T   13.7   535
  74   156   1％BP1％TSB1％VG100   3％G3   4.2   527
  75   160   2.5％VG1002.5％BP   3％G3   5.0   516
  76   80   5％SP6   3％G2   4.3   516
  77   84   5％VG100   3％G2   4.5   515
  78   191   2.5％SP62.5％VG100   2％G3   3.9   512
  79   79   5％SP6   3％G1   4.5   511
  80   240   1％VG1001％SP61％BP   8％G3T   13.4   509
  81   238   1％VG1001％SP61％BP   6％G3T   8.6   504
  82   235   1％VG1001％SP61％BP   4％G3T   6.2   501
  83   315   1.5％VG1000.75％SP60.75％TSB   4％G4   7.7   1.8   500
  84   101   3.7％BHI   3％G3   6.6   498
  85   192   2.5％SP62.5％VG100   3％G3   5.9   487
  86   316   1.5％VG1000.75％SP60.75％TSB   4％G4   7.7   476
  87   134   5％E110   3％G2   7.3   5.8   467
  88   241   1％VG1001％SP61％BP   8％G3T   13.2   459
  排列   培养号   组成(蛋白胨)   组成(明胶)   pH(0h时)   OD(～40h)   胶原酶活性[U/l]
  89   239   1％VG1001％SP61％BP   6％G3T   8.8   459
  90   99   3.7％BHI   3％G1   5.6   456
  91   124   5％VG200   3％G3   6.1   454
  92   126   5％A482   3％G2   7.4   6.0   451
Figure G2009101492290D00241
以NH4OH调节pH
$以KOH调节pH
注意到，具有某种植物蛋白胨与鱼明胶的组合的组合物，在胶原酶体积活性方面至少等于并通常高于含有3.7％BHI和3％G1的标准培养基，所述BHI和G1均来自哺乳动物源。因此，提供多种新培养基以用于生长和培养溶组织梭菌，并从这类培养物的上清液产生胶原酶蛋白酶。

Claims (12)

1.用于培养溶组织梭菌的液体组合物，所述液体组合物包含水、鱼明胶和来自植物源的蛋白胨，其中不包括鱼蛋白胨，且其中该组合物中鱼明胶浓度在2％至10％之间，其中百分比在分离的鱼明胶是干物质时指重量比体积，且在分离的鱼明胶是液体物质时指体积比体积。
2.根据权利要求1的组合物，其特征在于所述鱼明胶选自高分子量鱼明胶、来自鱼的清洁可食物种的明胶、液体鱼明胶、及其混合物。
3.根据权利要求1和2任一项的组合物，其特征在于所述蛋白胨的植物源是选自大豆、蚕豆、豌豆、马铃薯及其混合物的植物源。
4.根据权利要求3的组合物，其特征在于该组合物包含两种或更多不同的蛋白胨，其中该组合物中植物蛋白胨总浓度在重量比体积2％至10％之间。
5.根据权利要求4的组合物，其特征在于所述蛋白胨选自BP、E1P、大豆蛋白胨E110、VG100和VG200，其中组合物中的蛋白胨浓度为重量比体积5％。
6.根据权利要求4的组合物，其特征在于所述蛋白胨为VG100，其中组合物中的蛋白胨浓度为重量比体积2％。
7.根据权利要求1和2任一项的组合物，其特征在于该组合物的pH在pH7和pH8之间。
8.根据权利要求1至7任一项的灭菌的组合物。
9.根据权利要求8的组合物，另外包含溶组织梭菌细菌接种物。
10.根据权利要求8或权利要求9的组合物在生长和培养溶组织梭菌并由其分泌具有胶原酶活性的蛋白酶中的用途。
11.产生溶组织梭菌液体培养物上清液的方法，所述上清液含有一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶，所述方法包括步骤
(a)提供具有溶组织梭菌细菌接种物的根据权利要求8的灭菌的组合物；
(b)生长并培养该细菌，其中细菌将一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；
(c)从液相分离细胞和其他特定物质；
从而产生具有一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶的培养物上清液。
12.从溶组织梭菌产生一种或多种纯化的具有胶原酶活性的蛋白酶的方法，包括步骤
(a)提供具有溶组织梭菌细菌接种物的根据权利要求8的灭菌的组合物；
(b)生长并培养该细菌，其中细菌将一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶分泌到液相中；
(c)从液相分离细胞和其他特定物质，由此获得培养物上清液；
(d)从培养物上清液分离一种或多种具有胶原酶活性的蛋白酶。
从而从溶组织梭菌产生一种或多种纯化的具有胶原酶活性的蛋白酶。
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