RU2103360C1 - Питательная среда для культивирования клеток эукариотов и способ получения основы питательной среды - протеолитического гидролизата - Google Patents
Питательная среда для культивирования клеток эукариотов и способ получения основы питательной среды - протеолитического гидролизата Download PDFInfo
- Publication number
- RU2103360C1 RU2103360C1 RU96115552/13A RU96115552A RU2103360C1 RU 2103360 C1 RU2103360 C1 RU 2103360C1 RU 96115552/13 A RU96115552/13 A RU 96115552/13A RU 96115552 A RU96115552 A RU 96115552A RU 2103360 C1 RU2103360 C1 RU 2103360C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proteolytic
- waste
- medium
- nutrient medium
- hydrolyzate
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Использование: в биотехнологии, ветеринарии и медицине. Сущность изобретения: питательная среда для культивирования клеток эукариотов включает сыворотку крови крупного рогатого скота, раствор Хенкса и протеолитический гидролизат отходов рыболовных промыслов, который получают путем протеолитического гидролиза отходов тушек промысловых рыб, измельченных с кишечником в щелочной среде. Смесь перемешивают с дистиллированной водой в соотношении 1: 1. Гидролиз ведут до массовой доли аминного азота 5,5-5,6% и свободных аминокислот 50-60%, 2 с.п.ф-лы, 6 табл.
Description
Изобретение относится к медицинской и ветеринарной биотехнологии и касается усовершенствованного способа получения протеолитического гидролизата отходов переработки рыбы, а также питательной среды на его основе, предназначенной для выращивания клеток эукариотов - продуцентов биологически активных веществ, используемых для производства диагностических и профилактических биологических и медицинских препаратов.
Известен способ получения основы питательных сред включающий измельчение белоксодержащего сырья (внутренние органы рыб) его гидролиз в присутствии хлороформа в щелочной среде при температуре 40-42oС в течение 2-2,5 сут с последующим прогреванием биомассы при температуре 90oС в течение 5-10 мин и осаждением высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точку белка [1].
Известен способ получения основы питательных сред путем гидролиза кильки в присутствии поджелудочной железы крупного рогатого скота при температуре 37-40oС в течение суток с последующим прогреванием биомассы при 80oС в течение 5-10 мин с последующим фильтрованием и высушиванием. Протеолитический гидролизат содержит не менее 18 аминокислот [2]. Однако, указанный процесс получения основы питательных сред включает использование дорогостоящего продукта - фермента поджелудочной железы.
Известна питательная среда (ПС), полученная из продуктов ферментативного гидролиза белка молока (ГЛА) [3] производства фирмы "Дифко" (США), которая используется, главным образом, для первично-трипсинизированных культур клеток.
Известна также ПС 199 для культивирования различных гетероплоидных перевиваемых клеток человека и животных [4]. ПС 199 содержит более 60 компонентов, в том числе 20 аминокислот, 17 витаминов, коэнзимы, глюкозу, минеральные соли и некоторые другие вещества; Среда полностью синтетическая. ПС 199 используется для длительного культивирования перевиваемых клеточных культур и обеспечивает высокую степень стандартности исследования. Недостатком является сложная технология ее изготовления из дорогостоящих реагентов. В условиях биотехнологического производства, где требуется большое количество питательной среды для получения клеточной биомассы ПС 199 не рентабельна.
Задачей изобретения является упрощение технологии получения протеолитического гидролизата и снижение себестоимости конечного продукта - основы питательной Среды, а также создание новой питательной Среды Автофизат-1 для культивирования клеток эукариотов.
Сущность изобретения заключается в том, что измельченную белоксодержащую массу-гомогенат, состоящую из отходов промысловых рыб на стадии разделки (неполноценные тушки и кишечник, содержащий протеолитические ферменты), смешивают с водой в весовом соотношении 1:1, выдерживают при температуре 40-42oС при рН 7,6-8,0 в присутствии хлороформа при перемешивании в течение 18 ч с последующим прогреванием биомассы при температуре 90oС в течение 5-10 мин, осаждением высокомолекулярных соединений в изоэлектрической точке белка, фильтрованием и высушиванием конечного продукта.
Сущность изобретения заключается в том, что питательная среда Автофизат-1 для культивирования клеток эукариотов содержит протеолитический гидролизат (ПГ) гомогената отходов промысловых рыб и внутренних органов при следующем соотношении компонентов, об.%:
ПГ гомогената отходов промысловых рыб и внутренних органов - 0,15-0,20
Сыворотка крови КРС - 5-10
Раствор Хенкса - Остальное
Полученный описываемым способом протеолитический гидролизат отходов промысловых рыб и внутренних органов - полноценный продукт, содержащий в своем составе 18 свободных аминокислот, в том числе все незаменимые для культивирования изолированных клеток человека и животных, а также набор витаминов, включая группу В и витамин Е (табл.1).
ПГ гомогената отходов промысловых рыб и внутренних органов - 0,15-0,20
Сыворотка крови КРС - 5-10
Раствор Хенкса - Остальное
Полученный описываемым способом протеолитический гидролизат отходов промысловых рыб и внутренних органов - полноценный продукт, содержащий в своем составе 18 свободных аминокислот, в том числе все незаменимые для культивирования изолированных клеток человека и животных, а также набор витаминов, включая группу В и витамин Е (табл.1).
Для изготовления ферментативного гидролизата не требуется экзогенных протеолитических ферментов, а ПС на его основе обеспечивает стандартные условия культивирования клеток эукариотов. Среда полноценна в отношении всех жизненно необходимых изолированной клетке компонентов, обеспечивает стандартные условия культивирования изолированных клеток с типичной морфологией без признаков цитопатологии в течение длительного срока.
Пример 1. Получение протеолитического гидролизата.
Отходы промысловых рыб (тушки и кишечник лососевых и тресковых) промывают проточной водой и измельчают. Гомогенат разводят дистиллированной водой в весовом соотношении 1:1 и проводят гидролиз при температуре 42oС при рН 7,8 в присутствии хлороформа (1,0 об.%) при перемешивании в течение 18 ч.
Гидролиз прекращают прогреванием при температуре 90oС в течение 10 мин. При этом коагулируют и выпадают в осадок неразгидролизованные белки.
Оставшиеся в надосадочной жидкости высокомолекулярные соединения осаждают в изоэлектрической точке белка, надосадочную жидкость фильтруют, затем подвергают высушиванию в потоке горячего воздуха, методом распыления. Режим высушивания (на входе 130oС на выходе 70oС) обеспечивает получение сухого препарата с остаточной влажностью не более 3,0%. Полученный продукт имеет следующие физико-химические характеристики:
Тонкодисперсный порошок, гигроскопичный, от белого до светло-кремового цвета с характерным запахом без гнилостного;
рН 1%-ного раствора - 5,5-6,5;
Растворимость, % - не менее 10;
Массовая доля общего азота, % - 11-12;
Массовая доля аминного азота, % - 5,5-6,5;
Массовая доля свободных аминокислот, % - 50-60.
Тонкодисперсный порошок, гигроскопичный, от белого до светло-кремового цвета с характерным запахом без гнилостного;
рН 1%-ного раствора - 5,5-6,5;
Растворимость, % - не менее 10;
Массовая доля общего азота, % - 11-12;
Массовая доля аминного азота, % - 5,5-6,5;
Массовая доля свободных аминокислот, % - 50-60.
Аминокислотный состав сухого конечного продукта (%) приведен в табл.2.
Строгое соблюдение условий процесса и регулярный контроль физико-химических параметров продукта в процессе гидролиза позволяет получать в достаточной степени стандартный результат, имеющий разброс количественных показателей аминокислот не более 5-6%.
Пример 2. Подобрана концентрация протеолитического гидролизата отходов промысловых рыб и внутренних органов рыб, обеспечивающая оптимальные условия жизнедеятельности перевиваемой линии клеток почки человека RH-PA.
Результаты представлены в табл.3.
Из приведенных в табл.3 данных следует, что оптимальные условия для роста и развития клеток обеспечивает ПС, содержащая 0,15-0,2 об.% ферментативного гидролизата отходов промысловых рыб и внутренних органов рыб (что соответствует содержанию аминного азота 14-15 мг% соответственно содержанию аминного азота в ПС 199).
Пример 3. Биологические ростовые свойства предлагаемой ПС испытывали при культивировании гетероплоидных перевиваемых линий клеток: почки человека RН-РА и СПЭВ в сравнении с ПС 199 производства ИПМ и ВЭ АМН РФ (все Среды дополнены 5% сыворотки КРС) (табл.4). Из представленных в табл.4 данных следует, что ПС Автофизат-1 (0,2 об.% протеолитического гидролизата отходов рыб на растворе Хенкса) обладает ростстимулирующими свойствами, идентичными ростстимулирующим свойствам ПС 199 производства ИПМ и ВЭ АМН РФ.
Видовая специфичность разных пород рыб, использованных для получения гидролизата, не оказывает влияния на ростстимулирующие свойства конечного продукта.
Пример 4. Проведена оценка ростстимулирующих свойств ПС Автофизат-1 в процессе длительного пассирования (табл.5) на ней перевиваемой линии клеток почки человека RH-РА в сравнении с синтетической питательной средой 199. Концентрация клеток при засеве 1,0-1,5 х 10 кл/мл, концентрация сыворотки КРС 5%, коэффициент пересева 1:3. Сроки формирования монослоя 3-4 сут.
Полученные данные свидетельствуют о том, что при длительном пассировании перевиваемой культуры клеток почки человека RH-РА ростстимулирующая активность ПС Автофизат-1 аналогична ростстимулирующей активности ПС 199.
Пример 5. Определена способность ПС Автофизат-1 обеспечивать восстановление жизнеспособности перевиваемой линии клеток почки человека RH-РА, замороженных на 30-ом пассаже после криоконсервации.
Полученные данные представлены в табл.6.
Данные, представленные в табл. 6, свидетельствуют о том, что клетки, выращенные в ПС Автофизат-1, сохраняют хорошую жизнеспособность и к пятому пассажу после размораживания полностью восстанавливают свои свойства.
Таким образом описываемый способ получения ферментативного гидролизата позволяет сохранить технологию процесса и снизить себестоимость конечного продукта за счет использования белоксодержащих отходов рыболовных промыслов и ферментсодержащих внутренних органов рыб.
Питательная среда "Автофизат-1" на основе полученного ферментативного гидролизата отходов рыболовных промыслов и ферментсодержащих внутренних органов рыб обладает хорошими ростстимулирующими свойствами как для первичных, так и для перевиваемых гетероплоидных линий клеток животных и человека, что позволяет применять ее для получения больших количеств клеточной биомассы в биотехнологических производствах наряду и вместо многокомпонентной синтетической питательной средой ПС 199.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Патент РФ N 2001101, кл. Е 12 N 1/20, 15.10.93.
1. Патент РФ N 2001101, кл. Е 12 N 1/20, 15.10.93.
2. Справочник по микробиологическим питательным средам. Под редакцией Меджидова М.М., Махачкала, 1989, с.104.
3. Melnick f., Riordan f., "Polyomyelitis viruses in tissue culture IV. Protein free nutrient media in stationary and roller tube culture. Proc.Soc. Exp.Biol.Med., 1452, 81, p.208-213.
4. Morgan f.F. et al.Nutrition of animal cells in tissue culture I.Ynitial studies on a synthatic medium. Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 1950, 78,1, p. 1-8.
Claims (1)
1. Питательная среда для культивирования клеток эукариотов, включающая сыворотку крови крупного рогатого скота и раствора Хенкса, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит протеолитический гидролизат отходов рыболовных промыслов, полученный путем протеолитического гидролиза отходов тушек промысловых рыб, измельченных совместно с кишечником в щелочной среде, при следующем соотношении компонентов, об.
Протеолитический гидролизат отходов рыбных промыслов 0,15 0,20
Сыворотка крови крупного рогатого скота 5 10
Раствор Хенкса Остальное
2. Способ получения основы питательной среды протеолитического гидролизата для культивирования клеток эукариотов, предусматривающий протеолитический гидролиз отходов рыболовных промыслов в щелочной среде, температурную инактивацию, фильтрование и высушивание, отличающийся тем, что в качестве отходов рыболовных промыслов используют отходы тушек промысловых рыб, которые измельчают совместно с кишечником, затем смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1 1, гидролиз ведут при температуре 40 42oС до массовой доли аминного азота 5,5 6,5% и массовой доли свободных аминокислот 50 60% температурную инактивацию проводят в изоэлектрической точке.
Сыворотка крови крупного рогатого скота 5 10
Раствор Хенкса Остальное
2. Способ получения основы питательной среды протеолитического гидролизата для культивирования клеток эукариотов, предусматривающий протеолитический гидролиз отходов рыболовных промыслов в щелочной среде, температурную инактивацию, фильтрование и высушивание, отличающийся тем, что в качестве отходов рыболовных промыслов используют отходы тушек промысловых рыб, которые измельчают совместно с кишечником, затем смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1 1, гидролиз ведут при температуре 40 42oС до массовой доли аминного азота 5,5 6,5% и массовой доли свободных аминокислот 50 60% температурную инактивацию проводят в изоэлектрической точке.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96115552/13A RU2103360C1 (ru) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | Питательная среда для культивирования клеток эукариотов и способ получения основы питательной среды - протеолитического гидролизата |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU96115552/13A RU2103360C1 (ru) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | Питательная среда для культивирования клеток эукариотов и способ получения основы питательной среды - протеолитического гидролизата |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2103360C1 true RU2103360C1 (ru) | 1998-01-27 |
| RU96115552A RU96115552A (ru) | 1998-09-20 |
Family
ID=20183917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU96115552/13A RU2103360C1 (ru) | 1996-07-25 | 1996-07-25 | Питательная среда для культивирования клеток эукариотов и способ получения основы питательной среды - протеолитического гидролизата |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2103360C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003066665A2 (en) * | 2002-02-06 | 2003-08-14 | Green Earth Industries, Llc | Proteolytic fermenter |
| WO2005018337A1 (fr) * | 2003-08-22 | 2005-03-03 | Sergey Marovich Dudkin | Procede de preparation d'un hydrolysat enzymatique a base de proteines de poisson |
| US9464309B2 (en) | 2002-07-29 | 2016-10-11 | Zymtech Holding Ag | Methods for recovering peptides/amino acids and oil/fat from one or more protein-containing raw materials, and products produced by the methods |
-
1996
- 1996-07-25 RU RU96115552/13A patent/RU2103360C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Справочник по микробиологическим питательным средам. /Под редакцией М.М. Меджидова. - Махачкала, 1989, с. 104. 2. Morgan F. et al Nutrition of animal cells in tissue culture. J. Ynitiol studies on a synthatic medium. Proc. Soc.Exp. Biol. Med. 1950, 78, 1, p.1 - 8. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003066665A2 (en) * | 2002-02-06 | 2003-08-14 | Green Earth Industries, Llc | Proteolytic fermenter |
| WO2003066665A3 (en) * | 2002-02-06 | 2005-02-03 | Green Earth Ind Llc | Proteolytic fermenter |
| US6960451B2 (en) | 2002-02-06 | 2005-11-01 | Green Earth Industries | Proteolytic fermenter |
| US9464309B2 (en) | 2002-07-29 | 2016-10-11 | Zymtech Holding Ag | Methods for recovering peptides/amino acids and oil/fat from one or more protein-containing raw materials, and products produced by the methods |
| WO2005018337A1 (fr) * | 2003-08-22 | 2005-03-03 | Sergey Marovich Dudkin | Procede de preparation d'un hydrolysat enzymatique a base de proteines de poisson |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7396912B2 (en) | Collagen production method | |
| US11884953B2 (en) | Method for preparing protein peptide based on connective tissue and prepared protein peptide and use thereof | |
| KR100977744B1 (ko) | 콜라겐과 그 생산방법 | |
| EP2133415B1 (en) | Growth medium for Clostridium histolyticum without ingredients of mammalian sources | |
| CN1382806A (zh) | 深海鱼皮组织工程用胶原蛋白和制备方法 | |
| RU2103360C1 (ru) | Питательная среда для культивирования клеток эукариотов и способ получения основы питательной среды - протеолитического гидролизата | |
| Baburina et al. | Chemical and biotechnological processing of collagen-containing raw materials into functional components of feed suitable for production of high-quality meat from farm animals | |
| RU2068879C1 (ru) | Способ получения ферментативного гидролизата и питательная среда "эпидермат-2" для культивирования клеток эукариотов | |
| WO2022192446A1 (en) | Production of heme for cell-based meat products | |
| RU2074249C1 (ru) | Способ получения ферментативного гидролизата из мышечной ткани ластоногих и питательная среда "целат" для культивирования клеток эукариотов | |
| RU2020153C1 (ru) | Способ получения ферментативного гидролизата и питательная среда для культивирования клеток эукариотов | |
| JP4295387B2 (ja) | 分解ペプチド類の製造法 | |
| RU2295249C2 (ru) | Способ получения гидролизата сои | |
| RO134119A0 (ro) | Procedeu de obţinere a gelatinei cu proprietăţi bioactive din gasteropode marine | |
| EP0061549B1 (en) | Collagen tissue culture substrate | |
| RU2214827C1 (ru) | Способ получения коллагена для лечения патологий тканей организма | |
| RU2103345C1 (ru) | Способ получения гидролизатов и использование их при изготовлении питательных сред для культивирования микроорганизмов | |
| JPS6350992B2 (ru) | ||
| RU2812484C1 (ru) | Штамм бактерий Bacillus licheniformis - продуцент кератиназы | |
| RU2710718C1 (ru) | Способ модификации пролиферативной активности клеточных культур млекопитающих | |
| RU2754364C2 (ru) | Способ получения белкового гидролизата | |
| RU1609153C (ru) | Способ получения пептона | |
| JPS62181797A (ja) | 家畜，家禽の病原性細菌の産生する蛋白質抗原の製法 | |
| RU2002801C1 (ru) | "Питательна среда "Бактофет" дл культивировани бифидобактерий" | |
| JPH04149200A (ja) | 細胞培養基質用コラーゲン |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040726 |