JPH04149200A - 細胞培養基質用コラーゲン - Google Patents
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
培養する際に、増殖及び機能保持に有効な基質用コラー
ゲンに関する。
培養技術の著しい進歩により、動物の組織、臓器等の細
胞を生体外で培養する細胞培養が可能になり、細胞培養
は、種々の臓器の代謝、ホルモン応答等の生化学的研究
や細胞の増殖抑制、分化、形態、老化、がん化等の基礎
的研究、細胞が産生ずる生理活性物質(例えば、ホルモ
ン様物質、成長因子等)の探索、新薬開発のスクリーニ
ング系、薬剤の安全性検査、臨床検査等の分野で広く用
いられている。
胞とに大別される。多くの動物細胞は後者の接着依存性
細胞で、足場となる培養基質が存在しないと生存するこ
とができない。細胞の足場となる培養基質として特殊処
理が施されたガラス製培養皿、プラスチック製培養皿等
が広く用いられているが、この培養系では細胞の増殖、
分化の誘導、形態形成及び長期培養等が困難であり、細
胞が本来備わっている機能を保持することができないケ
ースが多いことが報告されている。そこで、生体におけ
る細胞環境を模倣したコラーゲン基質を利用する培養法
が考えられた。この培養法は細胞をコラーゲン拳フィル
ム上やコラーゲン拳ゲルの上又は中で培養する方法であ
り、多くの細胞で増殖や機能保持などにおいて有効性が
確認されている。コラーゲン・フィルムやゲルを調製す
るために用いるコラーゲンは、動物の結合組織などがら
酸や酵素で可溶化したタイプIコラーゲンである。この
コラーゲンを培養皿などにコーティングし、乾燥すれば
コラーゲン・フィルムが得られる。
コラーゲン・ゲルが得られる。このようなコラーゲン・
ゲルを細胞培養に用いる場合、ゲル強度が高い程好適で
あることが知られている。
調製した場合、強度が高くしかも製品ロフト間で強度が
一定のゲルを得るのは困難であり、培養データにバラツ
キを与えることが多いという問題がある。
たもので、本発明の目的はゲル強度が高く且つ製品ロッ
ト間でのゲル強度のバラツキの少ない細胞培養基質用コ
ラーゲンを提供することにある。
果、コラーゲン分子が分子間架橋で結合したコラーゲン
分子の会合体(以下、コラーゲン会合体という)がゲル
強度に影響していること及び酸やペプシンで可溶化され
たコラーゲンには、ある程度の量のコラーゲン会合体が
存在し、その量が多い程、ゲル強度が高くなることを見
い出した。また、コラーゲン会合体の量をコントロール
することにより、製品ロット間でゲル強度を一定にする
ことかできることを見い出した。本発明は上記の知見に
基づいてなされたもので、本発明の細胞培養基質用コラ
ーゲンは、可溶化コラーゲンから分画された、コラーゲ
ン会合体を多く含むコラーゲンからなるものであり、コ
ラーゲン会合体含量が25重量%程度以上、より好まし
くは35重量%以上のものが好適である。
ン会合体を多く含むコラーゲンは、可溶性コラーゲンを
分画することにより得られる。ここで使用される可溶性
コラーゲンは慣用の方法で調製することができ、例えば
、牛、豚等の動物の結合組織(例えば、皮膚、鍵、骨等
)を細切し、水洗、塩洗、脱脂し、乾燥することにより
前処理原料を調製する。かくして調製された原料を、酸
性溶液(例えば、塩酸溶液、酢酸溶液等)で抽出する方
法又はタンパク質分解酵素(例えば、ペプシン、プロナ
ーゼ等)で分解する方法を用いて、フラーゲン溶液を調
製し、次いで潰食塩水で塩析することにより、可溶性コ
ラーゲン(タイプIコラーゲン)が得られる。
会合体が多く含まれる両分を分画する方法としては、例
えば、0.5M NaCjlを含む酸性溶液CpH3
,0程度)に可溶性コラーゲンを添加し、可溶性画分と
不溶性画分とを分離することにより行われる。コラーゲ
ン会合体は当該不溶性画分に多く含まれるので、不溶性
画分を分離し、必要に応じて洗浄、乾燥することにより
コラーゲン会合体を多く含むコラーゲンを得ることがで
きる。このようにして得られたコラーゲン会合体を多く
含むコラーゲンは、通常、コラーゲン会合体を30重量
%以上含有しており、好ましくはコラーゲン会合体含量
が35重量%以上、より好ましくは40重量%以上のも
のが使用される。
ゲンは、粉末等の固体状態又は酸性溶液に溶解し、紫外
線滅菌等の慣用の滅菌法で滅菌された溶液状態で保存す
ることができ、保存条件としては低温で保存するのが好
ましい。
ーゲン会合体を多く含むコラーゲンからなるものである
。本発明の基質用コラーゲンは、従来の基質用コラーゲ
ンと同様にコラーゲン・ゲル上培養法、浮遊コラーゲン
・ゲル°培養法、コラーゲン・ゲル包埋培養法等の細胞
培養法の基質として利用することができる。また、これ
らの方法に用いられコラーゲン拳ゲルマトリックスの調
製も従来の基質用コラーゲンと同様な方法にて行うこと
ができる。例えば、下記(ω〜(C1に示される溶液を
用意し、滅菌した後、冷却しておく。
度); <b+細胞培養培地の高濃度溶液;及び(C1再構成用
アルカリ性緩衝液。
、(al〜(C)の溶液を冷却下で適宜混合し、得られ
た混合液を25〜37℃程度で、5〜40分間程度加熱
してゲル化させることによりコラーゲン・ゲルが得られ
る。コラーゲン・ゲルの強度としては、レオメータ−で
0.5インチプランジャーを用いて、挿入速度20mm
/分の条件で測定した場合に、約200g以上、好まし
くは250g以上、より好ましくは300g以上のゲル
強度となるように調製するのがよい。
皿等のコラーゲン・コート剤としても使用できる。例え
ば、希コラーゲン溶液を培養皿に注ぎ、薄く引き延ばし
た後に、コラーゲンの変性を防止するため比較的低温で
乾燥させることによりコラーゲン・フィルムが形成され
、コラーゲン・コート培養皿が調製できる。かかるコラ
ーゲン・コート培養器を用いた細胞培養によっても良好
な培養結果が得られる。
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。
た後、アセトンとエチルエーテルで脱脂し、乾燥させて
前処理原料を得た。この原料をpH3,0の塩酸溶液(
1ス下、単に塩酸溶液という)中で、4℃、2日間攪拌
することにより酸可溶性コラーゲンを抽出した。この酸
可溶性コラーゲンにNaC41を0.7Mになるように
加え、沈澱物を遠心分離により回収し、た。さらに、こ
の沈澱物画分を0.5MNa、Cβを含む塩酸溶液中で
攪拌し、遠心分離により上溝と不溶性画分とに分画した
。不溶性画分の方にコラーゲン会合体が多く含まれる。
体を多く含む酸可溶性コラーゲンを得た。かくして得ら
れたコラーゲン中のコラーゲン会合体含量を、5DS−
ポリアクリルアミド電気泳動及びデンシトメーターを用
いて測定したところ、コラーゲン会合体含量は40重量
%であった。
ゲル強度の測定及び当該ゲルを用いてラット血管内皮細
胞を培養した。その方法及び結果を以下に示す。なお、
調製されたゲルは透明性の高いゲルであった。
した後、夫々を3:l:lの割合で水冷下混合した。得
られた混合液を、プラスチックシャーレ(φ35m+i
)に分注し、均一な厚さになるようにした後、37℃の
インキュベータで30〜40分間加熱してゲル化させ、
コラーゲン・ゲル(以下、本発明のゲルという)を調製
した。
; ■20%牛脂児血清、50gg / 11粗内皮細胞成
長因子、501.U、ペニシリン、50gg/l!スト
レプトマイシン及び2.5μg/’12アンホテリシン
Bを含有する199培地(以下、単に]99培地という
)の10倍濃度溶液;■0.05N N a OH1
00111に対し、炭酸水素ナトリウム2.2g及びH
EPES4.77gを溶解した溶液。
ン会合体を多く含む不溶性画分を分離した後の上清(コ
ラーゲン会合体の少ないコラーゲン)を用いて同様な方
法でコラーゲン・ゲルを調製した(比較例]、)。また
、市販の基質用コラーゲンを用いて同様な方法でコラー
ゲン・ゲルを調製した(比較例2)。なお、比較例1及
び比較例2で使用したコラーゲンのコラーゲン会合体含
量を、前記実施例1に記載した方法で測定したところ、
夫々10重量%及び25重量%であった。
、L、 、t メ−9−(NRM−20101−CW、
不動工業社製)で0.5インチプランジャーを用いて、
挿入速度20mn/分の条件でゲル強度を測定した。そ
の結果を後記第1表に示す。
ット胸部大動脈より単離した血管内皮細胞をI X 1
04個/シャーレずつ播種した。次いで、前記の199
培地を用いて、Co2インキュベータ内で、37℃にて
7〜10日間培養し、ランダム・エリアの生存細胞数を
計測した。
調製に使用したコラーゲン中のコラーゲン会合体含量(
重量%)を第1表に併せて示した。
含量と相関することが認められた。また、本発明のゲル
は比較例1及び2のゲルに比べて著しくゲル強度が高く
、更に細胞増殖率も高く、細胞培養用基質として極めて
優れていることが判明した。
胞に代えて、マウス線維芽細胞を用0て培養試験を行っ
たが、この細胞においても良好な増殖性が認められた。
燥重量に対し、1/25量のペプシンを含む塩酸溶液中
で20℃、2日間攪拌し溶解した。
aCjlをQ、7Mになるように加え、沈澱物を遠心分
離により回収した。さらに、この沈澱物画分を0.5M
NaCj7を含む塩酸溶液中で攪拌し、遠心分離に
より上清と不溶性画分と1こ分画した。不溶性画分の方
にコラーゲン会合体が多く含まれる。最後に不溶性画分
を塩酸溶液に溶解し、コラーゲン会合体を多く含むペプ
シン可溶性コラーゲンを得た。コラーゲン会合体含量は
40重量%であった。
にしてゲル強度及び細胞増殖率を求めた。
たゲル強度を示し、また従来のペプシン可溶性の基質用
コラーゲンと比べて高い細胞増殖率を示した。
含むコラーゲンを繰り返して調製し、比較したところ、
すべて強度が高く且つ一定のゲルが得られた。そして、
細胞を用いた実験でも高い増殖率及び再現性が認められ
た。
ル強度の高いコラーゲン・ゲルが得られ、その結果細胞
の増殖性が良くなり、細胞にとって好適な環境が得られ
る。また、コラーゲン会合体の量をコントロールするこ
とにより、ゲル強度が一定のゲルが得られ、培養データ
の再現性を向上できる。従って、本発明の基質用コラー
ゲンは、細胞培養において極めて有用である。
Claims (1)
- 可溶化コラーゲンから分画された、コラーゲン分子の会
合体を多く含むコラーゲンからなる細胞培養基質用コラ
ーゲン。
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JP2014015415A (ja) * | 2012-07-09 | 2014-01-30 | Nippon Meat Packers Inc | 神経突起伸張剤 |
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-
1990
- 1990-10-09 JP JP02271899A patent/JP3125038B2/ja not_active Expired - Lifetime
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