JPH04149200A - 細胞培養基質用コラーゲン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は細胞培養基質用コラーゲンに関する。

より詳細には、コラーゲン支持基質を用いて動物細胞を
培養する際に、増殖及び機能保持に有効な基質用コラー
ゲンに関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］近年、
培養技術の著しい進歩により、動物の組織、臓器等の細
胞を生体外で培養する細胞培養が可能になり、細胞培養
は、種々の臓器の代謝、ホルモン応答等の生化学的研究
や細胞の増殖抑制、分化、形態、老化、がん化等の基礎
的研究、細胞が産生ずる生理活性物質（例えば、ホルモ
ン様物質、成長因子等）の探索、新薬開発のスクリーニ
ング系、薬剤の安全性検査、臨床検査等の分野で広く用
いられている。

動物細胞の生育様式は接着非依存性細胞と接着依存性細
胞とに大別される。多くの動物細胞は後者の接着依存性
細胞で、足場となる培養基質が存在しないと生存するこ
とができない。細胞の足場となる培養基質として特殊処
理が施されたガラス製培養皿、プラスチック製培養皿等
が広く用いられているが、この培養系では細胞の増殖、
分化の誘導、形態形成及び長期培養等が困難であり、細
胞が本来備わっている機能を保持することができないケ
ースが多いことが報告されている。そこで、生体におけ
る細胞環境を模倣したコラーゲン基質を利用する培養法
が考えられた。この培養法は細胞をコラーゲン拳フィル
ム上やコラーゲン拳ゲルの上又は中で培養する方法であ
り、多くの細胞で増殖や機能保持などにおいて有効性が
確認されている。コラーゲン・フィルムやゲルを調製す
るために用いるコラーゲンは、動物の結合組織などがら
酸や酵素で可溶化したタイプＩコラーゲンである。この
コラーゲンを培養皿などにコーティングし、乾燥すれば
コラーゲン・フィルムが得られる。

また、適当なｐＨ，イオン強度、温度でゲル化を行うと
コラーゲン・ゲルが得られる。このようなコラーゲン・
ゲルを細胞培養に用いる場合、ゲル強度が高い程好適で
あることが知られている。

しかしながら、従来の基質用コラーゲンを用いてゲルを
調製した場合、強度が高くしかも製品ロフト間で強度が
一定のゲルを得るのは困難であり、培養データにバラツ
キを与えることが多いという問題がある。

本発明は上記の従来技術の欠点を解消するためになされ
たもので、本発明の目的はゲル強度が高く且つ製品ロッ
ト間でのゲル強度のバラツキの少ない細胞培養基質用コ
ラーゲンを提供することにある。

［課題を解決するための手段〕 本発明者らは、コラーゲン基質について鋭意研究した結
果、コラーゲン分子が分子間架橋で結合したコラーゲン
分子の会合体（以下、コラーゲン会合体という）がゲル
強度に影響していること及び酸やペプシンで可溶化され
たコラーゲンには、ある程度の量のコラーゲン会合体が
存在し、その量が多い程、ゲル強度が高くなることを見
い出した。また、コラーゲン会合体の量をコントロール
することにより、製品ロット間でゲル強度を一定にする
ことかできることを見い出した。本発明は上記の知見に
基づいてなされたもので、本発明の細胞培養基質用コラ
ーゲンは、可溶化コラーゲンから分画された、コラーゲ
ン会合体を多く含むコラーゲンからなるものであり、コ
ラーゲン会合体含量が２５重量％程度以上、より好まし
くは３５重量％以上のものが好適である。

上記の構成からなる本発明において用いられるコラーゲ
ン会合体を多く含むコラーゲンは、可溶性コラーゲンを
分画することにより得られる。ここで使用される可溶性
コラーゲンは慣用の方法で調製することができ、例えば
、牛、豚等の動物の結合組織（例えば、皮膚、鍵、骨等
）を細切し、水洗、塩洗、脱脂し、乾燥することにより
前処理原料を調製する。かくして調製された原料を、酸
性溶液（例えば、塩酸溶液、酢酸溶液等）で抽出する方
法又はタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン、プロナ
ーゼ等）で分解する方法を用いて、フラーゲン溶液を調
製し、次いで潰食塩水で塩析することにより、可溶性コ
ラーゲン（タイプＩコラーゲン）が得られる。

かくして調製された可溶性コラーゲンから、コラーゲン
会合体が多く含まれる両分を分画する方法としては、例
えば、０．５Ｍ　　ＮａＣｊｌを含む酸性溶液ＣｐＨ３
，０程度）に可溶性コラーゲンを添加し、可溶性画分と
不溶性画分とを分離することにより行われる。コラーゲ
ン会合体は当該不溶性画分に多く含まれるので、不溶性
画分を分離し、必要に応じて洗浄、乾燥することにより
コラーゲン会合体を多く含むコラーゲンを得ることがで
きる。このようにして得られたコラーゲン会合体を多く
含むコラーゲンは、通常、コラーゲン会合体を３０重量
％以上含有しており、好ましくはコラーゲン会合体含量
が３５重量％以上、より好ましくは４０重量％以上のも
のが使用される。

かくして調製されたコラーゲン会合体を多く含むコラー
ゲンは、粉末等の固体状態又は酸性溶液に溶解し、紫外
線滅菌等の慣用の滅菌法で滅菌された溶液状態で保存す
ることができ、保存条件としては低温で保存するのが好
ましい。

本発明の基質用コラーゲンは、かくして調製されたコラ
ーゲン会合体を多く含むコラーゲンからなるものである
。本発明の基質用コラーゲンは、従来の基質用コラーゲ
ンと同様にコラーゲン・ゲル上培養法、浮遊コラーゲン
・ゲル°培養法、コラーゲン・ゲル包埋培養法等の細胞
培養法の基質として利用することができる。また、これ
らの方法に用いられコラーゲン拳ゲルマトリックスの調
製も従来の基質用コラーゲンと同様な方法にて行うこと
ができる。例えば、下記（ω〜（Ｃ１に示される溶液を
用意し、滅菌した後、冷却しておく。

（ａ１本発明の基質用コラーゲンの酸性溶液（ｐＨ３程
度）； ＜ｂ＋細胞培養培地の高濃度溶液；及び（Ｃ１再構成用
アルカリ性緩衝液。

次いで、所望する培地濃度、ゲル強度、ｐＨ等に応じて
、（ａｌ〜（Ｃ）の溶液を冷却下で適宜混合し、得られ
た混合液を２５〜３７℃程度で、５〜４０分間程度加熱
してゲル化させることによりコラーゲン・ゲルが得られ
る。コラーゲン・ゲルの強度としては、レオメータ−で
０．５インチプランジャーを用いて、挿入速度２０ｍｍ
／分の条件で測定した場合に、約２００ｇ以上、好まし
くは２５０ｇ以上、より好ましくは３００ｇ以上のゲル
強度となるように調製するのがよい。

また、本発明の基質用コラーゲンは、プラスチック培養
皿等のコラーゲン・コート剤としても使用できる。例え
ば、希コラーゲン溶液を培養皿に注ぎ、薄く引き延ばし
た後に、コラーゲンの変性を防止するため比較的低温で
乾燥させることによりコラーゲン・フィルムが形成され
、コラーゲン・コート培養皿が調製できる。かかるコラ
ーゲン・コート培養器を用いた細胞培養によっても良好
な培養結果が得られる。

［実施例コ 以下、実施例及び試験例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。

実施例１ 新鮮な牛又は豚の皮又は尉を細切し、水洗、塩洗を行っ
た後、アセトンとエチルエーテルで脱脂し、乾燥させて
前処理原料を得た。この原料をｐＨ３，０の塩酸溶液（
１ス下、単に塩酸溶液という）中で、４℃、２日間攪拌
することにより酸可溶性コラーゲンを抽出した。この酸
可溶性コラーゲンにＮａＣ４１を０．７Ｍになるように
加え、沈澱物を遠心分離により回収し、た。さらに、こ
の沈澱物画分を０．５ＭＮａ、Ｃβを含む塩酸溶液中で
攪拌し、遠心分離により上溝と不溶性画分とに分画した
。不溶性画分の方にコラーゲン会合体が多く含まれる。

最後に不溶性画分を塩酸溶液に溶解し、コラーゲン会合
体を多く含む酸可溶性コラーゲンを得た。かくして得ら
れたコラーゲン中のコラーゲン会合体含量を、５ＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動及びデンシトメーターを用
いて測定したところ、コラーゲン会合体含量は４０重量
％であった。

試験例１ 実施例１で得られたコラーゲンを用いてゲルを調製し、
ゲル強度の測定及び当該ゲルを用いてラット血管内皮細
胞を培養した。その方法及び結果を以下に示す。なお、
調製されたゲルは透明性の高いゲルであった。

（１）ゲルの調製方法 下記■、■及び■の３種の溶液を調製し、各溶液を滅菌
した後、夫々を３：ｌ：ｌの割合で水冷下混合した。得
られた混合液を、プラスチックシャーレ（φ３５ｍ＋ｉ
）に分注し、均一な厚さになるようにした後、３７℃の
インキュベータで３０〜４０分間加熱してゲル化させ、
コラーゲン・ゲル（以下、本発明のゲルという）を調製
した。

■実施例１で得られたコラーゲン溶液（濃度３■／ｌ）
； ■２０％牛脂児血清、５０ｇｇ　／　１１粗内皮細胞成
長因子、５０１．Ｕ、ペニシリン、５０ｇｇ／ｌ！スト
レプトマイシン及び２．５μｇ／’１２アンホテリシン
Ｂを含有する１９９培地（以下、単に］９９培地という
）の１０倍濃度溶液；■０．０５Ｎ　　Ｎ　ａ　ＯＨ１
００１１１に対し、炭酸水素ナトリウム２．２ｇ及びＨ
ＥＰＥＳ４．７７ｇを溶解した溶液。

なお、比較例として、上記実施例１において、コラーゲ
ン会合体を多く含む不溶性画分を分離した後の上清（コ
ラーゲン会合体の少ないコラーゲン）を用いて同様な方
法でコラーゲン・ゲルを調製した（比較例］、）。また
、市販の基質用コラーゲンを用いて同様な方法でコラー
ゲン・ゲルを調製した（比較例２）。なお、比較例１及
び比較例２で使用したコラーゲンのコラーゲン会合体含
量を、前記実施例１に記載した方法で測定したところ、
夫々１０重量％及び２５重量％であった。

（２）コラーゲン・ゲル強度の測定 上記（１）で得られた３種のコラーゲン・ゲルにつイテ
、Ｌ、　、ｔ　メ−９−（ＮＲＭ−２０１０１−ＣＷ、
不動工業社製）で０．５インチプランジャーを用いて、
挿入速度２０ｍｎ／分の条件でゲル強度を測定した。そ
の結果を後記第１表に示す。

Ｇ）血管内皮細胞の培養試験 上記（１）で得られた３種のコラーゲン・ゲル上に、ラ
ット胸部大動脈より単離した血管内皮細胞をＩ　Ｘ　１
０４個／シャーレずつ播種した。次いで、前記の１９９
培地を用いて、Ｃｏ２インキュベータ内で、３７℃にて
７〜１０日間培養し、ランダム・エリアの生存細胞数を
計測した。

その結果を第１表に示す。なお、各コラーゲン・ゲルの
調製に使用したコラーゲン中のコラーゲン会合体含量（
重量％）を第１表に併せて示した。

第１表 ＊コ本発明のゲルの生存細胞数を１００とした。

第１表に示されるように、ゲル強度はコラーゲン会合体
含量と相関することが認められた。また、本発明のゲル
は比較例１及び２のゲルに比べて著しくゲル強度が高く
、更に細胞増殖率も高く、細胞培養用基質として極めて
優れていることが判明した。

また、上記（３）の細胞培養試験において、血管内皮細
胞に代えて、マウス線維芽細胞を用０て培養試験を行っ
たが、この細胞においても良好な増殖性が認められた。

実施例２ 実施例１と同様にして得られた前処理原料を、原料の乾
燥重量に対し、１／２５量のペプシンを含む塩酸溶液中
で２０℃、２日間攪拌し溶解した。

このようにして得られたペプシン可溶性コラーゲンにＮ
ａＣｊｌをＱ、７Ｍになるように加え、沈澱物を遠心分
離により回収した。さらに、この沈澱物画分を０．５Ｍ
　　ＮａＣｊ７を含む塩酸溶液中で攪拌し、遠心分離に
より上清と不溶性画分と１こ分画した。不溶性画分の方
にコラーゲン会合体が多く含まれる。最後に不溶性画分
を塩酸溶液に溶解し、コラーゲン会合体を多く含むペプ
シン可溶性コラーゲンを得た。コラーゲン会合体含量は
４０重量％であった。

かくして得られたコラーゲンを用いて、試験例１と同様
にしてゲル強度及び細胞増殖率を求めた。

その結果、実施例１で得られたコラーゲンと同様に優れ
たゲル強度を示し、また従来のペプシン可溶性の基質用
コラーゲンと比べて高い細胞増殖率を示した。

実施例３ 実施例１及び２の方法を用い、コラーゲン会合体を多く
含むコラーゲンを繰り返して調製し、比較したところ、
すべて強度が高く且つ一定のゲルが得られた。そして、
細胞を用いた実験でも高い増殖率及び再現性が認められ
た。

［発明の効果］ 以上のように、本発明の基質用コラーゲンによれば、ゲ
ル強度の高いコラーゲン・ゲルが得られ、その結果細胞
の増殖性が良くなり、細胞にとって好適な環境が得られ
る。また、コラーゲン会合体の量をコントロールするこ
とにより、ゲル強度が一定のゲルが得られ、培養データ
の再現性を向上できる。従って、本発明の基質用コラー
ゲンは、細胞培養において極めて有用である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 可溶化コラーゲンから分画された、コラーゲン分子の会
   合体を多く含むコラーゲンからなる細胞培養基質用コラ
   ーゲン。