JPH11164685A - 種々の基質の安定性および／または貯蔵寿命を増加させる方法 - Google Patents

種々の基質の安定性および／または貯蔵寿命を増加させる方法

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JPH11164685A
JPH11164685A JP10278645A JP27864598A JPH11164685A JP H11164685 A JPH11164685 A JP H11164685A JP 10278645 A JP10278645 A JP 10278645A JP 27864598 A JP27864598 A JP 27864598A JP H11164685 A JPH11164685 A JP H11164685A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、種々の細胞接着および他のコート
された基質の安定性および／または保存寿命を増加する
方法の提供。 【解決手段】 コートされた基質の保存寿命および／ま
たは安定性を増加させる方法は、（ａ）約０．００５Ｍ
〜約０．５Ｍの塩溶液中に約５μｇ／ｍｌ〜１０００μ
ｇ／ｍｌの細胞接着プロモーターを含有するコーティン
グ組成物で基質をコーティングする工程と、（ｂ）前記
基質上の前記コーティング組成物をインキュベートする
工程と、（Ｃ）前記コートされた基質を洗浄し、前記基
質にしっかりと結合していない余分の材料を取り除く工
程と、（ｄ）コーティング組成物をその上に有する基質
を乾燥する工程と、（ｅ）増加した安定性および／また
は保存寿命を有するコートされた基質を得る工程と、を
具える。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、例えば細胞接着コ
ートされた基質などの種々のコートされた基質の安定性
および／または保存寿命を増加させる方法に関連してお
り、この方法は基質の表面に塗布するための改善された
コーティング組成物を利用する工程を含んでいる。
【０００２】
【従来の技術】組織培養によって生体外で維持および増
殖するために組織から細胞を採取することは、医薬およ
び生化学研究における主な手段である。組織培養は、形
成された栄養環境において生物体（植物または動物）由
来の組織または細胞の代謝を増殖するおよび／または支
える技術または方法である。細胞はゆるやかな組織溶解
によって一度分離されると、生命機能を支えることので
きる栄養のある媒体中でインキュベートされる。いくつ
かの例外はあるが、細胞は通常の代謝機能、成長および
分裂を行うために基層に付着する必要がある。組織にお
いて、細胞成長用支持体を提供する基層は、基底膜もし
くはコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどから
なる間質性マトリックスのどちらかである。生体外にお
いては、ガラス、細孔性セルロースフィルターおよび他
のフィルターが代替品としてしばしば用いられるが、こ
の基層はほとんどの場合プラスチックである。組織培養
を経て生成される細胞の使用例は、（１）細胞の代謝、
細胞における感染性薬剤（すなわち、ウィルス、バクテ
リアなど）の影響、異なる細胞の種類（すなわち上皮細
胞、線維芽細胞、免疫担当細胞、胸腺細胞、血小板な
ど）の相互代謝、細胞性代謝における外因的要素の効
果、そして（生体外診断の）細胞の一般組成物の研究、
（２）特異的化合物、すなわちＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパ
ク質または他の細胞性成分の生成、および（３）皮膚、
角膜の移植片、脳、脈管移植片、および生体外受精用と
しての細胞の再移植である。
【０００３】近年、コラーゲン、ラミニン、フィブロネ
クチン、および他の細胞外マトリックス成分は、動物組
織から抽出され、精製され、そして、細胞接着プロモー
ターとして細胞および組織培養の研究者に販売される。
合成ポリ−Ｄ−リジンおよびポリ−Ｌ−リジンは、その
ような目的のために市販されている。その主な理由は、
生体外であるプラスチックまたはガラスのような基質
は、生物学的に不活性であり、適切な細胞または組織付
着に対し十分な基質接着を付与しないときがあるからで
ある。乏しい付着効率の説明としての特別な例は、主な
細胞の分離体、低密度で播種された細胞、トランスフェ
クトされた細胞、および生物反応器または中空管培養シ
ステムのような連続フローシステム内で播種された細胞
を含む。加えて、脈管の移植片用に用いられるいくつか
の細孔性フィルターまたはTeflon（登録商標）材料のよ
うな特定の基質は、低い表面エネルギーのため細胞付着
をしない。
【０００４】細胞接着プロモーターは、かなりな程度に
付着問題を助けてきたが、ある不適切さがまだ目に付
く。特に、ほとんどのこれらの要素は一度基質に付着す
ると、種々のそして不適切な保存寿命を有する。
【０００５】したがって本発明の一つの目的は、細胞接
着プロモーターおよび安定剤として有用なコーティング
組成物を提供し、組織培養または非組織培養材料および
基質への細胞の付着効率、接着の速度および／または強
度、成長、および特別機能を促進または増大させること
であり、ここで基質としては、プラスチック、ガラス、
金属、細孔性フィルター（セルロース、ナイロン、ガラ
スファイバー、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ
エチレンテレフタレート、および他の合成ポリマー材料
ならびに前述の合成ポリマー材料になされる改質から得
られる生成物を含む他の合成ならびに非合成材料）、天
然ポリマーまたは他の非合成材料、および組織または補
欠分子を移植する手順において用いてもよい合成または
異質プラスチック（alloplastic ）材料（例えば、人工
心臓およびポリテトラフルオロエチレンおよび関連の脈
管移植する材料）が挙げられる。
【０００６】本発明の第二の目的は、種々の基質つまり
上述したもののいくつかへの、タンパク質、ＤＮＡ、ホ
ルモン、および抗生物質のような他の生物学的に活性な
部位の付着効率、接着の速度および／または強度を促進
または増大させる細胞接着プロモーターとして有用な製
剤を提供することである。
【０００７】タンパク質および他の高分子のような生物
学的に活性な部位は、水溶液からの非共有吸着によっ
て、例えばポリスチレン表面のような基板表面上にコー
トされる。かかる表面上に吸着されるこれらの高分子の
量は、コーティングの条件（例えば、ｐＨ、温度、イオ
ン強度、イオン性組成物、反応物の濃度など）に依存す
る。表面上のコーティングの安定性は、同様のパラメー
ター、およびコーティングの乾燥および保存条件（例え
ば、湿度、温度、気体環境など）にも広がって依存す
る。
【０００８】発明者は、表面に強度にコートされたポリ
−Ｄ−リジンの安定性は、コーティング工程の間に用い
られた対の陰イオンに依存するとわかっている。ポリ−
Ｄ−リジンは中性のｐＨで非常に高く正に帯電してお
り、そのためコートされた表面上の対の陰イオンと複合
される。例えばクエン酸塩溶液または硫酸塩溶液中のポ
リ−Ｄ−リジンを含有するコーティング組成物（従って
対の陰イオンとしてクエン酸塩または硫酸塩を用いる）
のような本発明の改善されたコーティング組成物を種々
の基質表面に塗布することによって、これらの基質に増
加された保存寿命が得られるということがわかった。得
られた結果は、塩化物、酢酸塩、ＥＤＴＡ、炭酸塩、お
よびＰＢＳ（リン酸塩／塩化物の組み合わせ）溶液また
は水を用いる以前のコーティング組成物よりはるかに優
れている。
【０００９】ポリスチレン表面上にコートされたＰＤＬ
の１×ＰＢＳ溶液である本発明のＰＤＬ ＢＩＯＣＯＡ
Ｔ（登録商標）Cellware製品は、基質の形状（皿状、フ
ラスコ状、またはプレート状であるかどうか、さらにプ
レート上の穴のサイズおよび数など）、貯蔵温度、湿
度、パッケージングなどに依存した保存寿命を有する。
コートされた基質の保存寿命（すなわち安定性）は、本
発明の方法によって少なくとも２〜３倍に増幅される。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の方法は、上述
したような種々の基質および例えばプラスチック製品を
含む種々の基質をコートするために利用され、例えば４
℃以下の温度で冷蔵を必要とする代わりにかかる生成物
を室温で貯蔵することを可能にする。本発明の方法によ
って、例えばプラスチック製品のパッケージングに依存
しない安定性／増加した保存寿命を得る。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、細胞接着コー
トされた基質のような種々のコートされた基質の保存寿
命および／または安定性を増加させる方法に関してお
り、この方法は、基板表面に改善されたコーティング組
成物を塗布する工程を含み、このコーティング組成物
は、塩が例えばクエン酸塩または硫酸塩である塩溶液中
の細胞接着プロモーターからなる。
【００１２】本発明は、コートされた基質の保存寿命お
よび／または安定性を増加させる方法に関しており、こ
の方法は、（ａ）約０．００５Ｍ〜約０．５Ｍの塩溶液
中に５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの細胞接着プロ
モーターを含有するコーティング組成物で基質をコーテ
ィングする工程と、（ｂ）基質上のコーティング組成物
をインキュベートする工程と、（ｃ）前記コートされた
基質を洗浄し、基質にしっかりと結合していない余分な
材料を取り除く工程と、（ｄ）コーティング組成物を上
に有する基質を乾燥する工程と、（ｅ）増加した保存寿
命および／または安定性を有するコートされた基質を得
る工程と、を具える。
【００１３】本発明の方法から得られたコートされた基
質は、室温で増加された保存寿命および／または安定性
を有する。コートされた基質用の特別なパッケージング
は必要ない。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明は、細胞接着コートされた
基質のような種々のコートされた基質の保存寿命および
／または安定性を増加させる方法に関する。本発明の方
法の重要な態様は、基質表面に塗布され、改善された安
定性および増加した保存寿命を有する表面が得られる改
善されたコーティング組成物の調製および利用である。
このコーティング組成物は、塩溶液中の細胞接着プロモ
ーターを含有する。
【００１５】本発明は、コートされた基質の保存寿命お
よび／または安定性を増加させる方法に関しており、
（ａ）約０．００５Ｍ〜約０．５Ｍの塩溶液中に５μｇ
／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの細胞接着プロモーターを
含有するコーティング組成物で基質をコーティングする
工程と、（ｂ）基質上のコーティング組成物をインキュ
ベートする工程と、（ｃ）コートされた基質を洗浄し、
基質にしっかりと結合していない余分の材料を取り除く
工程と、（ｄ）コーティング組成物を上に有する基質を
乾燥する工程と、（ｅ）増加した保存寿命および／また
は安定性を有するコートされた基質を得る工程と、を具
える。
【００１６】基質は、基質のｃｍ2 あたり、約５μｇ／
ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌの細胞接着プロモーターを
含む約５０μｌ〜約５００μｌの前述の組成物でコート
される。
【００１７】好ましい具体例において、コーティング組
成物は、塩溶液中の細胞接着プロモーターとしてポリ−
Ｄ−リジンからなる。好ましくは、塩はクエン酸塩また
は硫酸塩である。もう一つの具体例において、細胞接着
プロモーターは、ポリ−Ｌ−リジン、コラーゲン、ラミ
ニン、フィブロネクチン、ポリオルニチン（ポリアミノ
酸）または他の細胞接着基質またはそれらの混合物から
選択される。ここでの塩溶液の好ましい具体例は、以下
にさらに記載するようにクエン酸塩溶液または硫酸塩溶
液であるが、本発明に用いられる塩溶液は、本発明の目
的を達成できるいかなる塩溶液でもよく、ホウ酸；コハ
ク酸、酒石酸、およびグルタル酸などのジカルボン酸の
塩；両性イオンのスルホン酸塩；およびＭＥＳ、ビス−
トリス、ＭＯＰＳ、およびＨＥＰＥＳのような有機緩衝
液を含む。
【００１８】慣用の細胞培養研究のための基質は、プラ
スチック、ガラス、および細孔性フィルター（例えば、
セルロース、ナイロン、ガラスファイバー、ポリエステ
ル、ポリカーボネート）を含む。バッチもしくは連続細
胞培養、または一般的技術に用いられる生物反応器用の
基質は、中空繊維管または微細担体ビーズを含む。脈管
または骨移植片用の基質は、ポリテトラフルオロエチレ
ン（Teflon（登録商標））、セラミックおよび関連のポ
リマー材料のような材料を含む。これらのほとんどの表
面は、負の有効電荷を運び、したがって正の有効電荷を
有する材料にしっかりと結合する。
【００１９】真核生物の細胞の成長および通常の代謝
は、基質への付着を必要としている。慣用的に、細胞培
養はプラスチック基質を利用し、そしてわずかではある
が細胞の付着および増殖のためにガラスおよび細孔性フ
ィルターを利用する。より最近では、生理学的基質（コ
ラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ポリ−Ｄ−リ
ジンおよびポリ−Ｌ−リジン）は、プラスチック（ポリ
スチレン）上にコートされる目的で用いられ、トランス
フェクトされた細胞、形質変換された細胞、主な細胞分
離体、または低い播種密度で播種された細胞の培養に固
有の問題を避ける。
【００２０】本発明で考えられる好ましい基質形状は、
多穴プレート（２４穴をもつおよび９６穴をもつプレー
トなど）、皿（ペトリ皿など）、培養フラスコなどを含
む。
【００２１】本発明の改善されたコーティング組成物で
の基質のコーティングおよび基質への付着は、一般に、
以下のように行われる。所望の最終濃度に応じて、約
０．５〜２．０ｍｌのコーティング組成物を６穴をもつ
多穴プレート内の１つの穴に塗布し、約０．２５〜１．
０ｍｌを２４穴をもつ多穴プレート内の１つの穴に塗布
し、約５０μｌ〜１００μｌを９６穴をもつプレート中
の１つの穴に塗布する。さらに、例えば、皿において
は、約０．５〜２．０ｍｌを３５ｍｍ径の皿に塗布し、
０．５〜４．０ｍｌを６０ｍｍ径の皿に塗布し、２．０
〜１２．０ｍｌを１００ｍｍ径の皿に塗布する。
【００２２】塗布後、コーティング組成物をインキュベ
ートして、基質の表面に細胞接着物質を吸着させ、残り
のコーティング組成物を取り除き、コートされた基質表
面を洗浄して余分な材料を取り除き、乾燥し、最終的に
増加した保存寿命を有する安定なコートされた基質を得
る。
【００２３】コートされた基質表面を、例えば水、エタ
ノールまたは生物的に相溶な滅菌媒体であるいかなる媒
体でも洗浄できる。
【００２４】もう一つの具体例において、本発明は、生
体外細胞培養システムに関しており、この生体外細胞シ
ステムは、基質と、その上の約０．００５Ｍ〜約０．５
Ｍの塩溶液中に約５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの
接着プロモーターを含有するコーティング組成物のコー
ティングとを含有する。この基質、コーティング組成
物、接着プロモーター、および塩溶液は、先に定義した
いずれでもよい。
【００２５】以下の実施例は、説明のためであって、本
発明の形態を制限するものではない。
【００２６】実施例１ ラットの小脳顆粒球分析を、事前に５０℃で飽和湿度、
および５０℃で周囲湿度にて促進された安定性条件下で
保存された９６穴を有するコートされた多穴プレートに
おいて行われ、対照標準として４℃で保持されたプレー
トをテストした。
【００２７】分析を、以下のコーティング組成物でそれ
ぞれコートされた３個の別個の多穴プレートにおいて行
った：（１）ポリ−Ｄ−リジンのクエン酸塩溶液でコー
トされた多穴プレート、（２）ポリ−Ｄ−リジンの硫酸
塩溶液でコートされた多穴プレート、（３）ポリ−Ｄ−
リジンのＰＢＳ溶液でコートされた多穴プレート。
【００２８】これらのプレートを以下のようにして製造
した。
【００２９】（１）ポリ−Ｄ−リジンをｐＨ８．０に調
整されたた５ｍＭトリスベースを有する０．１Ｍのクエ
ン酸ナトリウム溶液中に溶解し、最終濃度５０μｇ／ｍ
ｌにした。このコーティング組成物を約８０μｌ／穴で
９６穴を有するプレートに加えた。このコーティング組
成物を約１時間にわたってプレートの表面に吸着させる
ようにした。残りのコーティング組成物を活発にデカン
トした。次いで、前述の（コーティング組成物の）量の
水を二回で穴に加え、取り除いた。この工程を繰り返し
た。次いで、このプレートを、室温で一晩減圧オーブン
中で乾燥させた。次いでプレートを紫外線トンネルを通
過させた。
【００３０】（２）ポリ−Ｄ−リジンを、ｐＨ８に調整
された５ｍＭトリスを有する１００ｍＭの硫酸塩溶液に
溶解し、最終濃度を５０μｌ／ｍｌにした。
【００３１】（１）と同じコーティング工程を（２）に
おいて行った。
【００３２】（３）ポリ−Ｄ−リジンを、ｐＨ８．０に
調整した１×ＰＢＳ溶液に溶解し、最終濃度を５０μｇ
／ｍｌにした。（１×ＰＢＳ＝２．７ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 ；１３７ｍＭ ＮａＣｌ；
３．７ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）（１）および（２）と同
じコーティング工程を（３）において行った。
【００３３】コーティング組成物の質を評価するための
ラットの小脳顆粒球（ＲＣＧ）分析を、ＲＣＧ細胞の初
代培養の細胞付着を基にして、以下のように行った。
【００３４】ラットの小脳顆粒球の付着分析 １．０ 細胞単離 ＲＣＧを以下のようにしてラットの小脳から分離した。
【００３５】この手順は、６（および１２）対のラット
の小脳からの細胞の単離を記載する。６（および１２）
対より少ないまたはより多い小脳を用いる場合、試薬の
量を比例して調節した。
【００３６】１．１ 材料 １．１．１ 生後６〜１２日の仔ラットの小脳、６対
（１２対） １．１．２ トリパンブルー、Ｐ／Ｎ ０１−０６０９
０ １．１．３ ０．２ミクロンのナルゲン（Nalgene ）減
圧濾過器、Ｐ／Ｎ ０１−０００４８ １．１．４ Millex GV フィルター 、Ｐ／Ｎ ０１
−０００５２ １．１．５ カレントロット（current lot ）溶液１
（ＨＥＰＥＳ［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ′−２−エタンスルホン酸］を含む培養媒体） １．１．６ トリシン原液、１０ｍｇ／ｍｌ １．１．７ ＤＮＡ分解酵素原液 １．１．８ 大豆トリプシン阻害剤原液、３．５ｍｇ／
ｍｌ １．１．９ ０．５Ｍ ＭｇＳＯ4 原液 １．１．１０ ０．０５Ｍ ＣａＣｌ2 原液 １．１．１１ ラットの小脳顆粒細胞成長培養液
【００３７】１．２ 装置 １．２．１ 倒立顕微鏡、装置ＩＤ Ｃ−０００４３ １．２．２ 血球計数器 １．２．３ 卓上遠心機、装置ＩＤ Ｃ−００４６８ま
たはＣ−０００１２ １．２．４ 層流フード、装置ＩＤ Ｃ−０００１８ま
たはＣ−０００１９ １．２．５ インキュベーター、５％ＣＯ2 、３７℃ 装置ＩＤ Ｃ−０００１６およびＣ−０００４６５
【００３８】１．３ 供給物 １．３．１ 遠心管、１５ｍｌ、Ｐ／Ｎ ０１−０００
１８ １．３．２ 遠心管、５０ｍｌ、Ｐ／Ｎ ０１−０００
１３ １．３．３ １ｍｌ容ピペット、Ｐ／Ｎ ０１−０００
４２ １．３．４ ５ｍｌ容ピペット、Ｐ／Ｎ ０１−０００
４４ １．３．５ １０ｍｌ容ピペット、Ｐ／Ｎ ０１−００
０４１ １．３．６ ２５ｍｌ容ピペット、Ｐ／Ｎ ０１−００
０４０ １．３．７ １００ｍｍ径ペトリ皿、Ｐ／Ｎ ０１−０
３００３ １．３．８ 細胞スクレーパ、使い捨て、CoStar Ｃ／
Ｎ ３０１０ １．３．９ リットル容無菌ボトル １．３．１０ 注射器 必要とされた注射器の数
【００３９】
【表１】
【００４０】１．４ 溶液の調製 注：かっこ内における全ての値および情報は、１２対の
仔ラットの小脳の調製に適用する。
【００４１】注：全ての溶液を、製造日時の２４時間以
内で用いた。
【００４２】１．４．１ 全ての溶液を層流フードの下
で調製した。 １．４．２ 以下の溶液を３７℃の水浴内で溶かし、必
要になるまで４℃の冷蔵庫内で保存した。
【００４３】
【表２】
【００４４】１．４．３ 溶液２の調製（トリプシン溶
液） １．４．３．１ ３５ｍｌの溶液１を２つの無菌５０ｍ
ｌ容遠心管のそれぞれに移した。 １．４．３．２ ０．８７５ｍｌのトリプシン原液を各
５０ｍｌ容遠心管に加えた。 １．４．３．３ 該管を蓋締めし、逆転するまたは回旋
することによって混合した。 １．４．３．４ ６０ｍｌ容注射器およびMillex GV
０．２２μｍフィルターを、各管の溶液を新たな無菌５
０ｍｌ容遠心管に無菌濾過するのに用いた。 １．４．３．５ 得られる溶液２の入った管を後で用い
るために保存した。
【００４５】１．４．４ 溶液３の調製（ＤＮＡ分解酵
素および大豆トリプシン阻害剤（ＳＴＩ）溶液） １．４．４．１ ２０ｍｌの溶液１を２つの無菌５０ｍ
ｌ容遠心管にそれぞれ移した。 １．４．４．２ ０．９５ｍｌのＤＮＡ分解酵素原液を
各管に加えた。 １．４．４．３ ０．９４ｍｌのＳＴＩ原液を各管に加
えた。 １．４．４．４ ２２μｌの０．５Ｍ ＭｇＳＯ4 原液
を各管に加えた。 １．４．４．５ 各管を蓋締めし、逆転するまたは回旋
することによって混合した。 １．４．４．６ ３０ｍｌ容注射器およびMillex GV
０．２２μｍのフィルターを、管の溶液を新たな１５ｍ
ｌ容遠心管に無菌濾過するのに用いた。 １．４．４．７ 得られる溶液３の入った管を後で用い
るために保存した。
【００４６】１．４．５ 溶液４の調製（ＤＮＡ分解酵
素およびＳＴＩ溶液） １．４．５．１ ５ｍｌの溶液１を２つの無菌１５ｍｌ
容遠心管にそれぞれ移した。 １．４．５．２ ０．５７ｍｌのＤＮＡ分解酵素原液を
各管に加えた。 １．４．５．３ ０．７３４ｍｌのＳＴＩ原液を各管に
加えた。 １．４．５．４ ３０μｌの０．５Ｍ ＭｇＳＯ4 原液
を各管に加えた。 １．４．５．５ 各管を蓋締めし、逆転するまたは回旋
することによって混合した。 １．４．５．６ １０ｍｌ容注射器およびMillex GV
０．２２μｍフィルターを、管の溶液を新たな５０ｍｌ
容遠心管に無菌濾過するのに用いた。 １．４．５．７ 得られる溶液４の入った管を後で用い
るために保存した。
【００４７】１．４．６ 溶液５の調製（ＭｇＳＯ4 ／
ＣａＣｌ2 溶液） １．４．６．１ ２４ｍｌの溶液１を２つの無菌５０ｍ
ｌ容遠心管にそれぞれ移した。 １．４．６．２ ６２μｌの０．５Ｍ ＭｇＳＯ4 原液
を各管に加えた。 １．４．６．３ ４８μｌの０．０５Ｍ ＣａＣｌ2 原
液を各管に加えた。 １．４．６．４ 各管を蓋締めし、逆転するまたは回旋
することによって混合した。 １．４．６．５ ３０ｍｌ容注射器およびMillex GV
０．２２μｍのフィルターを、管の溶液を新たな５０ｍ
ｌ容遠心管に無菌濾過するのに用いた。 １．４．６．６ 得られる溶液５の入った管を後で用い
るために保存した。
【００４８】１．５ラットの脳の小脳顆粒細胞の調製 １．５．１ 細胞分散体（二つの調製） 注：ラットの小脳を調製した。これらは、氷上にある
が、冷凍されていない。 １．５．１．１ 無菌の使い捨て細胞スクレーパを１０
０ｍｍ径ペトリ皿に６対の小脳を移すのに用いた。 １．５．１．２ 組織をしごきストローク（wiping str
okes）を設けた細胞スクレーパを用いて、スクレーパと
皿の表面の間の組織を閉じこめながら穏やかにつぶた。 １．５．１．３ 組織を均質のペーストが得られるまで
（２〜３分）スクレーパを用いた作業をした。 １．５．１．４ １０ｍｌの溶液１を、細胞スクレーパ
の先端に交わる溶液１を射出して粘着性のある小脳組織
を取り除きながら、皿に加えた。 １．５．１．５ 細胞を、ピペットで懸濁液を吸引し射
出すことによって懸濁させた。 １．５．１．６ 懸濁液を吸引し、５０ｍｌ容の無菌遠
心管に移した。 １．５．１．７ 工程１．５．１．４〜１．５．１．６
をペトリ皿から管に残りの組織を移すようにもう２回繰
り返した。 １．５．１．８ この管を遠心分離用に保留した。 １．５．１．９ １２対のラットの小脳を調製するとき
は、残りの６対の小脳を１００ｍｍ径ペトリ皿に移し、
工程１．５．１．２〜１．５．１．８をこれらの小脳に
対して繰り返した。 １．５．１．１０ ペトリ皿および初めに小脳を収容し
た容器を廃棄した。 １．５．１．１１ 管を室温で５分間にわたて１０００
ｒｐｍで遠心分離した。 １．５．１．１２ 上清を吸引し、廃棄した。
【００４９】１．５．２トリプシン処理およびＤＮＡ分
解酵素 １．５．２．１ ３０ｍｌの溶液２を工程１．５．１で
得られた細胞ペレットに加えた。 １．５．２．２ 混合物を、２５ｍｌピペットを用いて
細胞懸濁液を吸引し射出することによって分散させた。 １．５．２．３ 管を３７℃のＨ2 Ｏ浴で正確に１５分
間にわってインキュベートした。 １．５．２．４ インキュベートしている管を２〜３分
ごとに手で管を回旋させて攪拌した。 １．５．２．５ この管を浴から取り出した。 １．５．２．６ 混合物に存在する凝集塊またはゼラチ
ン状の塊を、２５容ピペットを用いて細胞懸濁液を２〜
３回、吸引し射出することによって混合物中に分散させ
た。 １．５．２．７ 工程１．５．２．６を５ｍｌ容ピペッ
トを用いて繰り返した。 １．５．２．８ 凝集塊またはゼラチン状の塊が混合物
中に存在しなくなったところで、混合物を、５ｍｌ容ピ
ペットで細胞懸濁液を２〜３回、吸引し射出することに
よって分散させた。 １．５．２．９ １５ｍｌの溶液３を管に加え、３０〜
６０秒間にわたって手で回旋させた。 １．５．２．１０ 管を３７℃のＨ2 Ｏ浴で正確に１５
分間にわたってインキュベートした。 １．５．２．１１ インキュベートしている管を２〜３
分毎に手で管を回旋することによって攪拌し、粘性を減
少させた。 １．５．２．１２ 管を浴から取り出した。 １．５．２．１３ 管を室温で５分間にわたって１００
０ｒｍｐで遠心分離させた。 １．５．２．１４ 上清を吸引し、廃棄した。
【００５０】１．５．３ 単細胞懸濁液 １．５．３．１ ５ｍｌ容ピペットを用いて４ｍｌの溶
液４を工程１．５．２で得られた細胞ペレットに加え
た。 １．５．３．２ 混合物を、５ｍｌ容ピペットを用いて
細胞懸濁液を４０回、吸引し射出して懸濁させた。過度
の泡が発生することを避けるため、混合物を遠心管の壁
をつたわらせて入れた。 １．５．３．３ １２対のラットの小脳を調製する場合
は、両方の管の細胞を単一の５０ｍｌ容遠心管内にため
た。 １．５．３．４ １０ｍｌの溶液５を各細胞懸濁液に加
えた。 １．５．３．５ 混合物を、管の内容物を５〜１０回、
吸引し射出することによって分散させた。 １．５．３．６ 懸濁液を正確に５分間にわたって静置
させておいた。 １．５．３．７ 大きな沈降した凝集塊が発生したら、
１０ｍｌ容ピペットを用いて凝集塊の上の細胞懸濁液を
吸引し、細胞懸濁液を新たな無菌５０ｍｌ容遠心管に移
し、凝集塊を廃棄した。 １．５．３．８ １０ｍｌの溶液５を各吸引されれた細
胞懸濁液に加えた。 １．５．３．９ 管の混合物を手で管を回旋することに
よって攪拌した。 １．５．３．１０ 管を室温にて１００ｒｐｍで５分間
にわたって遠心分離した。 １．５．３．１１ 上清を吸引し、廃棄した。
【００５１】１．６ 細胞数および生存度 １．６．１ 細胞ペレットを２０ｍｌの成長培養液中で
再懸濁させた。 １．６．１．１ ５ｍｌ容ピペットを用いて５ｍｌの成
長培養液を細胞ペレットに加えた。 １．６．１．２ 混合物を５ｍｌ容ピペットを用いて細
胞懸濁液を吸引し射出して分散させた。 １．６．１．３ １５ｍｌの成長培養液を細胞分散液に
加えた。 １．６．１．４ 混合物を、細胞懸濁液を吸引し射出す
ることによって分散させた。
【００５２】１．６．２ 細胞の１：１０希釈液を、 １．６．２．１ ０．１ｍｌの細胞懸濁液を無菌の５ｍ
ｌ遠心管にピペットで加える工程と、 １．６．２．２ ０．４ｍｌの成長培養液を管に加える
工程と、 １．６．２．３ ０．５ｍｌのトリパンブルーを管に加
える工程とから調製した。
【００５３】１．６．３ 管の内容物を手でゆっくりを
回旋させて混合した。
【００５４】１．６．４ ０．１ｍｌの希釈液を細胞カ
ウント用に取り除いた。
【００５５】１．６．５ １：１０希釈液を、血球計数
器が満たされるまで血球計数器に注入した。
【００５６】１．６．６ ３×３格子のますめを決定
し、生存可能の細胞をその格子の４つの角のますめにお
いて数えた。
【００５７】注：生存可能の細胞は、白くて屈折してみ
える。生存不可能の細胞は、青みを帯びているようであ
る。
【００５８】１．６．７ 各四角形内の細胞の数を記録
し、その平均を、総細胞数を４で割って決定した。
【００５９】１．７ 希釈度の計算 １．７．１ 平均細胞／ｍｌの溶液を、工程１．６．７
で得られた数を採用し１０5 をかけることによって計算
した。 １．７．２ コートされたプレートをテストするために
必要な細胞懸濁液の総量を、特別容量（容量は遠心分離
によって変わる）をプレートの数にかけて計算した。 １．７．３ １．０×１０6 細胞／ｍｌ溶液を作るため
に必要な基の細胞懸濁液の量を、総量（工程１．７．
２）を１×１０6 倍にし、この結果を平均細胞／ｍｌ
（工程１．７．１）で割って計算した。 １．７．４ 総量を工程１．７．２で計算された量に導
くための成長培養液の量を、総量（工程１．７．２）か
ら細胞の量（工程１．７．３）を引くことによって計算
した。
【００６０】１．８ 播種／プレーティング用の細胞懸
濁液を、 １．８．１ 工程１．７．３で計算された元の細胞懸濁
液から細胞の量をピペットを用いて移す工程と、 １．８．２ 工程１．７．２で計算された量を収容する
のに十分の大きさのＴ字型フラスコにこの量を加える工
程と、 １．８．３ Ｔ字型フラスコに工程１．７．４で計算さ
れた量の成長培養液を加える工程と、 １．８．４ 手で緩やかにＴ字型フラスコを回旋し、懸
濁液を混合する工程と、から製造した。
【００６１】２．０ 分析手順−９６穴プレート
【００６２】２．１ 細胞懸濁液を１．０×１０6 細胞
／ｍｌに調整した。
【００６３】２．２ ０．１ｍｌ細胞／穴をＣおよびＤ
列に播種した。（１２列あり、ＣとＤを任意に取り出し
た。）
【００６４】２．３ インキュベートを２２〜２６時間
にわたって、３７℃にて５％ＣＯ2 平衡空気、１００％
湿度で行った。
【００６５】２．４ 穴を、手がかりとして参照分析検
量写真を用いる分析において少なくとも２つの別個の技
術によって各列を評価した。
【００６６】２．５ データを記録し、平均をとり、グ
ラフ化した。
【００６７】２．６ 有効分析のため、正の対照標準
は、点数が２．０以上であり、負の対照標準は、点数が
０を有する。点数は１〜３のスケールにおけるものであ
る。
【００６８】ＲＣＧ分析の結果は、クエン酸塩溶液を有
するコーティング組成物を利用したプレートおよび硫酸
塩溶液を有するコーティング組成物を利用したプレート
の増加した安定性を示した。
【００６９】実施例２ この実施例において、同じＲＣＧ分析が、予め５０℃で
飽和湿度、および５０℃で周囲湿度にて保持した２４穴
を有するコートされた多穴プレートにも行われ、対照標
準として４℃にて保持されたプレートをテストした。２
４穴を有する３つの多穴プレートを、（１）ポリ−Ｄ−
リジンのクエン酸塩溶液、（２）ポリ−Ｄ−リジンの硫
酸塩溶液、または（３）ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）の
ＰＢＳ溶液のいずれかでコートした。
【００７０】コーティング組成物およびコートされたプ
レートは、実施例１に記載した方法で製造した。
【００７１】ＲＣＧ分析を、工程２．２において０．５
ｍｌの細胞を２４穴プレートの穴当たりに塗布したこと
を除いて、実施例１と同様に行った。
【００７２】このＲＣＧ分析の結果はクエン酸塩溶液を
含むコーティング組成物または硫酸塩溶液を含むコーテ
ィング組成物を有するプレートの増加した安定性を示し
ている。
【００７３】実施例３ この実施例では、ＲＣＧ分析を、予め５０℃で飽和湿
度、および５０℃で周囲湿度にて保持された９６穴プレ
ートに１２種類のコーティング組成物を用いて行われ、
対照標準として４℃にて保持されたプレートをテストし
た。
【００７４】この実施例に用いられた多穴（９６穴）プ
レートを、（１）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５
ｍＭトリスを含む０．１Ｍ ＰＯ4溶液、（２）ｐＨ
８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．
１Ｍ酢酸塩溶液、（３）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤ
Ｌの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液、
（４）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリス
を含む０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液、（５）ｐＨ８．０に調
整された、ＰＤＬの５ｍＭトリス溶液、（６）ｐＨ８．
０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ
炭酸塩溶液、（７）ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの
５ｍＭトリスを含む０．１Ｍ クエン酸塩溶液、（８）
ｐＨ８．０に調整された、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む
０．１Ｍ 硫酸塩溶液、（９）ｐＨ８．０に調整され
た、ＰＤＬの５ｍＭトリスを含む１×ＰＢＳ溶液、（１
０）１×ＰＢＳおよび１２．５％のＥｔＯＨ中のＰＤ
Ｌ、（１１）１×ＰＢＳおよび２５％ＥｔＯＨ中のＰＤ
Ｌ、または（１２）１×ＰＢＳおよび５０％ＥｔＯＨ中
のＰＤＬでコートした。
【００７５】各溶液において、ポリ−Ｄ−リジンを最終
濃度５０μｇ／ｍｌになるように溶液中に溶解した。
【００７６】コーティング工程を、ピペッティングを手
で行うのではなく自動化された機械で行うことを除いて
実施例１および２と同様に行った。
【００７７】ＲＣＧ分析を実施例１に記載したように行
った。
【００７８】第７日から第５６日のこのＲＣＧ分析の結
果は、プレート上の１２のコートされた組成物のそれぞ
れの安定性／保存寿命を示した。このクエン酸塩溶液を
有するコーティング組成物および硫酸塩溶液を有するコ
ーティング組成物の増加した保存寿命は、この分析によ
って明らかに示された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｌ 31/00 Ａ６１Ｌ 31/00 Ｚ (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 フランク ジェイ． マヌザ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 バ ーリントン コルコラン ロード ２ (72)発明者 スティーブン アール． イルスリー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ボ ストン シャーマー ロード ７ (72)発明者 アーサー マイルズ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ア クトン グレート エルム ウエイ 401

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 コートされた基質の保存寿命および／ま
    たは安定性を増加させる方法であって、 （ａ）約０．００５Ｍ〜約０．５Ｍの塩溶液中に約５μ
    ｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの細胞接着プロモーター
    を含有するコーティング組成物で基質をコーティングす
    る工程と、 （ｂ）前記基質上の前記コーティング組成物をインキュ
    ベートする工程と、 （ｃ）前記コートされた基質を洗浄し、前記基質にしっ
    かりと結合していない余分の材料を取り除く工程と、 （ｄ）コーティング組成物をその上に有する基質を乾燥
    する工程と、 （ｅ）増加した安定性および／または保存寿命を有する
    コートされた基質を得る工程と、を具えることを特徴と
    する方法。
  2. 【請求項２】 前記細胞接着プロモーターが、ポリ−Ｄ
    −リジン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリオルニチン、フィブ
    ロネクチン、ラミニン、コラーゲン、またはこれらの混
    合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記塩が、クエン酸塩または硫酸塩であ
    るか、またはホウ酸、ジカルボン酸の塩および両性イオ
    ンのスルホン酸の塩よりなる群から選択され、前記塩溶
    液がＭＥＳ、ビス−トリス、ＭＯＰＳ、またはＨＥＰＥ
    Ｓである有機緩衝液であることを特徴とする請求項１に
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記基質が、基質のｃｍ2 あたり、約５
    μｇ／ｍｌ〜約１０００μｍ／ｍｌの前記細胞接着プロ
    モーターを含む約５０μｌ〜約５００μｌの前記組成物
    でコートされていることを特徴とする請求項１に記載の
    方法。
  5. 【請求項５】 前記コーティング組成物が、生物学的に
    相溶性の滅菌用媒体を用いて前記基質を洗浄することに
    よって前記基質上で滅菌されることを特徴とする請求項
    １に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記基質が、合成ポリマー材料、ガラ
    ス、金属、および細孔性フィルターよりなる群から選択
    されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 生体外の細胞培養システムであって、基
    質と、その上の約０．００５Ｍ〜約０．５Ｍの塩溶液中
    に約５μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌの細胞接着プロ
    モーターを含有するコーティング組成物のコーティング
    と、を含有することを特徴とする細胞培養システム。
  8. 【請求項８】 前記細胞接着プロモーターが、ポリ−Ｄ
    −リジン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリオルニチン、フィブ
    ロネクチン、ラミニン、コラーゲン、またはこれらの混
    合物であることを特徴とする請求項７に記載の細胞培養
    システム。
  9. 【請求項９】 前記塩が、クエン酸塩または硫酸塩であ
    るか、またはホウ酸、ジカルボン酸の塩、および両性イ
    オンのスルホン酸の塩よりなる群から選択され、前記塩
    溶液が、ＭＥＳ、ビス−トリス、ＭＯＰＳ、またはＨＥ
    ＰＥＳである有機緩衝液であり、前記基質が、合成ポリ
    マー材料、ガラス、金属、および細孔性フィルターより
    なる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載
    の細胞培養システム。
  10. 【請求項１０】 前記基質が、基質のｃｍ2 当たり、約
    ５μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌの前記細胞接着プ
    ロモーターを含む約５０μｌ〜約５００μｌの前記組成
    物でコートされることを特徴とする請求項７に記載の細
    胞培養システム。
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