JPH11164685A - 種々の基質の安定性および/または貯蔵寿命を増加させる方法 - Google Patents
種々の基質の安定性および/または貯蔵寿命を増加させる方法Info
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- JPH11164685A JPH11164685A JP10278645A JP27864598A JPH11164685A JP H11164685 A JPH11164685 A JP H11164685A JP 10278645 A JP10278645 A JP 10278645A JP 27864598 A JP27864598 A JP 27864598A JP H11164685 A JPH11164685 A JP H11164685A
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Abstract
された基質の安定性および/または保存寿命を増加する
方法の提供。 【解決手段】 コートされた基質の保存寿命および/ま
たは安定性を増加させる方法は、(a)約0.005M
〜約0.5Mの塩溶液中に約5μg/ml〜1000μ
g/mlの細胞接着プロモーターを含有するコーティン
グ組成物で基質をコーティングする工程と、(b)前記
基質上の前記コーティング組成物をインキュベートする
工程と、(C)前記コートされた基質を洗浄し、前記基
質にしっかりと結合していない余分の材料を取り除く工
程と、(d)コーティング組成物をその上に有する基質
を乾燥する工程と、(e)増加した安定性および/また
は保存寿命を有するコートされた基質を得る工程と、を
具える。
Description
ートされた基質などの種々のコートされた基質の安定性
および/または保存寿命を増加させる方法に関連してお
り、この方法は基質の表面に塗布するための改善された
コーティング組成物を利用する工程を含んでいる。
殖するために組織から細胞を採取することは、医薬およ
び生化学研究における主な手段である。組織培養は、形
成された栄養環境において生物体(植物または動物)由
来の組織または細胞の代謝を増殖するおよび/または支
える技術または方法である。細胞はゆるやかな組織溶解
によって一度分離されると、生命機能を支えることので
きる栄養のある媒体中でインキュベートされる。いくつ
かの例外はあるが、細胞は通常の代謝機能、成長および
分裂を行うために基層に付着する必要がある。組織にお
いて、細胞成長用支持体を提供する基層は、基底膜もし
くはコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどから
なる間質性マトリックスのどちらかである。生体外にお
いては、ガラス、細孔性セルロースフィルターおよび他
のフィルターが代替品としてしばしば用いられるが、こ
の基層はほとんどの場合プラスチックである。組織培養
を経て生成される細胞の使用例は、(1)細胞の代謝、
細胞における感染性薬剤(すなわち、ウィルス、バクテ
リアなど)の影響、異なる細胞の種類(すなわち上皮細
胞、線維芽細胞、免疫担当細胞、胸腺細胞、血小板な
ど)の相互代謝、細胞性代謝における外因的要素の効
果、そして(生体外診断の)細胞の一般組成物の研究、
(2)特異的化合物、すなわちDNA、RNA、タンパ
ク質または他の細胞性成分の生成、および(3)皮膚、
角膜の移植片、脳、脈管移植片、および生体外受精用と
しての細胞の再移植である。
クチン、および他の細胞外マトリックス成分は、動物組
織から抽出され、精製され、そして、細胞接着プロモー
ターとして細胞および組織培養の研究者に販売される。
合成ポリ−D−リジンおよびポリ−L−リジンは、その
ような目的のために市販されている。その主な理由は、
生体外であるプラスチックまたはガラスのような基質
は、生物学的に不活性であり、適切な細胞または組織付
着に対し十分な基質接着を付与しないときがあるからで
ある。乏しい付着効率の説明としての特別な例は、主な
細胞の分離体、低密度で播種された細胞、トランスフェ
クトされた細胞、および生物反応器または中空管培養シ
ステムのような連続フローシステム内で播種された細胞
を含む。加えて、脈管の移植片用に用いられるいくつか
の細孔性フィルターまたはTeflon(登録商標)材料のよ
うな特定の基質は、低い表面エネルギーのため細胞付着
をしない。
付着問題を助けてきたが、ある不適切さがまだ目に付
く。特に、ほとんどのこれらの要素は一度基質に付着す
ると、種々のそして不適切な保存寿命を有する。
着プロモーターおよび安定剤として有用なコーティング
組成物を提供し、組織培養または非組織培養材料および
基質への細胞の付着効率、接着の速度および/または強
度、成長、および特別機能を促進または増大させること
であり、ここで基質としては、プラスチック、ガラス、
金属、細孔性フィルター(セルロース、ナイロン、ガラ
スファイバー、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ
エチレンテレフタレート、および他の合成ポリマー材料
ならびに前述の合成ポリマー材料になされる改質から得
られる生成物を含む他の合成ならびに非合成材料)、天
然ポリマーまたは他の非合成材料、および組織または補
欠分子を移植する手順において用いてもよい合成または
異質プラスチック(alloplastic )材料(例えば、人工
心臓およびポリテトラフルオロエチレンおよび関連の脈
管移植する材料)が挙げられる。
上述したもののいくつかへの、タンパク質、DNA、ホ
ルモン、および抗生物質のような他の生物学的に活性な
部位の付着効率、接着の速度および/または強度を促進
または増大させる細胞接着プロモーターとして有用な製
剤を提供することである。
学的に活性な部位は、水溶液からの非共有吸着によっ
て、例えばポリスチレン表面のような基板表面上にコー
トされる。かかる表面上に吸着されるこれらの高分子の
量は、コーティングの条件(例えば、pH、温度、イオ
ン強度、イオン性組成物、反応物の濃度など)に依存す
る。表面上のコーティングの安定性は、同様のパラメー
ター、およびコーティングの乾燥および保存条件(例え
ば、湿度、温度、気体環境など)にも広がって依存す
る。
−D−リジンの安定性は、コーティング工程の間に用い
られた対の陰イオンに依存するとわかっている。ポリ−
D−リジンは中性のpHで非常に高く正に帯電してお
り、そのためコートされた表面上の対の陰イオンと複合
される。例えばクエン酸塩溶液または硫酸塩溶液中のポ
リ−D−リジンを含有するコーティング組成物(従って
対の陰イオンとしてクエン酸塩または硫酸塩を用いる)
のような本発明の改善されたコーティング組成物を種々
の基質表面に塗布することによって、これらの基質に増
加された保存寿命が得られるということがわかった。得
られた結果は、塩化物、酢酸塩、EDTA、炭酸塩、お
よびPBS(リン酸塩/塩化物の組み合わせ)溶液また
は水を用いる以前のコーティング組成物よりはるかに優
れている。
の1×PBS溶液である本発明のPDL BIOCOA
T(登録商標)Cellware製品は、基質の形状(皿状、フ
ラスコ状、またはプレート状であるかどうか、さらにプ
レート上の穴のサイズおよび数など)、貯蔵温度、湿
度、パッケージングなどに依存した保存寿命を有する。
コートされた基質の保存寿命(すなわち安定性)は、本
発明の方法によって少なくとも2〜3倍に増幅される。
したような種々の基質および例えばプラスチック製品を
含む種々の基質をコートするために利用され、例えば4
℃以下の温度で冷蔵を必要とする代わりにかかる生成物
を室温で貯蔵することを可能にする。本発明の方法によ
って、例えばプラスチック製品のパッケージングに依存
しない安定性/増加した保存寿命を得る。
トされた基質のような種々のコートされた基質の保存寿
命および/または安定性を増加させる方法に関してお
り、この方法は、基板表面に改善されたコーティング組
成物を塗布する工程を含み、このコーティング組成物
は、塩が例えばクエン酸塩または硫酸塩である塩溶液中
の細胞接着プロモーターからなる。
よび/または安定性を増加させる方法に関しており、こ
の方法は、(a)約0.005M〜約0.5Mの塩溶液
中に5μg/ml〜1000μg/mlの細胞接着プロ
モーターを含有するコーティング組成物で基質をコーテ
ィングする工程と、(b)基質上のコーティング組成物
をインキュベートする工程と、(c)前記コートされた
基質を洗浄し、基質にしっかりと結合していない余分な
材料を取り除く工程と、(d)コーティング組成物を上
に有する基質を乾燥する工程と、(e)増加した保存寿
命および/または安定性を有するコートされた基質を得
る工程と、を具える。
質は、室温で増加された保存寿命および/または安定性
を有する。コートされた基質用の特別なパッケージング
は必要ない。
基質のような種々のコートされた基質の保存寿命および
/または安定性を増加させる方法に関する。本発明の方
法の重要な態様は、基質表面に塗布され、改善された安
定性および増加した保存寿命を有する表面が得られる改
善されたコーティング組成物の調製および利用である。
このコーティング組成物は、塩溶液中の細胞接着プロモ
ーターを含有する。
よび/または安定性を増加させる方法に関しており、
(a)約0.005M〜約0.5Mの塩溶液中に5μg
/ml〜1000μg/mlの細胞接着プロモーターを
含有するコーティング組成物で基質をコーティングする
工程と、(b)基質上のコーティング組成物をインキュ
ベートする工程と、(c)コートされた基質を洗浄し、
基質にしっかりと結合していない余分の材料を取り除く
工程と、(d)コーティング組成物を上に有する基質を
乾燥する工程と、(e)増加した保存寿命および/また
は安定性を有するコートされた基質を得る工程と、を具
える。
ml〜約1000μg/mlの細胞接着プロモーターを
含む約50μl〜約500μlの前述の組成物でコート
される。
成物は、塩溶液中の細胞接着プロモーターとしてポリ−
D−リジンからなる。好ましくは、塩はクエン酸塩また
は硫酸塩である。もう一つの具体例において、細胞接着
プロモーターは、ポリ−L−リジン、コラーゲン、ラミ
ニン、フィブロネクチン、ポリオルニチン(ポリアミノ
酸)または他の細胞接着基質またはそれらの混合物から
選択される。ここでの塩溶液の好ましい具体例は、以下
にさらに記載するようにクエン酸塩溶液または硫酸塩溶
液であるが、本発明に用いられる塩溶液は、本発明の目
的を達成できるいかなる塩溶液でもよく、ホウ酸;コハ
ク酸、酒石酸、およびグルタル酸などのジカルボン酸の
塩;両性イオンのスルホン酸塩;およびMES、ビス−
トリス、MOPS、およびHEPESのような有機緩衝
液を含む。
スチック、ガラス、および細孔性フィルター(例えば、
セルロース、ナイロン、ガラスファイバー、ポリエステ
ル、ポリカーボネート)を含む。バッチもしくは連続細
胞培養、または一般的技術に用いられる生物反応器用の
基質は、中空繊維管または微細担体ビーズを含む。脈管
または骨移植片用の基質は、ポリテトラフルオロエチレ
ン(Teflon(登録商標))、セラミックおよび関連のポ
リマー材料のような材料を含む。これらのほとんどの表
面は、負の有効電荷を運び、したがって正の有効電荷を
有する材料にしっかりと結合する。
は、基質への付着を必要としている。慣用的に、細胞培
養はプラスチック基質を利用し、そしてわずかではある
が細胞の付着および増殖のためにガラスおよび細孔性フ
ィルターを利用する。より最近では、生理学的基質(コ
ラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ポリ−D−リ
ジンおよびポリ−L−リジン)は、プラスチック(ポリ
スチレン)上にコートされる目的で用いられ、トランス
フェクトされた細胞、形質変換された細胞、主な細胞分
離体、または低い播種密度で播種された細胞の培養に固
有の問題を避ける。
多穴プレート(24穴をもつおよび96穴をもつプレー
トなど)、皿(ペトリ皿など)、培養フラスコなどを含
む。
の基質のコーティングおよび基質への付着は、一般に、
以下のように行われる。所望の最終濃度に応じて、約
0.5〜2.0mlのコーティング組成物を6穴をもつ
多穴プレート内の1つの穴に塗布し、約0.25〜1.
0mlを24穴をもつ多穴プレート内の1つの穴に塗布
し、約50μl〜100μlを96穴をもつプレート中
の1つの穴に塗布する。さらに、例えば、皿において
は、約0.5〜2.0mlを35mm径の皿に塗布し、
0.5〜4.0mlを60mm径の皿に塗布し、2.0
〜12.0mlを100mm径の皿に塗布する。
ートして、基質の表面に細胞接着物質を吸着させ、残り
のコーティング組成物を取り除き、コートされた基質表
面を洗浄して余分な材料を取り除き、乾燥し、最終的に
増加した保存寿命を有する安定なコートされた基質を得
る。
ノールまたは生物的に相溶な滅菌媒体であるいかなる媒
体でも洗浄できる。
体外細胞培養システムに関しており、この生体外細胞シ
ステムは、基質と、その上の約0.005M〜約0.5
Mの塩溶液中に約5μg/ml〜1000μg/mlの
接着プロモーターを含有するコーティング組成物のコー
ティングとを含有する。この基質、コーティング組成
物、接着プロモーター、および塩溶液は、先に定義した
いずれでもよい。
発明の形態を制限するものではない。
および50℃で周囲湿度にて促進された安定性条件下で
保存された96穴を有するコートされた多穴プレートに
おいて行われ、対照標準として4℃で保持されたプレー
トをテストした。
ぞれコートされた3個の別個の多穴プレートにおいて行
った:(1)ポリ−D−リジンのクエン酸塩溶液でコー
トされた多穴プレート、(2)ポリ−D−リジンの硫酸
塩溶液でコートされた多穴プレート、(3)ポリ−D−
リジンのPBS溶液でコートされた多穴プレート。
した。
整されたた5mMトリスベースを有する0.1Mのクエ
ン酸ナトリウム溶液中に溶解し、最終濃度50μg/m
lにした。このコーティング組成物を約80μl/穴で
96穴を有するプレートに加えた。このコーティング組
成物を約1時間にわたってプレートの表面に吸着させる
ようにした。残りのコーティング組成物を活発にデカン
トした。次いで、前述の(コーティング組成物の)量の
水を二回で穴に加え、取り除いた。この工程を繰り返し
た。次いで、このプレートを、室温で一晩減圧オーブン
中で乾燥させた。次いでプレートを紫外線トンネルを通
過させた。
された5mMトリスを有する100mMの硫酸塩溶液に
溶解し、最終濃度を50μl/mlにした。
おいて行った。
調整した1×PBS溶液に溶解し、最終濃度を50μg
/mlにした。(1×PBS=2.7mM KCl;
1.5mM KH2 PO4 ;137mM NaCl;
3.7mM Na2 HPO4 )(1)および(2)と同
じコーティング工程を(3)において行った。
ラットの小脳顆粒球(RCG)分析を、RCG細胞の初
代培養の細胞付着を基にして、以下のように行った。
の小脳からの細胞の単離を記載する。6(および12)
対より少ないまたはより多い小脳を用いる場合、試薬の
量を比例して調節した。
(12対) 1.1.2 トリパンブルー、P/N 01−0609
0 1.1.3 0.2ミクロンのナルゲン(Nalgene )減
圧濾過器、P/N 01−00048 1.1.4 Millex GV フィルター 、P/N 01
−00052 1.1.5 カレントロット(current lot )溶液1
(HEPES[N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−
N′−2−エタンスルホン酸]を含む培養媒体) 1.1.6 トリシン原液、10mg/ml 1.1.7 DNA分解酵素原液 1.1.8 大豆トリプシン阻害剤原液、3.5mg/
ml 1.1.9 0.5M MgSO4 原液 1.1.10 0.05M CaCl2 原液 1.1.11 ラットの小脳顆粒細胞成長培養液
たはC−00012 1.2.4 層流フード、装置ID C−00018ま
たはC−00019 1.2.5 インキュベーター、5%CO2 、37℃ 装置ID C−00016およびC−000465
18 1.3.2 遠心管、50ml、P/N 01−000
13 1.3.3 1ml容ピペット、P/N 01−000
42 1.3.4 5ml容ピペット、P/N 01−000
44 1.3.5 10ml容ピペット、P/N 01−00
041 1.3.6 25ml容ピペット、P/N 01−00
040 1.3.7 100mm径ペトリ皿、P/N 01−0
3003 1.3.8 細胞スクレーパ、使い捨て、CoStar C/
N 3010 1.3.9 リットル容無菌ボトル 1.3.10 注射器 必要とされた注射器の数
仔ラットの小脳の調製に適用する。
内で用いた。
で調製した。 1.4.2 以下の溶液を37℃の水浴内で溶かし、必
要になるまで4℃の冷蔵庫内で保存した。
液) 1.4.3.1 35mlの溶液1を2つの無菌50m
l容遠心管のそれぞれに移した。 1.4.3.2 0.875mlのトリプシン原液を各
50ml容遠心管に加えた。 1.4.3.3 該管を蓋締めし、逆転するまたは回旋
することによって混合した。 1.4.3.4 60ml容注射器およびMillex GV
0.22μmフィルターを、各管の溶液を新たな無菌5
0ml容遠心管に無菌濾過するのに用いた。 1.4.3.5 得られる溶液2の入った管を後で用い
るために保存した。
素および大豆トリプシン阻害剤(STI)溶液) 1.4.4.1 20mlの溶液1を2つの無菌50m
l容遠心管にそれぞれ移した。 1.4.4.2 0.95mlのDNA分解酵素原液を
各管に加えた。 1.4.4.3 0.94mlのSTI原液を各管に加
えた。 1.4.4.4 22μlの0.5M MgSO4 原液
を各管に加えた。 1.4.4.5 各管を蓋締めし、逆転するまたは回旋
することによって混合した。 1.4.4.6 30ml容注射器およびMillex GV
0.22μmのフィルターを、管の溶液を新たな15m
l容遠心管に無菌濾過するのに用いた。 1.4.4.7 得られる溶液3の入った管を後で用い
るために保存した。
素およびSTI溶液) 1.4.5.1 5mlの溶液1を2つの無菌15ml
容遠心管にそれぞれ移した。 1.4.5.2 0.57mlのDNA分解酵素原液を
各管に加えた。 1.4.5.3 0.734mlのSTI原液を各管に
加えた。 1.4.5.4 30μlの0.5M MgSO4 原液
を各管に加えた。 1.4.5.5 各管を蓋締めし、逆転するまたは回旋
することによって混合した。 1.4.5.6 10ml容注射器およびMillex GV
0.22μmフィルターを、管の溶液を新たな50ml
容遠心管に無菌濾過するのに用いた。 1.4.5.7 得られる溶液4の入った管を後で用い
るために保存した。
CaCl2 溶液) 1.4.6.1 24mlの溶液1を2つの無菌50m
l容遠心管にそれぞれ移した。 1.4.6.2 62μlの0.5M MgSO4 原液
を各管に加えた。 1.4.6.3 48μlの0.05M CaCl2 原
液を各管に加えた。 1.4.6.4 各管を蓋締めし、逆転するまたは回旋
することによって混合した。 1.4.6.5 30ml容注射器およびMillex GV
0.22μmのフィルターを、管の溶液を新たな50m
l容遠心管に無菌濾過するのに用いた。 1.4.6.6 得られる溶液5の入った管を後で用い
るために保存した。
が、冷凍されていない。 1.5.1.1 無菌の使い捨て細胞スクレーパを10
0mm径ペトリ皿に6対の小脳を移すのに用いた。 1.5.1.2 組織をしごきストローク(wiping str
okes)を設けた細胞スクレーパを用いて、スクレーパと
皿の表面の間の組織を閉じこめながら穏やかにつぶた。 1.5.1.3 組織を均質のペーストが得られるまで
(2〜3分)スクレーパを用いた作業をした。 1.5.1.4 10mlの溶液1を、細胞スクレーパ
の先端に交わる溶液1を射出して粘着性のある小脳組織
を取り除きながら、皿に加えた。 1.5.1.5 細胞を、ピペットで懸濁液を吸引し射
出すことによって懸濁させた。 1.5.1.6 懸濁液を吸引し、50ml容の無菌遠
心管に移した。 1.5.1.7 工程1.5.1.4〜1.5.1.6
をペトリ皿から管に残りの組織を移すようにもう2回繰
り返した。 1.5.1.8 この管を遠心分離用に保留した。 1.5.1.9 12対のラットの小脳を調製するとき
は、残りの6対の小脳を100mm径ペトリ皿に移し、
工程1.5.1.2〜1.5.1.8をこれらの小脳に
対して繰り返した。 1.5.1.10 ペトリ皿および初めに小脳を収容し
た容器を廃棄した。 1.5.1.11 管を室温で5分間にわたて1000
rpmで遠心分離した。 1.5.1.12 上清を吸引し、廃棄した。
解酵素 1.5.2.1 30mlの溶液2を工程1.5.1で
得られた細胞ペレットに加えた。 1.5.2.2 混合物を、25mlピペットを用いて
細胞懸濁液を吸引し射出することによって分散させた。 1.5.2.3 管を37℃のH2 O浴で正確に15分
間にわってインキュベートした。 1.5.2.4 インキュベートしている管を2〜3分
ごとに手で管を回旋させて攪拌した。 1.5.2.5 この管を浴から取り出した。 1.5.2.6 混合物に存在する凝集塊またはゼラチ
ン状の塊を、25容ピペットを用いて細胞懸濁液を2〜
3回、吸引し射出することによって混合物中に分散させ
た。 1.5.2.7 工程1.5.2.6を5ml容ピペッ
トを用いて繰り返した。 1.5.2.8 凝集塊またはゼラチン状の塊が混合物
中に存在しなくなったところで、混合物を、5ml容ピ
ペットで細胞懸濁液を2〜3回、吸引し射出することに
よって分散させた。 1.5.2.9 15mlの溶液3を管に加え、30〜
60秒間にわたって手で回旋させた。 1.5.2.10 管を37℃のH2 O浴で正確に15
分間にわたってインキュベートした。 1.5.2.11 インキュベートしている管を2〜3
分毎に手で管を回旋することによって攪拌し、粘性を減
少させた。 1.5.2.12 管を浴から取り出した。 1.5.2.13 管を室温で5分間にわたって100
0rmpで遠心分離させた。 1.5.2.14 上清を吸引し、廃棄した。
液4を工程1.5.2で得られた細胞ペレットに加え
た。 1.5.3.2 混合物を、5ml容ピペットを用いて
細胞懸濁液を40回、吸引し射出して懸濁させた。過度
の泡が発生することを避けるため、混合物を遠心管の壁
をつたわらせて入れた。 1.5.3.3 12対のラットの小脳を調製する場合
は、両方の管の細胞を単一の50ml容遠心管内にため
た。 1.5.3.4 10mlの溶液5を各細胞懸濁液に加
えた。 1.5.3.5 混合物を、管の内容物を5〜10回、
吸引し射出することによって分散させた。 1.5.3.6 懸濁液を正確に5分間にわたって静置
させておいた。 1.5.3.7 大きな沈降した凝集塊が発生したら、
10ml容ピペットを用いて凝集塊の上の細胞懸濁液を
吸引し、細胞懸濁液を新たな無菌50ml容遠心管に移
し、凝集塊を廃棄した。 1.5.3.8 10mlの溶液5を各吸引されれた細
胞懸濁液に加えた。 1.5.3.9 管の混合物を手で管を回旋することに
よって攪拌した。 1.5.3.10 管を室温にて100rpmで5分間
にわたって遠心分離した。 1.5.3.11 上清を吸引し、廃棄した。
再懸濁させた。 1.6.1.1 5ml容ピペットを用いて5mlの成
長培養液を細胞ペレットに加えた。 1.6.1.2 混合物を5ml容ピペットを用いて細
胞懸濁液を吸引し射出して分散させた。 1.6.1.3 15mlの成長培養液を細胞分散液に
加えた。 1.6.1.4 混合物を、細胞懸濁液を吸引し射出す
ることによって分散させた。
l遠心管にピペットで加える工程と、 1.6.2.2 0.4mlの成長培養液を管に加える
工程と、 1.6.2.3 0.5mlのトリパンブルーを管に加
える工程とから調製した。
回旋させて混合した。
ウント用に取り除いた。
器が満たされるまで血球計数器に注入した。
し、生存可能の細胞をその格子の4つの角のますめにお
いて数えた。
える。生存不可能の細胞は、青みを帯びているようであ
る。
し、その平均を、総細胞数を4で割って決定した。
で得られた数を採用し105 をかけることによって計算
した。 1.7.2 コートされたプレートをテストするために
必要な細胞懸濁液の総量を、特別容量(容量は遠心分離
によって変わる)をプレートの数にかけて計算した。 1.7.3 1.0×106 細胞/ml溶液を作るため
に必要な基の細胞懸濁液の量を、総量(工程1.7.
2)を1×106 倍にし、この結果を平均細胞/ml
(工程1.7.1)で割って計算した。 1.7.4 総量を工程1.7.2で計算された量に導
くための成長培養液の量を、総量(工程1.7.2)か
ら細胞の量(工程1.7.3)を引くことによって計算
した。
濁液を、 1.8.1 工程1.7.3で計算された元の細胞懸濁
液から細胞の量をピペットを用いて移す工程と、 1.8.2 工程1.7.2で計算された量を収容する
のに十分の大きさのT字型フラスコにこの量を加える工
程と、 1.8.3 T字型フラスコに工程1.7.4で計算さ
れた量の成長培養液を加える工程と、 1.8.4 手で緩やかにT字型フラスコを回旋し、懸
濁液を混合する工程と、から製造した。
/mlに調整した。
列に播種した。(12列あり、CとDを任意に取り出し
た。)
にわたって、37℃にて5%CO2 平衡空気、100%
湿度で行った。
量写真を用いる分析において少なくとも2つの別個の技
術によって各列を評価した。
ラフ化した。
は、点数が2.0以上であり、負の対照標準は、点数が
0を有する。点数は1〜3のスケールにおけるものであ
る。
するコーティング組成物を利用したプレートおよび硫酸
塩溶液を有するコーティング組成物を利用したプレート
の増加した安定性を示した。
飽和湿度、および50℃で周囲湿度にて保持した24穴
を有するコートされた多穴プレートにも行われ、対照標
準として4℃にて保持されたプレートをテストした。2
4穴を有する3つの多穴プレートを、(1)ポリ−D−
リジンのクエン酸塩溶液、(2)ポリ−D−リジンの硫
酸塩溶液、または(3)ポリ−D−リジン(PDL)の
PBS溶液のいずれかでコートした。
レートは、実施例1に記載した方法で製造した。
mlの細胞を24穴プレートの穴当たりに塗布したこと
を除いて、実施例1と同様に行った。
含むコーティング組成物または硫酸塩溶液を含むコーテ
ィング組成物を有するプレートの増加した安定性を示し
ている。
度、および50℃で周囲湿度にて保持された96穴プレ
ートに12種類のコーティング組成物を用いて行われ、
対照標準として4℃にて保持されたプレートをテストし
た。
レートを、(1)pH8.0に調整された、PDLの5
mMトリスを含む0.1M PO4溶液、(2)pH
8.0に調整された、PDLの5mMトリスを含む0.
1M酢酸塩溶液、(3)pH8.0に調整された、PD
Lの5mMトリスを含む0.1M EDTA溶液、
(4)pH8.0に調整された、PDLの5mMトリス
を含む0.1M NaCl溶液、(5)pH8.0に調
整された、PDLの5mMトリス溶液、(6)pH8.
0に調整された、PDLの5mMトリスを含む0.1M
炭酸塩溶液、(7)pH8.0に調整された、PDLの
5mMトリスを含む0.1M クエン酸塩溶液、(8)
pH8.0に調整された、PDLの5mMトリスを含む
0.1M 硫酸塩溶液、(9)pH8.0に調整され
た、PDLの5mMトリスを含む1×PBS溶液、(1
0)1×PBSおよび12.5%のEtOH中のPD
L、(11)1×PBSおよび25%EtOH中のPD
L、または(12)1×PBSおよび50%EtOH中
のPDLでコートした。
濃度50μg/mlになるように溶液中に溶解した。
で行うのではなく自動化された機械で行うことを除いて
実施例1および2と同様に行った。
った。
果は、プレート上の12のコートされた組成物のそれぞ
れの安定性/保存寿命を示した。このクエン酸塩溶液を
有するコーティング組成物および硫酸塩溶液を有するコ
ーティング組成物の増加した保存寿命は、この分析によ
って明らかに示された。
Claims (10)
- 【請求項1】 コートされた基質の保存寿命および/ま
たは安定性を増加させる方法であって、 (a)約0.005M〜約0.5Mの塩溶液中に約5μ
g/ml〜1000μg/mlの細胞接着プロモーター
を含有するコーティング組成物で基質をコーティングす
る工程と、 (b)前記基質上の前記コーティング組成物をインキュ
ベートする工程と、 (c)前記コートされた基質を洗浄し、前記基質にしっ
かりと結合していない余分の材料を取り除く工程と、 (d)コーティング組成物をその上に有する基質を乾燥
する工程と、 (e)増加した安定性および/または保存寿命を有する
コートされた基質を得る工程と、を具えることを特徴と
する方法。 - 【請求項2】 前記細胞接着プロモーターが、ポリ−D
−リジン、ポリ−L−リジン、ポリオルニチン、フィブ
ロネクチン、ラミニン、コラーゲン、またはこれらの混
合物であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記塩が、クエン酸塩または硫酸塩であ
るか、またはホウ酸、ジカルボン酸の塩および両性イオ
ンのスルホン酸の塩よりなる群から選択され、前記塩溶
液がMES、ビス−トリス、MOPS、またはHEPE
Sである有機緩衝液であることを特徴とする請求項1に
記載の方法。 - 【請求項4】 前記基質が、基質のcm2 あたり、約5
μg/ml〜約1000μm/mlの前記細胞接着プロ
モーターを含む約50μl〜約500μlの前記組成物
でコートされていることを特徴とする請求項1に記載の
方法。 - 【請求項5】 前記コーティング組成物が、生物学的に
相溶性の滅菌用媒体を用いて前記基質を洗浄することに
よって前記基質上で滅菌されることを特徴とする請求項
1に記載の方法。 - 【請求項6】 前記基質が、合成ポリマー材料、ガラ
ス、金属、および細孔性フィルターよりなる群から選択
されることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 生体外の細胞培養システムであって、基
質と、その上の約0.005M〜約0.5Mの塩溶液中
に約5μg/ml〜1000μg/mlの細胞接着プロ
モーターを含有するコーティング組成物のコーティング
と、を含有することを特徴とする細胞培養システム。 - 【請求項8】 前記細胞接着プロモーターが、ポリ−D
−リジン、ポリ−L−リジン、ポリオルニチン、フィブ
ロネクチン、ラミニン、コラーゲン、またはこれらの混
合物であることを特徴とする請求項7に記載の細胞培養
システム。 - 【請求項9】 前記塩が、クエン酸塩または硫酸塩であ
るか、またはホウ酸、ジカルボン酸の塩、および両性イ
オンのスルホン酸の塩よりなる群から選択され、前記塩
溶液が、MES、ビス−トリス、MOPS、またはHE
PESである有機緩衝液であり、前記基質が、合成ポリ
マー材料、ガラス、金属、および細孔性フィルターより
なる群から選択されることを特徴とする請求項7に記載
の細胞培養システム。 - 【請求項10】 前記基質が、基質のcm2 当たり、約
5μg/ml〜約1000μg/mlの前記細胞接着プ
ロモーターを含む約50μl〜約500μlの前記組成
物でコートされることを特徴とする請求項7に記載の細
胞培養システム。
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