JPH02171183A

JPH02171183A - 付着性細胞の培養方法

Info

Publication number: JPH02171183A
Application number: JP63321991A
Authority: JP
Inventors: Junji Kobayashi; 準次小林; Tadashi Maeda; 正前田; Yutaka Sato; 裕佐藤
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1988-12-22
Filing date: 1988-12-22
Publication date: 1990-07-02
Also published as: JPH0534951B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、付着性細胞の培養方法に関する。さらに詳し
くは、付着性細胞培養物に水性媒体中でプロテアーゼを
作用せしめて付着性細胞を剥離した後固定化プロテアー
ゼ阻害剤を作用せしめ次いで培養せしめてなる培養方法
に関する。

〔従来の技術〕

付着性細胞を用いた存用物質の工業的生産等には、先ず
細胞を増殖させることが必須であるが、付着性細胞の増
殖には浮遊系細胞の増殖と異なり培養担体への付着が必
要である。したがって、例えば付着性細胞のスケールア
ップ培養においては、種培養時の培養担体上で増殖した
該細胞を培養担体より分離し、回収した細胞を主培養の
培養担体に移植する工程が必要となる。

従来、培養時の該細胞の付着表面積を増加せしめ栄養分
の補給やガス交換が容易とせしめるため該細胞を付着せ
しめる培養担体をマイクロキャリアー等とすることが行
われているが、これらの培養担体より該細胞を剥離する
には、プロテアーゼを使う方法が一般的に用いられてい
る。このプロテアーゼを使用して剥離した該細胞を新た
な培養担体に接着せしめるに当り、該細胞の培養担体に
対する付着、伸展を良好にするため剥離した該細胞を充
分に洗浄する工程が必要であった。この洗浄工程は培養
スケールが大きくなるほど煩雑になり、該工程の簡略化
が大量培養における大きな問題であった。

上記の洗浄操作の代わりの方法として、プロテアーゼを
使用してｆｊＪ離した該細胞浮遊液に対して、牛胎児血
清や子牛血清などを通常５〜１０％Ｖ／■添加した血清
培地を用いることにより簡便に該細胞の新たな培養担体
に対する良好な付着、伸展が行い得る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしこのような血清含有培地は、血清自体が高価であ
るにもかかわらず、血清のロフト間の品質に差異があり
同一品質の血清、を得ることが困難であり、また培養さ
れた細胞培養物から目的有用物質の単離精製をも困難に
している。

近年、無血清培地ないし低血清培地による培養が脚光を
浴びている。しかし、無血清培地や低血清培地は前述の
血清培地に比べ細胞増殖速度、細胞密度、細胞の安定性
などの点で欠点があり、なお多くの改良を必要とした。

さらに同じく無血清培地ないし低血清培地にて付着性細
胞を移植して培養するには、やはり上記の洗浄工程が不
可避であった・〔問題点を解決するための手段〕本発明者らは、先に固定化プロテアーゼ阻害剤が、無血
清培地ないし低血清培地において速やかに付着性細胞の
細胞増殖を促進し、増殖を安定化することを見出し、さ
らに研究の結果、固定化プロテアーゼ阻害剤を用いる付
着性細胞の培養法を確立し、本発明を完成するに至った
。

即ち、本発明は、付着性細胞の培養において、付着性細
胞培養物に水性媒体中でプロテアーゼを作用せしめて付
着性細胞を剥離した後固定化プロテアーゼ阻害剤を作用
せしめ次いで培養することを特徴とする培養方法である
。

本発明において付着性細胞とは、培養担体への付着が細
胞増殖の必須要因である細胞で、一般的には付着性の動
物細胞が例示され、例えば正常および胎児組織由来の付
着性正常２倍体初代または株化細胞ならびに癌およびそ
の他の組織由来付着性初代または株化細胞が挙げられる
。具体的には、ヒト組織由来細胞、例えばヒト腎癌細胞
ＴＲＣ−２９Ｒ（ｍ１研１寄第１０２７４号（ＦＥＲＭ
Ｐ−１０２７４））およびヒト肺癌細胞ＴＬＣ−９Ａ（
特開昭６２−３８３２５号公報）などが例示される。

ヒト腎癌細胞ＴＲＣ−２９Ｒの性状は下記に示すとおり
である。

■形ａｉ：上皮細胞様、 ■染色体数：高３倍体域である染色体数７４本のモーダ
ル・ナンバーを示すことを特徴とする染色体数の分布モ
ード、 ■継代培養：無限な継代培養、 ■機能的特徴：ヒトーＣ３Ｆ産生、 ■細胞増殖性：細胞の増殖が進み、飽和状態になると重
層状に増殖する傾向が見られる。特に、５〜２０％牛脂
児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地において増殖性良
（、ボピュレイション・ダブリング・タイムは２９±６
時間である。

固定化プロテアーゼ阻害剤とはプロテアーゼ阻害剤を不
溶性または親水性の固定化担体に固定化したものを示し
、本発明に使用しうるプロテアーゼ阻害剤としては付着
性細胞を剥離するのに使用されるプロテアーゼ、例えば
トリプシンなどを有効に阻害するものであればよく、例
えばα、−ブロテイナーゼ・インヒビター、α１−マイ
クログロブリン、オボインヒビター、ウシ膵臓トリプシ
ンインヒビター、ダイズトリブシン・インヒビタ、リマ
マメ・インヒビター、ナンキンマメ・インヒビター、イ
ンゲンマメ・インヒビター、マングマメ・インヒビター
、フジマメ・インヒビター−タチナタマメ・インヒビタ
ー、フジマメ・インヒビター、ポテト・インヒビター、
ストレプトミセスズブチリシン・インヒビター、プラス
ミノストレブチン、抗プロテアーゼ抗体およびその他の
合成プロテアーゼ阻害剤、例えばベンズアミジン塩酸塩
、ｐ−アミノベンズアミジン塩酸塩、フン化フェニルメ
チルスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル−し−リジン
クロルメチルケトン塩酸塩等が挙げられる。さらに、固
定化プロテアーゼ阻害剤を細菌、カビ等の微生物のコン
タミの防止のために、熱殺菌が可能な合成プロテアーゼ
阻害剤、例えばベンズアミジン塩酸塩、ｐ−アミノベン
ズアミジン塩酸塩、フッ化フェニルメチルスルホニル、
ｐ−１−ルエンスルホニルーし一リジンクロルメチルケ
トン塩酸塩等、が好ましい。

固定化担体としては、プロテアーゼ阻害剤を固定化する
ための官能基、例えばアミノ基、イミノ基、カルボキシ
ル基、アルデヒド基、カルボニル基、ヒドロキシル基、
チオール基、アミド基、シアノ基、イソシアノ基など、
またはこれらの官能基から誘導された、少なくともプロ
テアーゼ阻害剤を固定化するための反応性基を有してい
ればよ（、何ら限定されるものではなく、例えばアルブ
ミンやゼラチンなどの蛋白質の不溶化したもの、アガロ
ース、セルロース、セファロース、デキストリンやキト
サンなどの多糖類のエピクロルヒドリン処理による不溶
化したものや臭化シアン処理やその他のアミノ基導入試
薬、チオール基導入試薬やカルボキシル基導入試薬にて
処理した不溶化したものなどの不溶性半合成高分子系担
体、また例えばアクリロニトリル、アクリル酸、アクリ
ル酸エステル、メタアクリル酸、メタアクリル酸エステ
ル、ビニルアルコール、酢酸ビニル、スチレン、アミノ
スチレン、クロルスチレン、スルホスチレン、マレイン
酸、フマル酸などのモノマーからなる重合体または他の
七ツマ−との共重合体や例えばヒドロキシメチル（メタ
）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレー
ト、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート等のヒド
ロキシアルキル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリ
ルアミド、グリシジル（メタ）アクリレートなどのモノ
マーとの共重合体の親木性担体や、さらにそれらのハイ
ポーラスなものなどの合成高分子達担体やケイ素やアル
ミニウムなどの無機化合物またはそのハイポーラス無機
化合物の不溶性無機系担体などが挙げられる。さらに、
これらの担体にフェライト等の磁性体を含有せしめると
、磁気による分離回収が可能でありより好ましい。

プロテアーゼ阻害剤を固定化担体に固定化するに当たっ
ては、固定化担体のハイポーラス吸着能に基づく吸着固
定化を行ってもよく、または固定化担体の有する官能基
またはそれに導入した官能基とプロテアーゼ阻害剤の有
する官能基またはそれに導入した官能基とを必要に応じ
て架橋剤を用いて共有結合または抱合せしめてもよい。

また官能基を導入する場合にはスペーサー導入のための
試薬を用いてもよく、例えばスクシニルアルデヒド、グ
ルタルアルデヒド、アジポアルデヒド、などのジアルデ
ヒド化合物、ω−アミノ酪酸、ω−アミノグルタミン酸
などのアミノ酸化合物またはその酸クロライド、スクシ
ンイミドエステル、ｐ−二トロフェニルエステルなどの
反応性誘導体、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジ
ピン酸などのジカルボン酸化合物またはその反応性誘導
体、ヘキサメチレンジアミン、デカメチレンジアミンな
どのジアミン化合物、３−（２’　　−ピリジル−ジチ
オ）プロピオン酸、３−　（２’　　−ピリジル−Ｎ−
オキシド−ジチオ）プロピオン酸、３−（２゛−ベンゾ
チアゾリル−ジチオ）プロピオン酸などのチオカルボン
酸化合物またはその反応性誘導体、Ｓ−アセチルメルカ
プトカプトサクシニック・アンハイドライド、２−アミ
ノエタンチオール、γ−アミノプロピルエトキシシラン
などの試薬の１種または２種以上を用いてアルデヒド基
、カルボキシル基、アミノ基、チオール基などの官能基
を導入してもよい。さらにこのような固定化担体および
プロテアーゼ阻害剤の共有結合体を得るに当たっては、
この固定化担体、プロテアーゼ阻害剤の有するアミノ基
、水酸基、カルボキシル基、チオール基などの官能基ま
たはその反応性誘導体やさらに導入された官能基または
その反応性誘導体に基づいて、必要に応じて両者を結合
しえる架橋試薬を用いて得られる。また架橋試薬として
は、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオール基な
どの官能基と反応し得る基を２つ以上有する多官能性試
薬であればよく、例えばスクシニルアルデヒド、グルタ
ルアルデヒド、アジボアルデヒド、などのジアルデヒド
化合物、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸
などのジカルボン酸化合物またはその反応性誘導体、ヘ
キサメチレンジイソシアナート、２．４−）ルエンジイ
ソシアナートなどのジイソシアナート化合物、マレイミ
ド安息香酸、マレイミドフェニル酢酸などのマレイミド
カルボン酸化合物またはその反応性誘導体、Ｎ、Ｎ’　
　−エチレンビスマレイミド、ＮＮ’　−ｏ−フェニレ
ンジマレイミドなどのシマレイミド化合物、ビスジアゾ
ベンジジン、ジエチルマロンイミデート、ジメチルアジ
ピンイミデート、Ｎ、Ｎ’　　−ポリメチレンビスヨー
ドアセトアミドや３−（２’−ビリジルージチオ）プロ
ピオン酸、３−（２°　−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
プロピオン酸などのチオカルボン酸化合物またはその反
応性誘導体、Ｎ−（２−（２’　−ピリジル−ジチオ）
エチル）−３−（２°　−ベンゾチアゾリル−ジチオ）
１０ピオンアミド、Ｉ−（２’ベンゾデアゾリル−ジチ
オ）−２−（２″　−ピリジル−ジチオ）エタンなどの
ジチオ化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテ
ル、ｌ、４−ブタンジオールジグリシジルエーテル等の
ジグリシジルエーテル化合物またはその反応性誘導体が
挙げられ、これらの試薬は、用いる固定化担体およびプ
ロテアーゼ阻害剤の結合に関与するアミノ基、水酸基、
カルボキシル基、アルデヒド基、チオール基などの官能
基を考慮して選択使用すればよく、また反応媒体は、水
、緩衝液、アセトン、ＤＭＦ、、ＤＭＳＯ，クロロホル
ム、メチレンクロライドなどの溶媒を選択使用すればよ
い。

−船釣には入手の容易な市販品である固定化プロテアー
ゼ阻害剤として、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−５ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ６Ｂ（ファルマシア社製、商品名）のゲル状物
や磁気による分離回収が可能であるｐ−Ａ＊ｉｎｏ−Ｂ
ｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−Ａｇａｒｏｓｅ　　（磁気分離
用）（ステロ−ジンバイオケミカル社製、商品名）を用
いることもできる。

本発明の培養法は、継代培養に用いることができ、また
、種培養等の前培養により得た付着性細胞をさらに大量
培養する後培養等において用いることができる。

本発明の培養法に用いられる培養担体は容器壁等であっ
てもよいが、培養時の該細胞の付着表面積を増加せしめ
栄養分の補給やガス交換が容易とせしめるため、マイク
ロキャリアー（以下、ＭＣと略す）を用いることがより
好ましい。Ｍｃとしては、デキストラン、変性コラーゲ
ン、ガラス、ポリスチレン、ポリアクリルアミドやセル
ロース等がよく利用され、動物細胞の培養においては、
通常、粒径１００〜２００μｍの粒状物が使用される。

また、このようなＭｃに磁性体を保持せしめた磁性体保
持担体を培養担体として使用することも以後の分離回収
に有用であり好ましく、さらに好ましくはＭｃ内部に磁
性体を含有せしめた培養担体を使用してもよい。

継代培養または大量培養に際しては、新たなＭＣを追加
するかまたは新たなＭｅと置換するとよい。プロテアー
ゼ処理により剥離した細胞とＭｃを分離するには、遠心
分離、メツシュフィルターおよび磁性体を保持する培養
担体を用いた場合には磁気にて簡単に分離する方法が利
用される。

固定化プロテアーゼ阻害剤をプロテアーゼにて剥離した
細胞浮遊液に添加し培養するに際しては、必要に応じて
固定化プロテアーゼ阻害剤と細胞浮遊液とを一定時間作
用せしめた後、該固定化プロテアーゼ阻害剤を除去する
ことができる。該固定化プロテアーゼ阻害剤を除去する
場合には、例えば磁気分離用の固定化プロテアーゼ阻害
剤を用いて磁気にて簡単に分離するかまたは、遠心分離
により分離する方法や、さらに固定化プロテアーゼ阻害
剤を充填したカラムに培養液を導入せしめることもでき
る。

固定化プロテアーゼ阻害剤の形状は、用いる固定化担体
の形状に基づき粒子状や繊維状等のどのような形状であ
ってもよく、その大きさも培養液に接触しやすさやその
後の分離回収のしやすさ等を考慮して適宜変更しうるが
、通常粒子状で粒径１００μｍ”１．Ｏｍｍ程度のもの
が使用される、また、固定化プロテアーゼ阻害剤ゲル（
含水率８５〜９５％）　　１ｍｌ当りトリプシン約５〜
２０ｍｇが結合し得、ゲル１ｍｌで５０μｓ／ｍｊ！）
リブシン液約３００ｍｊ！を処理できるが、好ましくは
５０〜２００　ｍ　Ｉｔの範囲で調製すればよく、プロ
テアーゼ阻害剤の培地中の濃度としては、少なくとも０
．０５ｍＭの量として用いればよく、通常５ｍＭ以下で
あればよい、さらに、好ましくは０．３ｍＭ　〜２ｍＭ
である。

本発明で水性媒体とは、付着性細胞の剥離、接着の工程
における反応媒体を意味し、接着以後の継代培養に利用
しうる培地すなわちプロテアーゼの作用を実質的に阻害
しない量以下の血清を含むかあるいは全く血清を含まな
い培地であってもよい、すなわち生理食塩液や緩衝液、
有機溶媒含有水溶液あるいは無血清培地または低血清培
地等の等張渡が例示される。また、後記の方法により剥
離工程以前に種培養等の前培養時の培地を生理食塩液や
緩衝液、有機溶媒含有水溶液または別の無血清培地また
は低血清培地等と置換することも行い得るが、前培養時
に使用した無血清培地または低血清培地中で以後の操作
を行うことが簡単でよい。

無血清培地とは特に限定されるものではなく、例えばホ
ワイト（Ｗｈｉｔｅ　）の培地、フィシャー（＼Ｆｉｓｈｅｒ）の培地、バーカー（Ｐａｒｋｅｒ）の培
地、アーμ（Ｅａｒｌｅ　）の培地、ウェイマウス（Ｗ
ａｙｍｏｕｔｈ）の培地、イーグル（ｔ！ａｇｌｅ　）
の培地、バック（Ｐａｃｋ）の培地、ハム（ｆｌａｗ　
）の培地、トロウェル（Ｔｒｏｗａｌｌ　）の培地、マ
ックコイ（ＭｃＣｏｙ　）の培地、ムーア（Ｍｏｏｒｅ
　）の培地、ウィリアムズ・メディウム（Ｗｉｌｌｉａ
ｍ’ｓ　ｍｅｄｉｕｇａ）　Ｅ培地などの種々の基礎培
地とその改変培地、さらにそれらの混合培地が挙げられ
る。さらに例示すれば、組成公知のフィシャーの培地と
してはＶ−６１４、パーカーの培地としてはＭ１５０、
Ｍ２Ｂ５、Ｍ２Ｏ３、Ｍａ２Ｏ、Ｍｌ　９９、ＣＭＲＬ
−１０６６、ＣＭＲＬ−１４１５、アーμの培地として
はＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、ウェイマウスの培
地としてはＭＢ７５２／１．ＢＭＥ、イーグルの培地と
してはＭＥＭ、ダルベツコＭＥＭ、ジョウワリック、ア
ルファＭＥＭ、パックの培地としてはＮ１５、Ｎ１６、
ハムの培地としてはＦ７、ＦｌＯ１Ｆ１２、）ロウエル
の培地としてはＴ７、マックコイの培地としては７７ク
コイ５Ａ、ムーアの培地としてはＲＰＭ［−１６２９、
ＲＰＭＩ−１６３０、ＲＰＭＩ−１６３４、ＲＰＭＩ−
１６４０などの培地またはそれらの混合培地が挙げられ
る。また、例えばＭＥＭ培地、１９９培地、ハム培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、Ｎ
ＣＴＣｌ　０９培地等の組成においては、種々のアミノ
酸類、ビタミン類、無機塩類やその他グルコース等を添
加調製したものでも良い、さらに、このような培地にお
いて、リン脂質、脂肪酸好ましくは不飽和脂肪酸、アミ
ン化合物好ましくはエタノールアミン、インシュリン、
グルカゴン、ソマトスタチン、バラサイロイドホルモン
（ＰＴＨ）　、チロプロティン・リリージングホルモン
、ルテイニング・ホルモン・リリージングホルモン、（
ＬＨ−ＲＨ）　、セレン、トランスフェリン、アルブミ
ン、エビデ、ルマル・グロス・ファクター（ＥＧＦ）　
、ファイプロプラスト・グロス・ファクター（ＦＧＦ）
　、プロスタグランジン、例えばプロスタグランジンＦ
ｔα、プロスタグランジンＥ、、トリョードチロニン、
ハイドロコーチシン、プロゲステロン、テストステロン
、エストラジオール、ラクトアルブミン、その他抗生物
質などから選択した一種以上の化合物を添加調整しても
よい。

また、低血清培地とは、具体的には、上記無血清培地等
に例えば０．５％以下の血清を添加調整した培地を示す
。

種培養等の前培養により得た付着性細胞をさらに大量培
養する後培養においては、例えば前培養により得た培養
物を通常５０μｇ　／　ｍ　ｌのプロテアーゼにて３７
℃１０分間処理して＃Ｊ＃せしめた細胞浮遊液を得、次
いでこれを、固定化プロテアーゼ阻害剤を添加しそのま
ま培養するか、または、室温度で１０〜３０分間接触せ
しめた後、除去するとともに、新たなＭｅを追加するか
または新たなＭｃと置換するとよい。

付着性細胞の培養に当たっては、上記の調整された水性
媒体に通常５ｘｔｏ’〜５Ｘ１０”個／ｍＩｌの細胞濃
度となるように添加して移植すればよい。

培養条件は細胞の種類により適宜変更し得るが、動物細
胞の場合には通常３７℃、５％ＣＯ□、１００％相対湿
度の条件にて９６時間以上培養を行えばよい。

〔実施例〕

次いで本発明の実施例を挙げるが、本発明はこれらによ
って何ら限定されるものではない。

実施例１、比較例１１）前培養マイクロキャリアー（ファルマシア　ファインケミカル
社製、Ｃｙｔｏｄｅｘ−１）　３００ａ＋ｇを常法にし
たがって（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＋Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉ
ｅｒ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）膨潤させ、無血清培地（Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地（Ｇ　ｉ　ｂ　ｃ　ｏ社製）に１
０　ｎｇ／ｍＩＥＧＦ　（東洋紡績社製）、５μｇ／ｍ
βインシュリン（シグマ社製）、ｌＩＪｇ／ｍＡ）ラン
スフェリン（シグマ社製）、１μＭ硫酸第一鉄（和光純
薬社製）　、０．０１χ（Ｗ／Ｖ）低分子ゼラチン（＠
ニラと社製）　、１０μｇ　／　ｍ　１葉酸（和光純薬
社製）、１０ｍＭヘペス（シグマ社製）　、０．３χ（
Ｈ／Ｖ）重曹（和光純薬社製）、１００μｇ　／　ｍ　
１ペニシリンＧ（明治製菓社製）、１００μｇ　／　ｍ
　Ｉｔ硫酸ストレプトマイシンを添加した培地）　１０
０　ｍ　Ｉ中にヒト腎臓癌細胞由来の株化細胞ＴＲＣ−
２９Ｒ株（徽工研菌寄第１０２７４号（ＦＥＲＭ　　Ｐ
−１０２７４））懸濁液（培養液１ｍＪ当たり３ＸｌＯ
’個含有）と共に１００ｍｊ！容スピンナーフラスコ（
ベルコ社製）に加えマグネチックスタークー上、３０ｒ
ｐ−で撹拌しながら３７℃、５％炭酸ガスインキュベー
ター内で培養した。培養開始後２日目より毎日８０％の
培養液を新たなものと交換しながら６日間培養を行うと
、細胞がＭｃ上で密生し、飽和増殖（培養液１ｍ１当た
り約１．８Ｘ１０’個の細胞濃度）に達した。

２）剥離工程前記で得た飽和増殖Ｍｃを沈澱させ上清を廃棄し、つい
でＰ　Ｂ　Ｓ　（−）　　（日永製薬社製、Ｃａ　２　
＊Ｍｇ２°不含有のリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，２）　）
に溶解したトリプシン（５００μｇ　／　ｍ　ｌ　、バ
イオザイムラバラトリーズ社製）１０ｍｆｆとＰ　Ｂ　
Ｓ　（−）を加えて最終容量１００ｍｊ！とし、攪拌を
行ってＭｃより細胞を剥離させた。次いで１００メツシ
エフイルターで細胞マイクロキャリアースラリーから使
用済Ｍｃを分離し、細胞浮遊液をＰ　Ｂ　Ｓ　（−）で
１００ｍ１にメスアップした後、２本のフラスコに５０
ｍ１ずつ分注した。

３）接着一方のフラスコには、磁性体含有の固定化プロプアーゼ
阻害剤（ｐ−アミノベンズアミジン−アガロース（ｉｆ
ｉ気分離用）ビーズ、ステロジンバイオケミカル社製）
を１ｍＪ容加え、１０分間弱い撹拌を行って阻害剤にト
リプシンを結合させた。

磁石を用いて、固定化プロテアーゼ阻害剤ビーズを一カ
所に集めながら細胞浮遊液を８　ｍ　１分取し、５倍濃
度のＮａＣ１およびＮ　ａ　ｚ　ＨＰ　Ｏａ　４２Ｈｔ
Ｏ不含有無血清培地〔無血清培地からＮａＣ１およびＮ
ａｔＨＰＯ４４２ＨｔＯを除去した培地、以後５倍濃度
培地と略する〕を２ｍｌ加え、種細胞液とした。予め準
備しておいた無血清培地とＭ　ｃ　３００ｍｇとの懸濁
培地９０ｍｊ＋を１００ｍ１容スピンナーフラスコに加
え次いでこれに種細胞液１０ｍｊ＋を接種した（実施例
１）。

他方のフラスコにはＰ　Ｂ　Ｓ　（−）　　１　ｍ　ｌ
を加え１０分間弱い撹拌を行った後、細胞浮遊液８　ｍ
　ｌを採取し、５倍濃度培地２ｍｌ加え種細胞液とした
。実施例と同様に無血清培地とＭ　ｃ　３００ｍｇとの
懸濁培地９０ｍ１を１００ｍ１容スピンナーフラスコに
加え次いでこれに種細胞液１０ｍ１を接種した（比較例
１）。

前記の実施例１および比較例１のそれぞれのスピンナー
フラスコをマグネチックスターラー上２０〜３Ｑｒｐｎ
＋で撹拌しながら３７℃、５％炭酸ガスインキュベータ
ー内で培養した。細胞を播種した翌日にＭｅに接着した
細胞数を核染色法（Ｓａｎｆｏｒｄ＋Ｋ　１１７７３　
Ｊ、Ｎａｔ、Ｃａｎｃｅｒ　）で測定した。表１に細胞
継代時の細胞接着率を示す。細胞接着率とは、接種した
細胞数に対する翌日までにＭｃに接着した細胞数の比を
百分率で示したものである。

また、培養開始後２日目より毎日８０％の培養液を新た
な培地と交換しながら８日間培養を行い、到達細胞数を
測定し表１に示した。

実施例１の方が比較例１より接着率、到達細胞数いずれ
も高く、固定化プロテアーゼ阻害剤使用の効果が明らか
であった。

表１実施例２、比較例２１）接着実施例１の１〉前培養および２）剥離工程にて得られた
細胞浮遊液５０ｍ１ずつを分注した２本のフラスコを用
意し、一方のフラスコには固定化プロテアーゼ阻害剤（
ファルマシア社製、ベンズアミジン−セファロース　６
Ｂ）１ｍ１ｇｅｌを充填したカラム（８Ｘ２０ｍｍ）の
還流装置を無菌的に装着させ、４ｍ１／分の流速で３０
分間還流することにより、カラム内の固定化プロテアー
ゼ阻害剤にトリプシンを結合させた（実施例２）。

他方のフラスコには滅菌したｐ−アミノベンズアミジン
（シグマ社製）を最終濃度１０ｍＭとなるように加え３
０分間ゆっくりと撹拌したく比較例２）。

それぞれの細胞浮遊液を９ｍＡに、５倍濃度墳地２ｍβ
ずつを加え、種細胞液とした。予め準備しておいた無血
清培地とＭ　ｃ　３００ａ＋ｇとの懸濁培地９９ｍｊｌ
ずつをそれぞれ１００ｍＡ容スピンナーフラスコに加え
次いでこれに種細胞液１０ｍ１ずつを接種した。それぞ
れのスピンナーフラスコをマグネチックスクーラー上２
０〜３０ｒｐｍ＋で撹拌しながら３７℃、５％炭酸ガス
インキュベーター内で培養した。細胞接着率および到達
細胞数の結果を表２に示した。

実施例２の方が比較例２より接着率、到達細胞数いずれ
も高く、固定化阻害剤使用の効果が明らかである。

表２実施例３、比較例３１）前培養マイクロキャリアー（ファルマシア　ファインケミカル
社製、Ｃｙｔｏｄｅｘ−１）　６００ｍｇを常法にした
がって膨潤させ、無血清培地２００ｒｒｌ中にヒト腎臓
癌細胞由来の株化細胞ＴＲＣ−２９Ｒ株（微工研菌寄第
１０２７４号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０２７４））懸濁液
（培養液１ｍ／当たり３Ｘ１０’個含有）と共に２５０
ｍ／容スピンナーフラスコ（テクネ社製）に加えマグネ
チソクスターラー上、３゜ｒｐｎ＋で撹拌しながら３７
℃、５％炭酸ガスインキュベーター内で培養した。培養
開始後２日目より毎日８０％の培養液を新たなものと交
換しながら６日間培養を行うと、細胞がＭｃ上で密生し
、飽和増殖（培養液１ｍｌ当たり約１．８ｘ１０ｓ個の
細胞濃度）に達した。

２）剥離工程前記で得た飽和増殖Ｍｅを沈澱させ上清を廃棄し、つい
でＰ　Ｂ　Ｓ　（−）に？容解したトリプシン（５００
μｇ　／　ｍ　１、バイオザイムラバラトリーズ社製）
２０ｒｒｌ’とＰＢＳ（−ンを加えてＩＩ終容１１００
ｍ７！とじ、撹拌を行ってＭｃより細胞を剥離させた。

次いでｌＯＯメツシュフィルターで細胞マイクロキ中リ
アースラリーから使用済Ｍｃを分離し、細胞浮遊液をＰ
　Ｂ　Ｓ　（−）で１００ｍＪにメスアップし細胞浮遊
液を得た。

３）接着１００ｍ＃容フラスコに細胞浮遊液５０ｎｌを分注し、
磁性体含有の固定化プロテアーゼ阻害剤（ｐ−アミノベ
ンズアミジン−アガロース（磁気分離用）ビーズ、ステ
ロ−ジンバイオケミカル社製）を１ｍｊ！加え、１０分
間弱い撹拌を行って阻害剤にトリプシンを結合させた。

磁石を用いて、固定化プロテアーゼ阻害剤ビーズを一カ
所に集めながら細胞浮遊液を４Ｑｍ１分取し、５倍濃度
培地を１０ｍ１加え、種細胞液とした。予め準備してお
いた無血清培地とＭ　Ｃｌ５００ｍｇとの懸濁培地２０
０ｍ１を５００ｍ１容スピンナーフラスコ（ベルコ社製
）に加え次いでこれに種細胞液５０ｍｊ！を接種した（
実施例３）。

別に５０ｍＪ容遠心チューブに上記２）剥離工程にて得
た細胞浮遊液４０ｍ１を無菌的に移し、１０００ｒｐ１
１．５分間遠心を行って細胞を沈澱させ、上清のトリプ
シン液を廃棄した。次いで５０ｍ１のＰＢＳ（−）で細
胞を充分洗浄した。再度１１０００ｒｐ　、５分間遠心
を行って細胞を沈澱せしめ、洗浄液を廃棄した後、無血
清培地５０ｍ１に細胞を充分分散させ種細胞液とした。

次に予め準備しておいた無血清培地とＭ　ｃ　１５００
ｍｇとの懸濁培地２００ｍ１を５００ｍ１容スピンナー
フラスコに加え種細胞液５０ｍ１を接種した（比較例３
）。

それぞれのスピンナーフラスコをマグネチックスクーグ
−上１５ｒｐｍで撹拌しながらエイプル社製システムフ
ァーメンタ−（Ｍｏｄｅｌ　ＡｌＳ−１２）により、３
７℃、５％炭酸ガス条件下で培養した。細胞を播種した
翌日に無血清培地を２５０ｍ１ずつをそれぞれのフラス
コに加え５００ｍ１容量とし、撹拌を３０ｒｐｎ＋に上
げて培養を行った。培養開始後２日目より連続的に培地
を１日当たり４００ｍ１！交換する方法で８日間培養を
行った。細胞増殖経過を第１図に示した。−・−は実施
例３を、−〇−は比較例３を示す。

図から明らかのように固定化プロテアーゼ阻害剤を使用
した継代法で培養した細胞の増殖性を従来の継代法で培
養した細胞と同等であった。

〔発明の効果〕

本発明の固定化プロテアーゼ阻害剤を用いる培養法によ
れば極めて簡単な操作で付着性細胞の付着が可能となり
伸展等の細胞の増殖においても影響が抑え得るものであ
った。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３および比較例３の継代培養結果を示
す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）付着性細胞の培養において、付着性細胞培養物に
水性媒体中でプロテアーゼを作用せしめて付着性細胞を
剥離した後固定化プロテアーゼ阻害剤を作用せしめ次い
で培養することを特徴とする培養方法。
（２）付着性細胞が、付着性動物細胞である特許請求の
範囲第１項記載の培養方法。
（３）付着性細胞をマイクロキャリアーにて培養するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の培養方法。
（４）水性媒体が、無血清培地または低血清培地である
特許請求の範囲第１項記載の培養方法。
（５）固定化プロテアーゼ阻害剤のプロテアーゼ阻害剤
が、熱殺菌可能である特許請求の範囲第１項記載の培養
方法。
（６）固定化プロテアーゼ阻害剤の固定化担体が、磁性
体保持担体である特許請求の範囲第１項記載の培養方法
。