JPH01500641A - 固定化したセロトニンおよびインドール類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 固定化したセロトニンおよびインドール類似体発明の技術分野 本発明は細胞を接着および成長するための表面と、該表面の形成方法と、該表面 上での細胞の接着促進方法およびその成長方法に関する。

発明の背景技術 哺乳類の細胞などの多種類の細胞の増殖は、その細胞が接着しかつ拡散しうるだ けの和合性のある表面においてのみ行なわれる。

この培養体表面の細胞に対する和合性は、成長媒体の血清成分から特別な粘着性 蛋白質を吸収する能力に関係があると考えられている。

もちろん種々の化学反応に無関係な、例えば蛋白質、が、培養において細胞の成 長に補助的に役立つが、たいていの場合細胞接着およびその成長に関しては、基 体表面上に吸着された粘着性の蛋白質すなわちフィブロネクチンなどが仲立ちを していると考えられている。

また、他の血清蛋白質すなわちビトロネクチンや血清拡散因子も通常の組織培養 における細胞接着の主たる促進媒体として提唱されている。

しかしながら、これらのフィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントある いはビトロネクチンといった粘着性蛋白質は、基体に結合させた場合にそれらの 構造の複雑さと、いわゆる構造機能特異性とによって比較的不安定になる。

したがって、作成した表面上での上記細胞の好適な接着および成長を確実なもの とするには、該細胞や組織へのこれらの蛋白質の適合性について相当の注意を払 う必要がある。

本発明者らは適当な条件下において、セロトニン、トリプタミン、Ｌ−トリプト ファンあるいはその類似体を含有するインドール群から選択したインドールが、 種々の細胞に対して強力な親和力を有するビトロネクチンやフィブロネクチンあ るいはフィブロネクチンフラグメントなどの粘着性蛋白質を培養媒体を含む血清 から吸収することを見出だした。

このことが認識されるまでは、該セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）は 複合糖質とのみ強い相互作用を呈すると考えられていた。

しかしながら、該セロトニンはアガロースビーズと結合することによって固定化 されると、糖蛋白質や糖ペプチドに対して強い親和力を示し、ざらに哺乳類の細 胞の成長のための接着表面として作用することがわかった。

そして、本発明者らは前記セロトニンとその他のインドール類似体が血清蛋白質 を吸収して機能的に安定な複合体を提供し、さらに該複合体は種々の細胞に対し て強い親和力を有することを見出だした。

なお、該インドール類の粘着性血清蛋白質を吸収する性質は本発明者らに先立つ 記録においてはこれまで見当たらない。

発明の開示 従って、本発明は血清蛋白質の固有の結合特性を向上することによって細胞成長 の発生のための改善された機能を有する細胞成長用表面を提供することを目的と する。

さらに本発明により、セロトニン、トリプタミン、Ｌ−トリプトファンあるいは その類似体を含有するインドール群から選択したインドールに吸着される粘着性 血清蛋白質から成り、さらに該インドール−蛋白質複合体が適当な基体に固定化 されている細胞成長用の表面を提供する。

なお、該表面は必要に応じて付着細胞を含んで、該細胞の該表面上における成長 を容易とするための培養開始因子として効果的に作用する。

また本発明により、セロトニン、トリプタミン、Ｌ−トリプトファンあるいはそ の類似体を含有するインドール群から選択したインドールを適当な基体に固定化 することと、該基体に粘着性血清蛋白質を供給することとから成り、該粘着性血 清蛋白質の基体への供給時に、前記インドールが該蛋白質を吸着して細胞成長の ための固定化されたインドール−蛋白質複合体を形成する細胞の接着および成長 用表面の形成方法を提供する。

従って、該表面は上記のように形成されているので、必要に応じて所定の濃度の 細胞を該表面上に供給して、細胞の接着および成長のための培養開始因子とする ことができる。また本発明の他の態様によれば、基体上での細胞接着およびその 成長を促進する方法が提供され、該方法においてはセロトニン、トリプタミン、 Ｌ−）リプトファンあるいはその類似体を含有するインドール群から選択したイ ンドールに吸着された粘着性血清蛋白質から成る表面に細胞を供給することから 成り、さらに該インドール−蛋白質複合体が適当な基体に固定化されている。

従って、本発明の新規性に一貫して共通する要素は、本発明が基体上での細胞接 着および誉の成長を促進する方法を提供し、さらに該方法が、セロトニン、トリ プタミン、Ｌ−トリプトファンあるいはその類似体を含有するインドール群から 選択したインドールから成る表面を提供することと、該表面に生体細胞と粘着性 蛋白質とを含む媒体を提供することとから成ることである。

また当該技術に熟達したものであれば、本発明にょる前記の表面および方法がイ ンビトロおよびインビボの両方において使用可能であることが理解されると考え る。

例えば該表面および方法は、表面を接着細胞によって群集させる必要がある場合 に応用することができ、たとえばアガロースあるいは他の表面上にインドールを 誘導可能として、宿主あるいは供与体細胞による良好な表面再群集を要する維管 束移植のような生体移植を提供可能とする。

さらに、本発明の他の態様として、本発明は新規な表面による人体組織の移植を 提供する。

該表面を形成するに要する基体は、当該業者により適当と考えられるポリマー、 セラミックあるいは金属を使用してもよい。

さらに詳しく例示すると、該ポリマーはアガロース、コラーゲン、ポリビニルア ルコール、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、シリコ ンラバーおよび、ポリヒドロキシエチルメタクリレートがあり、その他結合部位 に遊離の水酸基あるいはチオール基を有するポリマーがある。

また上記セラミック基体としては、アルミナ、部分的に安定化したジルコニウム 、カーボンおよび窒化シリコンなどがあり、さらに金属基体としてプラチナ、チ タニウムおよびイリジウムなどがある。

なお、該基体は上記の特定した例に限らず、もちろん他の適当な基体を使用して もよい。

また、インドールの基体への固定化は当該技術により使用される結合方法あるい は照射移植法（紫外線照射移植を含む）によって行ってもよい。

該結合方法はブロモシアンの存在下において好適に行うことができる。

また、上記粘着性血清蛋白質として通常用いるものは、フィブロネクチン、ビト ロネクチン、およびフィブロネクチンフラグメントなどがある。

好ましい実施態様 以下、本発明を下記に示す例を用いて説明する。

実施例 細胞培養およびラベリング 通常のボビン大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞の栄養系統と、ニワトリ胚繊維芽細胞（ ＣＥ　Ｆ）とをハナン（Ｈａｎｎａｎ）およびマコウスラン（ＭｃＡｕｓｌａｎ ）らによる方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉｎｔ、６　（１９８３）３７５］によって 成長させ維持した。

次に、ベビーハムスタの腎臓（ＢＨＫ）細胞を１０％のウシ胎児血清（Ｆｅ２） で補助したいわゆるグラスゴー変異（ＧＭＥ、Ｍ）最少培地に維持した。

その後、ボビン平滑筋（ＢＳＭ）細胞をハナン（Ｈａｎｎａｎ）およびマコウス ラン（ＭｃＡｕｓｌａｎ）らによる方法［Ｅｘｐ、　Ｃｅ１１．　Ｒｅｓ、　Ｉ ｎＰｒｅｓｓ　（１９８７）コで維持した。

次いで、上記の細胞を樹脂組織培養皿あるいはスピナーフラスコに１０５個／ｍ ｌの割合で１　ｇ　／　１００　ｍ　ｌの変成アガロースビーズに接種した。

固定化したリガンドの作成および使用方法セロトニン−アガロースをブロモシア ン活性化セファロース４Ｂ　（ＰｈａｍａｃＬａ）あるいは活性化セファロース ４８　（Ｐｈａｍａｃｉａ）を用いるハナン、レドモンおよびマコウスランらに よる方法［Ｂ　ｉ　ｏ　ｃ　ｈ　Ｌ　ｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　８０１　（１９８４）３９６］によって作成した 。

該方法はまた、トリプタミンおよびＬ−）リブトファンと前記ブロモシアン（Ｃ ＮＢ　ｒ）活性化セファロース４Ｂとの結合にも用いられる。

また、エタノールアミン−アガロースおよびフィブロネクチン−アガロースも上 記と同一の方法によって作成できる。

ただし、該方法においてはエタノールアミンＩＭまたは３ｍｇ／ｍｌの精製ボビ ン血しょうをそれぞれリガンドとして用いる。

次いで、前記方法で成長させた細胞を１０％ＦＣＮＧＭＥＮ中でアガロースビー ズに固定したリガンドの懸濁液にスピナーフラスコ内で攪拌しながら１ｍｌあた り１０５個の割合で接種し、３７℃で成長させた。

上記細胞の一部は定期的に取出されて以下に示す染色法により該細胞のアガロー スビーズ上での接着およびその成長がモニターされる。

接着細胞の生体染色 上記細胞の形態変異をしらべるために、前記ＢＨＫ細胞を４時間アガロースビー ズ上で成長させたものと、適当な濃度に２４時間継続して同ビーズ上で成長させ たものとを取出してアクリジンオレンジで染色し、４５０ｎｍの波長光で蛍光顕 微鏡によって観察したところ、被覆されていない前記ビーズの淡い青緑色に映え て前記色素によって細胞質が染色されて、明るい赤色に彩どられた細胞の輪郭を はっきりと確認することができた。

このとき、低倍率では該ＢＨＫ細胞の種々の集団段階をみることができ、また高 倍率にすると、個々の細胞および単層中に隣接する細胞同士の輪郭を明確に観察 することができた。従ってこの方法は、種々の表面上におけるあらゆる細胞の接 着および成長の調査に有効であるといえる。

また、他の方法としては位相差顕微鏡あるいは走査電子顕微鏡を用いて細胞の接 着および成長をモニターする方法もあり、これらの方法によって得られた結果は それぞれ上記の方法と同等の水準であると考えられる。

効果 固定化セロトニン、トリプタミンおよびＬ−トリプトファン上での細胞接着およ び成長の速度 まず、前記セロトニン−アガロースビーズを含有する成長媒体中に前記ＢＡＥ細 胞およびＢＨＫ細胞を接種して細胞接着および成長について調べたところ、該細 胞は数時間のうちに該ビーズ表面に接着した。

しかしながら、上記の単純アミンであるエタノールアミンを結合したアガロース ビーズについてこれらの細胞を同様に試みたところ、該細胞の接着および成長は 見られなかった。

また、前記ＢＡＥ細胞、８８Ｍ細胞およびＢＨＫ細胞はセロトニンアガロース、 トリプタミンアガロースあるいはＬ−）リブトラアンアガロース上で、２４時間 経過する迄にフィブロネクチンアガロース上と同様にそれぞれ同等かつ良好に成 長することがわかった。

該ＢＡＥ細胞およびＢＨＫ細胞を成長させた後、該ＢＨＫ細胞は上記ビーズ表面 を単層で完全に占有するまでに成長し、生体培養の形態変異性を有していること がわかった。

この結果２４時間にわたる前記固定化リガンドに対するＢＡＥ細胞、８８Ｍ細胞 およびＢＨＫ細胞の接着度合の定量的評価（表１参照）によって、これらトリプ タミン−アガロース、Ｌ−トリプタミン−アガロースまたはセロトニン−アガロ ース上に接種したすべての細胞が前記フィブロネクチン−アガロース上で成長さ せた最適の場合と同等の細胞密度を形成することが可能であることがわかった。

なお、表１中の固定化リガンド上での前記ＣＥＦ細胞の成長結果については記載 していない。

さらに、前記エタノールアミンによるアガロース誘導体に接種したＢＡＥ細胞、 ８８Ｍ細胞、ＣＥＦ細胞およびＢＨＫ細胞は３日間経過した後も上記細胞接着お よび成長は全くみられなかった。

次に種々の基体上で成長させた前記ＢＨＫ細胞の成長速度について調べた。

固定化したエタノールアミン上での細胞接着および細胞成長がない場合に比べて 、ＢＨＫ細胞はセロトニン−アガロースおよびフィブロネクチン−アガロースの ビーズの両方に数時間で速やかに接着し、さらに３日経過後には高密度になるま でに成長した。

しかしながら、該細胞のセロトニン−アガロースビーズへの初期の接着速度はフ ィブロネクチン−アガロースのビーズ上へのそれよりも遅く、同等の速度となっ たのは６時間経過した後であった。

また、該細胞のトリプタミンアガロースおよびＬ−）リブトノアン−アガロース ビーズ上での接着および成長速度も従来よりも改良されることがわかり、さらに 時間を経過するにつれて前記セロトニンの場合と同等となり、これはそれぞれが インドール類似体と同様の構造を有しているためと考えられる。

このようにして、インビトロにより粘着性蛋白質の存在下、種々の固定化された インドール類似体上に数多くの哺乳類の生体細胞を成長可能とすることにより、 細胞接着およびその成長ための改善された促進方法を提供する新規な表面を得る ことができ、さらに該方法がインビボの場合においても速やかに利用可能となる ことは、当該技術者にとって論を待つところではなく、また維管束移植のような 生体移植に対する特別な応用方法についてもすぐに明らかとなると考えられる。

表１ 固定化リガンドに対する細胞接着及び成長（ａ）　接着した細胞の数はフィブロ ネクチン−アガロースビーズに接着させた場合の数（４時間で５Ｘ１０４個／ｍ １２．２４時間で３Ｘ１０１個／ｄ）に対するパーセントの値として表現した。

またその値は３回の定量の平均値をとり、その誤差は８％以内であった。

ＢＡＥ　：ボビン大動脈内皮細胞 ＢＳＭ：ボビン平滑筋細胞 ＢＨＫ：ペパーハムスター腎臓細胞 間際調査報告 ”ｌｕ＃ｍ４＋％Ｍ−イ１ｗｍｍ＆ＰＣＴ／Ａｌ１８７１ＣＧ２５６Ｎ９こズＴ Ｏフミフξワ国に１ａＯ−箕λにΣだ２ゴＣ艶Ｄξシヘに＝ａＯＪ−Ｍ々＝Ｏ− αＫ）、　ＦＴ’ＡＩＪ　８７００２６６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 〔１〕細胞接着および成長促進用表面において、セロトニン、トリプタミン、Ｌ −トリプトファンあるいはその類似体を含む群から選択したインドールに吸着さ れる粘着性血清蛋白質から成り、さらに該インドール−蛋白質複合体が適当な基 体に固定化されていることを特徴とする細胞接着および成長促進用表面。 〔２〕前記表面がさらに付着細胞を含む請求項１に記載の細胞接着および成長促 進用表面。 〔３〕前記粘着性血清蛋白質がフィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブロネ クチン−フラグメントから成る群から選択される請求項１または２に記載の細胞 接着および成長促進用表面。 〔４〕前記基体がポリマーである請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞接 着および成長促進用表面。 〔５〕前記ポリマーが遊離の水酸基または遊離のチオール基を有するポリマー群 から選択される請求項４に記載の細胞接着および成長促進用表面。 〔６〕前記基体がアガロース、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリエステ ル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、シリコンラバーおよびポリ（ ヒドロキシエチルメククリレート）から成る群から選択される請求項１乃至３の いずれか１項に記載の細胞接着および成長促進用表面。 〔７〕前記基体がセラミックである請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞 接着および成長促進用表面。 〔８〕前記セラミックがアルミナ、部分的に安定化したジルコニウム、カーボン および窒化シリコンを含む群から選択される請求項７に記載の細胞接着および成 長促進用表面。 〔９〕前記基体が金属である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の細胞接着お よび成長促進用表面。 〔１０〕前記金属がプラチナ、チタニウムおよびイリジウムを含む群から選択さ れる請求項９に記載の細胞接着および成長促進用表面。 〔１１〕請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の基体を取込む人体組織移植。 〔１２〕細胞接着および成長用基体を作成する方法において、 （ａ）セロトニン、トリプタミン、Ｌ−トリブトファンあるいはその類似体を含 むインドール群から選択したインドールを適当な基体に固定することと、（ｂ） 粘着性蛋白質を該基体に供給し、前記インドールに該蛋白質を吸着させて、細胞 成長用の固定化したインドール−蛋白質複合体を形成すること、とから成ること を特徴とする細胞接着および成長用基体の作成方法。 〔１３〕前記固定化したインドール−蛋白質複合体を所定濃度の細胞に供給し、 該細胞を前記表面に接着させて細胞成長用の粘着性表面を形成する段階をさらに 含む請求項１２に記載の細胞接着および成長用基体の作成方法。 〔１４〕前記インドールが適当な表面と共有結合によって固定化される請求項１ ２または１３に記載の細胞接着および成長用基体の作成方法。 〔１５〕前記共有結合がシアン化ブロムの存在下で行われる請求項１４に記載の 細胞接着および成長用基体の作成方法。 〔１６〕前記インドールが適当な基体に照射移植法によって固定化される請求項 １２または１３に記載の細胞接着および成長用基体の作成方法。 〔１７〕請求項１２乃至１６のいずれか１項に記載の細胞接着および成長用基体 の作成方法によって行なわれる人体組織移植。 〔１８〕基体上での細胞接着および成長の促進方法において、請求項１乃至１１ のいずれか１項に記載の表面に細胞を提供することから成ることを特徴とする基 体上での細胞接着および成長の促進方法。 〔１９〕基体上での細胞接着および成長の促進方法において、 （ａ）適当な基体に固定化したセロトニン、トリブタミン、Ｌ−トリプトファン あるいはその類似体を含む群から選択したインドールから成る基体を提供するこ とと、（ｂ）生体細胞および粘着性蛋白質を含有する媒体に該表面を供給するこ と、 とから成ることを特徴とする基体上での細胞接着および成長の促進方法。 〔２０〕前記基体上での細胞接着および成長の促進方法が、実質的に前記実施例 に基づいて説明された如きである請求項１９に記載の基体上での細胞接着および 成長の促進方法。