JP2013063922A - タンパク質捕捉剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】一般式(1)
(式中、R1は水素原子、炭素数1から4のアルキル基、または炭素数1から4のハロアルキル基もしくはフェニル基を表し、R2は水素原子、炭素数1から4のアルキル基、炭素数7から11のアラルキル基、アミノ基で置換されていてもよいフェニル基、またはチエニル基を表し、Xは水素原子、ハロゲン原子、炭素数1から4のアルコキシ基、ハロアルコキシ基、または炭素数7から11のアラルキルオキシ基を表す。)で表される2−(インドール−3−イル)エチルアミノ基を、カルボニル基を介して不溶性担体に固定化して得られる、タンパク質の捕捉に有用な捕捉剤。
【選択図】なし
Description
一般式(1)
その具体例として、不溶性担体とカルボニル基導入剤とを反応させ、次いで一般式(1a)
(A)R1がメチル基または4−ヒドロキシフェニル基であり、R2が水素原子であり、Xが水素原子
(B)R1およびR2が水素原子であり、Xが5−クロロ、5−メトキシ、5−ベンジルオキシ、7−メトキシまたは7−ベンジルオキシ
本発明のタンパク質捕捉剤の製造原料であるトリプタミン誘導体(1a)は、市販品として入手可能な化合物や、既知の方法で合成できる化合物を用いることができる。また、必要に応じて、これらの塩酸塩を用いてもよい。トリプタミン誘導体(1a)の不溶性担体(gel)に対する固定化量は、タンパク質の捕捉の性能がよい点で、100μmol/mL(gel)以上が好ましい。
(1)不溶性担体として、ポリメタクリレートゲルであるトヨパール(TOYOPEARL HW−65F、商品名、東ソー社製)を用いた。まず該ゲルを遠沈管に充填し100×gで遠心分離することで、沈降ゲル(10mL)を得た。
(2)吸引濾過により溶媒を除去し、ゲルを1,4−ジオキサン(50mL×5)で洗浄した。
(3)ゲルに1,4−ジオキサン(10mL)と1,1’−カルボニルジイミダゾール(1.0g,6.17mmol)を添加し、40℃で1時間、150rpmでレシプロ振とうし、反応させた。
(4)100×gでゲルを遠心分離し、反応液を吸引濾過した。
(5)ゲルを1,4−ジオキサン(20mL×4)で洗浄することで、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲルを得た。
(1)実施例1に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル(2mL)に、5−メトキシトリプタミンの1,4−ジオキサン溶液(1.23mol/L,1.9mL)を加え、45℃で一晩、150rpmでレシプロ振とうし、反応させた。
(2)反応終了後、ゲルを1,4−ジオキサン(4mL×5)で洗浄した。
(3)さらに水(10mL×10)で洗浄後、0.1mol/L塩酸(10mL)を加え、25℃で15分間、150rpmでロータリー振とうした。
(4)反応液をろ過し、水(10mL×10)で洗浄した。
(5)0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液(10mL)を加え、25℃で15分間、150rpmでロータリー振とうした。
(6)反応液を濾過後、さらに水(10mL×10)で洗浄することで、5−メトキシトリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル(固定化ゲル11)を得た。
(1)実施例2に記載の方法で製造した固定化ゲル11を、オープンカラム(バイオスピンエンプティーカラム、商品名、BioRad社製)に充填し、100×gで1分間遠心分離し、沈降ゲル(0.5mL)を得た。
(2)ヒト免疫グロブリン溶液(150mg/mL,化血研製)3mLを、150mMの塩化ナトリウムを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)(緩衝液A)10.5mLで希釈することでタンパク質溶液(1.5mL,免疫グロブリン50mgを含む)を調製し、これを固定化ゲル11を充填したカラムに添加した。
(3)マイクロチューブローテーター(アズワン社製MTR103)を用いて25℃で一晩回転した後、40×gで2分間遠心濾過した。
(4)カラムに緩衝液A(1.5mL)を加え、40×gで2分間遠心濾過する洗浄操作を、計4回繰り返した。
(5)カラムに100mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH3.0)1.5mLを加え、40×gで2分間遠心濾過するタンパク質回収操作を、計4回繰り返した。
(1)実施例1に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル(2mL)に、5−クロロトリプタミンの(1,4−ジオキサン:水=1:1)溶液(1.23mol/L,1.9mL)を加え、45℃で一晩、150rpmでレシプロ振とうし、反応させた。
(2)反応終了後、得られたゲルを(1,4−ジオキサン:水=1:1)溶液(4mL×5)で洗浄した。
(3)更に水(10mL×10)で洗浄した後、0.1mol/L塩酸(10mL)を加え、25℃で15分間、150rpmでロータリー振とう後、水(10mL×10)で洗浄した。
(4)0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液(10mL)を加え、25℃で15分間、150rpmでロータリー振とうした。
(5)濾過後、さらに水(10mL×10)で洗浄することで5−クロロトリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル(固定化ゲル10)を得た。
実施例3の記載と同様な方法で、固定化ゲル10のタンパク質捕捉量を測定した。タンパク質の捕捉量は42mg/mL(gel)であった。
(1)実施例1に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル(2mL)に、0.3mol/Lの2−(4−ヒドロキシフェニル)トリプタミン塩酸塩の(1,4−ジオキサン:水=1:1)溶液(1.9mL)と、トリエチルアミン(622mg,6.15mmol)を加え、45℃で一晩、150rpmでレシプロ振とうし、反応させた。
(2)反応終了後、水(4mL×5)で洗浄し、更に水(10mL×10)で洗浄した後、0.1mol/L塩酸(10mL)を加え、25℃で15分間、150rpmでロータリー振とうした。
(3)水(10mL×10)で洗浄後、0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液(10mL)を加え、25℃で15分間、150rpmでロータリー振とうした。
(4)濾過後、さらに水(10mL×10)で洗浄することで、2−(4−ヒドロキシフェニル)トリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル(固定化ゲル4)を得た。
実施例3の記載と同様な方法で、固定化ゲル4のタンパク質捕捉量を測定した。タンパク質の捕捉量は40mg/mL(gel)であった。
実施例1の記載と同様な方法で、アガロースゲルであるSepharose 6 Fast Flow(商品名、GEヘルスケア社製)の水酸基をイミダゾリルカルボニル化した。
実施例4の記載と同様な方法で、実施例8に記載の方法で調製した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したアガロースゲル(2mL)への5−クロロトリプタミンの固定化を行ない、5−クロロトリプタミン固定化アガロースゲル(固定化ゲル17)を得た。実施例4の記載と同様な方法で分析した結果、固定化ゲル17に固定化された5−クロロトリプタミンの固定化量は340μmol/mL(gel)であった。
実施例3の記載と同様な方法で、固定化ゲル17のタンパク質捕捉量を測定した。タンパク質の捕捉量は80mg/mL(gel)であった。
実施例1の記載と同様な方法で、セルロースゲルであるセルファインGCL−2000(商品名、チッソ社製)の水酸基をイミダゾリルカルボニル化した。
実施例4の記載と同様な方法で、実施例11に記載の方法で調製した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したセルロースゲル(2mL)への5−クロロトリプタミンの固定化を行ない、5−クロロトリプタミン固定化セルロースゲル(固定化ゲル18)を得た。実施例4の記載と同様な方法で分析した結果、固定化ゲル18に固定化された5−クロロトリプタミンの固定化量は580μmol/mL(gel)であった。
実施例3の記載と同様な方法で、固定化ゲル18のタンパク質捕捉量を測定した。タンパク質の捕捉量は52mg/mL(gel)であった。
1H−NMR(400MHz,DMSO−d6,TMS,ppm):δ 3.12(t,J=7.6Hz,2H),3.80(t,J=7.6Hz,2H),6.80(d,J=8.6Hz,2H),7.00(dd,J=7.6 and 7.6Hz,1H),7.07(dd,J=7.6 and 7.6Hz,1H),7.32(d,J=7.6Hz,1H),7.42(d,J=8.6Hz,2H),7.57(d,J=7.6Hz,1H),7.78−7.82(m,4H),9.61(s,1H),11.0(s,1H).
参考例2 2−[2−(4−ヒドロキシフェニル)インドール−3−イル]エチルアミン塩酸塩の合成
1H−NMR(400MHz,CDCl3,TMS,ppm):δ 3.14(t,J=2.9Hz,4H),3.50(brs,2H),6.76(dd,J=2.1 and 6.6Hz,2H),7.14(ddd,J=1.1 and 7.5 and 7.5 Hz,1H),7.21(ddd,J=1.1 and 7.5 and 7.5Hz,1H),7.26(brs,1H),7.35(dd,J=1.1 and 7.5Hz,1H),7.41(dd,J=2.1 and 6.6Hz,2H),7.61(dd,J=1.1 and 7.5Hz,1H),8.02(s,1H).
実施例および参考例に記載の方法に基づき製造可能な、トリプタミン誘導体、該誘導体を固定化した担体(固定化ゲル)、該固定化ゲルのトリプタミン誘導体固定化量、および該固定化ゲルによるタンパク質(ヒト免疫グロブリン)捕捉量をまとめた表を表1から6に示す。
Claims (8)
- 一般式(1)
- 不溶性担体とカルボニル基導入剤とを反応させ、次いで一般式(1a)
- カルボニル基導入剤が、1,1’−カルボニルジイミダゾールである請求項2に記載のタンパク質捕捉剤。
- R1が水素原子、メチル基または4−ヒドロキシフェニル基であり、R2が水素原子であり、Xが水素原子、5−クロロ、5−メトキシ、5−ベンジルオキシ、7−メトキシまたは7−ベンジルオキシである請求項1から3のいずれかに記載のタンパク質捕捉剤。
- R1およびXが下記(A)または(B)である請求項4に記載のタンパク質捕捉剤。
(A)R1がメチル基または4−ヒドロキシフェニル基であり、Xが水素原子
(B)R1が水素原子であり、Xが5−クロロ、5−メトキシ、5−ベンジルオキシ、7−メトキシまたは7−ベンジルオキシ - 不溶性担体が、水酸基を導入したポリメタクリレート、アガロース、セルロースのいずれかである、請求項1から5のいずれかに記載のタンパク質捕捉剤。
- 請求項1から6のいずれかに記載のタンパク質捕捉剤を用いた、タンパク質の分離精製法。
- タンパク質が、免疫グロブリンまたはその類縁体、フラグメントもしくは融合体である、請求項7に記載の分離精製法。
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Citations (3)
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JPH01500641A (ja) * | 1986-08-15 | 1989-03-09 | コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼイション | 固定化したセロトニンおよびインドール類似体 |
JPH10502339A (ja) * | 1994-06-29 | 1998-03-03 | マッセイ ユニヴァーシティー | イオン化可能原子団を有する疎水性クロマトグラフィー用樹脂 |
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- 2011-09-16 JP JP2011202811A patent/JP2013063922A/ja active Pending
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