BRPI0611227A2 - adsorventes de afinidade para plasminogÊnio - Google Patents

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BRPI0611227A2
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James Christopher Pearson
Claudia Hildegard Kuhn
Jason Richard Betley
Baldev Singh Baines
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Prometic Biosciences Ltd
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Abstract

Para separação, remoção, isolamento, purificação, caracterização, identificação ou quantificação de plasminogênio ou uma proteína que é um análogo de plasminogênio, um adsorvente de afinidade é usado que é um composto da fórmula II em que um X é N e o outro é N, C-Cl ou C-CN; A é uma matriz de suporte, opcionalmente ligada ao anel de triazina por um separador; Z é O, S ou N-R e R é H, alquila C~1-6~, hidroxialquila C~1-6~, benzila ou <225>-feniletila; B é uma ligaçâo de hidrocarboneto opcionalmente substituido contendo de 1 a 10 átomos de carbono; D é H, OH ou um grupo amino primário, amino secundário, amino terciário, amônio quaternário, imidazol, guanidino ou amidino; ou B-D é -CHCOOH- (CH~2~)~3-4~-NH~2~; q é 2 a 6.

Description

ADSORVENTES DE AFINIDADE PARA PLASMINOGÊNIO
CAMPO DA INVENÇÃO
Essa invenção refere-se a compostos e seus usoscomo ligantes de afinidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
0 plasminogênio (alternativamente conhecido comomicroplasmina, PLG ou angioestatina) é um zímógeno deglicoproteina de 91 kDa de cadeia simples e é precursor daenzima plasmina fibrinolitica. A forma nativa deplasminogênio é composta de 791 aminoácidos com ácidoglutâmico localizado na porção do terminal N (Glu-plasminogênio). 0 plasminogênio possui cinco regiõeshomólogas conhecidas como "Kringles". Essas regiões sãoespecificas para os "Kringles" complementares localizados natPA, uPA e protrombina. Esses "Kringles" possuem um sitio deligação de lisina de alta afinidade e quatro sítios deligação de lisina de baixa afinidade que mediam asinterações de plasminogênio com fibrina e alfa-2-antiplasmina.
0 plasminogênio é convertido à plasmina via umacascata de várias reações que resultam na hidrólise daligação do peptídeo Arg560-Val561 de plasminogênio,resultando em duas cadeias que permanecem covalentementeassociadas por uma ligação de dissulfeto. A função principalda protease plasmina semelhante a tripsina é a paralisaçãoda coagulaçâo.
As deficiências de plasminogênio resultantes dasmutações homo- ou heterozigóticas no DNA codificante semanifestam em um número de patologias, incluindoconjuntivite lenhosa e trombose.
O plasminogênio está presente em plasma humano emuma concentração de -100 pg/mL. É possível purificar oplasminogênio do plasma usando lisina imobilizada em umsuporte sólido, em um processo de cromatografia porafinidade que é bem caracterizado. A cromatografia de lisinaimobilizada é também usada para a captura primária dacolheita de cultura celular de proteínas tais como ativadorde plasminogênio de tecido (tPA), comumente usado como umadroga anti-coagulação. As capacidades de ligação de resinascomercialmente disponíveis para plasminogênio estãotipicamente na faixa de 0,6-1,0 mg. de proteína/mL deadsorvente. A pureza, do plasminogênio eluído a partir dessesmateriais é excelente, geralmente com pureza > 95% a partirda captura primária. Seria útil ter um material retendoessas características de excelente pureza de eluição, porémmostrando uma capacidade de ligação em excesso daquelesatualmente disponíveis.
O WO 97/10887 revela compostos baseados emtriazina, úteis como adsorventes de afinidade, de fórmula I
<formula>formula see original document page 3</formula>
em que Ri é H, alquila, hidroxialquila, ciclohexila, NH2,fenila, naftila, 1-fenilpirazol, indazol, benzotiazol,benzoxazol ou benzimidazol, qualquer um dos gruposaromáticos pode ser substituído com um ou mais de alquila,alcoxi, aciloxi, acilamino, amino, NH2, OH, CO2H, sulfonila,carbamoila, sulfamoila, alquilsulfonila e halogênio;
um X é N e o outro é N, C-Cl ou C-CN;
Y é 0, S ou NR2;
Z é 0, S ou NR3;
R2 e R3 são independentemente H, alquila,hidroxialquila, benzila ou β-feniletila;
Q é benzeno, naftaleno, benzotiazol, benzoxazol,1-fenilpirazol, indazol ou benzimidazol;
R4, R5 e Rô são independentemente Η, OH, alquila,alcoxi, amino, NH2, aciloxi, acilamino, CO2H, ácidosulfônico, carbamoila, sulfamoila, alquiisulfonila ouhalogênio;
η é 0 a 6;
ρ é 0 a 20; e
A é uma matriz de suporte, opcionalmente ligada aoanel de triazina por um separador.
Compostos de fórmula I são descritos como tendoafinidade por proteínas tais como imunoglobulinas, insulina,Fator VII ou hormônio de crescimento humano.
Compostos da estrutura relacionada são descritosno WO 00/67900 e WO 03/097112. Eles possuem afinidade porendotoxinas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Surpreendentemente, foi revelado que certoscompostos, muitos dos quais são novos, são úteis paraisolamento baseado em afinidade de plasminogênio. Essescompostos são da fórmula II
<formula>formula see original document page 4</formula>
em que A, X e Z são como definidos pela fórmula I acima;
B é uma ligação de. hidrocarboneto opcionalmentesubstituído contendo de 1 a 10 átomos de carbono;
D é H., OH ou um grupo amino primário, aminosecundário, amino terciário, amônio quaternário, imidazol,guanidino ou amidino; ou
B-D é -CHCOOH-(CH2) 3-4-NH2; e
q é 2 a 6.Além disso, compostos da invenção incluem osligantes correspondentes, nos quais A é substituído por umgrupo funcional, ligado diretamente ou indiretamente ao anelde triazina, que pode ser reagido de forma que o compostoseja imobilizado em uma matriz de suporte. Os termos"ligante" e "adsorvente" podem ser usadosintercambiavelmente abaixo.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Os WO 97/10887, WO 00/67900 e WO 03/097112 revelamcomo as bibliotecas combinatórias de ligantes podem serconstruídas em um suporte sólido. Tais revelações, incluindoexemplos de modalidades e procedimentos comuns para apresente invenção, são incorporadas aqui como referência.Durante a varredura de um conjunto dessas bibliotecascombinatórias com plasma humano agrupado como matéria-prima,um número de ligantes foi identificado como sendo capaz deligar-se seletivamente e eluir plasminogênio humano.
Compostos de formula II, para uso na invenção,podem ser preparados por procedimentos conhecidos poraqueles versados na técnica. Tais procedimentos sãodescritos nas 3 publicações PCT acima identificadas; elespodem ser prontamente adaptados para a preparação de novoscompostos.
Nos compostos da invenção, q é preferencialmente4. Será apreciado que esse ^braço" da molécula é derivado dalisina. B inclui preferencialmente um anel aromático, porexemplo, anel benzênico.
O WO 97/10887 dá exemplos de A, incluindoseparadores ou ligantes L, através dos quais o anel detriazina pode ser ligado a um suporte sólido M. Comodescrito no WO 97/10887, tais suportes incluem agarose,sílica, celulose, dextrano, amido, alginato, carragena,polímeros sintéticos, vidro e óxidos metálicos. Taismateriais podem ser ativados antes da reação para formar umadsorvente dessa invenção.
L pode ser, por exemplo, -T-(-Vi-V') m-, em que
T é O, S ou -NR7-;
m é 0 ou 1;
V1 é um radical de hidrocarboneto opcionalmentesubstituído de 2 a 20 átomos de carbono; e
V2 é 0, S, -C00-, -CONH-, -NHCO-, -PO3H-,-NH-arileno-S02-CH2-CH2- ou -NR8-; e
R7 e R8 são cada um independentemente H ou alquila Ci-6·
Em uma modalidade preferida da invenção, oadsorvente de ligação de plasminogênio é representado pelaestrutura III
<formula>formula see original document page 6</formula>
Erh uma modalidade preferida adicional da invenção,o adsorvente de ligação de plasminogênio é representado pelaestrutura IV
<formula>formula see original document page 6</formula>
Em uma modalidade preferida adicional dá invsnçâo,o adsorvente de ligação de plasminogênio é representado pelaestrutura V<formula>formula see original document page 7</formula>
Os ligantes de ligação de plasminogênio eadsorventes aqui descritos são úteis para o isolamento porafinidade e purificação de plasminogênio de vários fluidos emisturas de complexo incluindo, mas não limitado à plasmahumano, plasma humano drenado de uma ou mais outrasproteínas e sobrenadantes de fermentação recombinante. Essautilidade é demonstrada abaixo no Exemplo 4, porexperimentos de cromatografia usando plasma humano agrupado.
0 termo "plasminogênio" é usado aqui paradescrever o plasminogênio em si e também análogos quepossuem as características funcionais de plasminogênio, porexemplo, em termos de afinidade a um dado composto aquidescrito. Assim, o analito pode ser uma proteína que é um15 fragmento funcional de plasminogênio ou um análogoestrutural tendo um ou mais de todos dos mesmos sítios deligação, ou uma proteína de fusão.
Os seguintes exemplos ilustram a invenção.
Exemplo 1 - Síntese do Adsorvente III
Gel de agarose Purabead reticulado 6% (1000 gdecantado em água de osmose reversa (OR) ) foi suspenso emágua de OR (670 mL) , hidróxido de sódio 10 M (NaOH) (90 mL)e epiclorohidrina (127 mL) . A suspensão foi agitada por 2horas. Após uma amostra ser retirada para análise, asuspensão foi filtrada, então lavada com água de OR(12 χ 1 L) . A análise para grupos epóxi mostrou que o gelfoi derivatizado com 17,3 μπιοί de grupos epóxi por grama degel decantado.O gel foi drenado da água de OR (800 mL) e foiadicionada solução de amônia aquosa de densidade especifica0, 88 (200 mL) . A mistura foi agitada e aquecida a 40°C,então agitada nessa temperatura por 16 horas. Após umaamostra ser retirada para análise, a suspensão foi filtrada,então lavada com água de OR (12 χ 1000 mL) . A análise TNBSpara grupos amina mostrou que o gel foi derivatizado com25,6 pmol de grupos amina por grama do gel decantado.
0 gel aminado decantado (1000 g) foi suspenso emfosfato de potássio 1 M pH 7,0 (1 L) , depois drenado. Foiadicionado a esse gel, fosfato de potássio 1 M pH 7,0(250 mL) e água de OR (250 mL) . A suspensão foi agitadavigorosamente enquanto acetona (500 mL) foi adicionada. Apósresfriamento em um banho gelo/sal durante 30 minutos,cloreto cianúrico (25 g) em acetona fria (250 mL) foiadicionada em uma porção. A mistura foi agitada a 0°C por 1hora, antes de ser lavada com acetona aquosa 50% (5 χ 1 L) ,água de OR (5 χ 1 L) , acetona aquosa 50% (5 χ 1 L) , água deOR (10 χ 1 L) . Antes de uma amostra ser retirada paraanálise, o gel foi deixado decantar sob gravidade. A análisepara liberação de cloreto indicou que o gel foi derivatizadocom 16,8 μιτιοί de diclorotriazina substituída por grama degel decantado.
O gel decantado do estágio anterior (1000 g) foisuspenso com tampão de fosfato de potássio (1 L) contendocloridrato de lisina (45 g) , pH 8,5, a temperatura ambientedurante 16 horas. A suspensão foi filtrada, depois lavadacom água de OR (15 χ 1 L) . Para 950 g (decantado) do gelsuspenso em água de OR (950 mL) etanolamina (14,82 g) foiadicionada. A mistura foi agitada a 60°C durante a noite.Após uma amostra do sobrenadante ter sido retirada paraanálise, a suspensão foi filtrada, depois lavada com água deOR (12 χ 1L) . A análise para liberação de cloreto indicouque o gel tinha sido derivatizado com 22,7 μπιοί deetanolamina por grama de gel decantando.
0 gel foi incubado em uma concentração final deNaOH 0,5 M durante a noite a 40°C, depois lavado com NaOH0,5 M (5 χ 1 L). Após a lavagem final ser drenada sobgravidade, foi adicionado NaOH (IL) e a mistura foi incubadaa 40°C durante a noite. 0 gel foi então lavado com NaOH0,5 M (5 χ 1 L) , depois com água de OR (10 χ 1L) . Apóslavagem com PBS 0,1 M pH 7,0 (3 χ 1 L) , o gel foi lavadodurante um tempo adicional com água de OR (10 χ 1 L) , antesde ser armazenado em um ambiente frio a 40C em etanol aquoso20% v/v.
Exemplo 2 - Síntese do Adsorvente IV
Agarose ativada por diclorotriazina foi preparadade acordo com o método descrito no Exemplo 1. Gel decantado(41,5 g, 22 μιηοΐ DCT/g decantado) foi reagido durante anoite a 60°C com uma solução aquosa de cloridrato de lisina(1,67 g, 10 equivalentes molar) em água (40 mL) enquantomantendo o pH em 9,0 com NaOH 10 M. Nesse ponto, o gel foilavado com dimetilformamida aquosa 50% (5 χ 80 mL) , água deOR (5 χ 80 mL) , HCl 0,1 M (5 χ 80 mL) , isopropanol 30%/NaOH0,2 M (5 χ 80 mL) , e água de OR (5 χ 80 mL) , antes de serarmazenado em ambiente frio a 4°C em etanol aquoso 20% v/v.
Exemplo 3 - Síntese do Adsorvente V
Agarose ativada por diclorotriazina foi preparadade acordo com o método descrito no Exemplo 1. Gel decantado(43 g, 21,1 pmol DCT/g decantado) foi reagido por 30 minutosa 5°C com uma solução de 2-(hidroximetil)anilina (0,56 g, 5equivalentes molar) em 50% de DMF/água (40 mL). Nesse ponto,o gel foi lavado com dimetilformamida aquosa 50%(5 χ 80 mL) , água de OR (5 χ 80 mL) . 0 gel foi então reagidodurante a noite a 60°C com uma solução aquosa de cloridratode 1 isina (1,71 g, 10 equivalentes molar) em água (40 mL)enquanto mantendo o pH a 9,0 com NaOH 10 M. Nesse ponto, o gelfoi lavado com dimetilformamida aquosa 50% (5 χ 80 mL) , águade OR (5 χ 80 mL), HCl 0,1 M (5 χ 80 mL), isopropanol 30%/NaOH0,2 M (5 χ 80 mL) , e água de OR (5 χ 80 mL) , antes dearmazenar em ambiente frio a 40C em etanol aquoso 20% v/v.
Exemplo 4 - Cromatografia com Adsorventes III, IV eV usando plasma humano
Experimentos de cromatografia foram executadosusando uma coluna de cromatografia de 1,6 cm de diâmetrointerno e 10 cm de altura do leito usando sistema decromatografia Akta Explorer. A coluna foi equilibrada comcloreto de sódio 140 mM/citrato de sódio 20 mM/Tris 20 mM pH7,5 a 100 cm/h. Plasma humano (ajustado para Tris 20 mM/ pH7,5 filtrado através de filtros de 3; 0,8; 0,45 e 0,2 pm, 1,3L) foi então carregado a 50 cm/h. A lavagem pós-carregamentofoi executada com cloreto de sódio 140 mM/citrato de sódio 20mM/Tris 20 mM pH 7,5 a 50 cm/h para absorbância da base. Acoluna foi então eluida com cloreto de sódio 140 mM/citrato desódio 20 mM/Tris 20 mM/ ácido ε-aminocapróico 500mM, pH 7,5 a100 cm/h, e regenerado com hidróxido de sódio 0,5 M. Fraçõesde carga, sem restrição e de eluição foram analisadas pornefelometria para determinar capacidades de ligação. A SDS-PAGE foi executada para determinar a pureza.
A pureza de frações de eluição de todos osadsorventes foi > 85%. Capacidades de ligação dinâmicas (em10% de penetração) são mostradas na Tabela 1.
Tabela 1
<table>table see original document page 10</column></row><table>

Claims (7)

1. Uso de um adsorvente de afinidade paraseparação, remoção, isolamento, purificação,caracterização, identificação ou quantificação deplasminogênio ou uma proteína que é um análogo deplasminogênio, caracterizado pelo fato de que o adsorventede afinidade é um composto de fórmula II<formula>formula see original document page 11</formula>em que um X é N e o outro é N, C-Cl ou C-CN;A é uma matriz de suporte, opcionalmente ligadaao anel de triazina por um espaçador;Z é 0, S ou N-R e R é H, alquila Ci-6,hidroxialquila Ci-6, benzila ou β-feniletila;B é uma ligação de hidrocarboneto opcionalmentesubstituído contendo de 1 a 10 átomos de carbono;D é H, OH ou um grupo amino primário, aminosecundário, amino terciário, amônio quaternário, imidazol,guanidino ou amidino; ouB-D é -CHCOOH-(CH2) 3-4-NH2; eq é 2 a 6.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o adsorvente é de fórmula<formula>formula see original document page 11</formula>
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o adsorvente é de fórmula IV
4. Uso, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o adsorvente é de fórmula V<formula>formula see original document page 12</formula>
5. Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de queo plasminogênio está em uma amostra de plasma.
6. Composto novo, caracterizado pelo fato de serda fórmula II, conforme definido em qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5.
7. Composto, que é um precursor de um compostoconforme a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de queA é substituído por um grupo funcional, diretamente ouindiretamente ligado ao anel de triazina, o qual permiteimobilização do precursor em um suporte sólido.
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