PT1885485E

PT1885485E - Adsorventes de afinidade para plasminogênio

Info

Publication number: PT1885485E
Application number: PT06727050T
Authority: PT
Inventors: Richard Betley Jason; Christopher Pearson James; Hildegard Kuhn Claudia; Singh Baines Baldev
Original assignee: Prometic Biosciences Ltd
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2016-06-02
Also published as: CN101171078B; AU2006245575A1; WO2006120423A1; ES2573464T3; US7998960B2; US20080293925A1; DK1885485T3; BRPI0611227A2; CA2607851A1; CA2607851C; GB0509438D0; NZ563165A; EP1885485B1; JP2008540497A; CN101171078A; EP1885485A1; NO20075784L; JP4933535B2; MX2007013947A; AU2006245575B2

Description

DESCRIÇÃO ADSORVENTES DE AFINIDADE PARA PLASMINOGÊNIO Campo de invenção

Esta invenção refere-se a compostos e a sua utilização como ligandos de afinidade.

Antecedentes da Invenção 0 plasminogénio (alternativamente conhecido como microplasmina, PLG ou angiostatina) é uma cadeia simples de 91 kDa glicoproteina zimogénio, e é o precursor da plasmina enzima fibrinolitica. A forma nativa de plasminogénio é composta por 791 aminoácidos com ácido glutâmico localizado na porção N-terminal (Glu-plasminogénio). 0 plasminogénio possui cinco regiões homólogas conhecidas como Kringles. Estas regiões são específicos para os Kringles complementares localizados em tPA, uPA e protrombina. Estes kringles tem uma alta afinidade e quatro baixa afinidade locais que mediam as interações de plasminogénio com fibrina e alfa-2-antiplasmina ligação lisina. 0 plasminogénio é convertido em plasmina através de uma cascata de várias reações que resultam na hidrólise da ligação peptídica Arg560-Val561 de plasminogénio, resultando em duas cadeias, que permanecem associadas de forma covalente por uma ponte dissulfureto. 0 principal papel da plasmina protease tipo tripsina é a repartição de coágulos.

Deficiências resultantes de mutações de plasminogénio homo-ou heterozigotas no DNA de codificação se manifestar de uma série de patologias, incluindo conjuntivite lenhosas e trombose. 0 plasminogénio está presente no plasma humano a uma concentração de -100 pg/ml. É possível purificar o plasminogénio a partir de plasma usando lisina imobilizada num suporte sólido, em um processo de cromatografia de afinidade que está bem caracterizado. Cromatografia em lisina imobilizada é também utilizada para a captura primária de colheita de cultura de células de proteínas tais como o ativador do plasminogénio tecidual (tPA), vulgarmente utilizado como uma droga anticoagulante. As capacidades de ligação das resinas disponíveis comercialmente para plasminogénio são tipicamente na gama de 0,6-1,0 mg de proteína/mL de adsorvente. A pureza do plasminogénio eluída a partir destes materiais é excelente, com pureza rotineiramente> 95% de captação primária. Seria útil dispor de um material de retenção estas características de excelente pureza de eluição, mas exibindo uma capacidade de ligação em excesso do que os existentes atualmente.

O documento WO97/10887 divulga compostos à base de triazina, úteis como adsorventes de afinidade, de fórmula I

em que Ri é H, alquilo, hidroxialquilo, ciclo-hexilo, NH2, fenilo, naftilo, 1-fenilpirazole, indazole, benzotiazole, benzoxazole ou benzimidazole, qualquer um dos quais grupos aromáticos podem ser substituídos com um ou mais de alquilo, alcoxi, aciloxi, acilamino, amino, NH2, OH, CO2H, sulfonilo, carbamoilo, sulfamoilo, alquilsulfonilo e halogénio; um X é N e o outro é N, C-Cl ou C-CN; Y é 0, S ou NR2; Z é 0, S ou NR3; R2 e R3 são cada um H, alquilo, hidroxialquilo, benzilo ou β-feniletilo; Q é benzeno, naftaleno, benzotiazole, benzoxazole, 1-fenilpirazole, indazole ou benzimidazole; R4, R5 e R6 são cada um H, OH, alquilo, alcoxi, amino, NH2, aciloxi, acilamino, CO2H, ácido sulfónico, carbamoilo, sulfamoilo, alquilsulfonilo ou halogénio; n é 0 a 6; p é 0 a 2 0; e A é uma matriz de suporte, opcionalmente ligado ao anel de triazina por um espaçador.

Os compostos de fórmula I são revelados como tendo afinidade para proteínas tais como imunoglobulinas, insulina, Fator VII ou a hormona de crescimento humano.

Os compostos de estrutura relacionada são divulgados no documento WO00/67900 e WO03/097112. Eles têm afinidade para endotoxinas.

Sumário da invenção

Surpreendentemente, verificou-se que certos compostos, muitos dos quais são novos, são úteis para o isolamento com base em afinidade de plasminogénio. Estes compostos são definidos nas reivindicações 1, 3 e 4.

Descrição da Invenção WO97/10887, WO00/67900 e W0003/097112 revelam como bibliotecas combinatórias de ligantes podem ser construídas sobre um suporte sólido. Durante o rastreio de um conjunto destas bibliotecas combinatórias com plasma humano como matéria-prima, um certo número de ligandos foram identificados como sendo capaz de se ligar selectivamente e eluindo plasminogénio humano.

Os compostos de fórmula III, IV e V, para uso no invento, podem ser preparados por procedimentos conhecidos dos peritos na arte. Tais procedimentos são descritos nas publicações PCT 3 identificadas acima; eles podem ser facilmente adaptados para a preparação de novos compostos. 0 documento WO97/10887 descreve exemplos de A, incluindo espaçadores ou ligantes L, através do qual o anel de triazina podem ser ligados a um suporte sólido M. Tal como descrito em WO97/10887, tais suportes incluem agarose, sílica, celulose, dextrano, amido, óxidos de alginato, carragenano, polímeros sintéticos, vidro e metal. Tais materiais podem ser ativados antes de reação para formar um adsorvente deste invento. L pode ser, por exemplo, -T- (-V^V2)m-, em que T é 0, S ou -NR7-; m é 0 ou 1; V1 é um radical de 2 a 20 átomos de C de hidrocarboneto opcionalmente substituído; e V2 é 0, S, -COO-, -C0NH-, -NHCO-, -PO3H-, -NH-arileno-S02-CH2-CH2- ou -NRs-; e R7 e R8 são cada um independentemente H ou Ci-e alquilo.

0 adsorvente de ligação ao plasminogénio é representado pela estrutura III

0 adsorvente de ligaçao ao plasminogénio para utilização na invenção também é representado pela fórmula estrutural IV

0 adsorvente de ligação ao plasminogénio é representado pela fórmula estrutural V

Os ligantes e adsorventes aqui descritos de ligação do plasminogénio são úteis

para o isolamento e purificação de afinidade de plasminogénio a partir de vários fluidos e misturas complexas, incluindo, mas não se limitando a, plasma humano, plasma humano desprovido de um ou mais outras proteínas e os sobrenadantes de fermentação recombinantes. Esta utilidade é demonstrada no Exemplo 4 abaixo, através de experiências de cromatografia utilizando plasma humano reunido. 0 termo "plasminogénio" é aqui utilizado para descrever plasminogénio si e também os análogos que possuem as características funcionais do plasminogénio, por exemplo em termos de afinidade para um determinado composto aqui descrito. Deste modo, o analito pode ser um proteína que é um fragmento funcional de plasminogénio ou um análogo estrutural tendo um, mais de todos os mesmos locais de ligação, ou uma proteína de fusão.

Os seguintes Exemplos ilustram a invenção.

Exemplo 1 - Síntese de adsorvente III 6% gel de agarose Purabead reticulado (1,000 g assente na osmose reversa (OR) de água) foi empastado com água RO (670 mL) , 10 M de hidróxido de sódio (NaOH) (90 mL) e epicloridrina (127 ml ) . A lama foi agitada durante 2 horas. Depois de uma amostra foi retirada para análise, a suspensão foi filtrada, em seguida, lavou-se com água RO (12 x 1 L). Análise para grupos epoxi mostrou que o gel foi derivatizado com 17,3 pmol de grupos epoxi por g de gel estabelecido. 0 gel foi drenado antes RO água (800 ml) e solução de 0,88 de gravidade específica aquosa de amoníaco (200 ml) foram adicionados. A mistura foi agitada e aquecida a 40 °C, depois agitada a esta temperatura durante 16 horas. Depois de uma amostra foi retirada para análise, a suspensão foi filtrada, em seguida, lavou-se com água RO (12 x 1000 mL) . TNBS para análise grupos amina mostraram que o gel foi derivatizado com grupos amina 25,6 mmol por g de gel estabelecido. O, gel de aminada constante (1,000 g) foi suspenso em 1 M de fosfato de potássio pH 7,0 (1 L) , depois deixou-se drenar. Para este gel, em seguida, foi adicionado 1 M de fosfato de potássio pH 7,0 (250 ml), e água RO (250 mL). A lama foi agitada vigorosamente enquanto acetona (500 mL) foi adicionado. Após arrefecimento num banho de gelo/sal durante 30 minutos, cloreto cianúrico (25 g) em acetona fria (250 mL) foi adicionado em uma porção. A mistura foi agitada a 0 °C ao longo de 1 hora, antes de ser lavada com acetona aquosa a 50% (5 x 1 L), água RO (5 x 1 L), solução aquosa de acetona a 50% (5 x 1 L), e água RO (10 x 1 L) . O gel foi deixado sedimentar sob gravidade, antes que uma amostra foi retirada para análise. Análise para libertação cloreto indicaram que o gel foi derivatizado com 16,8 pmol de diclorotriazina substituídos por g de gel estabelecido.

Gel estabelecido a partir da fase anterior (1,000 g) foi misturado com tampão de fosfato de potássio 1 Μ (1 L) contendo cloridrato de lisina (45 g), pH 8,5, à temperatura ambiente durante 16 horas. A suspensão foi filtrada, em seguida, lavou-se com água RO (15 x 1 L). etanolamina a 950 g (assente) do gel de uma lama em água RO (950 mL) foi adicionado (14,82 g). A mistura foi agitada a 60 °C durante a noite. Depois de uma amostra do sobrenadante foi retirada para análise, a suspensão foi filtrada, em seguida, lavou-se com água RO (12 x 1 L). Análise para libertação cloreto indicaram que o gel tinha sido derivatizada com 22,7 mmol de etanolamina por g de gel estabelecido. 0 gel foi incubado numa concentração final de 0,5 M de NaOH durante a noite a 40 °C, depois lavou-se com NaOH 0,5 M (5 x 1 L) . Após a lavagem final foi deixada a escorrer por gravidade, foi adicionado NaOH 0,5 Μ (1 L) e a mistura foi incubada at'40 °C durante a noite. O gel foi então lavado com NaOH 0,5 M (5 x 1 L), depois com água RO (10 x 1 L) .

Após a lavagem com PBS a 0,1 M pH 7,0 (3 x 1 L), o gel foi lavado mais uma vez com água RO (10 x 1 L) , antes do armazenamento na câmara fria a 4 °C em 20% v/v de etanol aquoso.

Exemplo 2 - Síntese de adsorvente IV

Agarose ativada por diclorotriazina foi preparada de acordo com o método descrito no Exemplo 1. gel estabelecido (41,5 g, 22 mmol TDC/g resolvido) foi feita reagir durante a noite a 60 °C com uma solução aquosa de cloridrato de lisina (1,67 g, 10 o equivalentes molares) em água (40 ml) enquanto se mantinha o pH a 9,0 com NaOH a 10 m. Neste ponto, o gel foi lavado com 50% de formamida aquosa de dimetilo (5 x 80 mL) , água RO (5 x 80 mL) , 0,1 M HC1 (5 x 80 mL), 30% de isopropanol/NaOH a 0,2 M (5 x 80 mL), e água RO (5 x 80 mL), antes de serem armazenadas na câmara fria a 4 °C em 20% de etanol v/v aquoso.

Exemplo 3 - Síntese de adsorvente V

Agarose ativada por diclorotriazina foi preparada de acordo com o método descrito no Exemplo 1. gel estabelecido (43 g, 21,1 mmol TDC/g resolvido) foi feita reagir durante 30 minutos a 5 °C com uma solução de 2- (hidroximetil) anilina ( 0,56 g, 5 equivalentes molares) em 50% de DMF/água (40 mL). Neste ponto, o gel foi lavado com 50% de formamida de dimetilo aquoso (5 x 80 mL) , e água RO (5 x 80 mL) . O gel foi em seguida feito reagir durante a noite a 60 °C com uma solução aquosa de cloridrato de lisina (1,71 g, 10 equivalentes molares) em água (40 mL) enquanto se mantinha o pH a 9,0 com NaOH 10 M. Neste ponto, o gel foi lavado com 50% de formamida aquosa de dimetilo (5 x 80 mL), água RO (5 x 80 mL) , 0,1 M HC1 (5 x 80 mL), 30% de isopropanol/NaOH a 0,2 M (5 x 80 mL) , e água RO (5 x 8 0 mL) , antes de serem armazenadas na câmara fria a 4 °C em 20% de etanol v/v aquoso.

Exemplo 4 - A cromatografia com adsorventes III, IV e V utilizando plasma humano [0026] experiências de cromatografia foram realizados usando um diâmetro interno de 1,6 cm, a 10 cm de altura do leito da coluna de cromatografia de coluna utilizando um sistema de cromatografia Akta Explorer. A coluna foi equilibrada com cloreto de sódio 140 mM/citrato de sódio 20 mM/Tris 20 mM, pH 7,5 a 100 cm/hr. 0 plasma humano (ajustado para Tris 20 mM/pH 7,5 filtrada através de 3, 0,8, 0,45 e 0,2 pm, filtros de 1,3 L) foi então carregado a 50 cm/hr. lavagem pós-carga estava com com cloreto de sódio 140 mM/citrato de sódio 20 mM/Tris 20 mM pH 7,5 a 50 cm/hr à linha de base absorção. A coluna foi então eluida com citrato de cloreto de sódio a 140 mM/20 mM de sódio/Tris 20 mM/ácido mM ε-aminocapróico 500, pH 7,5 a 100 cm/h, e regenerado com hidróxido de sódio 0,5 M. Load, não ligado, e frações de eluição foram analisados por nefelometria para determinar capacidades de ligação. SDS-PAGE foi efetuada para determinar a pureza. A pureza das fracções de eluição a partir de todos os adsorventes foi> 85%. As capacidades de ligação dinâmica (a 10% de protecção) são mostradas na Tabela 1.

Tabela 1

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Utilização de um adsorvente de afinidade para a separação, remoção, o isolamento, purificação, caracterização, a identificação ou quantificação de plasminogénio ou de uma proteína que é um análogo de plasminogénio, em que o adsorvente de afinidade é um composto de fórmula III, IV ou V:

em que A é uma matriz de suporte, opcionalmente ligado ao anel de triazina por um espaçador.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o plasminogénio é, numa amostra de plasma.
3. Um composto de fórmula III

em que A é uma matriz de suporte, opcionalmente ligado ao anel de triazina por um espaçador. em que A é uma matriz de suporte, opcionalmente ligado ao anel de triazina por um espaçador.
4. Um composto de fórmula V

em que A é uma matriz de suporte, opcionalmente ligado ao anel de triazina por um espaçador.
5. Um composto que é um precursor de um composto de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que A é substituído por um grupo funcional, ligado diretamente ou indiretamente ao anel de triazina, que permite a imobilização do precursor num suporte sólido.