JP5498025B2 - 新規なチアゾール誘導体固定化マトリックス、及びその製造方法 - Google Patents
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−エトキシピリジン−5−イル基、2,3−ジメチルピリジン−5−イル基、ピリジル−4−イル基、2−メチルピリジン−4−イル基、2−エチルピリジン−4−イル基、2−メトキシピリジン−4−イル基、2−エトキシピリジン−4−イル基、2−ピリミジル基、5−メチルピリミジン−2−イル基、5−エチルピリミジン−2−イル基、2−エトキシピリジン−5−イル基、2,3−ジメチルピリジン−5−イル基、2−メチルピリジン−4−イル基、2−エチルピリジン−4−イル基、2−メトキシピリジン−4−イル基、2−エトキシピリジン−4−イル基、5−クロロピリミジン−2−イル基、5−ブロモピリミジン−2−イル基、5−メトキシピリミジン−2−イル基、ピリミジル−4−イル基、ピリミジル−5−イル基、1,2,4−トリアジン−3−イル基、1,2,4−トリアジン−5−イル基、1,2,4−トリアジン−6−イル基、ベンゾジオキソラン−3−イル基、ベンゾフラン−2−イル基、ベンゾフラン−3−イル基、ベンゾフラン−4−イル基、ベンゾフラン−5−イル基、ベンゾフラン−6−イル基、ベンゾフラン−7−イル基、ベンゾチオフェン−2−イル基、ベンゾチオフェン−3−イル基、ベンゾチオフェン−4−イル基、ベンゾチオフェン−5−イル基、ベンゾチオフェン−6−イル基、ベンゾチオフェン−7−イル基、1−メチルインドール−2−イル基、ベンゾチアゾール−2−イル基、ベンゾチアゾール−4−イル基、ベンゾチアゾール−5−イル基、ベンゾチアゾール−6−イル基、ベンゾチアゾール−7−イル基、ベンズイソキサゾール−3−イル基、ベンズイソキサゾール−4−イル基、ベンズイソキサゾール−5−イル基、ベンズイソキサゾール−6−イル基、ベンズイソキサゾール−7−イル基、ナフタレン−1−イル基、ナフタレン−2−イル基、キノリン−2−イル基、キノリン−3−イル基、キノリン−4−イル基、キノリン−5−イル基、キノリン−6−イル基、キノリン−7−イル基、キノリン−8−イル基、キノキサリン−5−イル基、キノキサリン−6−イル基、キナゾリン−4−イル基、キナゾリン−5−イル基、キナゾリン−6−イル基、キナゾリン−7−イル基、キナゾリン−8−イル基、ベンゾオキサジン−5−イル基、ベンゾオキサジン−6−イル基、ベンゾオキサジン−7−イル基、ベンゾオキサジン−8−イル基、ベンゾチアジン−5−イル基、ベンゾチアジン−6−イル基、ベンゾチアジン−7−イル基、ベンゾチアジン−8−イル基、1,3−ベンゾジオキソール−4−イル基、1,3−ベンゾジオキソール−5−イル基、1,3−ベンゾジオキソール−6−イル基、1,3−ベンゾジオキソール−7−イル基、アントラセン−1−イル基等を例示することができる。
工程1はフタルイミド誘導体(2)をアシルチオウレア誘導体(3)と反応させ、チアゾール誘導体(4)を合成する方法である。フタルイミド誘導体(2)は非特許文献2や特許文献7等を参考に合成することができる。
製造方法2は2−置換アミノチアゾール誘導体(5)と酸ハロゲン化物(6)を反応させ、チアゾール誘導体(4a)を製造する方法である。当該方法の反応では、反応は溶媒中で行なうことが好ましく、反応に害を及ぼさない溶媒であれば使用することができ、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2−ジクロロエタンなどのハロゲン系溶媒、ジエチルエーテル、THF、DME、ジオキサンなどのエーテル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ベンゼン、トルエン、キシレン、クロロベンゼンなどの芳香族炭化水素系溶媒、DMF、N−メチルピロリドンなどのアミド系溶媒、DMSO、水あるいはこれらの混合溶媒を用いることができ、収率が良い点でジクロロメタン、クロロホルム、1,2−ジクロロエタンなどのハロゲン系溶媒を用いるのが好ましい。反応温度については特に制限はないが、0℃から150℃の範囲から適宜選ばれた温度で反応させることにより目的物を得ることができ、収率が良い点で0℃から100℃の範囲で反応させるのが好ましい。本工程では、塩基存在下に行なうこともでき、塩基としては、水素化ナトリウム、ナトリウムアミド、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウム−tert−ブトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩基、トリエチルアミン、トリブチルアミン、N−メチルモルホリン、ピリジン、ジメチルアニリンなどの有機アミン類を用いることができる。塩基の使用量は特に制限はないが、反応基質に対して等量以上用いて反応を実施することにより、収率良く目的物を得ることができる。反応終了後は、通常の後処理操作により目的物を得ることができるが、必要であればカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などにより精製することもできる。当該方法で合成されたチアゾール誘導体(4a)は、製造方法1の工程2を経由することによって、チアゾール誘導体(1a)へと導くことができる。
製造方法3はチアゾール誘導体(1a)と活性化基(活性化基とは、アミノ基あるいはアンモニウム塩と容易に反応できる官能基のことで、例えば、スクシンイミドオキシカルボニル基、ホルミル基、カルボキシル基、2,2,2−トリフルオロエチルスルホニル基(トレシル基)、塩化スルホニル基、トシル基、ビニルスルホニル基、エポキシ基をあげることができる。)含有マトリックスと反応させてチアゾール誘導体固定化マトリックス(1)を製造する方法である。なお、当該方法で用いる活性化基含有マトリックスの活性化基としては、スクシンイミドオキシカルボニル基、ホルミル基、2,2,2−トリフルオロエチルスルホニル基(トレシル基)、エポキシ基、カルボキシル基が特に好ましい。また、当該方法で用いる活性化基含有マトリックスは、活性化基を有しないマトリックスから周知の方法で活性化基を付加することで調製しても良く、HiTrap NHS−activated HP(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)、エポキシトヨパール(商品名)、ホルミルトヨパール(商品名)、トレシルトヨパール(商品名)、カルボキシトヨパール(商品名)(以上東ソー株式会社製)、活性化キトパールK−66(商品名)ゲル(富士紡ホールディングス株式会社製)、BIOACT EPO(商品名)ゲル(昭和電工株式会社製)、POROS−EP(商品名)ゲル(アプライドバイオシステムズ株式会社製)、セルファインホルミル(商品名)ゲル(チッソ株式会社製)、Profinity Epoxide(商品名)ゲル(バイオラッド株式会社製)、M.S.GEL Epoxy−D−50−1000AW(商品名、AGCエスアイテック株式会社製)などのリガンド固定化用担体として市販されているものをそのまま用いても良い。
(合成例1)
アルゴン雰囲気下、4−メチル−N−{5−(4−フタルイミドブチル)チアゾール−2−イル}ベンズアミド(0.105g,0.25mmol)とフェロセン(0.023g,0.125mmol)に、DMSO(1.5mL)、3M−ヨウ化トリフルオロメチル/DMSO溶液(0.25mL,0.75mmol)、1M−硫酸/DMSO溶液(0.25mL,0.25mmol)を加えて撹拌した。この溶液に、室温下で31%過酸化水素水(75μL,0.75mmol)を滴下した。反応終了後、反応溶液を水(200mL)にあけ、しばらく撹拌した。クロロホルムで抽出し、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、4−メチル−N−{4−トリフルオロメチル−5−(4−フタルイミドブチル)チアゾール−2−イル}ベンズアミドの白色固体(0.023g,19%)を得た。1H−NMR(CDCl3,TMS,ppm):δ 1.79から1.82(m,4H),2.47(s,3H),3.01(t,J=7.5Hz,2H),3.76(t,J=7.5Hz,2H),7.34(d,J=7.5Hz,1H),7.72から7.90(m,6H),9.37(s,1H);19F−NMR(CDCl3,TMS,ppm):−60.87。
合成例1または2の方法に準じて、表1から12に記載したチアゾール誘導体を得た。
合成例89の方法に準じて、表13から26に記載したチアゾール誘導体を得た。
チアゾール誘導体を40μmol/mLになるようDMSOに溶解し、これに等量の0.5M 塩化ナトリウムを含む0.2M 炭酸ナトリウム緩衝液(pH8.3)を加えて濃度20μmol/mLのチアゾール誘導体溶液を調製した。N−ヒドロキシスクシニミド(NHS)にて活性化されたアガロースゲルであるHiTrap NHS−activated HP 1mL(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製;以下HiTrapカラムと略記する)に、非特許文献3に記載された方法に従って前記チアゾール誘導体溶液を2mL通液することによって固定化を行なった。未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングは、非特許文献3に記載された方法に従って行なった。固定化量は非特許文献3に記載された方法のうち「B.酸性条件法」に従って、HiTrapカラム通液前後のリガンド(チアゾール誘導体)溶液の紫外吸収極大波長(300nm付近)における吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定することにより算出した。当該方法で固定化した各化合物の固定化リガンド密度を表42に示す。なお、本実施例以降で記載の化合物番号は表33から41記載の化合物番号に対応する。
チアゾール誘導体を20μmol/mL、トリエチルアミンを40μmol/mL含むDMSO溶液を調製した。HiTrapカラムをDMSOで置換後、これに前記チアゾール誘導体−トリエチルアミンのDMSO溶液を2mL通液した。一時間放置した後、HiTrapカラムに3mLのDMSOを通液して、さらに5mLの0.5M 塩化ナトリウムを含む0.2M 炭酸ナトリウム緩衝液(pH8.3)を通液した。未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングは、非特許文献3に記載された方法に従って行なった。固定化量は非特許文献3に記載された方法のうち「B.酸性条件法」に従って、HiTrapカラム通液前後のリガンド(チアゾール誘導体)溶液の紫外吸収極大波長(300nm付近)における吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定することにより算出した。当該方法で固定化した化合物304の固定化リガンド密度を表43に示す。
実施例2あるいは3に記載の方法にて調製したチアゾール誘導体固定化HiTrapカラムをAKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウムを含む10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)(以下平衡化緩衝液と呼ぶ)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したヒト血漿由来免疫グロブリン製剤(化血研製、本製剤の免疫グロブリンは免疫グロブリンGである)0.5mg(OD280=0.7)を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、平衡化緩衝液から10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。免疫グロブリンのカラムからの溶出は280nmにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。チアゾール誘導体を固定化したHiTrapカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図1から図6に示し、これらのクロマトグラフィーにおける免疫グロブリンの回収率を表44に示す。いずれのチアゾール誘導体を用いたときも免疫グロブリンは50%以上の回収率で回収され、チアゾール誘導体固定化HiTrapカラムによる免疫グロブリンの吸脱着が確認された。特に化合物286、304、329を用いた場合の回収率は90%以上と極めて高かった。
実施例2あるいは3に記載の方法にて調製したチアゾール誘導体固定化HiTrapカラムをAKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、前記平衡化緩衝液を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン(SIGMA社製)0.5mg(OD280=0.3)を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、平衡化緩衝液から10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は280nmにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。各種チアゾール誘導体を固定化したHiTrapカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図7から12に示す。また、これらのクロマトグラフィーにおけるウシ血清アルブミンの回収率を表45に示す。いずれのチアゾール誘導体を用いたときもウシ血清アルブミンは10番目の画分までに溶出しており、カラムへの吸着はほとんど見られなかった。また、図1から6に示した免疫グロブリンを通液したときの結果とは大きく異なっていた。よって、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いることで、試料中の免疫グロブリンとウシ血清アルブミンとの分離が可能であることが示された。
実施例2に記載の方法にて調製した化合物286を固定化したHiTrapカラムをAKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、前記平衡化緩衝液を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したリボヌクレア−ゼA、リゾチ−ム、αキモトリプシノ−ゲンAの混合液(リボヌクレア−ゼA 0.15mg、リゾチ−ム 0.03mg、αキモトリプシノ−ゲンA 0.04mg)(OD280=0.24)を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、平衡化緩衝液から10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。タンパク質のカラムからの溶出は280nmにおける吸光度の吸光度をモニターして検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物286を固定化したHiTrapカラムを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図13に示し、このクロマトグラフィーにおけるタンパク質の回収率を表46に示す。いずれのタンパク質も10番目の画分以内に溶出しており、免疫グロブリン(25番目から45番目までの画分に溶出、図1参照)とは異なる画分となった。このことから、本発明のチアゾール誘導体固定化マトリックスを用いることで、試料中の免疫グロブリンとリボヌクレア−ゼA、リゾチ−ム、αキモトリプシノ−ゲンAとの分離が可能であることが示された。
ヒト−マウスキメラ抗体であるリツキサン(商品名)(中外製薬株式会社製、10mg/mL)を固定化パパイン(Immobilized Papain、PIERCE株式会社製)を用い、同説明書記載の方法で37℃、10時間処理することによって、限定加水分解物を得た。
遠沈管に化合物286(102mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3;8mL)、トリエチルアミン(90μL、0.6mmol)を添加して化合物286が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物286が127μmol/mL(gel)固定化されていることを確認した。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物286が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物286を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物286は残存していないことが確認された。
遠沈管に化合物329(107mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、0.5M 水酸化ナトリウム水溶液(2.4mL)、水(5.6mL)を添加して化合物329が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで24時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物329を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物329が81μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで20時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物329が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物329を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物329は残存していないことが確認された。
遠沈管に化合物286(30mg、88μmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.1mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(2.4mL)、緩衝液(組成:0.1M Na2HPO4−NaH2PO4、pH7.0;2.5mL)、トリエチルアミン(30μL、0.2mmol)を添加して化合物286が溶解したことを確認したのち、3mLのホルミルトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、ホルミル基含量:65μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温25℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで攪拌振盪した。攪拌振盪を開始してから30分後、遠沈管にボラン−ピリジン複合体(250μL、2.5mmol)を添加し、さらに165rpmで2.5時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量することによって、化合物286が19μmol/mL(gel)固定化されたホルミルトヨパールゲルを得た。
遠沈管に化合物320(111mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、0.5M 水酸化ナトリウム水溶液(0.6mL)、水(7.4mL)を添加して化合物320が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで24時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV254nm)にて残存する化合物320を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物320が176μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液(溶媒は水)、pH8.3;5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで20時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物320が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物320を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物320は残存していないことが確認された。
遠沈管に化合物384(112mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、0.5M 水酸化ナトリウム水溶液(0.9mL)、水(7.1mL)を添加して化合物384が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで24時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物384を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物384が126μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで20時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物384が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物384を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物384は残存していないことが確認された。
遠沈管に化合物423(111mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、0.5M 水酸化ナトリウム水溶液(0.9mL)、水(7.1mL)を添加して化合物423が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで24時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物423を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物423が114μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで20時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物423が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物423を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物423は残存していないことが確認された。
遠沈管に化合物283(94mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3;8mL)、トリエチルアミン(90μL、0.6mmol)を添加して化合物283が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物283を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物283が102μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物283が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物283を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物283は残存していないことが確認された。
遠沈管に化合物284(98mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3;8mL)、トリエチルアミン(90μL、0.6mmol)を添加して化合物284が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物284を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物284が117μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物284が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物284を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物284は残存していないことが確認された。
遠沈管に化合物292(191mg、0.5mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.5mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.5mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3;4mL)、トリエチルアミン(140μL、1.0mmol)を添加して化合物292が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製;エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物292を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物292が56μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物292が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物292を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物292は残存していないことが確認された。
遠沈管に化合物364(193mg、0.5mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.5mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.5mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3;8mL)、トリエチルアミン(140μL、1.0mmol)を添加して化合物364が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物364を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物364が257μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物364が固定化されたエポキシトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物364を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物364は残存していないことが確認された。
遠沈管に化合物286(102mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3;4mL)、トリエチルアミン(90μL、0.6mmol)を添加して化合物286が溶解したことを確認したのち、0.3gのトレシルトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製)を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量することによって、トレシルトヨパールに化合物286が94μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたトヨパールゲル中の未反応のトレシル基をブロックするため、得られたトヨパールゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:0.5M トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3;5mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで16時間攪拌振盪することによりゲル中の残存トレシル基をトリスヒドロキシメチルアミノメタンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてトヨパールゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄し、化合物286が固定化されたトレシルトヨパールゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物286を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物286は残存していないことが確認された。
遠沈管に化合物329(30mg、84μmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.1mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(2.4mL)、緩衝液(組成:0.1M Na2HPO4−NaH2PO4、pH7.0;2.5mL)、トリエチルアミン(30μL、0.2mmol)を添加して化合物329が溶解したことを確認したのち、3mLのホルミルトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、ホルミル基含量:65μmol/mL(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温25℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで攪拌振盪した。攪拌振盪を開始してから30分後、遠沈管にボラン−ピリジン複合体(250μL、2.5mmol)を添加し、さらに165rpmで2.5時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物329を定量し、化合物329が14μmol/mL(gel)固定化されたホルミルトヨパールゲルを得た。
遠沈管に化合物286(170mg、0.5mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.5mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.5mL)、緩衝液(組成:0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3;8mL)、トリエチルアミン(140μL、1.0mmol)を添加して化合物286が溶解したことを確認したのち、0.3gのエポキシトヨパール(商品名)ゲル(東ソー株式会社製、エポキシ基含量:804μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで63時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量することによって、エポキシトヨパールに化合物286が167μmol/mL(gel)固定化されたことを確認した。この化合物286固定化エポキシトヨパールゲル中の窒素原子含有量及び硫黄原子含有量を測定したところ、窒素原子が1.2重量%、硫黄原子が0.89重量%含まれることを確認した。
遠沈管に化合物358(134mg、0.4mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.4mL添加した。次いで、遠沈管に1,4−ジオキサン(10mL)、トリエチルアミン(120μL、0.9mmol)を添加して化合物358が溶解したことを確認したのち、2.5mLのトヨパールCM−650S(商品名)ゲル(東ソー株式会社製;イオン交換容量:0.1mol/L(gel))と1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(154mg、0.8mmol)を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温25℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで14時間攪拌振盪した。反応終了後、グラスフィルターでトヨパールゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のトヨパールゲルを1,4−ジオキサン(10mL)で2回洗浄したのち、洗浄液(組成:0.05%トリフルオロ酢酸含有CH3CN/0.05%トリフルオロ酢酸水溶液=45/55;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:0.05%トリフルオロ酢酸含有CH3CN/0.05%トリフルオロ酢酸水溶液、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV254nm)にて残存する化合物358を定量し、化合物358が16μmol/mL(gel)固定化されたトヨパールCM−650Sゲルを得た。
実施例8に記載の方法にて調製した化合物286固定化エポキシトヨパールゲル1mLをTRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、前記平衡化緩衝液を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したウヒト血漿由来免疫グロブリン製剤(化血研製)0.5mg(OD280=0.7)を添加してカラムに通液した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、平衡化緩衝液から10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)への硫酸ナトリウムに関する直線濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。免疫グロブリンのカラムからの溶出は280nmにおける吸光度をモニターして検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物286固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図16に示し、このクロマトグラフィーにおける免疫グロブリンの回収率を表47に示す。免疫グロブリンはHiTrapカラムを用いたとき(図1参照)よりもいくぶん幅広く20番目から50番目までの画分に溶出していた。
実施例8に記載の方法にて調製した化合物286固定化エポキシトヨパールゲル1mLをTRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体0.5mg(OD280=0.7)を添加した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物286固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図17に示し、このクロマトグラフィーにおけるヒト化モノクローナル抗体の回収率を表48に示す。ヒト化モノクローナル抗体は30番目から45番目までの画分に溶出し、免疫グロブリン(図16参照)と比べていくぶん後ろの位置で溶出していた。
実施例8に記載の方法にて調製した化合物286固定化エポキシトヨパールゲル1mLをTRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン0.5mg(OD280=0.3)を添加した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物286固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図18に示し、このクロマトグラフィーにおけるウシ血清アルブミンの回収率を表49に示す。ウシ血清アルブミンは10番目の画分までに溶出し、これは免疫グロブリン(図16参照)とは異なる画分であり、HiTrapカラムを用いたとき(図1及び図7参照)と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体と固定化するマトリックスをアガロースからトヨパールに変更しても同様な免疫グロブリンの分離性能を有していることが示された。
実施例9に記載の方法にて調製した化合物329固定化エポキシトヨパールゲルをTRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体0.5mg(OD280=0.7)を添加した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物329固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図19に示し、このクロマトグラフィーのヒト化モノクローナル抗体の回収率を表50に示す。ヒト化モノクローナル抗体は30番目から45番目までの画分に溶出と、化合物286をチアゾール誘導体として用いたとき(図17参照)と同じ画分の位置で溶出していた。
実施例9に記載の方法にて調製した化合物329固定化エポキシトヨパールゲルをTRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン0.5mg(OD280=0.3)を添加した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物329固定化エポキシトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図20に示し、このクロマトグラフィーのウシ血清アルブミンの回収率を表51に示す。ウシ血清アルブミンは10番目の画分までに溶出し、これはヒト化モノクローナル抗体(図19参照)とは異なる画分であり、化合物286をチアゾール誘導体として用いたとき(図18参照)と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体を化合物286から化合物329に変更しても同様なタンパク質の分離性能を有していることが示された。
実施例10に記載の方法にて調製した化合物286固定化ホルミルトヨパールゲルを1mL TRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したヒト化モノクローナル抗体0.5mg(OD280=0.8)を添加した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ヒト化モノクローナル抗体のカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物286固定化ホルミルトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図21に示し、このクロマトグラフィーのヒト化モノクローナル抗体の回収率を表52に示す。ヒト化モノクローナル抗体は30番目から45番目までの画分に溶出と、エポキシトヨパールをチアゾール誘導体の固定化に用いたとき(図17参照)と同じ画分の位置で溶出していた。
実施例10に記載の方法にて調製した化合物286固定化ホルミルトヨパールゲルをTRICORNカラム(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に充填し、AKTAprime plus(商品名)(GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製クロマトグラフィー装置)に取り付け、0.7M 硫酸ナトリウム、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を20mL通液し平衡化した。AKTAprime plusを流速1mL/minで自動運転し、平衡化緩衝液を10mL通液後、同緩衝液に溶解したウシ血清アルブミン0.5mg(OD280=0.3)を添加した。さらに平衡化緩衝液を10mL通液後、10mM リン酸ナトリウム−10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を用いた硫酸ナトリウムの濃度勾配クロマトグラフィーを行なった。ウシ血清アルブミンのカラムからの溶出は280nmにおける吸光度のモニターにより検出した。溶出液は1mLずつ分画し、各フラクションの280nmにおける吸光度をU−2900スペクトロフォトメーター(日立製作所製)で測定し回収率を算出した。化合物286固定化ホルミルトヨパールゲルを用いて行なったクロマトグラフィーの結果を図22に示し、このクロマトグラフィーのウシ血清アルブミンの回収率を表53に示す。ウシ血清アルブミンは10番目の画分までに溶出し、これはヒト化モノクローナル抗体(図21参照)とは異なる画分であり、エポキシトヨパールをチアゾール誘導体の固定化に用いたとき(図18参照)と同様な結果になった。このことから、チアゾール誘導体の固定化に用いるマトリックスの有する活性化基をエポキシ基からホルミル基に変更しても同様なタンパク質の分離性能を有していることが示された。
水で洗浄した5mLの活性化キトパールK−66(商品名)ゲル(富士紡ホールディングス株式会社製;スクシンイミドオキシカルボニル基含量:15μmol/mL(gel))を遠沈管に計り取り、これにDMSOを10mL添加した。次に化合物286のDMSO溶液(0.25M)を900μL、1Mの1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液を225μL、トリエチルアミンを68μL、順次添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで3時間攪拌振盪した。反応終了後、グラスフィルターでキトパールゲルと反応溶液を分離し、グラスフィルター上のキトパールゲルをジメチルスルホキシド(5mL)、洗浄液(組成:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5;15mL)で洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(商品名)(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:CH3CN/MeOH/50mM NH4H2PO4=4/1/5、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量し、化合物286が5.0μmol/mL(gel)固定化されているキトパールゲルを得た。
遠沈管に化合物286(102mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、1M 水酸化ナトリウム水溶液(1.2mL)、水(6.8mL)を添加して化合物286が溶解したことを確認したのち、0.5gのBIOACT−EPO(商品名)ゲル(昭和電工株式会社製、エポキシ基含量:200μmol/g(gel))を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで43時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでBIOACT−EPOゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のBIOACT−EPOゲルを洗浄液(組成:0.05%トリフルオロ酢酸含有CH3CN/0.05%トリフルオロ酢酸水溶液=1/1;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:0.05%トリフルオロ酢酸含有CH3CN/0.05%トリフルオロ酢酸水溶液=1/1、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量することによって、BIOACT−EPOゲルに化合物286が46μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたBIOACT−EPOゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたBIOACT−EPOゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:アセトニトリル;2mL、0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);4mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで23時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてBIOACT−EPOゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄することで、化合物286が固定化されたBIOACT−EPOゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物286を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物286は残存していないことが確認された。
遠沈管に化合物286(102mg、0.3mmol)を計り取り、1,2−ジメトキシベンゼンのアセトニトリル溶液(1mmol/mL)を0.3mL添加した。次いで、遠沈管にアセトニトリル(1.7mL)、1M 水酸化ナトリウム水溶液(1.2mL)、水(6.8mL)を添加して化合物286が溶解したことを確認したのち、0.3gのPOROS−EP(商品名)ゲル(アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製、エポキシ基含量:非開示)を添加した。上記操作によって得られた混合物の入った遠沈管を内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで36時間攪拌振盪した。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターでPOROS−EPゲルと反応溶液を分離した。次にグラスフィルター上のPOROS−EPゲルを洗浄液(組成:0.05%トリフルオロ酢酸含有CH3CN/0.05%トリフルオロ酢酸水溶液=1/1;10mL)で2回洗浄した。反応溶液と洗浄液を合わせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:0.05%トリフルオロ酢酸含有CH3CN/0.05%トリフルオロ酢酸水溶液=1/1、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物286を定量することによって、POROS−EPゲルに化合物286が91μmol/mL(gel)固定化されていることが確認された。更に、上記の操作によって得られたPOROS−EPゲル中の未反応のエポキシ基をブロックするため、得られたPOROS−EPゲルを遠沈管に入れブロッキング溶液(組成:アセトニトリル;2mL、0.5M モノエタノールアミン、0.5M 塩化ナトリウム水溶液、pH8.3(溶媒は水);4mL)を添加した。反応溶液が入った遠沈管を、内温40℃に設定した卓上振盪機にセットし、165rpmで6時間攪拌振盪することによりゲル中の残存エポキシ基をモノエタノールアミンでブロックした。反応終了後、遠沈管にアセトニトリル(5mL)を添加し、グラスフィルターにてPOROS−EPゲルとブロッキング溶液を分離した。次いで、ゲルをエタノール(5mL)、水(5mL)でそれぞれ2回ずつ洗浄することで、化合物286が固定化されたPOROS−EPゲルを得た。また、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に残存する化合物286を高速液体クロマトグラフィーで測定したところ、ブロッキング溶液と洗浄液を合わせた溶液中に化合物286は残存していないことが確認された。
化合物286を4mg/mLになるようにDMSOに溶解し、これを10mMホウ酸−1M NaCl緩衝液(pH8.5)で8倍に希釈して0.5mg/mL濃度の化合物溶液を調製した。BIACOREセンサーチップCM5(商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)をBIACORE2000(商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)に装着し、BIACOREアミンカップリングキット(商品名、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製)を用いてセンサーチップCM5上のカルボキシメチルデキストランをN−ヒドロキシスクシニミド(NHS)で活性化した。これに前記0.5mg/mL濃度の化合物286溶液を25℃で5分間接触させることにより固定化を行なった。その後1M モノエタノールアミン水溶液を用いて未反応のスクシンイミドオキシカルボニル基のブロッキングを行なった。一連の固定化過程はセンサーチップCM5表面のSPR共鳴単位(RU)の増加によってモニタリングした。
実施例32によって調製したリガンド−マトリックス複合体(化合物286を固定化したセンサーチップCM5)に対して、HBS−EP緩衝液(組成:10mM HEPES(pH7.4),0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005% SP20)で希釈したマウスIgM(10μg/mL、試料A)、マウスIgG(320μg/mL、試料B)、ニワトリIgY(400μg/mL、試料C)、ウシ血清アルブミン(320μg/mL、試料D)をそれぞれ120秒間通液(結合相)し、その後280秒間HBS−EP緩衝液で置換(解離相)して親和性を解析した。またそれぞれの分析終了ごとに10mM水酸化ナトリウムを80秒間通液してセンサーチップCM5の再生を行った。化合物286を固定化したセンサーチップCM5のセンサーグラムを図23に示す。また解離時間240秒後の残存RUを表54に示す。
0.1M N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸緩衝液(pH9.0)/アセトニトリル=1/1の混合液を調製し、これを溶媒として、化合物486と水酸化ナトリウムとをそれぞれ41mMとなるように加えた。遠沈管に3.0mLのセルファインホルミル(商品名)ゲル(チッソ株式会社製、ホルミル基を10から15μmol/mL含有)をとり、そこに前記の化合物486を含んだ溶液を5mL加え、卓上振盪機を用いて、30分間、25℃、160rpmで振盪した後、ボラン−ピリジン複合体(0.17mL、1.7mmol)を添加し、同じ条件で16時間振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル5mLで1回、次いで、洗浄液(アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸=45/55/0.05)で5mLずつ4回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:洗浄液と同じ組成、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物486を定量することによって、セルファインホルミルゲルに化合物486が5μmol/mL(gel)固定化されたことを確認した。
0.1M N−シクロヘキシル−2−アミノエタンスルホン酸緩衝液(pH9.0)/アセトニトリル=1/1の混合溶媒に、化合物486と水酸化ナトリウムとをそれぞれ41mMとなるように加えた。遠沈管に0.3gのProfinity Epoxide(商品名)ゲル(バイオラッド株式会社製、エポキシ基を50から132μmol/g含有)をとり、そこに前記の化合物486を含んだ溶液を5mL加え、卓上振盪機を用いて、15時間、40℃、160rpmで振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル5mLで1回、次いで、洗浄液(アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸=45/55/0.05)で5mLずつ4回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:洗浄液と同じ組成、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物486を定量することによって、Profinity Epoxideゲルに化合物486が4μmol/mL(gel)固定化されたことを確認した。
2−ヒドロキシ−3−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]プロパンスルホン酸緩衝液(0.1M、pH8.0)/アセトニトリル=1/1の混合溶媒に、化合物486と水酸化ナトリウムとをそれぞれ41mMとなるように加えた。遠沈管に1.3gのM.S.GEL Epoxy−D−50−1000AW(商品名、AGCエスアイテック株式会社製、エポキシ基を73μmol/g含有)をとり、そこに、6.1mLの前記の溶液を加え、卓上振盪機を用いて、4日間、40℃、160rpmで振盪した。反応混合物をグラスフィルターで濾過し、アセトニトリル5mLで1回、次いで、洗浄液(アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸=45/55/0.05)で5mLずつ4回洗浄した。これらのろ液と洗浄液をあわせ、高速液体クロマトグラフィー(カラム:東ソー株式会社製 TSK−gel ODS−80TM(内径4.6mm×長さ15cm)、溶離液:洗浄液と同じ組成、流速:1mL/min、温度:25℃、検出:UV 254nm)にて残存する化合物486を定量することによって、M.S.GEL Epoxy−D−50−1000AWに化合物486が22μmol/mL(gel)固定化されたことを確認した。
200mLのナス型フラスコに塩化銅(I)(159mg,1.61mmol)、ペンタメチルジエチレントリアミン(419mg,2.42mmol)、メタノール(19.5mL)、及び2−ヒドロキシエチルメタクリレート(19.5mL,161mmol)を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に1.4gのクロロメチル化ポリスチレンビーズ(渡辺化学工業株式会社製、クロロメチル基含量:1.15meq/g)を添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を40℃で12時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、ポリスチレンビーズをメタノール(200mL)で2回洗浄した後、エタノール/5%アンモニア水=9/1(v/v)(1L)で3回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することで淡青色をしたポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)修飾ポリスチレンビーズ(18.4g、グラフト率:1200%)を得た。なおここでグラフト率は、
グラフト率=(反応後のポリスチレンビーズ重量−反応前のポリスチレンビーズ重量)/(反応前のポリスチレンビーズ重量)
と定義する。
200mLのナス型フラスコに塩化銅(I)(500mg,5.0mmol)、ペンタメチルジエチレントリアミン(1.30g,7.5mmol)、2−プロパノール(22mL)、及びアクリルアミド水溶液(組成:17.8g/22mL;250mmol)を順次添加し、室温で撹拌して反応混合物が均一に溶解したことを確認した。次に反応溶液に5.0gのクロロメチル化ポリスチレンビーズ(株式会社ペプチド研究所製、クロロメチル基含量:0.97meq/g)を添加し、凍結脱気により反応溶液中の溶存酸素を除去したのち、反応容器を80℃で18時間撹拌した。反応終了後、ポリスチレンビーズと反応溶液を分離し、ポリスチレンビーズをエタノール(150mL)で洗浄した後、エタノール/5%アンモニア水=9/1(v/v)(200mL)で2回洗浄した。洗浄終了後、ポリスチレンビーズと洗浄液を分離した後、真空乾燥することで淡青色をしたポリアクリルアミド修飾ポリスチレンビーズ(12.3g、グラフト率:146%)を得た。なおここでグラフト率は
グラフト率=(反応後のポリスチレンビーズ重量−反応前のポリスチレンビーズ重量)/(反応前のポリスチレンビーズ重量)
と定義する。
Claims (7)
- 一般式(1)
[1]ハロゲン原子
[2]ハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基、クロロ基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルコキシ基、炭素数1から6のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、又はアシル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキル基
[3]メチル基、エチル基、アリル基、プロパルギル基、ベンジル基、クロロベンジル基、又はジクロロベンジル基で置換されていてもよいチオエチル基
[4]メチルスルフィニルエチル基
[5]メチルスルホニルエチル基
[6]クロロ基、フルオロ基、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、シクロヘキシル基、シアノ基、又はニトロ基で置換されていてもよいフェナシル基
[7]チエニル基
[8]エチル基で置換されていてもよいチオフェン−イル基
[9]メチルフラン−イル基、エチルフラン−イル基、又はクロロフラン−イル基で置換されていてもよいメチル基
[10](フルオロフラン−イル)エチル基
[11]ヒドロキシ基で置換されていてもよいフルフリル基
[12]ピリジルメチル基
[13]エチル基、又はプロピル基で置換されていてもよいピリジン−イル基
[14]ハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基、クロロ基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルコキシ基、炭素数1から6のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、又はアシル基で置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシ基
[15]メチル基、エチル基、アリル基、プロパルギル基、ベンジル基、クロロベンジル基又はジクロロベンジル基で置換されていてもよいチオエトキシ基
[16]メチルスルフィニルエトキシ基
[17]メチルスルホニルエトキシ基
[18]ピリジルメトキシ基
[19]エトキシ基、又はプロポキシ基で置換されていてもよいピリジン−イル基
[20]ベンジルオキシ基
[21]メチル基で置換されていてもよい炭素数3から8のシクロアルコキシ基
[22]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数3から6のアルケニルオキシ基
[23]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数3から6のアルキニルオキシ基
[24]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数1から6のアシルオキシ基
[25]ハロゲン原子、又は炭素数3から8のシクロアルキル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルチオ基
[26]ハロゲン原子、又は炭素数3から8のシクロアルキル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルフィニル基
[27]ハロゲン原子、又は炭素数3から8のシクロアルキル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルホニル基
[28]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシカルボニル基
[29]カルボキシル基
[30]ニトロ基
[31]メチル基、エチル基、プロピル基、トリフルオロエチル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、2−メチルブチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、4−メチルペンチル基、ベンゼンスルホニル基、トルエンスルホニル基、クロロベンゼンスルホニル基、ニトロベンゼンスルホニル基、メチルスルホニル基、クロロメチルスルホニル基、トリフルオロメチルスルホニル基、エチルスルホニル基、メトキシカルボニル基、又はエトキシカルボニル基で置換されていてもよいアミノ基
[32]水酸基
[33]シアノ基 - 一般式(1)
[1]ハロゲン原子
[2]ハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基、クロロ基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルコキシ基、炭素数1から6のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、又はアシル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキル基
[3]メチル基、エチル基、アリル基、プロパルギル基、ベンジル基、クロロベンジル基、又はジクロロベンジル基で置換されていてもよいチオエチル基
[4]メチルスルフィニルエチル基
[5]メチルスルホニルエチル基
[6]クロロ基、フルオロ基、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、シクロヘキシル基、シアノ基、又はニトロ基で置換されていてもよいフェナシル基
[7]チエニル基
[8]エチル基で置換されていてもよいチオフェン−イル基
[9]メチルフラン−イル基、エチルフラン−イル基、又はクロロフラン−イル基で置換されていてもよいメチル基
[10](フルオロフラン−イル)エチル基
[11]ヒドロキシ基で置換されていてもよいフルフリル基
[12]ピリジルメチル基
[13]エチル基、又はプロピル基で置換されていてもよいピリジン−イル基
[14]ハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基、クロロ基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルコキシ基、炭素数1から6のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、又はアシル基で置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシ基
[15]メチル基、エチル基、アリル基、プロパルギル基、ベンジル基、クロロベンジル基又はジクロロベンジル基で置換されていてもよいチオエトキシ基
[16]メチルスルフィニルエトキシ基
[17]メチルスルホニルエトキシ基
[18]ピリジルメトキシ基
[19]エトキシ基、又はプロポキシ基で置換されていてもよいピリジン−イル基
[20]ベンジルオキシ基
[21]メチル基で置換されていてもよい炭素数3から8のシクロアルコキシ基
[22]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数3から6のアルケニルオキシ基
[23]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数3から6のアルキニルオキシ基
[24]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数1から6のアシルオキシ基
[25]ハロゲン原子、又は炭素数3から8のシクロアルキル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルチオ基
[26]ハロゲン原子、又は炭素数3から8のシクロアルキル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルフィニル基
[27]ハロゲン原子、又は炭素数3から8のシクロアルキル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルホニル基
[28]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシカルボニル基
[29]カルボキシル基
[30]ニトロ基
[31]メチル基、エチル基、プロピル基、トリフルオロエチル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、2−メチルブチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、4−メチルペンチル基、ベンゼンスルホニル基、トルエンスルホニル基、クロロベンゼンスルホニル基、ニトロベンゼンスルホニル基、メチルスルホニル基、クロロメチルスルホニル基、トリフルオロメチルスルホニル基、エチルスルホニル基、メトキシカルボニル基、又はエトキシカルボニル基で置換されていてもよいアミノ基
[32]水酸基
[33]シアノ基 - 一般式(1a)
[1]ハロゲン原子
[2]ハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基、クロロ基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルコキシ基、炭素数1から6のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、又はアシル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキル基
[3]メチル基、エチル基、アリル基、プロパルギル基、ベンジル基、クロロベンジル基、又はジクロロベンジル基で置換されていてもよいチオエチル基
[4]メチルスルフィニルエチル基
[5]メチルスルホニルエチル基
[6]クロロ基、フルオロ基、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、シクロヘキシル基、シアノ基、又はニトロ基で置換されていてもよいフェナシル基
[7]チエニル基
[8]エチル基で置換されていてもよいチオフェン−イル基
[9]メチルフラン−イル基、エチルフラン−イル基、又はクロロフラン−イル基で置換されていてもよいメチル基
[10](フルオロフラン−イル)エチル基
[11]ヒドロキシ基で置換されていてもよいフルフリル基
[12]ピリジルメチル基
[13]エチル基、又はプロピル基で置換されていてもよいピリジン−イル基
[14]ハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基、クロロ基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルコキシ基、炭素数1から6のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、又はアシル基で置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシ基
[15]メチル基、エチル基、アリル基、プロパルギル基、ベンジル基、クロロベンジル基又はジクロロベンジル基で置換されていてもよいチオエトキシ基
[16]メチルスルフィニルエトキシ基
[17]メチルスルホニルエトキシ基
[18]ピリジルメトキシ基
[19]エトキシ基、又はプロポキシ基で置換されていてもよいピリジン−イル基
[20]ベンジルオキシ基
[21]メチル基で置換されていてもよい炭素数3から8のシクロアルコキシ基
[22]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数3から6のアルケニルオキシ基
[23]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数3から6のアルキニルオキシ基
[24]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数1から6のアシルオキシ基
[25]ハロゲン原子、又は炭素数3から8のシクロアルキル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルチオ基
[26]ハロゲン原子、又は炭素数3から8のシクロアルキル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルフィニル基
[27]ハロゲン原子、又は炭素数3から8のシクロアルキル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルホニル基
[28]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシカルボニル基
[29]カルボキシル基
[30]ニトロ基
[31]メチル基、エチル基、プロピル基、トリフルオロエチル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、2−メチルブチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、4−メチルペンチル基、ベンゼンスルホニル基、トルエンスルホニル基、クロロベンゼンスルホニル基、ニトロベンゼンスルホニル基、メチルスルホニル基、クロロメチルスルホニル基、トリフルオロメチルスルホニル基、エチルスルホニル基、メトキシカルボニル基、又はエトキシカルボニル基で置換されていてもよいアミノ基
[32]水酸基
[33]シアノ基 - 活性化基含有マトリックスの活性化基がスクシンイミドオキシカルボニル基、エポキシ基、ホルミル基、2,2,2−トリフルオロエチルスルホニル基、カルボキシル基のいずれかであることを特徴とする請求項3に記載のチアゾール誘導体固定化マトリックスの製造方法。
- 一般式(1)
[1]ハロゲン原子
[2]ハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基、クロロ基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルコキシ基、炭素数1から6のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、又はアシル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキル基
[3]メチル基、エチル基、アリル基、プロパルギル基、ベンジル基、クロロベンジル基、又はジクロロベンジル基で置換されていてもよいチオエチル基
[4]メチルスルフィニルエチル基
[5]メチルスルホニルエチル基
[6]クロロ基、フルオロ基、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、シクロヘキシル基、シアノ基、又はニトロ基で置換されていてもよいフェナシル基
[7]チエニル基
[8]エチル基で置換されていてもよいチオフェン−イル基
[9]メチルフラン−イル基、エチルフラン−イル基、又はクロロフラン−イル基で置換されていてもよいメチル基
[10](フルオロフラン−イル)エチル基
[11]ヒドロキシ基で置換されていてもよいフルフリル基
[12]ピリジルメチル基
[13]エチル基、又はプロピル基で置換されていてもよいピリジン−イル基
[14]ハロゲン原子、炭素数3から8のシクロアルキル基、クロロ基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルコキシ基、炭素数1から6のアルコキシカルボニル基、カルボキシ基、又はアシル基で置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシ基
[15]メチル基、エチル基、アリル基、プロパルギル基、ベンジル基、クロロベンジル基又はジクロロベンジル基で置換されていてもよいチオエトキシ基
[16]メチルスルフィニルエトキシ基
[17]メチルスルホニルエトキシ基
[18]ピリジルメトキシ基
[19]エトキシ基、又はプロポキシ基で置換されていてもよいピリジン−イル基
[20]ベンジルオキシ基
[21]メチル基で置換されていてもよい炭素数3から8のシクロアルコキシ基
[22]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数3から6のアルケニルオキシ基
[23]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数3から6のアルキニルオキシ基
[24]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数1から6のアシルオキシ基
[25]ハロゲン原子、又は炭素数3から8のシクロアルキル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルチオ基
[26]ハロゲン原子、又は炭素数3から8のシクロアルキル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルフィニル基
[27]ハロゲン原子、又は炭素数3から8のシクロアルキル基で置換されていてもよい炭素数1から6のアルキルスルホニル基
[28]ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数1から12のアルコキシカルボニル基
[29]カルボキシル基
[30]ニトロ基
[31]メチル基、エチル基、プロピル基、トリフルオロエチル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、ペンチル基、イソアミル基、ネオペンチル基、2−メチルブチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、4−メチルペンチル基、ベンゼンスルホニル基、トルエンスルホニル基、クロロベンゼンスルホニル基、ニトロベンゼンスルホニル基、メチルスルホニル基、クロロメチルスルホニル基、トリフルオロメチルスルホニル基、エチルスルホニル基、メトキシカルボニル基、又はエトキシカルボニル基で置換されていてもよいアミノ基
[32]水酸基
[33]シアノ基 - タンパク質が免疫グロブリン、またはこれらの類縁体、フラグメント、融合体であることを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 免疫グロブリンが免疫グロブリンG(IgG)であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
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