CN104736236B

CN104736236B - 多孔基体支持物的表面修饰

Info

Publication number: CN104736236B
Application number: CN201380057311.5A
Authority: CN
Inventors: S.拉哈内; N.边; D.沙伊德
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2012-11-01
Filing date: 2013-10-02
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2033-10-02
Also published as: JP6336996B2; US10166527B2; EP2914377A1; SG11201503216SA; TW201431604A; KR102132157B1; WO2014067605A1; CA2889914A1; US20150298097A1; KR20150082436A; JP2016502457A; TWI609717B; CA2889914C; SG10201703540WA; CN104736236A

Abstract

本发明涉及具有改善的结合能力的新型分离材料、其制造和应用，尤其是用于结合蛋白A的应用。

Description

多孔基体支持物的表面修饰

本发明涉及具有改善结合能力的新型分离材料、其制造和应用，尤其是用于结合蛋白A的应用。

发明背景

蛋白A和单克隆抗体的纯化

由于单克隆抗体(mAb)用于药学应用，所以它们需要纯度非常高[A. Jungbauer,G. Carta, in: Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up;WILEY-VCH Verlag, Weinheim (Germany) 2010]。

蛋白A最初是最早在细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁中发现的56 kDa表面蛋白。其由spa基因编码，且其调节由DNA拓扑学、细胞渗透性和称为ArlS-ArlR的双组分系统所控制。因为其结合免疫球蛋白的能力，在生化研究中已发现其用途。其最初由五个折叠成三螺旋束的同源的结合Ig的结构域构成。各结构域能够结合来自许多哺乳动物物种的蛋白，最主要是IgG。其结合大部分免疫球蛋白的Fc区内的重链以及在人VH3家族的情况下在Fab区内的重链。通过这些在血清中的相互作用，其中IgG分子以错误定向(相对于正常抗体功能)结合，该细菌破坏调理作用和吞噬作用。

此处，术语"蛋白A"和"Prot A"可互换使用且包括从其天然来源回收的蛋白A、合成产生的蛋白A(例如通过肽合成或通过重组技术)、和其保留结合具有CH₂/CH₃区(诸如Fc区)的蛋白的能力的变体。蛋白A可商购自Repligen, GE或Fermatech。蛋白A通常固定在层析基质上。根据本发明的方法和系统中所使用的蛋白A的功能性衍生物、片段或变体的特征可以是对于小鼠IgG2a或人IgGI的Fc区的结合常数至少为K=I0⁸ M，优选为K=I0⁹ M。顺应此类结合常数的值的相互作用在本上下文中称为"高亲和力结合"。在一些实施方案中，蛋白A的此类功能性衍生物或变体包含至少一部分野生型蛋白A的功能性IgG结合结构域，其选自天然结构域E、D、A、B、C或其已经保留IgG结合功能的工程改造的突变体。

此外，工程改造使得单点连接至固体支持物的蛋白A衍生物或变体也可用于所要求保护方法中的亲和层析步骤。

单点连接通常意指蛋白部分经由单一共价键连接至蛋白A亲和层析的层析支持材料。该单点连接也可通过使用置于接近该蛋白折叠的N或C末端或在蛋白折叠的外部环境别处的暴露的氨基酸位置(即，在环中)的合适反应性残基而发生。合适的反应性基团是例如巯基或氨基官能团。

在一些实施方案中，变体的蛋白A衍生物经由多点连接而连接至合适的层析基质。

通常，生物技术过程仅提供非常低浓度的高度不纯mAb，使得这些杂质的去除需要一组复杂分离和纯化步骤，也称为下游过程。该下游过程的效率显著影响mAb的制造成本，这导致对每一相继步骤的程序改善的持续目标[R. Freitag 和 C. Horváth; Adv.Biochem. Eng./Biotechnol., 1996, 53, 17-59]。在所有涉及的过程步骤中，蛋白A层析(也称为亲和层析)始终是最重要且昂贵的步骤。这意指蛋白A亲和层析是单克隆抗体mAb的下游处理中最重要的纯化步骤之一。

详细地，粗制多组分溶液通过填充包含在固体多孔支持物上的固定蛋白A的固定相的柱。所期望的mAb通过mAb与蛋白A之间的特异性相互作用而被捕获，同时杂质与离开的溶剂一起离开该柱。被捕获的mAb通过使用适当洗脱剂来回收[P. Cuatrecasas, M.Wilchek, C. B. Anfinsen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61, 636 (1968)]。

实践中，该结合和洗脱操作由一系列的几个步骤组成。在第一步骤中，以缓冲液洗涤将上样含有目标分子的进料流的柱。下一步骤中，将含有目标mAb和杂质的进料流通过该含有蛋白A固定相的柱。在该步骤中，通过目标mAb分子对于蛋白A的特异性亲和力来捕获该目标mAb分子，而杂质大部分通过。随后，以洗涤缓冲液冲洗该固定蛋白A相，以去除残留杂质。然后通过使洗脱缓冲液通过该柱来回收(洗脱)所捕获的mAb分子。mAb的洗脱由该洗脱缓冲液所产生的诱导目标mAb分子与蛋白A之间的亲和力偏移的化学环境导致。该柱最终得到清洁和再生以重复mAb的结合和洗脱更多循环。

因此，亲和层析依赖于目标mAb与固定相表面之间的非常特异性的键合相互作用。理想地，该特异性结合应以对该表面不具有实质亲和力的起始混合物的每一组分通过层析柱，而保留期望的分子的方式发生。各种不同生理化学相互作用包括静电、疏水性、范德华和氢键合、携带该起始混合物的介质的性质、目标分子的互补排列和在树脂的表面上的结合位点通常是所期望的生物特异性的原因[K. Huse, H.-J. Böhme 和 G.H. Scholz, J.Biochem. Biophys. Methods, 2002, 51, 217]。然而，表面与生物分子之间的键需要弱到足以通过改变pH或盐浓度，或通过在溶液中添加竞争性抑制剂来洗脱[A. Jungbauer G.Carta, Protein Chromatography, WILEY-VCH Verlag, 2010; R. Freitag 和 C. Horváth, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol., 1996, 53, 17; A. A. Shukla, B. Hubbard,T. Tressel, S. Guhan 和 D. Low, J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed.Life Sci., 2007, 848, 28; P. Cuatrecasas, M. Wilchek 和 C.B. Anfinsen, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1968, 61, 636]。显而易见地，亲和层析的效率和表现取决于目标分子对表面的所述特异性相互作用。然而，由于产生各式各样的mAb，必需根据特异性mAb的需求使固定相的设计进化。通常，此类设计通过使用对于所考虑的mAb具有特异性亲和力的配体来改变固定相而实现。除了特异性相互作用之外，蛋白A层析介质的选择取决于几种其他程序参数，诸如强度(通常特征在于对所应用的流速的压力应答)和蛋白A层析的所有步骤中所使用的几种溶液的稳定性。

综上所述，有效亲和层析介质的设计需要正确选择配体、固定相和配体连接至该固定相的策略。所有这些要素的选择由纯化mAb中的特异性和效率、固定相的整体稳定性、和最后亲和介质的成本所支配。大部分配体由于其对于所期望分子(例如抗体、抗原、植物凝集素、受体、酶抑制剂、激素或仿生配体)的天然亲和力而合适[R. Freitag 和 C. Horváth, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol., 1996, 53, 17; K. Huse, H.-J. Böhme 和G.H. Scholz, J. Biochem. Biophys. Methods, 2002, 51, 217]。蛋白A成功地应用且充分证实为用于捕获单克隆免疫球蛋白G抗体的亲和力配体。[R. Freitag 和 C. Horváth,Adv. Biochem. Eng./Biotechnol., 1996, 53, 17; A. A. Shukla, B. Hubbard, T.Tressel, S. Guhan 和 D. Low, J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. LifeSci., 2007, 848, 28; S.R. Narayanan, J. Chromatogr., A, 1994, 658, 237; K.Huse, H.-J. Böhme 和 G.H. Scholz, J. Biochem. Biophys. Methods, 2002, 51,217; R. Hahn, P. Bauerhansl, K. Shimahara, C. Wizniewski, A. Tscheliessnig 和A. Jungbauer, J. Chromatogr., A, 2005, 1093, 98]。尽管蛋白A赋予介质特异性，但机械稳定性主要由下方支持材料所提供。使用几种材料作为蛋白A固定相的支持材料。除了机械强度之外，支持材料也应当能够提供高表面积以便以有效方式连接蛋白A。因此，需要满足这些权利要求且优选具有机械稳定性和化学稳定性的基质。

此外，层析柱的重要特征是其寿命。用于工业应用的亲和层析由四个阶段组成：吸附、洗涤、洗脱、再生[S.R. Narayanan, J. Chromatogr., A, 1994, 658, 237]。因此，预期所述柱的表现在很多循环范围内是恒定的，以保证该过程的重现性。

在用于纯化mAb的亲和层析中mAb对于固定蛋白A的高度特异性结合由与mAb的片段可结晶(FC)区和蛋白A的适当位点的相互作用所引起。蛋白A源自细菌金黄色葡萄球菌且实际上具有当以使哺乳动物免疫系统失效的方式结合IgG时保护该细菌免受哺乳动物免疫系统攻击的用途。该技术基本上使用蛋白A作为亲和层析配体来使用。蛋白A具有五种结构上相关的同源性结构域，所述结构域均可结合至IgG的个别FC区[K. Huse, H.-J. Böhme和 G.H. Scholz, J. Biochem. Biophys. Methods, 2002, 51, 217; S. Ibrahim,Scand. J. Immunol., 1993, 38, 368; S. Hober, K. Nord 和 M. Linhult, J.Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci., 2007, 848, 40]。蛋白是大分子且其活性基于三级结构(例如FC区)，使得其在空间中的定向和条件如介质的pH是配体与目标分子之间(在该情况下为蛋白A与IgG之间)成功复合构建的重要影响参数。但另一方面，适当的特异性结合环境的要求是在洗脱期间脱离的关键。IgG FC区与蛋白A的复合构建需要在孔中的适当定向。IgG-protA复合物的3D视图和排列由H.Yang等人解出[H. Yang, P.V. Gurgel, D. K. Williams, Jr., J. Cavanagh, D. C. Muddiman 和 R. G.Carbonell, J. Mol. Recognit., 2010, 23, 27]。

大小维度中的差异基于两种蛋白的分子量，IgG (144 kDa)明显大于蛋白A(40 -60 kDa)。支持材料的孔结构设计需要考虑那些事实。

除了mAb的特异性结合位点之外，蛋白A需要提供官能团以实现其在支持材料表面上的固定，保持活性位点的可达性。确定的固定蛋白A的把手(handle)是例如可共价连接至具备互补反应性基团(诸如环氧基、羧酸或醛)的固定相的胺基团(amine groups)和硫醇基[H. Ahmed, Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, andCharacterization, CRC Press LLC, 2004; P. Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 1970,245, 3059; Z. Pan, H. Zou, W. Mo, X. Huang 和 R. Wu, Anal. Chim. Acta, 2002,466, 141]。存在具备合适锚定基团的野生型蛋白A，但通过突变改变蛋白A使得能因氨基酸残基变化而产生在关于偶联化学、表现和耐碱性方面定制的蛋白A分子。多样蛋白A在官能团方面的可用性促使考虑不同的固定策略。取决于蛋白A的官能团的一点或多点连接、支持材料的选择和化学表面活化是可变的。

多点连接相比于一点连接保证例如改善蛋白A固定的耐久性，以防止任何蛋白A在mAb纯化期间的沥出。

硫醇由于其较强亲核性质而通常比胺更具有反应性，使得含有硫醇的蛋白A可非常有效地固定在提供环氧基的表面上。还存在几种含伯胺的配体的偶联方法。

本研究的焦点是具有多个末端胺的蛋白A用于固定在活化的多孔金属氧化物颗粒上的应用。

固定相

尽管mAb与表面的相互作用的特异性取决于PrA配体，但固定所述蛋白A配体的多孔基质需要符合特定标准。膜和单片(monolith)也已被视为用于蛋白层析的支持物，但多孔微米大小的珠粒是通常最普遍且广泛使用的支持材料的选择[ A. Jungbauer, G.Carta, in: Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag, Weinheim (Germany) 2010]。蛋白A介质的效率通常以每单位树脂体积的结合能力(静态或动态模式)来测量。结合能力与多孔珠粒的物理属性(诸如表面积、孔径、孔体积和珠粒大小)相关。然而，通常增加表面积提供每单位体积更多用于蛋白A连接的官能团，继而可提高结合能力。然而，增加表面积可以以填充在柱中的多孔珠粒的机械稳定性为代价。

机械稳定性对于多孔珠粒承受操作流速和所得压力是必要的，因为其在相同动态结合能力下与低流速相比以高流速操作更经济。然而，此类高速率导致多孔珠粒在柱中紧密填充，并且高压降低。从该观点来看，期望使用具有均匀粒径和窄孔径分布的材料，因此使得能够精确填充。具有小孔直径的颗粒经常提供高表面积。然而，孔径需要足以使生物分子扩散。除了这些物理属性之外，支持材料也应当具有几种化学属性。因为蛋白A层析根据所期望的分子与固定相之间的选择性亲和力原理操作，该固定相应当理想地缺乏与所期望的分子相互作用(一般称为非特异性吸附相互作用或结合)的任何可能性。[A. Jungbauer,G. Carta, in: Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up;WILEY-VCH Verlag, Weinheim (Germany) 2010]。

除了基于分离表现的固有需求以外，近来需要使用氢氧化钠水溶液再生("清洁")柱。一般称为"原位清洁"(CIP)的此类实践需要支持材料应提供针对高pH碱性条件的化学抗性。[M. Rogers, M. Hiraoka-Sutow, P. Mak, F. Mann 和 B. Lebreton, J.Chromatogr., A, 2009, 1216, 4589]。

考虑到这些标准，存在几种实践中广泛使用的支持材料，包括天然碳水化合物聚合物、合成聚合物和无机材料。天然碳水化合物聚合物包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖和壳聚糖，可从商业获得用于蛋白层析应用[A. Jungbauer, G. Carta, in: ProteinChromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag, Weinheim(Germany) 2010]。

修饰的天然碳水化合物聚合物用于离子交换的用途首次描述可回溯至二十世纪50年代[E.A. Peterson 和 H.A. Sober, J. Am. Chem. Soc., 1956, 78, 75131]。通常，多孔琼脂糖凝胶可通过冷却热琼脂糖溶液而制备。那些材料的主要特征是其亲水性特征(低非特异性吸附)和大量用于化学修饰和配体固定的羟基的可达性，使得可达到高能力。此外，碳水化合物在极碱性条件下具有化学抗性，因此适用于CIP。

然而，因为低固体密度，这些基于琼脂糖的材料缺乏机械稳定性，这限制其在非常高流速和压力下的用途。这些材料的机械稳定性可通过化学交联来改善。然而，此类化学交联一般使用羟基作为把手，限制在不牺牲可用作其他配体固定的把手的羟基的情况下该琼脂糖凝胶可交联的程度。因此，这些已交联琼脂糖凝胶的机械强度可能比不上竞争性材料如无机材料。

多孔合成聚合物珠粒也用作亲和层析的固定相。

这些具有所期望粒径的合成聚合物珠粒经常通过使用正确选择的致孔剂(porogen)的悬浮聚合或乳化聚合制备，该致孔剂也产生高表面积。该悬浮聚合一般涉及致孔剂接种单体的自由基聚合，且已证实产生窄粒径分布[T. Ellingsen, O. Aune, J.Ugelstad 和 S. Hagen, J. Chromatogr., 1990, 535, 147]。然而，由于珠粒的合成的性质，和取决于用于该合成的单体，合成聚合物可比天然碳水化合物聚合物明显更疏水。取决于单体的选择，聚合物珠粒也可提供可用于表面修饰的高密度官能团，因此可获得亲水性表面。不论如何，由于大量官能单体的商业可取得性，经由悬浮方法所产生的聚合物珠粒可以是化学多样化的和高度可调的。常用聚合物是聚丙烯酰胺和聚丙烯酸酯。甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)是高亲水性和生物相容性聚合物的实例[A. Jungbauer, G. Carta, in:Protein Chromatography, Process Development and Scale-Up; WILEY-VCH Verlag,Weinheim (Germany) 2010]。由于其较高固体密度，那些材料经常比碳水化合物更机械稳定，但它们亲水性越高，则它们倾向于在水性介质中膨胀。另一益处是聚合物珠粒的高化学抗性，使得CIP预期不影响树脂结构受损而导致填充有聚合物珠粒的柱的表现。

第三类支持材料是无机颗粒或陶瓷颗粒。此类颗粒是例如所谓受控制孔玻璃(CPG)颗粒。图1显示此类颗粒和其孔结构。

基于二氧化硅的珠粒(诸如由Merck Millipore销售的CPG)具有最高的固体密度，且提供优异的机械强度。尤其是使用具有其大、互连且均匀的孔的CPG能够提供优异的流动性质[Schnabel, R.; Langer, P., J. Chromatogr., 1991, 544, 137]。此外，由于形态学所导致的良好质量转移使得蛋白能够相当不受妨碍地孔扩散，使得这些性质得益于更大规模。维持形状和优异流动性质促使高流速以及线性压力提高，而不受妨碍的质量转移使得停留时间短。然而，CIP是使用无机支持材料诸如CPG的主要限制[M. Rogers, M.Hiraoka-Sutow, P. Mak, F. Mann 和 B. Lebreton, J. Chromatogr., A, 2009, 1216,4589]。通常，它们基于可溶于强碱性介质的SiO₂，使得那些柱的寿命的处理循环次数受限。此外，观察到比基于琼脂糖的材料更高的非特异性结合，以及无机支持物上的表面修饰通常更有挑战性。尽管如此，在不以氢氧化钠实施CIP的工业环境中，已成功地确立基于无机材料的蛋白层析介质。

整体而言，各基体基质提供一个或多个蛋白A亲和介质的优点，但最期望的改善是CPG的碱性稳定性(caustic stability)。

这意指，对于使用多孔无机颗粒如CPG而言，在其在大规模蛋白A层析的所有益处之下，耐碱性增强是期望的。文献中描述了几种关于该基于二氧化硅的材料的问题的方法。其中一些包括被称为"封端"反应的程序。残留的硅烷醇用氯硅烷处理以屏蔽二氧化硅表面。该技术增强了耐碱性，但寿命仍未满足高pH处理的要求，此外其在反相层析应用中是更合适的[Nawrocki, J., Dunlap, C., McCormick, A., Carr, P. W., J. Chromatogr.,A, 2004, 1028, 1; Samuelsson, J. A., Franz, Stanley, B. J., Fornstedt, T., J. Chromatogr., A, 2007, 1163, 177; Kirkland, J. J., van Straten, M. A.,Claessens, H.A., J. Chromatogr., A, 1995, 691, 3; Kirkland, J. J., vanStraten, M. A., Claessens, H. A., J. Chromatogr., A, 1996, 728, 259]。

二氧化硅表面上的聚合物涂层是针对大量聚合物进行充分研究的进一步选择[Petro, D. Berek, M., Chromatographia, 1993, 37, 549 36]。对于蛋白纯化应用，在使用基于碳水化合物的聚合物(诸如葡聚糖或壳聚糖)涂覆表面之后，已描述了硅胶的耐碱性的显著增强。之后，开放该聚合物表面用于常用修饰策略使用[Fengna Xi 和 JianminWu, React. Funct. Polym., 2006, 66, 682 ; E. Boschetti, P. Girot 和 L.Guerrier, J. Chromatogr., 1990, 523, 35]。除了这些研究之外，J. Nawrocki等人[J.Chromatogr., A, 2004, 1028, 1]在一篇详细报道中比较了基于二氧化硅和各种不同金属氧化物的填料的耐碱性，以及用于层析应用的其他重要性质。

考虑到所有这些研究，为了将蛋白A固定至多孔珠粒的表面上，该表面必需提供适用于蛋白A的官能团的反应性把手。明显地，蛋白A需要具有所述反应性官能团，但其结构和性质无许多掺杂。

发明目的

因此，本发明的目的是一方面提供在碱性攻击和降解方面稳定的合适的多孔支持材料，且另一方面提供具有用于蛋白A固定的官能团的合适的支持材料。此外，本发明的目的是提供制备本新型材料的方法。

发明概述

本发明的目的是基于含羟基多孔基体支持物的用于亲和层析的分离材料，所述含羟基多孔基体支持物的表面上通过共价键合而接枝聚合物链，其中

a) 两个或更多个接枝聚合物链从该表面上的一个羟基引发，和

b) 各聚合物链具有多个用于偶联亲和配体的可衍生基团。根据本发明，用于产生分离材料的多孔基体材料可由多孔陶瓷介质或表面具有羟基的多孔聚合物支持物组成。作为基体支持物的合适的多孔陶瓷介质可包含硅、锆、钛的氧化物和它们的混合物。实验已显示，如果多孔基体支持物是基于二氧化硅的多孔介质或者如果基于二氧化硅的多孔介质用氧化锆或氧化钛涂覆，则该新型分离材料显示良好性质。根据本发明，具有改善性质的用于亲和层析的分离材料由在第一产生步骤中用三或更多官能环氧化物处理的材料所提供。在合适条件下，所述反应的三或更多官能环氧化物形成富含环氧官能度的交联涂层。这意指，可产生改善的分离材料，其包含用交联涂层覆盖的多孔基体支持物，所述交联涂层富含用于共价键合接枝聚合物链的脂族羟基或二醇基团，所述接枝聚合物链包含提供羧酸基团的丙烯酸或其衍生物。

特别合适的根据本发明的分离材料是其中多孔基体支持物被富含用于共价键合通过单体的表面引发聚合的接枝聚合物链的脂族羟基或二醇基的交联涂层覆盖的那些，所述单体选自：提供用于进一步官能化的反应性基团的甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙烯基吖内酯(vinyl azlactone)、丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。当多孔基体支持物被富含用于共价键合由丙烯酸或其衍生物和提供羧酸基团的其他单体构成的接枝聚合物链的脂族羟基或二醇基的交联涂层覆盖且如果该分离材料的各聚合物链具有多个用于偶联蛋白A的可衍生基团，则本发明的分离材料显示特别良好的特征。因此，有利地，蛋白A偶联至该接枝聚合物链的反应性基团。

此处已发现，如果共价键合的接枝聚合物链由以下构成，则根据本发明的用于离子交换层析的分离材料尤其显示良好性质：

- 选自以下的含有具有负电荷的官能团的单体：顺丁烯二酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、羧乙基甲基丙烯酰胺、羧乙基甲基丙烯酰胺、羧基丙烯酰胺、羧基甲基丙烯酰胺、羧丙基丙烯酰胺、羧甲基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺基-2-甲磺酸和丙烯酰胺乙烷磺酸，和/或

- 选自以下的含有具有正电荷的官能团的单体：2-(二乙基氨基乙基)丙烯酰胺、2-(二乙基氨基乙基)甲基丙烯酰胺、2-(丙烯酰基氨基乙基)-三甲基氯化铵、3-(丙烯酰基氨基丙基)-三甲基氯化铵、2-(二甲基氨基乙基)甲基丙烯酰胺、2-(二甲基氨基乙基)丙烯酰胺、2-(二乙基氨基丙基)丙烯酰胺、2-(二乙基氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-(甲基丙烯酰基氨基乙基)-三甲基氯化铵和3-(甲基丙烯酰基氨基丙基)-三甲基氯化铵，和任选地

- 包含具有至多达18个碳原子的直链或支链烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基的疏水性单体，其任选地含有选自以下的亲水性基团：烷氧基、氰基、羧基、乙酰氧基和乙酰氨基。

本发明的用于亲和层析的分离材料在以下方法中制备，其特征在于多孔基体支持介质：

a) 与三官能环氧化物反应，

b) 与包含提供羧酸基团至步骤a)的涂层(其富含脂族羟基或二醇基)的丙烯酸或其衍生物的链接枝聚合，和

c) 蛋白A偶联至接枝聚合物链的反应性基团。有利地，多孔二氧化硅基体支持介质在与多官能环氧化物，尤其是与三或更多官能环氧化物反应之前用氧化锆或氧化钛涂覆，以改善所产生的分离材料的碱性稳定性。

本发明的进一步目的是含有此处所公开的分离材料的层析柱，和其用于从液体介质移出生物聚合物的用途。尤其，本发明分离材料适合用于亲和层析，从而通过与偶联的蛋白A和/或接枝聚合物链的离子基团，和任选地与疏水性基团相互作用而将该生物聚合物吸附至该分离材料，且通过以下而解吸：

a) 增加该溶液中的离子强度，和/或

b) 通过改变该溶液中的pH，和/或

c) 经由使用具有与该吸附缓冲液的极性不同的极性的洗脱液。

本发明详述

蛋白A具有可用于固定在合适载体上的不同反应性基团。硫醇或胺是蛋白A的用于反应的常见官能团[H. Ahmed, Principles and Reactions of Protein Extraction,Purification, and Characterization, CRC Press LLC, 2004; Z. Pan, H. Zou, W.Mo, X. Huang 和 R. Wu, Anal. Chim. Acta, 2002, 466, 141]。我们的实验已显示胺基团令人惊讶地特别适合于固定反应，而蛋白A的分子结构尽可能保持不变。图2示意显示蛋白A与合适载体表面上的羟基的固定反应。

通常，含胺的配体使用试剂(诸如溴化氰、环氧乙烷、三氟乙磺酰氯、二乙烯砜、苯醌碳二咪唑)而通过羟基偶联至该载体表面。

经由接枝聚合物将合适官能团添加至金属氧化物表面上的合适方式似乎是应用具有胺反应性侧基的个别单体。通过使用甲基丙烯酸缩水甘油酯(1)和丙烯酸(2)作为重复单元来满足该要求。两者单体均为市售，且其处理不复杂：

尽管甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基环可用于胺的亲核攻击，但丙烯酸的羧酸基团借助于碳二酰亚胺使得能够与蛋白A形成肽键。

方案1:

方案2:

对于有效、均匀且彻底表面修饰，金属氧化物需要进行活化以增加表面羟基的量。关于该问题的方法描述于文献中，其应用使用无机酸、氢氧化钠或等离子体(plasma)的常见化学处理。氧化锆缺乏可修饰表面羟基，因此需要其他表面活化以增加均匀地聚合物接枝的机会。

一种将配体偶联在提供羟基的表面(诸如碳水化合物和SiO₂)上的已建立方法成功使用双环氧乙烷(例如1,4-丁二醇二缩水甘油醚)，然而一个环氧基连接至表面，且第二个环氧基结合至配体[Platis, D., Labrou, N. E.; J. Sep. Sci., 2008, 31, 636;Head, D. M.,Andrews, B. A., Asenjo, J. A., Biotechnol. Tech., 1989, 3, 27]。出于脂族羟基产生的目的，代替偶联反应，将残留环氧乙烷水解而产生期望的羟基。该策略的进一步优点是插入间隔基。取决于脂族骨架的长度，可能的接枝反应较少受到与下方陶瓷表面的相互作用影响，烷基链由于其柔性而导致羟基对于反应物的可达性增加。

预期羟基的增加通过使用三羟甲基丙烷三缩水甘油醚(3) (TMTGE)作为三环氧乙烷而得到改善。上述表面活化的原理如方案3所示。在当前途径中，代替水解，使用巯基甘油(4)来猝灭环氧基以扩增可用于进一步修饰的羟基。此外，由硫代甘油提供的二醇基也适用于由Ce(IV)介导的聚合的引发。

方案3:

有利地，使用TMTGE提供由于其环氧基残基而构成交联水平网络以覆盖缺乏可修饰羟基的表面和使它们可用于接枝聚合的可能性。

存在两种经由在固体表面上的共价键固定聚合物的途径：

从……接枝(grafting-from)，

和

接枝至(grafting-to)。

使用接枝至的方法，已经合成的聚合物经由一个或多个锚定基团而与表面上的反应性基团反应。该技术的主要特征是使用具有所期望分子量和重量分布的定制的链以及共聚物、嵌段共聚物或其他特异性聚合物构造的组合物的选择[Huang, J., Koepsel, R.R., Murata, H., Lee, S. B., Kowalewski, T., Russell, A. J., Matyjaszewski,K.;Langmuir, 2008, 24, 6785]。相比之下，在从……接枝的方法中，聚合的引发位于固体表面，使得通过常规聚合机制从固体基质向上生长聚合物链，从而生长中的基团攻击周围单体。

通常，从……接枝的技术比接枝至的技术允许更高聚合物链接枝密度，因为小单体比需要通过连续建构的聚合物层达到表面中的反应性位点的长聚合物链更容易质量转移。在足够高的接枝密度的情况下，由于相邻链之间的排斥导致聚合物链从表面向外延伸而形成"聚合物刷"。

尽管ATRP提供几种优点，但其需要在聚合步骤之前将引发剂固定至表面。相比之下，通过铈(IV)盐引发需要在表面的还原基团(诸如羟基)用于引发，且可非常有效进行单一步骤聚合。在大部分情况下，该基于Ce(IV)的技术应用于具有脂族羟基的表面。

接枝聚合物关于接枝密度、链构型和分子量分布的性质取决于聚合技术和支配聚合本身的聚合条件的差异。在该工作中，ATRP和Ce(IV)引发的聚合由于其独特优点而适于接枝聚合：尽管ATRP是良好控制的聚合方法，但Ce(IV)简单且可从具有羟基的表面直接进行。

受控制的自由基聚合结合活性聚合和自由基聚合的益处。一方面，由活性特征引起，能够产生定制的具有窄链长分布和所期望构造的聚合物(例如嵌段-共聚物)。另一方面，该方法耐受大部分官能团，使得如在通常自由基聚合方法中一样，可获得遵循过渡金属催化的ATRP的一般原理应用广范围的单体[K. Matyjaszewski 和 J. Xia, Chem. Rev.,2001, 101, 2921]：

自由基(活性物质)通过卤素原子X从卤代烷(休眠物质)可逆原子转移至过渡金属络合物M^x(L)_y而产生。在乙烯基单体存在的情况下，聚合物链通过与常规自由基聚合相似的增长步骤构成。终止反应由高自由基浓度促进，因此活性物质的浓度需要调节。

成功聚合的主要前提是在适当氧化阶段中应用经常容易氧化的过渡金属络合物。因此，需要绝对无氧系统。

对空气耐受得多、因此稳健得多的技术被称为通过电子转移原子转移自由基聚合所产生的活化剂(AGET ATRP)。氧化阶段中允许原子转移用于活化的过渡金属使用还原剂在原位产生。AGET ATRP的原理由Jakubowski, W.等人，Macromolecules, 2006, 39, 39]中显示，与前述的唯一差异是需要通过同时被消耗的还原剂在原位产生M^x(L)_y[Jakubowski, W.,等人 Macromolecules, 2006, 39, 39; Min, K.等人,Macromolecules, 2007, 40, 1789]。

方案5:

AGET ATRP可通过ATRP引发剂固定在基材表面而容易地用于从聚合接枝。基材需要提供适当锚定官能度以固定引发剂分子，甚至可使用包括个别卤化物的聚合物(诸如聚(乙烯基苯甲基氯))，使得在该情况下不必固定。[Bayramoglu, G.,等人, ColloidsSurf., A, 2009, 345, 127]。

ATRP已成功地应用至各种不同含有可稳定增长自由基的取代基的单体，诸如苯乙烯、(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、二烯和丙烯腈。由于化学性质，各单体导致独特平衡率，使得最佳聚合条件无法容易转移。酸性单体如(甲基)丙烯酸可通过配位至过渡金属而使催化剂中毒。它们也可以使含氮配体质子化，这干扰金属络合能力。

引发剂分子的量决定正在生长的链数。对于窄分子量分布和均匀链生长重要的是迅速而完整的引发。通常使用的ATRP引发剂是卤代烷，包括卤化烷烃、苯甲基卤化物、α-卤代酯、α-卤代酮、α-卤代腈和磺酰基卤化物。单体和引发剂的结构相似性是有益的，使得α-溴异丁酸酯(A)是甲基丙烯酸酯(B)的ATRP的良好引发剂，而α-溴丙酸酯(C)用于丙烯酸酯(D)的聚合。

对于SI ATRP，认为引发剂固定在基材表面上。根据许多报告，使用在二氧化硅表面上的合适的氯化硅烷(E)、烷氧基硅烷(F)或在任何提供羟基的基材上的α-溴异丁酰溴(G)成功地固定[Kowalewski, R.,等人, Eur. Phys. J. E: Soft Matter Biol. Phys.,2003, 10, 5; Cao, L.,等人, Proceedings Published by the American ChemicalSociety, 2011;Nair, M. B., Blum, F. D.; Polym. Prepr. (Am. Chem. Soc., Div.Polym. Chem.), 2008, 49, 485]。

许多用于ATRP的催化剂系统描述于文献中，包括元素周期表第6至第11族的过渡金属。所有所述过渡金属中，铜催化剂传播最广，其多功能性和成本方面是优异的。除了过渡金属种类之外，对于作用的催化剂系统，还需要通常促进催化剂的溶解性以及活性的合适配体。多齿脂族胺确立为铜催化的ATRP的配体；2,2'-联吡啶(Bpy)和N,N,N',N',N''-五甲基-二亚乙基三胺(PMDETA)是ATRP中的铜络合物的常见配体。

如前所述，ATRP与AGET ATRP的关键区别是应用还原剂以在原位产生活化过渡金属络合物。在基于铜的系统中，这意指从氧化稳定性Cu(II)种类原位产生Cu(I)络合物。该技术的优点是比常规ATRP改善的稳健性。此外，催化剂的需要量减少：所有金属络合物可通过还原剂活化，且再生由终止所导致的损失的活性种类。成功地应用的AGET ATRP中的还原剂包括锡(II)物质(例如2-乙基己酸锡(II))、酚类、葡萄糖、肼、没食子酸(gallate)和抗坏血酸。

甲基丙烯酸酯单体的铜催化的SI AGET ATRP在提供羟基的表面上的整个反应方案描述于以下方案中：

聚合的引发也可由铈(IV)盐(诸如硝酸铈铵)所导致。在该情况下，该反应基于氧化还原反应而导致的自由基释放，这由G. Mino和S. Kaizerman首次描述于1958年 [Mino,G., Kaizerman, S., J. Polym. Sci., 1958, 31, 242]。氧化还原系统通常由铈盐和有机还原剂(诸如醇类、硫醇类、二醇类、醛类和胺类)组成。

在醇的情况下的氧化还原系统描述于以下方程；"Ce(IV)"表示水溶液中存在的铈络合物。

在乙烯基单体存在的情况下，该反应导致自由基聚合。对于基材(诸如纤维素、淀粉或聚(乙烯基醇))的使用，该方法产生接枝聚合物。

已针对许多乙烯基单体描述从羟基与Ce(IV)盐的接枝聚合，其中链生长由所产生的自由基引发。机制和动力学与自由基聚合相似，包括终止和转移反应。与溶液中的自由基聚合相比，表面引发形式经常显示由高局部自由基浓度导致的终止增加。典型基材是聚(乙烯基醇)、纤维素、淀粉和其他天然碳水化合物。与其他表面引发的聚合相比，一般方法带来高稳健性的益处。此外，与SI ATRP相比，无任何特异性引发剂需要在独立的反应步骤中固定用于Ce(IV)引发的接枝聚合。此外，因为Ce(IV)引发通常在酸性水性介质中进行，所以酸性单体的聚合容易地可能，甚至是理想的。

如上所述，不幸的是，蛋白、尤其是单克隆抗体以低浓度从细胞培养获得，且具有大量杂质。然而，如果这些化合物是药学应用的期望产物，则特异性纯度是必要的。

因此，单克隆抗体(mAb)的制造成本也受到构成生产方法的关键部分的所需蛋白的回收和纯化效率显著影响。用于蛋白回收的络合物分离和纯化步骤的集合通常称为下游过程[R. Freitag 和 C. Horváth, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol., 1996, 53, 17]。

在几个下游过程中，由于蛋白A对mAb的高特异性亲和力，蛋白A层析(也称为亲和层析)是mAb纯化中最重要的步骤之一。将粗制多组分溶液通过填充具有固定蛋白A的固定相的柱。所期望的mAb通过mAb与蛋白A之间的特异性相互作用而被捕获，同时杂质与溶剂离开该柱。之后，所捕获的mAb通过使用适当洗脱剂来回收[P. Cuatrecasas, M. Wilchek 和C.B. Anfinsen, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1968, 61, 636 ]。

存在三种常见类型的用于蛋白A层析的支持颗粒：

- 天然碳水化合物聚合物(例如琼脂糖、纤维素)，

- 合成聚合物(例如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯)，和

- 无机材料(例如二氧化硅、多孔玻璃、氧化锆或氧化钛)。

各材料均显示几个优点和缺点。作为此类无机材料，如多孔玻璃是优选的，因为与聚合物竞争者相比其具有高刚性。它们提供形状和孔径的恒定性，同时提高流速，因而提高压力。尽管其非球形形状，但直径充分定义且可变的大孔，连同优异的流动性质，使得受控制的孔玻璃(CPG)能够应用作为大规模治疗抗体纯化中的蛋白A树脂，但挑战是该无机多孔分离材料缺乏碱性稳定性。有利地，可通过本发明消除该弱点，且在下游过程中用于清洁层析介质的最常用介质之一的氢氧化钠存在的情况下尤其可确保层析柱的长寿命和恒定表现。

具有比二氧化硅明显更高化学抗性的金属氧化物(如氧化锆和氧化钛)保证相当高的机械稳定性但反应性表面羟基的量有限，使得使用"小分子"的常规表面修饰效率较差，因此产生较低配体密度。

但现在根据本发明，通过使用具有适当重复单元的聚合物修饰可补偿初始把手的缺乏，且可实现用于蛋白A连接的所需官能团的倍增。

颗粒修饰的成功主要通过配体密度LD_BCA和免疫球蛋白G的静态结合能力 Q_s来测量。

具体地，此处公开通过铈(IV)盐引发和通过电子转移原子转移自由基聚合所产生的表面引发的活化剂(SI AGET ATRP)的合适单体的接枝聚合。尽管氧化锆表面令人惊讶地更抗化学反应，但它们可根据本发明通过可如以下实例中所显示的合适方法进行修饰。

固定蛋白A的能力和所制备材料的所得层析表现得到几种分析支持。除了蛋白A存在的验证和LD_BCA 和Qs测量的可达性外，通过元素分析和用于测定接枝量的官能团滴定来表征修饰的颗粒。

材料表征

已广泛研究以Ce(IV)介导的自由基和SI AGET ATRP方法接枝固体基材。该文献整体聚焦于低表面积基材，诸如膜和纤维，且描述各种不同聚合参数对于通常由接枝产率、单体转化率、接枝长度来评估的接枝表现的影响。然而，根据本发明，具有在多孔金属氧化物颗粒上的可衍生把手的接枝聚合物对于这些用于亲和层析应用的蛋白A固定的修饰颗粒的适合性具有很大影响。

因为本情况下的聚合在多孔系统中发生，且无法推断官能团的不受妨碍地可达性以及用于IgG捕获的固定PrA的可达性，接枝表现与最终层析表现的相关性并不是不重要的。因此，发现可能的聚合影响参数，诸如单体类型、接枝前的表面处理、聚合温度、聚合时间、单体浓度和引发剂浓度与其对于所考虑的系统的影响相互作用。作为多孔无机载体的CPG在不同条件下与具有官能把手的聚合物接枝，且蛋白A连接至表示为垂悬(pendant)官能团的可能把手。取决于聚合条件，所得层析表现大部分通过配体密度和静态结合能力测量，且在个别条件下将该发现与接枝表现的文献报告进行比较。ProSepHC用作变异性的对照和作为表现目标。除了简单测试与各种聚合参数相关的层析表现之外，接枝表现与层析表现相关。此类研究对于理解由于孔中的有限可用空间所导致的起作用的相反因素，和用于有效捕获IgG的PrA的可达活性位点的需要是必要的。

此外，PrA偶联的条件在本研究范围内变化。该额外研究也导致聚合物触手性质与所得层析表现之间相关性的更好理解。

Ce(IV)引发的接枝聚合

下文中，记录提及Ce(IV)引发的接枝聚合所引发的三羟甲基丙烷三缩水甘油醚(TMTGE)涂覆的效果的研究。

氧化锆颗粒相比于根据本发明尝试碱性攻击表面缺乏羟基的氧化锆颗粒的表面活化是稳定的，且引入用TMTGE涂覆处理多孔颗粒的额外步骤以增加用于有效Ce(IV)化学的反应性羟基的数目。TMTGE涂覆随着涉及表面羟基和TMTGE的环氧基的热统计反应进行。

首先，TMTGE涂覆随后为使用常规环氧基-胺化学与作为锚定的残基环氧基直接蛋白A偶联，且所得配体密度用作优化的量度。这些涂覆实验的结果显示于图3a)和b)，其中显示在相同偶联条件下LD_BCA对反应时间和温度的依赖性[偶联蛋白A的涂覆有TMTGE的CPG的LD_BCA在80℃下与反应时间的关系(a)，和与4小时反应时间的反应温度的关系(b)]。

图3显示在相同偶联条件下LD_BCA对反应时间和温度的依赖性。

基于图3的结果，定性确认TMTGE涂覆的成功：在80℃的高温和4小时的反应时间下，实现最大LD_BCA。额外尝试表明该步骤的充分重现性。因此，在80℃用TMTGE预处理多孔颗粒4小时用于研究聚合条件的影响。

为了确保使用TMTGE的涂覆对于有效接枝是必需的，首先研究在接枝过程中该预处理步骤的影响，其通过配体密度和静态结合能力来监测。为了该目的，通过丙烯酸的Ce(IV)介导的聚合使涂覆和未涂覆CPG颗粒与pAA接枝，从而在相同条件下使pAA的垂悬羧酸基团与PrA偶联。图4a和图4b显示TMTGE涂覆分别对于在不同AA和CAN浓度下最终树脂的静态结合能力和配体密度的影响[在40℃且[CAN]为0.03M下具有不同单体浓度的涂覆和未涂覆样品的静态结合能力(a)和配体密度(b)]，和图5显示在40℃、0.15M丙烯酸下使用不同引发剂浓度的涂覆和未涂覆样品的静态结合能力(a)和配体密度(b)。

如图中显示，尽管在较高[AA]下，未涂覆和TMTGE涂覆的样品的Q_S和LD_BCA之间的差异得到放大，但[CAN]对该差异无显著影响。无论如何，无论该组实验中所测试的聚合条件的选择，用TMTGE涂覆CPG导致比未处理的CPG更高的配体密度和静态结合能力。

还应当注意的是，即使使用未涂覆CPG合成的树脂的Q_S和LD_BCA值比涂覆CPG低，这些值仍明显高于裸CPG上观察到的Q_S和LD_BCA，且显示甚至使用未处理的CPG，尽管效率不高，但Ce(IV)介导的聚合仍是成功的。其还与大部分文献报告一致，其描述使用由基材诸如碳水化合物所提供的脂族羟基的Ce(IV)引发的接枝聚合的应用。尽管如此，可清楚认识到在这些合成条件下TMTGE涂覆的优点。

因此，Ce(IV)引发的聚合的进一步研究仅聚焦于LD_BCA、Q_S与作为基材的涂覆TMTGE的CPG上的接枝聚合物的相关性。涂覆TMTGE的CPG用于聚合甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯酸两者。

尽管通过进一步实验，发现选自以下的单体也特别适于制备根据本发明的新型分离材料：提供用于进一步官能化的反应性基团的甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙烯基吖内酯、丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。但为了使实验数保持在可接受范围内，如上所述将实验计划限制为使用甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯酸。

在本发明范围内，用于离子交换层析的分离材料尤其是被富含用于共价键合由以下构成的接枝聚合物链的脂族羟基或二醇基的涂层覆盖的多孔基体支持材料：

- 选自以下的含有具有负电荷的官能团的单体：顺丁烯二酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、羧乙基甲基丙烯酰胺、羧乙基甲基丙烯酰胺、羧基丙烯酰胺、羧基甲基丙烯酰胺、羧丙基丙烯酰胺、羧甲基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺基-2-甲磺酸和丙烯酰胺乙烷磺酸，

和/或

- 选自以下的含有具有正电荷的官能团的单体：2-(二乙基氨基乙基)丙烯酰胺、2-(二乙基氨基乙基)甲基丙烯酰胺、2-(丙烯酰基氨基乙基)-三甲基氯化铵、3-(丙烯酰基氨基丙基)-三甲基氯化铵、2-(二甲基氨基乙基)甲基丙烯酰胺、2-(二甲基氨基乙基)丙烯酰胺、2-(二乙基氨基丙基)丙烯酰胺、2-(二乙基氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-(甲基丙烯酰基氨基乙基)-三甲基氯化铵和3-(甲基丙烯酰基氨基丙基)-三甲基氯化铵，

和任选地

包含具有至多达18个碳原子的直链或支链烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基的疏水性单体，其任选地含有选自以下的亲水性基团：烷氧基、氰基、羧基、乙酰氧基和乙酰氨基。

如前所述，这些单体在聚合之后各提供可衍生的垂悬(pendant)基团。

特别优选使用至少一种具有呈至少一个具有合适碳原子数的烷基和/或芳基形式的明显疏水性内容物的单体单元所制备，表面上包含共价键合的接枝聚合物的分离材料。该类型的分离材料已证实根据本发明特别有效，这归因于借助疏水性内容物以及还有借助接枝聚合物的带电荷内容物两者与待移出的生物聚合物相互作用的可能性。

因此，使用至少一种选自以下的具有疏水性内容物的单体进行衍生化是特别期望的：烷基乙烯基酮、芳基乙烯基酮、芳基烷基乙烯基酮、苯乙烯、丙烯酸烷酯、丙烯酸芳酯、丙烯酸芳基烷酯、丙烯酸烷基芳酯、甲基丙烯酸烷酯、甲基丙烯酸芳酯、甲基丙烯酸芳基烷酯和甲基丙烯酸烷基芳酯。

根据本发明的分离材料因此可以使用至少一种包含选自甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、2-、3-或4-氧杂戊基、2-、3-、4-或5-氧杂己基、2-、3-、4-、5-或6-氧杂庚基、3-丁氧基丙基、异丙基、3-丁基、异丁基、2-甲基丁基、异戊基、2-甲基戊基和3-甲基戊基，以及选自2-氧杂-3-甲基丁基、2-甲基-3-氧杂己基、2-苯基-2-氧代乙基、苯氧基乙基、苯基、苄基、苯乙基和苯丙基的疏水性基团的单体单元制备，由此后者基团诱导亲水效果，这可进入与生物分子的期望的相互作用。

首先聚合GMA，因为其可直接与蛋白A偶联，而其他羧酸基团通常需要中间体。

Ce(IV)引发的GMA的接枝在[CAN]=0.03M和DMF-水的不同混合物和只有水的情况下，以几种GMA浓度进行。为了证实从控制的多孔玻璃颗粒接枝pGMA的成功，在聚合之后进行元素分析。使用接枝CPG的碳含量C%和每克用于聚合的CPG的初始施加的GMA n _GMA,0，根据以下方程可计算接枝产率Y%：

n _GMA,CPG =每g接枝的CPG的GMA摩尔数

M _碳 =碳的原子质量

1 mol GMA包括7 mol碳。

对于在[GMA] = 0.1M, [CAN] = 0.03M, T = 40℃, t = 22h的GMA的Ce(IV)介导的聚合，观察到碳含量和接枝产率为C%=0.75w/w和Y%=15%。C%和Y%两者的正且显著值表明GMA的成功聚合。

然而，如前所述，对于在蛋白A层析中使用树脂的目的，偶联蛋白A的能力和最大化的结合能力比接枝产率更重要。因此，pGMA接枝的CPG样品通过在蛋白A偶联之后测定配体密度和静态结合能力进一步表征。用不同单体浓度的pGMA接枝的CPG的Q_S和LD_BCA的结果绘制于图6[用0.025M、0.1M和0.27M的GMA浓度GMA接枝的CPG的LD_BCA和Q_S；与纯CPG和ProsepHC相比]。

如图6中所示，pGMA接枝的CPG在蛋白A偶联步骤之后不具有或具有微不足道的配体密度和静态结合能力。由于非特异性结合，所述Q_S值与用裸CPG观察到的值相同或更低。此外，所述Q_S值低于在未优化条件下相当的[AA]下合成的pAA接枝的CPG获得的值。尽管pGMA涂覆的CPG的蛋白A偶联条件未针对这些研究进行优化，但鉴于文献中报告的高接枝产率，与测试条件范围的裸CPG相比相似或更低的Q_S值有点令人惊讶。先前报告描述了高接枝产率，可忽略量的游离聚合物，和在一篇报告中，表面上的环氧基的证据，如通过IR光谱学表征[R. Murugan 和 S. Ramakrishna, Colloid Polym. Sci., 2004, 282, 1316]。

但令人惊讶的是，图6中的结果表明在聚合之后未留下任何环氧基。通过环氧基的水解和随后的引发所导致的交联的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)的产生解释GMA的优异的接枝表现。此外，硝酸铈铵是强氧化剂，且能够氧化大部分有机组分，包括DMF、甲苯和丙酮。在反应期间，在GMA的聚合的情况下，发现在AA聚合情况下反应溶液的典型黄色消失。此类黄色归因于导致形成自由基的Ce(IV)种类，表明Ce(IV)的完全消耗。

综上所述，GMA彻底引发和聚合而无和最少量残留环氧基，以及聚合期间Ce(IV)种类的完全消耗导致不具任何用于PrA偶联能力的pGMA涂层。这意指通过GMA的Ce(IV)引发的接枝聚合导致的多孔金属氧化物颗粒的表面活化不适于合成PrA亲和力树脂。聚合期间的环氧基损失阻碍蛋白A成功地固定在表面上。

相比于GMA，在相同条件下的AA聚合导致高于无任何表面处理的裸CPG的可测量配体密度和静态能力。这是由于从丙烯酸的羟基的引发没有通过环氧基水解所产生的二醇基那么有效。无论如何，引发从聚(丙烯酸)接枝物的羟基的聚合没有有效消耗偶联所需的羧酸。因此，使用丙烯酸作为单体完成通过Ce(IV)引发的接枝所合成的介质的静止结合能力的进一步优化。

尽管Q_S 和LD_BCA随着用于TMTGE涂覆的CPG的不同聚合参数变化，但在从未涂覆的CPG的Ce(IV)介导的引发的情况下未观察到依赖性。这是为什么所有实验都使用TMTGE涂覆的颗粒进行的原因。所研究的不同变量范围呈现于表1。

表1: 用于在未涂覆的CPG上丙烯酸的接枝聚合的不同参数

变量	范围
		聚合温度	40 - 60℃
聚合时间	6 - 22h
		丙烯酸浓度	0.09 - 1.1 mol/L
CAN浓度	0.003 - 0.1 mol/L

除了接枝丙烯酸和其衍生物(如甲基丙烯酸缩水甘油酯)和乙烯基氮杂内酯(vinyl azalactone)的这些优化实验以外，可将大组的聚合物接枝至多孔支持材料以产生具有合适性质的分离材料。

合适的单体可以是：

选自以下的含有具有负电荷的官能团的单体：顺丁烯二酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、羧乙基甲基丙烯酰胺、羧乙基甲基丙烯酰胺、羧基丙烯酰胺、羧基甲基丙烯酰胺、羧丙基丙烯酰胺、羧甲基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺基-2-甲磺酸和丙烯酰胺乙烷磺酸；

选自以下的含有具有正电荷的官能团的单体：2-(二乙基氨基乙基)丙烯酰胺、2-(二乙基氨基乙基)甲基丙烯酰胺、2-(丙烯酰基氨基乙基)三甲基氯化铵、3-(丙烯酰基氨基丙基)三甲基氯化铵、2-(二甲基氨基乙基)甲基丙烯酰胺、2-(二甲基氨基乙基)丙烯酰胺、2-(二乙基氨基丙基)丙烯酰胺、2-(二乙基氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-(甲基丙烯酰基氨基乙基)三甲基氯化铵和3-(甲基丙烯酰基氨基丙基)三甲基氯化铵；

或导致层析分离中的疏水性相互作用的单体。

除此之外，来自单体如丙烯酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙烯基吖内酯的官能团可以用含有疏水性基团的胺(诸如具有6至18个碳原子的烷基胺、苯甲胺、苯乙胺、苯氧基乙胺、氟苯甲胺、苯胺或甲氧基苯甲胺)进一步官能化。

聚合时间的影响

该系统的聚合时间的依赖性通过在6小时、18小时和22小时之后停止反应来检查。Q_S和LD_BCA的各自测量结果显示于图7，其指示不同聚合持续期间的配体密度和静态能力。

在6小时和22小时聚合持续期间范围内的接枝CPG的表现恒定性证明反应在40℃6小时之后完成。

聚合温度的影响

聚合温度的影响通过使用两种不同的丙烯酸浓度在40℃、50℃和60℃实施的实验来检查。LD_BCA和Q_S的各自值绘制于图8a)和b)。

聚合温度增加至60℃导致较低和较高丙烯酸浓度两者的配体密度和静态能力的稍高值。

关于图8a)中的结果，在50℃下聚合对于在TMTGE涂覆的CPG上的丙烯酸接枝的稍许优点是显而易见的。

引发剂浓度的影响

硝酸铈铵浓度对于用于蛋白A固定的丙烯酸的接枝聚合的影响以高和低丙烯酸浓度，和两种不同EDC浓度(EDC=1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺的首字母缩略词；蛋白A偶联剂)来检查。研究结果绘制于图9a)和b)。

图9显示对于具有两种不同EDC浓度的两个系列，在特定CAN浓度(0.03mol/L)下静态能力和配体密度已达最大值。进一步增加或降低CAN浓度导致用于固定蛋白A的较低值。此外，相比于在低丙烯酸浓度的引发剂浓度的改变，该反应对于高丙烯酸浓度的引发剂浓度的改变更敏感。以0.005M CAN，使用高丙烯酸浓度的尝试显示比使用低丙烯酸浓度的尝试更低的LD_BCA和Q_S值。这可归因于蛋白A偶联条件。

硝酸铈铵的浓度影响上述由于氧化还原反应所产生的自由基数量(主要在提供羟基的表面)。自由基经由与增长步骤中与乙烯基键反应增长以形成聚合物接枝物，因此接枝产率随着释放的自由基的量而增加。然而，对于高于最佳值的CAN浓度，终止反应变得更显著。此外，溶液中均聚物的形成随着CAN浓度增加。均聚和接枝聚合是竞争反应。

单体浓度的影响

在0.09M至0.85M丙烯酸范围内、同时所有其他变量保持恒定的情况下研究丙烯酸浓度对于接枝聚合和PrA固定能力的影响。发现单体浓度是所有检查的聚合变量中最敏感的参数。因此，除了配体密度和静态能力以外，通过元素分析检查所获得的珠粒的碳含量。因此，可得到不依赖于蛋白A偶联的进一步接枝证据。结果呈现于图10。

图10中的数据显示接枝聚合物随着丙烯酸浓度增加至高达0.63M而增加。进一步浓缩单体导致涂覆CPG表面上的聚(丙烯酸)的量较少。

为了发现聚合、PrA固定和IgG捕获的能力的相关性，在图11中相对于单体浓度绘制配体密度和静态能力。

如图11中所示，关于配体密度和静态能力的值的趋势，较高的接枝产率导致较高的蛋白A固定，因此导致在特定限制单体浓度下的较高静态能力。因此，如果更多聚合物接枝在表面上，则更大量官能团可用，然后更多蛋白分子能够结合在触手上。但发现，丙烯酸浓度增加至超过特定限值(即，在[AA] > 0.35M下)不一定导致静态结合能力的进一步增加。此外，用超过0.3M的丙烯酸浓度的尝试在测量结果中倾向于显著变化。

蛋白A的固定和效率

为了获得蛋白A在聚(丙烯酸)触手上的固定和其对于层析表现的影响的更好理解，需要确定上文提及的处理步骤(TMTGE涂覆和聚合)中缺乏重现性不会导致测量结果变化。因此，进行接枝聚合步骤的规模放大。通过这么做，可将一批pAA接枝的CPG分开用于蛋白A偶联条件的研究。研究EDC浓度和蛋白A量对于用不同量的接枝pAA的蛋白固定至颗粒的影响。

EDC浓度对于蛋白A固定的影响

EDC用于羧酸基团的活化以便与蛋白A的胺基团形成肽键。由于偶联用对于EDC和蛋白A相同的浓度进行，所以EDC和蛋白A与羧酸基团的比率随着接枝pAA量的显著增加而改变。因此，使用相同批次的接枝CPG建立和进行一组用不同EDC浓度和两种不同蛋白A量(每mL树脂15mg和30mg的蛋白A)的偶联实验。该组实验的结果绘制于图12a)和b)。

表2显示对于不同EDC浓度和两种不同量的蛋白A装载的Q_S和LD_BCA的结果。如图12B中所示，LD_BCA随着溶液中的EDC量渐增而持续增加，直到EDC量为0.025g/10mL。然而，EDC含量的进一步增加导致与EDC浓度相关的检测到的蛋白A的平台区。相比之下，如图12A所示，观察到静态结合能力在0.025g/10mL溶液的EDC浓度展现最大值。在明显更长反应时间(22小时代替2.5小时)的偶联尝试确认该趋势，因此消除了偶联时间的影响。

根据图12中的结果，关于最大可实现静态结合能力和配体密度，EDC浓度非常敏感地影响蛋白A偶联。预期Q_S和LD_BCA两个值的平行增加(直到特定EDC浓度)，因为EDC促进偶联反应，且预期更多连接的蛋白A捕获更多IgG。

在与EDC浓度相关的LD_BCA中观察到的平台区可归因于当前系统中的两个限制。首先，考虑到较高蛋白A量导致稍微较高水平的平台区，所提供的蛋白A的有限量可以简单地限制最大可实现配体密度。其次，每个蛋白A分子占据聚合物触手的特定区段。所有可达的羧酸基团的耗尽可以是检查的接枝数量的平台区的原因。

与EDC浓度相关的静态结合能力最大值可归因于固定反应期间发生的几个现象。为了更好地概览这些本维度(dimensions)，将诸如所使用的EDC与羧酸基团的比率和与蛋白A的比率列于表2。

表2: 上述EDC研究中使用的EDC与羧酸基团和与蛋白A的比率。计算基于碳含量测量(0.16mmol AA/5mL 树脂)，蛋白A的平均分子量为50 千道尔顿。

表2显示基于羧酸基团，所使用的EDC浓度从过量偏移至短缺，正好在静态结合能力的最大值范围内(0.025 – 0.05 g/10mL)。而甚至最低EDC浓度构成与蛋白A分子相比的过量。然而，EDC也可由以下方案中所显示的水解反应不可逆地消耗，该方案显示用于产生肽键的羧酸基团的EDC介导活化，包括作为副反应的水解：

这意指，EDC对蛋白A的小过量(诸如0.005和0.0025g/10mL的尝试)不足以固定所有可用的蛋白A分子。大量EDC由于与水的水解作用而消耗，因此无法再用于蛋白偶联。

静态结合能力在配体密度的平台区开始的点达到最大值，且该结合能力随着进一步EDC增加而急剧降低。

EDC的高度过量可导致蛋白A活性位点的改变。在该情况下，蛋白的羧酸基团可被活化，且可导致蛋白分子的二聚化或交联，因此导致有限的IgG捕获能力。

此外，EDC作为疏水物应用，使得不同EDC浓度导致偶联溶液的pH改变和盐浓度改变。这些偏移可能导致链构型的改变。聚(丙烯酸)是弱聚电解质且在碱性条件下显示拉伸的链。高盐浓度和pH降低通常支持旋管(coil)构型。相比于拉伸的链，旋管会导致不利的固定蛋白A的定位。

此外，高EDC浓度增加同时活化的官能团的量，因此其导致蛋白分子的非常快速固定。假定聚合物链作为具有缠结的旋管存在，在沿着所述聚合物链的随机点的快速多点连接也导致不利的蛋白A定位，使得其IgG捕获能力受到抑制。

该EDC研究中固定蛋白A关于IgG捕获能力的效率描述于图13。图13显示取决于EDC浓度的固定蛋白A的IgG捕获效率。计算基于50 kD的蛋白A的分子量和144 kD的IgG的分子量。特别地，其显示在不同EDC浓度多少个IgG分子被一个蛋白A分子捕获。固定蛋白A的效率随着所应用的EDC增加而恒定地降低。

仍应记住的是，共有蛋白A具有五个用于IgG连接的活性位点，该图强调EDC改变蛋白A的活性位点或导致其缺乏可达性的假说。

接枝量、配体密度和静态结合能力之间的相关性：

在EDC浓度被鉴定为接枝CPG的层析表现的蛋白偶联步骤中的非常敏感的影响参数之后，通过改变丙烯酸浓度和蛋白A量完成减少的EDC研究。结果绘制于图14和15。

图14a)和b)显示在高蛋白量(每1mL树脂30mg蛋白A)的情况下LD_BCA (A)和Q_S (B)对于丙烯酸浓度和不同EDC浓度的依赖性。

图15a)和b)显示在低蛋白量(每1mL树脂15mg蛋白A)的情况下D_BCA (A)和Q_S (B)对于丙烯酸浓度和不同EDC浓度的依赖性。

图14和图15显示配体密度随着丙烯酸浓度增加而增加。从0.65M丙烯酸起，对于低蛋白装载(每mL树脂15mg蛋白A)，所检测到的蛋白的值保持恒定于约11 mg/mL，且对于高蛋白量(每mL树脂30mg蛋白A)的应用为~20mg/mL。同时，使用相同pAA接枝的颗粒，0.0025和0.005g/10mL的非常低的EDC浓度导致明显较低的蛋白固定。

尽管丙烯酸和EDC浓度对配体密度的影响是直接的，但静态结合能力以更复杂的方式变化。静态能力随着[AA]和配体密度增加而增加，只至[AA]=0.425M。对于高于0.425M的[AA]，尽管配体密度增加，但静态能力却降低，这表明存在[AA]为0.425M左右的最佳值。在最佳偶联条件下，在[AA]=0.425M下可实现~60mg/mL的Q_S值。丙烯酸浓度增加超过0.425M导致静态结合能力的急剧丧失。而在0.65M至0.85M的范围中，具有较少固定PrA(较低LD_BCA)的树脂能够比具有较高配体密度的树脂捕获更多IgG。该相关性对于EDC浓度所导致的LD_BCA的稍微改变而言是有效的，但在应用高蛋白量(图14)和低蛋白量(图15)之间的明显差异更清楚。

在本研究中获得的不同单体浓度的配体密度相对于静态结合能力的图显示于图16。该图显示丙烯酸浓度为0.21M、0.425M、0.65M和0.85M的静态结合能力相对于配体密度。

图16说明高接枝量(与丙烯酸浓度相关)导致高可实现的LD_BCA。然而，用高于0.425M的丙烯酸浓度的聚合导致Q_S降低，同时固定蛋白A的量增加。

这些结果表明添加太多蛋白A至具有大量接枝pAA的CPG颗粒导致孔阻塞或IgG至孔系统的质量转移受阻。此类孔阻塞或孔内IgG的质量转移受阻通过低于高LD_BCA的纯CPG(15 mg/mL)的非特异性结合能力的Q_S值进一步确认。

表3给出关于所使用的CPG颗粒的规格的接枝pAA和固定PrA的维度的最终概览，其借助碳含量和BCA测定测量来计算。

表3: CPG上的获得的接枝聚合物和固定的蛋白A的维度

基于表3中显示的数据，为了将蛋白A彻底固定在聚(丙烯酸)触手上，平均每个蛋白A分子必需有约150个重复单元。

整体而言，在具有平均孔径为1065Å的颗粒的情况下，观察到得到63 mg/mL的最大Q_S的丙烯酸浓度最佳值为0.425M。[AA]增加至超过该最佳值导致较高的配体密度，但较低的静态结合能力。由于孔阻塞和对于目标IgG分子的PrA分子的有限可达性而观察到此类丙烯酸浓度(因此接枝产率)、配体密度和静态能力之间的相关性。

用较小孔径的Ce(IV)引发的pAA接枝至CPG的转移

在这部分，基于进行实验来讨论AA的Ce(IV)介导的聚合转移至较小孔径的颗粒(从CPG1000至CPG800)。如先前所述，CPG1000和CPG800在其重要的属性方面不同。CPG800具有平均直径为859Å和表面积为46.4m²/mL(CPG1000: 1065Å, 26.6m²/mL)的孔。粒径和粒径分布是相同的。

在具有较小孔径的CPG上的Ce(IV)引发的 pAA接枝的研究结果绘制于图17a)和b)，其显示在不同EDC浓度和每1mL树脂15 mg蛋白A的情况下配体密度(A)和静态结合能力(B)依赖于小孔径CPG上的丙烯酸浓度的依赖性。

图17a)显示在研究的偶联条件下，从0.1M至0.2M丙烯酸，可实现的LD_BCA从9.0 g/mL增加至12.2 mg/mL。在0.425M丙烯酸的情况下，最高检测到的LD_BCA是10.6 mg/mL。此外，在低AA浓度，配体密度受EDC浓度的影响更强。在0.1M丙烯酸的情况下，更多EDC清楚地导致更高的配体密度。

该研究的检测的静态结合能力的趋势显示于图17b)。在0.2M丙烯酸的情况下，可实现的Q_S为60.5 mg/mL，高于0.1M的情况(高达45.0 mg/mL)，和0.425M的情况(高达51.6mg/mL)。EDC浓度对Q_S的影响与其对LD_BCA的影响相反。在检查范围中的EDC浓度的作用清楚地绘制于图18a)和b)。图18a)和b)显示在不同EDC和丙烯酸浓度的配体密度(A)和静态结合能力(B)。图18a)清楚地显示在0.1M丙烯酸的情况下LD_BCA随着应用的EDC浓度而增加，然而对于较高AA浓度则无结论性的趋势。在图18b)中显示0.1M和0.2M丙烯酸的Q_S随着渐增的EDC浓度而恒定地降低。在0.425M丙烯酸的情况下，EDC浓度对所得Q_S的影响微不足道。

相比于1065Å孔(CPG1000)，在具有859Å平均孔径的CPG(CPG800)上经由Ce(IV)引发的AA接枝导致在不同偶联条件以及聚合条件下的最佳层析表现。

由于CPG800提供明显高于CPG1000的表面积，所以预期在相同聚合条件下每mL树脂需要更多接枝的pAA链。该推断意指每个聚合物链较少重复单元可提供相同量的官能团。因此，CPG800和CPG1000在不同AA浓度下达到相同的配体密度和静态结合能力是合理的：

- CPG800：在0.2M丙烯酸，QS~60 mg/mL, BCA~11 mg/mL

- CPG1000：在0.425M丙烯酸，QS~59 mg/mL, BCA~10 mg/mL

此外，至不同孔径、表面积和因此改变的接枝聚合物排列的转移导致关于[AA]的不同的最佳聚合条件和关于[EDC]的不同的最佳偶联条件。如前所述，该偏移是与CPG1000相比CPG800的较小孔径和增加表面积的结果。CPG800的不同优化还突出了用作层析介质的具有接枝聚合物的多孔系统比非多孔低面积基材的复杂的性质。

SI AGET ATRP

本发明的进一步目的是表面引发的AGET ATRP活化用于在蛋白A层析中的多孔金属氧化物颗粒的表面的应用性。在Ce(IV)引发的接枝聚合中，接枝聚合物属性的可能影响参数改变，且这些变量对PrA固定能力的影响由静态结合能力和配体密度测量确定以发现SI AGET ATRP是否可应用于多孔系统来合成用作亲和层析介质的材料。

为此，选择GMA作为单体，且接枝聚合物可使用蛋白A直接偶联。相比之下，丙烯酸是弱酸性单体，且可阻碍ATRP的过程。

引发剂固定的影响

如前所述，SI AGET ATRP模型需要在聚合步骤之前将引发剂固定在支持材料表面上。固定引发剂分子的量对于正在生长的链数是决定性的，因此对接枝密度是决定性的。通过在固定步骤期间改变引发剂分子浓度来尝试改变连接的引发剂的量。

不幸的是，引发剂固定步骤无法获得精确可重现的结果。尽管在相同条件下从相同固定批次的聚合物接枝导致相当的Q_S和LD_BCA值，但这些值显示明显的批次间变异。还测试引发剂接枝的CPG的溴含量。

对于TMTGE涂覆的CPG，通过元素分析测定的溴含量总计为533 ppm，这对应于每6.6 nm²一个引发剂分子，因此在两个引发剂分子之间平均距离为2.9 nm。相同Bib固定条件导致未涂覆的CPG表面上的溴为137 ppm。此处两个引发剂分子之间的平均距离总计为5.7 nm。

聚合条件的影响

由于从理想SI AGET ATRP获得的聚合物链均为相同长度，且由于接枝密度通过引发剂固定而固定，所以理论上只有接枝层厚度或刷长度是可变的。因此，最具挑战性部分在于产生允许工作SI AGET ATRP的反应系统。

用于聚合的溶剂需要符合以下属性：1)所有组分 - 催化剂、配体、单体和至少部分还原剂--需要是可溶的。2)考虑到随后在水性环境中的处理，溶剂应当与水可混溶；非极性有机溶剂会阻碍孔可达性。

在这些方面，二甲基甲酰胺和四氢呋喃是适当的溶剂。抗坏血酸、CuBr₂、GMA和Bpy是在DMF中充分可溶的。在THF中，在作为配体的PMDETA的辅助下，只有少量CuBr₂是可溶的。抗坏血酸仅部分可溶于THF。

在两种溶剂中进行的聚合导致配体密度和静态结合能力的合适值。但由于在THF中的尝试，与在DMF中的尝试相反，没有通过单体浓度的广泛变化而显示出显著改变，且由于使用THF的溶解性问题限制变化的范围，所以在DMF中进行进一步聚合。

增加单体浓度是对于首先测试的变量的明显且容易的选择。为了研究[GMA]的影响，滴定pGMA接枝的CPG以测定环氧基含量。结果绘制于图19。图19显示通过以不同GMA浓度在经由SI AGET ATRP的pGMA接枝的CPG上滴定而测定的环氧基数目。该图显示CPG表面上的环氧基随着GMA浓度的增加而近似线性增加。

此外，>300µmol/mL的环氧基量证明官能团比用"小分子偶联"进行的蛋白A层析材料的常规制备的倍增。与此相比，已知CPG提供约50μmol羟基/mL树脂。

这意指在Ce(IV)介导的聚合中，总接枝量表示影响PrA固定能力和据推测静态结合能力的最敏感变量之一。本SI AGET ATRP的典型变量是聚合时间、催化剂浓度、温度和单体浓度。但由于通过环氧基滴定而发现在不同GMA浓度的pGMA接枝量的改变，GMA浓度对于可实现的配体密度和静态结合能力的影响是最显而易见的。结果绘制于图20a)和b)，其显示GMA浓度对于经由SI AGET ATRP接枝的CPG上的静态结合能力(A)和配体密度(B)的影响。图20详细地显示0.03M至0.55M GMA范围的Q_S和LD_BCA。尽管观察到配体密度未显著改变(在测试的[GMA]范围内为4至6mg/mL)，但Q_S随着GMA浓度增加而持续降低。静态结合能力从[GMA]=0.03M的30.5 mg/mL降至[GMA]=0.55M的12.8 mg/mL。

这些结果与通过Ce(IV)聚合获得的蛋白A固定在聚(丙烯酸)接枝的CPG上的发现相反，其中添加接枝的pAA导致蛋白A固定能力的增加，如通过LD_BCA所测量，且高达特定点时也导致静态结合能力的增加。接枝的pGMA的量显示对于配体密度的影响微不足道。相比之下，对于表面上具有较少环氧基的树脂观察到较高值。对于静态结合能力，在基于溴测定和环氧基滴定计算只产生具有平均高达十三个重复单元的寡聚体的点检测到最高值。

因此，证实明经由GMA的SI AGET ATRP的颗粒表面上的官能团的倍增。然而，鉴于环氧基的增加导致不变的配体密度和甚至导致静态结合能力降低的事实。但此不足以作为关于偶联条件的结论。

偶联条件对于层析表现的影响

关于蛋白A固定在经由SI AGET ATRP获得的pGMA接枝的CPG上的环境，与经由Ce(IV)聚合的pAA接枝的CPG相比，存在三个主要差异：

1) 尽管经由pAA的蛋白偶联由EDC的影响所成形(shape)，但pGMA提供具有每个重复单元的立刻反应性环氧基，这会导致蛋白A的不利定位。

2) pGMA不溶于水中。接枝链在表面上收缩，或在pAA的情况下至少不膨胀。大部分环氧基对蛋白A大分子而言是无法到达的。

3) 使用SI ATRP的可实现的接枝密度通常高于使用Ce(IV)接枝聚合。

为了补偿这些不等性，已进行一些改善偶联条件的尝试。添加乙醇和异丙醇以使偶联蛋白A溶液稍微更疏水。用于pGMA的更好溶剂(诸如THF或二氧杂环己烷)还没有应用，因为环境的剧烈变化可导致蛋白A的去活化。此外，进行适于在水溶液中用蛋白A还原胺化(见以下方案)的用于蛋白A偶联的完全不同的途径，从而使环氧基转化成醛。接枝聚合物链的更亲水性中间体可导致蛋白A的更好可达性。各自的结果列于表4。

该方案显示从环氧基开始的用于蛋白A偶联的替代"还原胺化"途径[H. Ahmed,Principles and Reactions of Protein Extraction, Purification, andCharacterization, CRC Press LLC, 2004]。

表4: 在相同批次的pGMA 接枝的CPG上通过不同的蛋白偶联条件获得的静态结合能力和配体密度的结果。

表4显示对于所应用的蛋白偶联条件，静态结合能力只有稍微改变。在50%乙醇和在1.1M硫酸钠存在的情况下的蛋白A偶联导致29.8 mg/mL的Q_S的最高值。在10.5 mg/mL的情况下，使用硫酸钠的LD_BCA明显高于使用常规偶联程序。

基于这些结果，除非明显更高的盐浓度迫使蛋白分子进入聚合物，否则在偶联反应期间蛋白A明显无法到达或只能部分到达接枝pGMA旋管或刷的内部。但是甚至如此，蛋白A无法有效地可用于IgG捕获。

转移至ZrO₂系统

如前文已描述，本发明的主要目的是提供用于蛋白A层析应用的耐碱性多孔陶瓷颗粒。由于已知ZrO₂颗粒对于碱性攻击是稳定的，所以还针对多孔ZrO₂颗粒测试本文所公开的CPG衍生化的概念，尽管已知ZrO₂不那么具有反应性且几乎不具有任何羟基。

由于，直至该点，丙烯酸的Ce(IV)引发的接枝聚合导致最好的层析表现，所以该技术应用于氧化锆涂覆的CPG作为原理的证明。再次，孔径、孔径分布和粒径是比较玻璃表面与氧化锆表面的本目的中的重要属性。由于这个原因，用ZrO₂的薄层涂覆先前研究中所使用的相同类型的CPG(CPG1000)。涂覆颗粒的特征呈现于图21。形态属性没有显著地受到氧化锆涂层影响。

因为氧化锆表面上具有较少可用的羟基(甚至对于与CPG相同的形态)，不预期相同表面活化和聚合的条件将导致相同的层析表现。然而，以与CPG1000类似的方式，使用ZrO₂涂覆的CPG来研究[AA]的影响。配体密度和静态结合能力的结果绘制于图22a)和b)。这些图显示丙烯酸浓度对氧化锆涂覆的CPG的配体密度(A)和静态结合能力(B)的影响。EDC：0.025g/10mL，蛋白A：30mg/mL树脂。

图22显示丙烯酸浓度对在氧化锆涂覆的CPG上的Ce(IV)引发的聚合的配体密度和静态结合能力的影响。LD_BCA随着丙烯酸浓度渐增，直到其达到15 mg/mL的平台水平。静态结合能力的图在0.17M AA显示51.3 mg/mL的Q_S的最大值。从这点起，随着[AA]增加，Q_S迅速降低。该最佳[AA]与CPG1000和CPG800两者相比都更低。

除了最佳单体浓度的绝对值以外，这两个图显示与两种所研究大小的CPG的情况所显示的相似的趋势。尽管最高Q_S值没有达到CPG1000的值，但上述结果证明，原则上TMTGE涂覆、随后pAA接枝和蛋白A固定的过程可成功地转移至适当的基于ZrO₂的多孔系统用于碱性稳定性蛋白A亲和介质的合成。

由于从纯CPG转移至氧化锆涂覆的CPG仅使用一个固定的EDC浓度进行，所以优化偶联条件是可能的。

综上所述，AA的Ce(IV)引发的接枝聚合从玻璃转移至陶瓷表面是成功的。出乎意料的是，据称耐碱性陶瓷树脂的实现的静态结合能力甚至高于具有相同形态的用小分子活化的市售CPG树脂(ProSepHC)。

获得的树脂的动态结合能力

尽管Q_S通常显示合成树脂的最大能力，但树脂在实际操作模式中的表现作为动态结合能力测量。此类测量通过以下来改进：将树脂填充在柱中，并用具有不同pH的缓冲剂的典型运行来测试它。在DBC实验运行中获得的曲线形状还提供一些关于所考虑的孔系统的质量转移性质的信息。对于本研究中获得的树脂，除了CPG800之外，对于通过ATRP和Ce(IV)介导的pAA接枝活化的CPG1000以及经由Ce(IV)引发用pAA接枝的氧化锆涂覆的CPG1000测定DBC。此外，测定市售ProSepHC的DBC作为众所周知的标准进行测定。各自的DBC测量的曲线绘制于图23。DBC在10%穿透(DBC_10%)和50%穿透(DBC_50%)的值提供于表3。

表3: 从本研究中使用的活化技术获得的示例性树脂和作为标准品的市售ProSepHC的DBC_10%、DBC_50%及Q_S

图23显示测试的蛋白A树脂的曲线进程。从旁路(bypass)切换至柱装载模式之后，最佳柱装载的持续期间由逐渐上升的平台区(直到大量来自进料的IgG穿透柱)的长度反映，因此UV吸收累积。一般规则是平台区越长，则动态结合能力越高。平台区之后的曲线斜率显示之后捕获多少IgG，且主要影响高IgG穿透的DBC。

不同树脂的图的第一印象显示所有树脂之间的差异，以及ProSepHC和通过Ce(IV)引发的pAA接枝制备的树脂具有不同的质量转移性质。尽管ProSepHC显示急剧的穿透，但由Ce(IV)介导的聚合制成的树脂展现相当延长的穿透，表明孔系统中的改变。通过ATRP处理获得的树脂的曲线形状与ProSepHC的结果相当。只有较短装载-平台区反映ATRP处理的树脂的预期较低的DBC。

Ce(IV)接枝的树脂的峰不那么明显尖锐，且在平台区之后的斜率清楚地较平坦。该现象可归因于受阻的质量转移。IgG仍然结合至通过扩散所导致的固定蛋白A，同时因为容易可达的蛋白A已被占据，所以大量IgG分子已经通过该柱。通常，DBC_50%达到近似Q_S的值，且所述值反映在平台区的长度中。在接枝的CPG800的情况下，令人惊讶的短平台区导致明显低于Q_S指示的DBC_50%。另一方面是该树脂的曲线最平坦，其意味着该柱在最初穿透点之后仍装载长时间。

在表3中呈现的DBC值意料之外的是第一和第五次运行之间的高度变异，尤其是对于从纯CPG制备的树脂。变异过程描述于图24。

根据图24中的结果，从经由Ce(IV)引发而在纯CPG上接枝pAA所获得的树脂在DBC测量的前五个运行期间不稳定。相比之下，具有氧化锆表面的ATRP处理的CPG和pAA接枝的CPG，以及小分子活化的CPG(ProSepHC)在进行测量期间是稳定的。

为了防止由缓慢质量转移导致的结合能力降低，流速的降低是适当的工具。测试树脂的改变的滞留时间的装载表现的差异示于图25。从3分钟至9分钟滞留时间的DBC_10%值改变列于表6。

图25显示对于ProSepHC (a)、ATRP处理的CPG (b)、具有pAA触手的CPG1000(c)和具有pAA触手的ZrO₂涂覆的CPG(d)的3分钟和9分钟滞留时间的柱装载表现的比较。

表6: 对于不同树脂的3分钟与9分钟滞留时间的DBC_10%的结果的比较

图25a)和图25b)显示ProSepHC(a)和ATRP处理的树脂(b)在改变的滞留时间下仅稍微变化的曲线进程。该变化主要归因于稍微较低的IgG进料浓度(见旁路峰)。表6中DBC_10%的几乎一致的值确认滞留时间对这两种树脂无影响。

相比之下，图25c)和图25d)中的曲线显示在IgG穿透之前具有较长滞留时间的明显较长的平台区。该观察在表6所列的DBC_10%的个别值中反映。

综上所述，本DBC研究表明经由pGMA的SI AGET ATRP的CPG表面活化导致受限于表面积的蛋白固定，其与使用小分子表面活化相当。该事实导致DBC测量中的不受妨碍的质量转移，因此导致尖锐信号。相比之下，如本DBC研究中已经证明，用pAA的Ce(IV)引发的接枝活化的CPG的高可实现的静态结合能力伴随着IgG捕获的受阻的质量转移实现。该ProSepHC与聚合物接枝的CPG之间的差异表明这两种树脂的质量转移性质的差异：由于ProSepHC的均匀孔结构，与在两种不同的滞留时间显示明显差异的聚合物接枝的CPG相比，在高和低滞留时间所测量的DBC之间无明显差异。

本发明的特别优点是，从初始可用的羟基开始，在基于多孔陶瓷的颗粒表面的可用官能团的倍增。铈(IV)盐引发聚合和SI AGET ATRP。使用丙烯酸和甲基丙烯酸缩水甘油酯作为单体提供用于随后蛋白固定的适当官能团。

此处所公开的两种聚合技术均符合官能团倍增的要求。SI AGET ATRP甚至允许经由接枝聚合容易控制环氧基的量，如其对单体浓度的线性依赖性所示。

但对于接枝颗粒的使用，比在表面上实际产生接枝聚合物链更重要的是其对于PrA固定的可用性和用于连接IgG分子的蛋白A配体的可达性。

公开的聚合技术用于活化蛋白A层析的支持颗粒的适用性显著不同 - 至少对于应用的单体和在不同处理条件范围内显著不同。

pAA的Ce(IV)引发的接枝、随后借助作为偶联剂的碳二酰亚胺(EDC)的PrA偶联导致高可用的配体密度和静态结合能力。根据官能团倍增的初始想法，直到特定点，可实现的LD_BCA和Q_S与接枝聚合物的量成正比。从该点起，LD_BCA停滞，而Q_S甚至降低。该现象归因于孔中的有限可用空间。不依赖于接枝的pAA的量，配体密度和所得静态结合能力敏感地受到偶联条件(尤其是EDC浓度)影响。

经由SI AGET ATRP的GMA的接枝聚合导致合理量的反应性环氧基(如滴定结果显示)，其随着聚合物链生长而渐增。

因此，根据本发明，在具有提供所需羟基的脂族涂层的受控制孔玻璃上实施两种不同的从……接枝的聚合技术。

两种技术，甲基丙烯酸缩水甘油酯的SI AGET ATRP和以丙烯酸作为单体的铈(IV)盐引发的接枝聚合，均允许随后用于蛋白A层析应用的蛋白A固定。

基本上，更多接枝的pAA允许更多蛋白A的固定。然而，所得的IgG捕获能力的增加有限，且必须避免孔阻塞。在参数变异的范围内，丙烯酸浓度被鉴定为接枝量的主要影响参数。配体密度和静态结合能力也受到偶联过程中的EDC浓度的强烈影响。相比于这些影响，参数诸如聚合温度、聚合时间(6小时之后)和引发剂浓度不具有显著影响。

对于经由SI AGET ATRP在CPG上接枝pGMA，通过所得材料的环氧基滴定来监测链生长。可用的环氧基的量随着应用的单体浓度线性增加。尽管配体密度在广范围的单体浓度中保持相似，但静态结合能力甚至随着环氧基增加而降低。值得注意的是，可实现的层析表现的水平低于经由Ce(IV)引发的用pAA接枝的CPG。

蛋白偶联的方式受到聚合物链构型以及同时活化的把手数目影响。尽管链构型主要由偶联过程期间的化学环境(溶剂、pH、盐浓度)决定，但因为每个重复单元提供一个环氧基，所以pGMA中的活化把手的数目是预先确定的。对于pAA，测定EDC浓度。

实验已显示，pGMA触手在水溶液中收缩在表面上，使得只有接枝层的表面可用于与蛋白A的胺基团反应。相比之下，pAA链由于其在水中的高溶解性和其聚电解质特征而得到拉伸，这导致垂直方向的所有聚合物段的高可达性。太多同时活化的官能团明显地诱导由蛋白A的多点连接所导致的聚合物链之间的交联，随后导致IgG至固定蛋白A分子的可达性较低。

在经由丙烯酸的Ce(IV)引发的接枝聚合的表面活化的情况下，已发现产生非常有效的蛋白A层析材料的方式。可实现的63 mg IgG/mL树脂的静态结合能力远高于通过常规"小分子"活化修饰的相同支持材料(ProSepHC)的市售产物的35 mg/mL。

因为开发的过程的稳健性和使用水溶液的可能性，本公开的程序比ATRP系统更经济和生态。

由于用Ce(IV)接枝聚合的高可得静态结合能力，将该原理转移至氧化锆涂覆的CPG，这导致耐碱性的基于陶瓷的颗粒。

总之，使用经由丙烯酸的Ce(IV)介导的聚合的表面活化，已发现用于产生蛋白A层析树脂的非常有利的程序。本研究工作中完成的应用在CPG上和转移至不同系统的透彻研究显示该过程尤其适于活化碱性稳定性的基于陶瓷的支持材料。

本说明使本领域技术人员能够全面地应用和实施本发明。甚至无需进一步评价，因此推测，本领域技术人员能够在最广范围利用上述说明。

如果有不清楚的地方，不言而喻，应当参考所引用的出版物和专利文献。这些文件相应地被视为本说明书的公开内容的部分。

为了更好地理解和为了说明本发明，下文给出在本发明保护范围内的实施例。这些实施例还用于说明可能的变体。然而，由于所述创造性原理的总体有效性，所述实施例不适于将本申请的保护范围缩减至单独的这些实施例。

此外，对于本领域技术人员而言不言而喻的是，在给出的实施例以及本说明书的其余部分两者中，基于作为整体的组合物，组合物中存在的组分量始终只加至总共100重量%或摩尔%，且无法超过该值，即使从所示的百分比范围可产生更高的值。除非另外表示，否则%数据被视为重量%或摩尔%，但以体积数据显示的比率除外，诸如对于其制备溶剂用作特定体积比的混合物的洗脱液。

实施例和说明书中以及权利要求中给出的温度始终以℃计。

实施例

通用程序

表面修饰

TMTGE涂覆

对于通用方法，在配备玻璃料(frit)的20 mL柱中测量5 mL的CPG(约220μmol的表面羟基)。为了该目的，在纯水中使CPG成浆，并在柱中沉降。在测定体积之前需要轻敲该柱，因为轻敲导致CPG进一步固结，因而导致真实体积测量。将所测量的CPG与10 mL的5%硝酸一起转移至20 mL反应小瓶，并在杂合器(hybridizer)中在80℃下旋转该浆体2.5小时。随后，用水洗涤颗粒数次，直到洗涤水的pH为中性。

TMTGE涂覆本身也在20 mL反应瓶中发生。向5 mL的CPG中添加2.5 mL TMTGE(9.6mmol)和2.5 mL的DMF。将反应混合物加热至80℃持续4小时。涂覆的颗粒用DMF洗涤三次，并用水洗涤三次。为了猝灭，将10mL的0.2M NaHCO₃中的10%硫代甘油溶液(含有0.5M NaCl)添加至反应小瓶中的颗粒。猝灭过程进行过夜。次日，用水洗涤CPG颗粒五次，最后将它们直接用于下一反应步骤，或储存在20%乙醇中。

对于直接接枝，CPG仅在80℃下用5%硝酸处理2.5小时，并在反应前用水洗涤。

实施例1

铈(IV)引发的接枝聚合

Ce(IV)引发的接枝聚合通常如下进行。对于5mL的预处理的CPG(有或没有TMTGE处理)，制备5mL水中的丙烯酸溶液(0.18M – 1.7M)和5mL水中的硝酸铈铵溶液(0.01M –0.2M) - 各溶液包括0.05mL的65%硝酸。在用水洗涤之后，将湿滤饼转移至具有隔膜的20mL反应小瓶。在添加两种溶液之后，将反应混合物均质化并用氮气吹扫。为了聚合，在杂合器中在40℃至60℃旋转该反应小瓶持续6小时至22小时。然后，基于用于在多孔聚合物颗粒上的CAN引发的接枝聚合的发明方案，将所述接枝颗粒暴露于充分洗涤顺序。^[63]洗涤程序在配备玻璃料的20mL柱中进行。使CPG颗粒再成浆以用于每一步骤。顺序如下：

- 7 x水

- 10 x含有0.2M抗坏血酸的1M硫酸

- 5 x水

- 2 x 10mM PBS溶液

- 2 x 水

一旦去除残留铈盐和游离聚合物，获得的接枝珠粒用于蛋白A偶联或储存于20%乙醇中。

实施例2

α-溴异丁酰溴(Bib)在CPG表面上的固定

如上所述预处理CPG颗粒，其只具有硝酸或用TMTGE涂覆。为了固定，100mL预处理的CPG在圆底烧瓶中在真空下在60℃干燥96小时，以确保完全去除残留湿气。用氮气吹扫圆底烧瓶，并用隔膜密封。使用注射器将无水THF(180 mL)和三乙胺(14 mL，100.4 mmol)转移至圆底烧瓶。将悬浮液冷却至0℃并在冰浴中缓慢摇动，同时在10分钟期间逐滴添加10mLBib(80.9 mmol)。在添加Bib之后，圆底烧瓶在冰浴中仍再摇动10分钟。然后，将反应混合物定位在定轨摇床上，其中其在室温温和摇动过夜。悬浮液在前30分钟期间变为棕色。然后，交替地用THF和水充分洗涤具有固定ATRP引发剂的颗粒，直到洗涤溶剂的上清液保持无色。将获得的颗粒在THF中储存于冰箱。

实施例3

SI AGET ATRP

经由SI AGET ATRP的CPG的典型表面活化如下进行。首先，在储备溶液中制备催化剂系统。为了该目的，将46.8 mg CuBr₂ (0.21 mmol)和164.2 mg Bpy (1.05 mmol)溶解于50 mL DMF中，并超声处理5分钟。之后，测量5mL具有固定引发剂的CPG并在具有玻璃料的20mL柱中用DMF洗涤两次。将CPG(5mL)、1mL引发剂溶液(4.2 µmol CuBr₂)、7.5mL DMF和0.53mL GMA(4.0 mmol)转移至具有隔膜的20mL反应小瓶，并用氮气吹扫混合物5分钟。通过用注射器添加包括50mg抗坏血酸(0.28mmol)的1mL DMF来确保聚合的实际引发。在前5分钟期间，反应混合物从青绿色变成棕色。将反应小瓶在杂合器中在30℃旋转22小时。聚合之后，将颗粒洗涤并在DMF中再成浆最少五次以去除游离聚合物，并在水中进行三次，然后其用于PrA偶联或储存于20%乙醇中。

蛋白偶联

实施例4

使用聚(丙烯酸)涂覆的树脂

通过聚(丙烯酸)接枝修饰的CPG颗粒(5 mL)在具有玻璃料的20 mL柱中测量，并用0.1M NaHCO₃水溶液洗涤三次。然后，将颗粒转移至20mL反应小瓶，随后添加10mL含有0.1 gEDC (0.52 mmol)的0.1M NaHCO₃中的蛋白A溶液(15 mg/mL)。蛋白A偶联在杂合器中在37℃进行2.5小时。之后，将颗粒用0.1M NaHCO₃洗涤三次以去除未连接的蛋白A。所获得的修饰的CPG在室温在0.1M NaHCO₃中的3%乙醇胺溶液中旋转过夜。次日，用水洗涤该样品三次。

实施例5

使用聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)涂覆的树脂

5mL通过聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯)接枝修饰的CPG在具有玻璃料的20mL柱中测量，并用0.1M NaHCO₃水溶液调整三次。然后将颗粒转移至20mL反应小瓶，并添加10mL的0.1M NaHCO₃中的蛋白A溶液(15mg/mL)。蛋白A偶联在杂合器中在37℃进行2.5小时。之后，将颗粒用0.1M NaHCO₃洗涤三次以去除未连接的蛋白A。通过在室温用10mL 0.2M NaHCO₃中的10%巯基甘油溶液(含有0.5M NaCl)处理来猝灭残留的环氧基。将颗粒交替地在含有0.15M NaCl的0.2M TRIS中和0.05M乙酸中洗涤，最后用0.1M NaHCO₃ 洗涤。

层析表现

动态结合能力(DBC)

亲和层析中的填充柱的表现通常通过使用动态结合能力(DBC)测定用于表征。DBC提供在直到所定义百分比的进料IgG浓度到达出口 (通常为10%)用恒定进料流可连接在柱中的IgG量。其通常针对柱体积V_C归一化且可以通过以下方程表示。

C_F = IgG进料浓度

V = 体积流速

t_b,10% = 穿透时间

V_b,10% = 穿透装载体积

V_C= 柱体积。

DBC基本上取决于平衡结合能力，也称为静态结合能力Q_S，但受到分散因子如移动相分散效果和溶质的质量转移抗性影响。因此，静态结合能力反映出系统的热力学并可用于关于IgG连接的理论最大能力表征固定相。总而言之，许多树脂属性影响蛋白层析柱的表现。

尽管如此，对于聚合物接枝的多孔陶瓷在蛋白A层析中的大规模应用，DBC是重要指数。对于新产生的固定相，DBC如下测定。

图26显示用于组装DBC测量中的设备的示意流程图。

DBC测量使用Äkta层析系统进行，该流程图示意描述于图26。出于本目的，以各自树脂填充层析柱，然而需要知道确切的柱体积。为了测量，将填充柱安装在层析系统中。在预备步骤中，整个系统以装载缓冲液冲洗以确保化学环境等于IgG进料的条件。随后，将输入切换至IgG进料，然而在开始时跳过该柱，只使用旁路。该设置允许经由UV检测内部测定进料的IgG浓度，此外使该柱前方的装载缓冲液的管线体积(tubing volume)最小化。一旦通过UV检测器监测到IgG浓度的信号，则该进料前进通过该柱用于实际DBC测量。示例性所得的层析图显示于图27。

图27显示市售ProSepHC的DBC测量的典型层析图。由旁路切换所导致的第一个信号决定100% IgG穿透的UV吸收。一旦阀从旁路位置切换至柱装载位置，其需要约一个柱体积，直到UV信号达到反映特定量的"非结合IgG"(DBC测定的0%点)的值。随后，以IgG装载该柱，则由IgG随进料流进入该柱时UV信号的可忽略斜率所反映。从穿透点起，当所有容易可达的蛋白A点被占据时，检测的IgG的量非常快速增加。在知道直到特定百分比IgG穿透和在IgG进料浓度下通过该柱的进料体积的情况下，以上述对应方程可计算DBC_X%。

配体密度LD_BCA (BCA测定)

用于测定蛋白浓度的二喹啉甲酸(BCA)测定已于1985年由P.K. Smith等人引入。假设所有蛋白均被固定且树脂体积已知，其可用于测量蛋白A层析介质的配体密度。BCA测定的原理基于在蛋白存在下通过使用二喹啉甲酸的双缩脲反应从Cu(II)形成Cu(I)络合物(见以下方案)。该深紫色络合物在562 nm显示吸光最大值，使得浓度可使用UV光谱仪定量。由于各蛋白-蛋白间存在敏感性差异，每次测量均需要使用各自蛋白的标准曲线。配体密度以mg蛋白A/mL树脂表示。

BCA测定中的Cu(I)和二喹啉甲酸的络合。

实施例6

在本工作中，配体密度测量如下进行。通过轻敲该柱，避免气泡，在具有玻璃料的5mL柱中精确量出1 mL的树脂。用9 mL水稀释湿滤饼，并以搅拌棒使分散体均质化用于三次转移125μL在每一个5mL试管中。然后，添加375μL水。对于标准曲线，根据下表，用蛋白A标准溶液(1 mg/mL)填充试管：

向每管中添加4mL的BCA测定溶液(1:50；Pierce^®BCA蛋白测定，试剂A：试剂B)，在室温下使加盖的管旋转4小时。在颗粒沉降之后，用水作为空白来测定各上清液在562 nm的吸收，然而借助于标准曲线算出蛋白A的量。为了获得更好的精确度，对于结果使用三次测量的平均值。

静态结合能力Q_S

尽管通过BCA测定测定每体积修饰介质的蛋白A的量，但静态结合能力的测量提供该介质能够捕获的IgG的量。静态结合能力不一定随配体密度线性增加。分子定向和立体可达性是重要的，使得两个值的知识给出拓扑学的概念和表面修饰后的孔结构的性质。尽管在高LD_BCA的低Q_S暗示缺乏PrA可达性，但相反情况是非特异性结合的指标。

Q_S测量的原理如下。将缓冲的IgG溶液(进料)添加至定义体积的修饰树脂。当达到表面上的可用PrA耗尽时，减去上清液的IgG浓度的进料的IgG浓度是每体积固定相所捕获的IgG的量，即静态结合能力Q_S。IgG浓度通过在280nm的UV吸收测定，通常在4小时后。

对于本工作中的测量，精确量出1mL的树脂并用水1:10稀释(见LD_BCA测量)。用搅拌棒使分散体均质化用于三次转移1mL在16mL试管中。每管用IgG进料溶液(在具有5mM EDTA的PBS缓冲液中1mg/mL)填满，此外一个空白试管用于测定确切IgG进料浓度。将所述管加盖，并在室温旋转4小时。在颗粒沉降之后，用含有5mM EDTA的PBS缓冲液作为空白来测定各上清液在280nm的消光。上清液中的IgG的绝对浓度如下经由比尔-朗伯定律(Beer-Lambert law)计算：

转换用于IgG浓度的测定：

d=使用的比色杯的宽度

为了结果的更好精确度，使用三次测量的平均值。

Q_S以及LD_BCA的每次测量均通过测定作为样品之一的Pro Sep vA High Capacity(ProSepHC)的Q_S和LD_BCA来验证。ProSepHC是基于本研究中使用但用小分子固定技术修饰的相同支持材料的市售蛋白A树脂。两种表征方法的精确度另外通过重复几次测量和通过测定空白CPG的Q_S和LD_BCA来证明。

化学性质

环氧基滴定

环氧基滴定根据文献方案进行。^[81]就在SI AGET ATRP之后，确切测量1mL的DMF洗涤的颗粒，并用5mL 1,4-二氧杂环己烷洗涤。将pGMA接枝的CPG转移至20mL反应小瓶，并添加10mL的1,4-二氧杂环己烷中的~0.2M HCl。剧烈摇动混合物5小时，然后使用酚酞作为指示剂，用乙醇中的0.05M NaOH滴定残留的酸。以空白CPG进行相同程序，使得需要的NaOH的差异意指每mL pGMA接枝的CPG的环氧基量。

元素分析

碳含量(Galbraith Labs, Inc., Knoxville, TN)：

设计LECO碳/硫测定仪通过燃烧和非分散性红外线检测来测量广泛多种有机和无机材料中的碳和硫。在纯氧气气氛中使用高热炭丝红外线灯(Thermolite)作为燃烧辅助在1450±50℃下燃烧样品。

分析物：碳范围：1.7 – 0.05%。

溴含量 (Galbraith Labs, Inc., Knoxville, TN)：

将样品秤重至燃烧杯，并添加矿物油作为燃烧辅助。为了测定溴(Br)，将1%过氧化氢溶液添加至燃弹(bomb)中。将样品和杯连同合适的吸收溶液密封至Parr氧燃烧弹中。用氧气吹扫该弹，然后加压至氧气压为25至30 atm，并点火。将该弹的内容物充分混合并转移至烧杯用于随后的离子层析。

分析物：溴范围：ppm - %。

从多孔珠粒的Ce(IV)引发的接枝用于合成蛋白A亲和介质：

实施例7

从CPG的Ce(IV)引发的接枝：比较未涂覆和三羟甲基丙烷三缩水甘油醚(TMTGE)涂覆的CPG(表面活化步骤)

在未涂覆和TMTGE涂覆的CPG上尝试聚(丙烯酸)(pAA)的Ce(IV)(CAN)引发的接枝。

对于"涂覆的"和"未涂覆的"样品两者，CPG首先用硝酸处理。硝酸洗涤之后，尽管"未涂覆"的CPG直接用pAA接枝，但"涂覆"的CPG首先用TMTGE涂覆，剩余的环氧基用硫代甘油猝灭以提供适于Ce(IV)引发的二醇基。

以下图28和29显示TMTGE涂覆对分别与丙烯酸和Ce(IV)浓度有关的最终树脂的静态结合能力(Qs)和配体密度(LD_BCA)的影响。

如图28a)、28b)、29a)和29b中所示，存在用TMTGE涂覆CPG以改善接枝效率，因此改善Qs和LD_BCA的明显优点。还应当注意的是，即使使用未涂覆的CPG合成的树脂的Qs和LD_BCA值与涂覆的CPG相比更低，这些值仍明显高于裸CPG上观察到的Qs和LD_BCA。

该观察表明，Ce(IV)介导的聚合是成功的，虽然效率不高，甚至用未处理的CPG也是如此。

实施例8

从TiO2/ ZrO2涂覆的CPG的Ce(IV)接枝用于合成PrA亲和树脂

ZrO₂涂覆的CPG以与CPG相似方式处理。首先，ZrO₂涂覆的CPG用TMTGE涂覆，且剩余的环氧基用硫代甘油猝灭以使二醇基适于通过Ce(IV)引发。然后，Ce(IV)引发的聚合物接枝用丙烯酸进行，并以与CPG的方式中相似的方式将PrA偶联至pAA接枝物以形成PrA亲和介质。

图30显示丙烯酸浓度对通过Ce(IV)接枝方法从ZrO₂涂覆的CPG合成的PrA亲和介质的Qs和LD_BCA的影响。

观察到配体密度随丙烯酸浓度增加，直到其达到15mg/mL的平台水平。Qs的图显示在0.17M AA的51.3mg/mL的Qs最大值。从这点起，随着[AA]增加，Qs迅速降低。使用ZrO2涂覆的CPG获得的最大Qs和LD_BCA与CPG的值相当。该图证明TMTGE涂覆、随后pAA接枝和PrA固定的过程可成功地转移至用于可能合成碱性稳定性PrA亲和介质的适当的基于ZrO₂的多孔系统。

以下图31显示基于ZrO2涂覆的CPG的PrA介质的动态结合能力(DBC)测量的轨迹。基于该测量，发现在10%穿透和3分钟滞留时间的情况下所述材料的DBC为29.1mg/ml。

实施例9

从聚合多孔(Eshmuno®)珠粒的Ce(IV)接枝用于合成PrA亲和介质

用pAA接枝聚合多孔珠粒，并将所述pAA接枝物与蛋白A偶联以形成PrA亲和介质。

对于Eshmuno®珠粒，表面不需要用TMTGE处理。Ce(IV)引发的接枝直接从所述珠粒进行而无任何预处理/活化步骤，如下文简述：

1) 将Eshmuno®珠粒(5ml)与含有Ce(IV)、65%硝酸和已知浓度的丙烯酸的溶液混合，并在杂合器中在40℃混合22小时以将pAA接枝至珠粒。

2) 用去离子水、含有抗坏血酸的水中的硫酸溶液、水、磷酸盐缓冲液和最终用水洗涤所述珠粒。

3) 对于蛋白A偶联，将pAA接枝的珠粒在含有已知量的活化剂(N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二酰亚胺盐酸盐(EDC))的合适缓冲液中与蛋白A混合。

4) 最后，用乙醇胺猝灭珠粒，以去除任何残留的反应性基团。

图32显示使用Eshmuno®珠粒通过使用Ce(IV)引发的接枝过程合成的代表性蛋白A亲和介质的Qs和LD_BCA。然而，使用所述聚合多孔颗粒已实现高达9.6 mg/ml的LD_BCA。

实施例10

pAA接枝的CPG珠粒的静态离子交换能力

1. pAA接枝的CPG珠粒通过在[AA] = 0.45 M和[Ce(IV)] = 0.03 M和在40℃从TMTGE涂覆的CPG珠粒进行聚合20小时来合成。

2. 制备pH=4.5和导电率为6.5 mS/cm的含有50 mM乙酸钠和40 mM氯化钠缓冲液的装载缓冲液。

3. 珠粒首先用去离子水洗涤5次，再各自用装载缓冲液洗涤。在装载缓冲液中以5mg/ml的浓度制备IgG和溶菌酶的溶液。

4. 对于每次测量，测量1mL的pAA接枝的CPG珠粒。

5. 将测量的珠粒悬浮在40mL的IgG和溶菌酶溶液中，并在室温下缓慢旋转16小时。

6. 孵育16小时之后，使珠粒沉降，且上清液用于测量。

7. 使用280 nm的波长的UV光谱学测量上清液(C_S)和起始溶液(C_I)中的IgG和溶菌酶的浓度。

8. 珠粒的离子交换能力使用以下方程计算。

发现pAA接枝的珠粒对于IgG和溶菌酶的静态能力分别为56±2 mg/ml和45±2mg/ml。

附图列表

图1：受控制的孔玻璃(CPG)颗粒和孔结构的电子显微照片

图2 图2示意显示蛋白A与合适载体表面上的羟基的固定反应

图3a)和b)显示在相同偶联条件下LD_BCA对反应时间和温度的依赖性[蛋白A偶联的用TMTGE涂覆的CPG的LD_BCA在80℃与反应时间的关系(a)，和对于4小时反应时间与反应温度的关系(b)]。

图4a)和b)显示TMTGE涂覆分别对在不同的AA和CAN浓度下最终树脂的静态结合能力和配体密度的影响。

图5a)和b)显示在40℃、0.15M丙烯酸的情况下具有不同的引发剂浓度的涂覆和未涂覆样品的静态结合能力(a)和配体密度(b)。

图6显示用0.025M、0.1M和0.27M的不同单体浓度的pGMA接枝的CPG的Q_S和LD_BCA聚合结果；与纯CPG和ProsepHC进行比较。

图7显示在未涂覆CPG上的丙烯酸聚合中不同聚合期间的接受的配体密度和静态能力。

图8显示在两种不同的丙烯酸浓度的情况下依赖于聚合温度的接受的配体密度(a)和静态能力(b)。

图9显示在不同丙烯酸和EDC浓度的情况下依赖于CAN浓度的配体密度和静态能力。

图10显示不同丙烯酸浓度的接枝的CPG的碳含量。

图11显示依赖于丙烯酸浓度的配体密度(A)和静态结合能力(B)。

图12a)和b)显示在不同EDC浓度和两种不同蛋白A量(15 mg PrA/mL树脂(低蛋白)，30 mg PrA/mL树脂(高蛋白))的尝试的静态结合能力(a)和配体密度(b)。接枝聚合在0.425M丙烯酸、0.03M CAN，40℃的情况下在TMTGE涂覆的CPG上进行。

图13显示依赖于EDC浓度的固定蛋白A关于IgG捕获能力的效率。计算基于50 kD的蛋白A的分子量和144 kD的IgG的分子量。

图14a)和b)显示在高蛋白量(每1mL树脂30mg蛋白A)的情况下LD_BCA (a)和Q_S (b)对丙烯酸浓度和不同EDC浓度的依赖性。

图15a)和b)显示在低蛋白量(每1mL树脂15mg蛋白A)的情况下LD_BCA (A)和Q_S (B)对丙烯酸浓度和不同EDC浓度的依赖性。

图16显示对于0.21M、0.425M、0.65M和0.85M的丙烯酸浓度的静态结合能力相对于配体密度。

图17 显示在不同EDC浓度和每1mL树脂15mg蛋白A的情况下配体密度(a)和静态结合能力(b)对小孔径CPG上的丙烯酸浓度的依赖性。

图18a)和b)显示在不同EDC和丙烯酸浓度的情况下的配体密度(A)和静态结合能力(B)。

图19显示与不同GMA浓度呈线性关系的通过在经由SI AGET ATRP的pGMA接枝的CPG上滴定而测定的环氧基数目。

图20a)和b)显示GMA浓度对经由SI AGET ATRP接枝的CPG上的静态结合能力(a)和配体密度(b)的影响。

图21纯CPG(A)和氧化锆涂覆的CPG(B)的EDX测量。

图22a)和b)显示丙烯酸浓度对氧化锆涂覆的CPG的配体密度(a)和静态结合能力(b)的影响。EDC：0.025g/10mL，蛋白A：30 mg/mL树脂。

图23显示在氧化锆涂覆的CPG上的不同树脂的动态结合能力测量的结果。IgG进料浓度为2 mg/mL，滞留时间为3分钟。

图24显示五次测量运行期间的DBC50%的改变。

图25a)-d)显示ProSepHC(a)、ATRP处理的CPG(b)、具有pAA触手的CPG1000(c)和具有pAA触手的ZrO₂涂覆的CPG(d)的3分钟与9分钟滞留时间的柱装载表现的比较。

图26显示用于组装DBC测量中的设备的示意流程图。

图27显示市售ProSepHC的DBC测量的典型层析图。

图28a)和b)显示在40℃和0.03M的[Ce(IV)]的情况下与丙烯酸浓度相关的涂覆和未涂覆样品的静态结合能力(A)和配体密度(B)。

图29a)和b)显示在40℃、0.15M丙烯酸的情况下与引发剂浓度相关的涂覆和未涂覆样品的静态结合能力(A)和配体密度(B)。

图30a)和b)显示丙烯酸浓度对ZrO₂涂覆的CPG的配体密度(A)和静态结合能力(B)的影响。EDC：0.025g/10mL，蛋白A：30mg/mL树脂。

图31显示从ZrO₂涂覆的CPG合成的PrA亲和介质的动态结合能力测量的轨迹。

图32显示从聚合多孔珠粒合成的实施例PrA亲和介质的Qs和 LD_BCA。

Claims

1.基于含羟基多孔基体支持物的用于亲和层析的分离材料，所述含羟基多孔基体支持物的表面上通过共价键合而接枝聚合物链，所述分离材料的特征在于，

a) 所述多孔基体支持物是用氧化锆或氧化钛涂覆的基于二氧化硅的多孔介质，

b) 两个或更多个接枝聚合物链从所述表面上的一个羟基引发，和

c) 各聚合物链具有多个用于偶联亲和配体的可衍生基团；

其中，所述分离材料包含首先用三或更多官能环氧化物处理的多孔基体支持物。

2.根据权利要求1的分离材料，其特征在于所述多孔基体支持物是多孔陶瓷介质。

3.根据权利要求1的分离材料，其特征在于所述多孔基体支持物是包含硅的氧化物、锆的氧化物、钛的氧化物、它们的混合物的多孔陶瓷介质。

4.根据权利要求1的分离材料，其特征在于所述多孔基体支持物是基于二氧化硅的多孔介质。

5.根据权利要求1的分离材料，其特征在于所述多孔基体支持物是表面具有羟基的多孔聚合物支持物。

6.根据权利要求1-5中任一项的分离材料，其中所述多孔基体支持物首先用三或更多官能环氧化物处理，形成富含环氧官能度的交联涂层。

7.根据权利要求1-5中任一项的分离材料，其包含用交联涂层覆盖的多孔基体支持物，所述交联涂层富含用于共价键合接枝聚合物链的脂族羟基或二醇基，所述接枝聚合物链包含提供羧酸基团的丙烯酸或其衍生物。

8.根据权利要求1-5中任一项的分离材料，其包含用交联涂层覆盖的多孔基体支持物，所述交联涂层富含用于共价键合通过单体的表面引发聚合的接枝聚合物链的脂族羟基或二醇基，所述单体选自：甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙烯基吖内酯、丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、甲基丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，其提供用于进一步官能化的反应性基团。

9.根据权利要求1-5中任一项的分离材料，其包含用交联涂层覆盖的多孔基体支持物，所述交联涂层富含用于共价键合由丙烯酸或其衍生物和提供羧酸基团的其他单体构成的接枝聚合物链的脂族羟基或二醇基。

10.根据权利要求1-5中任一项的用于离子交换层析的分离材料，其包含用交联涂层覆盖的多孔基体支持物，所述交联涂层富含用于共价键合接枝聚合物链的脂族羟基或二醇基，所述接枝聚合物链由以下构成：

-选自以下的含有具有负电荷的官能团的单体：顺丁烯二酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、羧乙基甲基丙烯酰胺、羧乙基甲基丙烯酰胺、羧基丙烯酰胺、羧基甲基丙烯酰胺、羧丙基丙烯酰胺、羧甲基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺基-2-甲磺酸和丙烯酰胺乙烷磺酸，

和/或

-选自以下的含有具有正电荷的官能团的单体：2-(二乙基氨基乙基)丙烯酰胺、2-(二乙基氨基乙基)甲基丙烯酰胺、2-(丙烯酰基氨基乙基)-三甲基氯化铵、3-(丙烯酰基氨基丙基)-三甲基氯化铵、2-(二甲基氨基乙基)甲基丙烯酰胺、2-(二甲基氨基乙基)丙烯酰胺、2-(二乙基氨基丙基)丙烯酰胺、2-(二乙基氨基丙基)甲基丙烯酰胺、2-(甲基丙烯酰基氨基乙基)-三甲基氯化铵和3-(甲基丙烯酰基氨基丙基)-三甲基氯化铵，

和任选地

11.根据权利要求1-5中任一项的分离材料，其特征在于各聚合物链具有多个用于偶联蛋白A的可衍生基团。

12.根据权利要求1-5中任一项的分离材料，其特征在于蛋白A偶联至接枝聚合物链的反应性基团。

13.根据权利要求7-10和权利要求12中任一项的分离材料的制备方法，其特征在于

a) 多孔二氧化硅基体支持介质用氧化锆或氧化钛涂覆

和，任选地，在用无机酸、氢氧化钠或等离子体处理后

b) 与三官能环氧化物反应，

c) 与包含提供羧酸基团至步骤b)的涂层上的丙烯酸或其衍生物的链接枝聚合，所述涂层富含脂族羟基或二醇基，

以及其特征在于

d) 蛋白A偶联至接枝聚合物链的反应性基团。

14.根据权利要求1-5中任一项的分离材料、根据权利要求13的方法中制备的分离材料在层析柱中的用途。

15.根据权利要求1-5中任一项的分离材料、根据权利要求13的方法中制备的分离材料用于从液体介质移出生物聚合物的用途。

16.根据权利要求15的用途，其特征在于通过与偶联的蛋白A和/或接枝聚合物链的离子基团，和任选地与疏水性基团相互作用而吸附至根据权利要求13的方法中制备的分离材料的所述生物聚合物通过以下而解吸

a) 增加所述溶液中的离子强度，和/或

b) 通过改变所述溶液中的pH

和/或

c) 通过使用具有与吸附缓冲液的极性不同的极性的洗脱液。

17.层析柱，其含有根据权利要求1-5中任一项的分离材料、根据权利要求13的方法中制备的分离材料。