CN1946479A - 一种制备分离基质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种制备分离基质的方法,该方法包括提供包含一个或多个色谱官能团的不饱和单体;使所述单体与引发剂和催化剂接触;对所述单体实施可控自由基聚合;和将所得聚合物连接到基础基质上。所述可控聚合技术可以是例如ATRP、RAFT或NMP。所述方法允许制备良好限定的配体,可用于例如HIC或任何其它类型的色谱方法。

Description

一种制备分离基质的方法
技术领域
本发明涉及通过吸附到分离基质上而分离例如蛋白质或其它有机化合物的分子。更加具体地,本发明涉及制备这种分离基质的方法,其中所述分离基质包括其上已经连接有聚合物配体的基础基质。
背景技术
色谱法包括一族紧密相关的分离方法。使色谱法区别于绝大多数其它物理和化学分离方法的特征在于使两个相互不混溶的相发生接触,其中一个相是固定相,另一个相是流动相。引入流动相中的样品混合物,在由流动相运载通过系统时经历很多次固定相和流动相之间的一系列的相互作用。相互作用是利用了样品中组分的物理或化学性质的差别。这些差别决定了在移动通过含有固定相的柱子的流动相的影响下单个组分的迁移速率。被分开的组分按照与固定相的相互作用增加的顺序出现。阻滞最小的组分首先洗脱,被最强烈地保留的物质最后洗脱。当一个组分被充分阻滞,从而防止与作为从柱子洗脱的样品组分的相邻溶质的区域重叠时,可以实现分离。固定相通常由担体(support)或基础基质(也称为载体)组成,其中含有官能团(即相互作用基团)的配体已经连接到所述基础基质(base matrix)。通常可以基于所利用的相互作用原理来指称各种色谱法。
例如,离子交换色谱法是基于电荷-电荷相互作用。在阴离子交换色谱法中,目标化合物的带负电的基团将与色谱基质的带正电的配体发生相互作用。另一方面,在阳离子交换色谱法中,目标化合物的带正电的基团将与色谱基质的带负电的配体发生相互作用。亲和色谱法是基于配体和目标化合物之间的生物亲和力,例如酶-受体相互作用和抗体-抗原相互作用。蛋白质A色谱法是公知的亲和色谱法,其中含有蛋白质A的配体与目标抗体的Fc片段发生相互作用。此类蛋白质A配体方便地由重组DNA技术制备。目标化合物和存在于固定相上的金属螯合基团之间的相互作用被用于固定的金属离子吸附色谱法(IMAC),其通常用于纯化蛋白质。已知多种螯合基团被用于IMAC中,例如亚氨基二乙酸(IDA)和次氮基三乙酸(NTA)。在亲硫吸附色谱法中,与含有游离巯基的配体连接的由二乙烯基砜活化的基础基质在易溶盐(lyotropic salt)的存在下吸附免疫球蛋白。最近,已经显示巯基的硫醚可以被氮或氧代替。在疏水相互作用色谱法(HIC)中,分离基质包含疏水基团。在反相色谱法(RPC)中,使用完全疏水的基质。
更新的一种色谱法是利用连接到基础基质上的刺激-响应聚合物。所述刺激-响应聚合物,也称为“聪明聚合物(intelligent polymers)”,当暴露于适当的刺激时将经历它们物理化学性质的结构上的和可逆的变化。所述刺激可以是例如温度变化、光、磁场、电场和振动。用于色谱法中的刺激-响应聚合物已经被提出,参见例如Palmgren,Ronnieet al:Stimulus-responsive polymers used in chromatographicseparation”Abstracts of papers,225th ACS National Meeting,NewOrleans,LA,United States,CAPLUS accession no.2003:179083和专利申请SE 0300791-1,其中公开了在疏水相互作用色谱法中使用pH-响应聚合物。
此外,US 5998588公开了一种相互作用分子共轭物,其例如是刺激-响应聚合物和亲和组分的组合。所公开的聚合物优选通过乙烯基-类型单体的链转移引发的自由基聚合制备。所述聚合物的分子量可以通过改变关键反应物的浓度和聚合条件进行控制。但是,所建议的聚合方案将导致相对宽的聚合物链长分布。
美国专利4581429(Commonwealth Scientific and IndustrialResearch Organization)涉及例如作为表面涂料例如高固体或无溶剂表面涂料、用于粘合剂和作为增塑剂等的聚合物的制备。更加具体地,公开的是一种可以实现对聚合过程的增长步骤进行改进的控制的方法。所述改进的控制允许例如得到链长度低于200单体单元的聚合物,这在该领域在1984年之前被认为是一个难题。增长步骤的控制通过使用自由基引发剂实现,该自由基引发剂包括至少一个其上可以存在自由基官能的碳原子。更加具体地,所述引发剂可以包括例如叔丁基、氰基异丙基、苯基、甲基等等的基团。所公开的方法被称为可控自由基聚合(CRP),并且使得能够制备多分散指数接近1的聚合物。
最近,其它研究的焦点在于对产物具有改进的控制的特定聚合方法的研发。所以,聚合物链的逆终止(reverse termination)已被用于硝基氧(nitroxide)调控的聚合(NMP)(也称为稳定自由基聚合(SFRP))中,该方法已经特别被用于基于苯乙烯的共聚物的合成。NMP已经被建议用于例如合成官能化的三维大分子,例如纳米颗粒,用于包裹和螯合多种客体分子的支架(scaffolds)等。
可逆加成断链链转移(RAFT)聚合(reverse addition-fragmentationtransfer polymerisation)是最近以来的特定的可控自由基聚合方法的另一个例子,其尤其公开于在纳米颗粒制备的上下文中。
US 5763548(Carnegie-Mellon University)公开了通过转移到金属络合物的配体而具有可逆终止的自由基聚合,其被称为原子转移自由基聚合(ATRP)。更加具体地,ATRP,其基于过渡金属络合物例如Cu(I)(II)之间的氧化还原反应,提供了苯乙烯、(甲基)丙烯酸酯和其它自由基可聚合单体的活性或可控自由基聚合。更加具体地,使用各种简单的有机卤化物作为引发剂和使用过渡金属络合物作为催化剂,这种活性自由基聚合提供了具有预定数均分子量和窄分子量分布的聚合物。
此外,Kim等人(Dong Jin Kim,Jin-yound Heo,Kwang Soo Kim,and Insung S.Choi in Macromol.Rapid Commun.2003,24,517-521:Formation of Thermoresponsive Poly(N-isopropylacrylamide)/DextranParticles by Atom Transfer Radical Polymerisation)公开了接枝聚合物到控制生物相互作用例如细胞粘附的表面。更加具体地,Kim等人公开了表面引发的水性原子转移自由基聚合,其通过将聚合引发剂连接到葡聚糖微球上并聚合N-异丙基丙烯酰胺实现。所得的杂化颗粒直径为约250μm并显示出热响应性。所建议的应用是表面粘附改性剂、活性药物靶定装置、生物化学触发的调节器或阀、细胞培养和组织工程的支持物。
WO 01/09204(Symyx Technologies)公开了通过活性类型或半活性类型的自由基聚合制备可控结构聚合物的方法。更加具体地,公开的结构化聚合物由具有在电泳分离系统中有利的性质的聚丙烯酰胺重复单元组成,这是因为与具有相同重复单元的线形非交联聚合物相比,所述部分支化或交联的聚合物的筛分能量得到增强。
发明简述
本发明的一个方面是合成具有可控分子量的聚合物色谱配体的方法。
本发明的另一个方面是合成具有可控结构、可控组成和/或可控官能团的聚合物色谱配体的方法。
本发明进一步的方面是合成具有窄多分散性的聚合色谱配体的方法。
本发明的其他方面和优点将在后面的详细描述中显现出来。
附图简述
图1提供了通过ATRP制备ω-溴端基-官能的聚苯乙烯的合成方案。
图2示出了制备ω-硫醇盐端基-官能的聚苯乙烯的合成方案。
图3示出了将ω-硫醇盐端基-官能的聚苯乙烯连接到经活化的琼脂糖颗粒上的合成方案。
图4示出了在现有技术分离介质上四种蛋白质(肌红蛋白(1)、核糖核酸酶A(2)、α-乳白蛋白(3)和α-糜蛋白酶原A(4))的对比洗脱图。
图5示出了在现有技术分离介质High Sub Phenyl SepharoseTM6FF(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)上四种蛋白质(如图4中所定义)的对比洗脱图。
图6示出了在如下所述的本发明凝胶1上四种蛋白质(如图4中所定义)的洗脱图。
定义
术语“从......接枝”在本文中用作表面引发的单体聚合。
术语“接枝到”用作将聚合物连接到表面上。
术语“基础基质”在本文中是指一种载体材料,可以将配体连接到其上以提供分离基质。
术语“分离基质”在本文中是指配体已经连接到其上的基础基质。术语“配体”以其在色谱领域的常规意义进行使用,即作为含有一个或多个能够与目标发生相互作用的官能团的侧链基团。在本文中,术语“相互作用”可以是结合(一般表示为吸附),或者是选择性阻滞。
术语“凝胶”在本文中用作凝胶形式的分离基质。
术语聚合“引发剂”本文中是指在链聚合过程中能够作为原子转移前体的化合物。
术语聚合“催化剂”本文中是指在链聚合过程中能够作为原子转移促进剂的化合物。
术语“多分散性”是指分子量分布,定义为重均分子量除以数均分子量(Mw/Mn)。
发明详述
本发明的第一方面是制备分离基质的方法,所述方法包括
(a)提供包含一个或多个色谱官能团的不饱和单体;
(b)使所述单体与引发剂和催化剂接触;
(c)对所述单体实施可控自由基聚合;
(d)将所得聚合物连接到基础基质上。
所述不饱和单体可以是任何能够进行可控自由基聚合的单体,并且可容易地由本领域的技术人员进行选择。在一个实施方案中,在步骤(a)中,提供单体的混合物,其中至少一种含有至少一个色谱官能团(functionality)。因此,从步骤(c)得到的聚合物可以是共聚物,嵌段聚合物,例如无规、嵌段、梯度、星形、接枝或梳形共聚物,以及超支化和树枝形聚合物或共聚物。制备共聚物的单体组合的说明性例子是甲基丙烯酸乙酯-苯乙烯和甲基丙烯酸乙酯-丙烯酰胺。在一个实施方案中,从步骤(c)得到的聚合物是被取代的。
在本发明方法的一个实施方案中,在步骤(a)中,提供含有一个或多个疏水色谱官能团的单体。在本文中,应理解的是术语“单体”是指一类单体。因此,在本发明方法的有利实施方案中,步骤(a)包括苯乙烯类单体(styrene monomers)和任选的一种或多种额外的不饱和单体。在一个具体实施方案中,所述单体选自苯乙烯、五氟苯乙烯、4-甲基苯乙烯、4-叔丁基苯乙烯、4-(三氟甲基)苯乙烯和缩水甘油基乙烯基苄基醚。所以,在本发明方法的一个实施方案中,分离基质是疏水相互作用(HIC)分离基质。因此,在这种情况下,每个单体单元将提供一个疏水官能团。但是,可选择的,步骤(a)可以包含两种或多种单体的混合物。适合与上述单体混合的其它不饱和单体对本领域的技术人员来说是公知的,包括例如甲基丙烯酸羟乙酯。
疏水基质的一种特定情况是适合用于反相色谱法(RPC)的基质,该色谱法使用比HIC更加强烈的疏水的基质。在该实施方案中,一些说明性单体是对辛基苯乙烯、对环己基苯乙烯、对十二烷基苯乙烯和对异丙基苯乙烯。
在可选择的实施方案中,对单体进行选择从而从步骤(c)得到的聚合物是如上所述的刺激-响应聚合物。因此,在该实施方案中,单体是例如N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm),并且得到的聚合物是温度响应聚合物。在另一个实施方案中,单体是丙烯酸(AAc)。在该实施方案中,从步骤(c)得到的聚合物是pH敏感的聚合物。在一个有利的实施方案中,从步骤(c)得到的聚合物是包含疏水官能团的pH响应聚合物,例如SE0300791-1(WO 2004/07831)(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)所公开的那样,该文献引入本文作为参考。因此,在一个实施方案中,分离基质包含pH响应聚合物。
如本领域技术人员将会理解的那样,任何其它种类的色谱官能团可以同样地存在于不饱和单体之上以提供其它种类的分离基质。因此,色谱官能团可以是例如离子交换基团、亲和基团、IMAC基团、混合型的配体等等。例如,亲和配体合适地由例如丙烯酰氨基鲱精胺和丙烯酰氨基苄脒的单体制备;以及离子交换配体可以由提供有离子交换基团或被保护的离子交换基团的丙烯酸叔丁酯或甲基丙烯酸叔丁酯制备。本领域的技术人员对于期望的目的可以容易地选择最合适的单体,并且如果需要还可以包括任何额外的步骤例如去保护。
如以上所述,步骤(c)是不饱和单体的可控自由基聚合。可控自由基聚合的概念在聚合物化学领域是公知的,很多教科书都详细描述了一般概念和各种实施方案,参见例如“Handbook of radicalpolymerisation”2002,Edited by Krzysztof Matyjaszewski and ThomasP.Davies,Wiley Intersciences,其引入本文作为参考。简单来说,与逐步聚合相反,可控自由基聚合(CRP)产生具有预定平均分子量和窄多分散性(polydispersities)的聚合物。CRP方法中的增长快速达到最终大小,该最终大小由单体:引发剂比率决定。因此,在一个实施方案中,单体:引发剂比率为1/5-1/200。
本发明首次提出,通过使用可控自由基聚合制备被良好限定的配体,接着将所得配体通过“接枝到”技术连接到基础基质,来制备分离基质。因此,所述可控自由基聚合步骤使得可以制备具有可控结构、组成和官能团的聚合物色谱配体。如以上所述,常规而言聚合物色谱配体通过“从......接枝”技术制备,其中在基础基质表面引发常规步骤聚合。这种技术之所以得到广泛使用,大概是由于常规色谱基质中的配体的精确组成并不重要。因此,容易制备使得由“从......接枝”步骤聚合的配体处于有利地位。但是,随着新型聚合物配体例如刺激-响应聚合物的最近的发展,出现了一个以前不知道的问题,即如何制备被更加良好限定的配体。配体的精确本性对实际的色谱性能越重要,那么该问题就越重要。例如,在HIC中,目标化合物的结合强度将取决于能够接触每个目标化合物的疏水官能团的数目,并且为了实现有效洗脱需要控制结合强度。
在本发明方法的一个实施方案中,步骤(b)包括催化剂并且所述引发剂包括有机卤化物基团。说明性的引发剂是烷基卤、芳基卤和卤代烷基酯。此类卤化物的一个具体例子是1-苯基乙基溴,其是可商购的,例如从Aldrich。在一个具体实施方案中,所述催化剂是过渡金属络合物并且可控聚合是原子转移自由基聚合(ATRP)。所述催化剂可以是能够参予与引发剂和休眠聚合物链的氧化还原循环但是不与聚合物链形成直接的碳-金属键的任何过渡金属化合物。所以,过渡金属络合物可以选自Cu(I)/Cu(II);Fe(II)/Fe(III);Ru(II)/Ru(III);Cr(II)/Cr(III);Mo(0)/Mo(I);Mo(II)/Mo(III);W(II)/W(III);Rh(III)/Rh(IV);Co(I)/Co(II);Re(II)/Re(III);Ni(0)/Ni(I);Mn(III)/Mn(IV);V(II)/V(III);Zn(I)/Zn(II);Au(I)/Au(II)和Ag(I)/Ag(II)。在ATRP中,不饱和的单体可以是任何自由基可聚合的烯,例如(甲基)丙烯酸酯、苯乙烯和二烯。合适单体和其它ATRP条件的更加详细的选择可在上述美国专利5763548中找到,其中ATRP被建议用于制备塑料、弹性体、粘合剂等等。
在一个有利的实施方案中,所述方法还包括提供对经活化的基础基质具有反应性的基团的所述聚合物的步骤。在一个实施方案中,这在早期阶段通过使用含有此类基团的引发剂实现。在第二实施方案中,这通过使用含有此类基团的反应性单体实现。在可选择的实施方案中,这在后面的阶段通过用对经活化的基础基质具有反应性的基团代替所述聚合物的端基卤化物实现。该可选择的实施方案优选作为在上述步骤(c)和(d)之间的步骤实施,并且有利地在例如如果步骤(c)采用ATRP实施的情况下使用。代替基团的一些例子包括例如叠氮基、氨基、巯基、羟基、羧酸等等。因此,在步骤(d)中,在一个具体实施方案中,通过将在聚合物末端得到的卤化物基团转化为硫醇基,可以容易地将通过ATRP制备的聚合物连接到基础基质上。
根据已知方法,含有对经活化的基础基质具有反应性的基团的聚合物被方便地连接到烯丙基活化的、环氧基活化的或硫醇活化的基础基质上。对适合于将聚合物连接到基础基质上的技术的综述,参见例如Immobilized Affinity Ligand Techniques,Hermanson et al,Gret T.Heranson,A.Krishna Malia and Paul K.Smith,Academic Press,INC,1992,其引入本文作为参考。
在可选择的实施方案中,可控聚合是硝基氧调控的聚合(NMP)。NMP以前在纳米颗粒领域被提出,在该领域中其多功能性使得能够制备适合用于构建限定的材料的三维大分子结构。NMP是可逆链聚合方法,可逆链聚合方法是指可逆的聚合-解聚平衡。可用于NMP中的不饱和单体是上述讨论的任一种,例如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、苯乙烯等等的单体。
在另一个可选择的实施方案中,可控聚合是可逆加成断链链转移(RAFT)聚合。RAFT聚合方法是作为制备活性(living)均聚物、嵌段和星形聚合物的有力的和工业友好的路径出现的。所述方法包括例如在硫代羰基硫化合物的存在下的常规自由基聚合。可用于RAFT中的不饱和单体是上述讨论的任一种,例如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、苯乙烯等等的单体。
在本发明方法的一个实施方案中,聚合步骤(c)的产物的多分散指数(PDI)低于约1.4,优选低于约1.3。因此,本发明提供了制备聚合物色谱配体的方法,其中分子量分布显著低于被建议用于该目的的任何其它方法。
从步骤(c)得到的聚合物可以是任何合适的长度,其可以由本领域的技术人员容易地调节到期望的值。在一个实施方案中,聚合物的大小为500g/mol-50000g/mol。聚合物的长度将取决于如此制备的分离基质的期望的性质。因此,需要考虑在共聚物的情况下每种官能团的频率以及需要考虑具体官能团的性质。如本领域技术人员将会容易地理解的那样,如果例如准备制备HIC基质,那么聚合物的长度将取决于官能团的疏水性以及任何其它单体的存在。但是,本发明的必要特征不是所使用的实际数量或单体单元,而是包含良好限定的配体的基质的这种设计。如上所述,用于从基础基质合成聚合物配体的现有技术聚合步骤不能制备良好限定的色谱配体。
所述基础基质可以是任何合适的形式,例如颗粒,优选基本为球形的颗粒,单块(monoliths),薄膜,过滤器(filters),碎片(chips),毛细管或任何其它表面。所述基础基质优选是多孔的,在这种情况下从步骤(c)得到的配体被连接到基质的外表面和连接到可以到达的孔表面。因此,在本发明方法的一个实施方案中,基础基质由直径低于约100μm例如低于约90μm的多孔颗粒组成。因此,说明性的颗粒直径范围是0-100μm,例如20-80μm,例如30-50μm或50-70μm。在一个有利的实施方案中,颗粒是多孔的。
在本发明方法中使用的基础基质可以由有机或无机材料例如有机聚合物制成。因此,在一个实施方案中,基础基质由交联的碳水化合物材料制成,例如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、魔芋(konjac)、角叉菜聚糖、结冷胶(gellan)、藻酸盐等等。此类基础基质可以由本领域技术人员根据标准方法容易地进行制备,例如反相悬浮凝胶化(S Hjertén:Biochim Biophys Acta 79(2),393-398(1964),其引入本文作为参考。或者,基础基质是可商购的产品,例如来自AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden的SepharoseTM FF、SepharoseTM HP或SephadexTM,该公司提供很多其它同样适合用于本发明方法中的基础基质。因此,在本发明基质的一个实施方案中,担体是交联的多糖。在一个具体实施方案中,所述多糖是琼脂糖。这些碳水化合物材料在固定配体之前通常被烯丙基化。概括而言,烯丙基化可以遵照标准方法用烯丙基缩水甘油基醚、烯丙基溴或任何其它合适的活化剂进行。
在可选择的实施方案中,用于本发明方法的基础基质由有机聚合物组成,例如交联的合成聚合物,例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺类、丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类、乙烯基酯类、乙烯基酰胺类等等。此类基础基质可由本领域技术人员根据标准方法容易地制备,参见例如”Styrene based polymer supports developed bysuspension polymerization”(R Arshady:Chimica e L’industria 70(9),70-75(1988)),其被引入本文作为参考。或者,用于本发明方法的基础基质是可商购的聚合物基质,例如来自Amersham Biosciences AB,Uppsala,Sweden的SourceTM,该公司提供很多其它同样适合用于本发明方法中的基础基质。
最后,本发明的通过可控自由基聚合制备的聚合物配体可以连接到无机基础基质,例如二氧化硅、磁颗粒、碳纳米管等等。如本领域的技术人员将会理解的那样,一些材料可能需要一些常规化学改性。
在一个可选择的实施方案中,分离基质是包覆有聚合物的基础基质,其中所述聚合物通过可控自由基聚合制备并接着接枝到所述基础基质。包覆类型的分离基质作为具有延伸剂(extenders)或具有柔软支臂(arms)的珠子、触手凝胶等等是已知的。可以提供此类包覆层以在空间上允许相对大的目标化合物与基质发生相互作用,或者改变基础基质的总体性质,例如从疏水改变为亲水。
在第二方面,本发明涉及如上所述制备的分离基质。在一个实施方案中,本发明的分离基质是疏水相互作用(HIC)基质。在另一个实施方案中,从步骤(c)得到的聚合物是刺激-响应聚合物。在一个具体实施方案中,从步骤(c)得到的聚合物是pH-响应聚合物,例如包含疏水官能团的pH-响应聚合物。
本发明的分离基质可以用于分离生物分子,例如蛋白质,例如单克隆或多克隆抗体,肽,例如二肽或低聚肽,核酸,例如DNA或RNA,肽核酸,病毒,细胞,例如细菌细胞,朊病毒(prions)等等。或者,所述分离基质可用于分离有机分子,例如候选药物。在一个可选择的实施方案中,本发明的分离基质可用于识别任何一种上述讨论的目标化合物,例如用于诊断目的。因此,使用本发明分离基质纯化的产物可以是药物或药物靶(drug targets);用于治疗中的载体(vectors),例如用于基因治疗中的质粒或病毒;营养添加剂(feed supplements),例如官能化的食物;诊断剂等等。根据本发明纯化的生物分子的具体应用是个性化医药的药物。
本发明的分离基质还可以用于从不希望的目标化合物例如上述的那些纯化期望得到的液体。
最后一个方面,本发明涉及含有上述分离基质的色谱柱。液相色谱的原理对于本领域的技术人员来说是公知的,包括吸附步骤和通常包括洗脱步骤。优选地,在所述步骤之间将对所述分离基质进行洗涤。如本领域技术人员将认识到的那样,缓冲液的性质和所使用的条件将取决于分离基质特别是聚合物配体的性质。
在一个实施方案中,本发明的色谱柱是称为“有限使用”色谱柱的类型,其在本发明中是指最适合使用有限的次数例如1-10次的填充色谱柱。在本文中,最适合是指为了得到与原始产品类似的性能,可以得到有限的使用次数。此类有限使用产品商业上称为“一次性产品”。
附图详述
图1提供了通过ATRP制备ω-溴端基-官能的聚苯乙烯的合成方案。
图2示出了制备ω-硫醇盐端基-官能的聚苯乙烯的合成方案。
图3示出了将ω-硫醇盐端基-官能的聚苯乙烯连接到经活化的琼脂糖颗粒上的合成方案。
图4示出了在现有技术分离介质Low Sub Phenyl SepharoseTM6FF(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)上四种蛋白质(肌红蛋白(1)、核糖核酸酶A(2)、α-乳白蛋白(3)和α-糜蛋白酶原A(4))的对比洗脱图。
图5示出了在现有技术分离介质High Sub Phenyl SepharoseTM6FF(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)上四种蛋白质(如图4中所定义)的对比洗脱图。
图6示出了在本发明凝胶1上四种蛋白质(如图4中所定义)的洗脱图。
更加具体地,图4-6示出了使用现有技术分离介质(Low Sub PhenylSepharoseTM 6 Fast Flow和High Sub Phenyl SepharoseTM 6 FastFlow,Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)(分别是图4和5)和一种根据本发明制备的HIC介质(图6)的四种蛋白质(肌红蛋白、核糖核酸酶A、α-乳白蛋白和α-糜蛋白酶原A)洗脱图的说明性对比。在相同的条件下将样品施加到柱子上,并且在所有情况下使用线性梯度降低盐浓度进行洗脱。
实验部分
本发明的实施例仅是用于说明目的,不应该理解为限制后附权利要求定义的本发明的范围。
实施例1:通过ATRP合成ω-溴端基-官能的聚苯乙烯
在磁力搅拌下,在圆底烧瓶中混合苯乙烯(St)(20.8g,200mmol,20eq.)、溴化亚铜(CuBr)(1.434g,10mmol,1eq.)和2,2’-联吡啶(Bipy)(3.436g,22mmol,2.2eq.)。该溶液用氮气或azote gas吹扫15分钟.将(1-溴乙基)苯(1-PeBr)(1.85g,10mmol,1eq.)加入到烧瓶中,然后将其密封。将反应从室温加热到110℃并进行5小时。然后冷却反应混合物并将聚合物溶于CH2Cl2中。使该溶液流过短的二氧化硅柱。蒸发溶剂得到粘稠的粗产物。将该粗产物溶于最少量的CH2Cl2中,通过在MeOH(MeOH体积=10倍CH2Cl2的体积)再沉淀CH2Cl2相而得到聚合物。在玻璃过滤器上过滤沉淀的聚合物并在50℃在真空下进行干燥。
Mn=2000gmol-1;PDI=1.26
实施例2:ω-硫醇盐(thiolate)端基-官能的聚苯乙烯的合成
在磁力搅拌下在圆底烧瓶中将实施例1的ω-溴端基-官能的聚苯乙烯(4g,2mmol,1eq.)溶于DMF(30ml)中。将该溶液加热到100℃并用氮气吹扫15分钟。将硫脲(0.305g,4mmol,2eq.)加入到烧瓶中,然后将其密封。反应在100℃过夜。将溶于水(1ml)的NaOH(0.16g,4mmol,2eq.)加入到烧瓶中并使反应在95℃过夜。然后将反应混合物冷却并加入CH2Cl2。然后用饱和NaCl水溶液萃取有机相三次。然后用MgSO4干燥有机相并在玻璃过滤器上过滤。蒸发溶剂,将得到的粗产物溶于最少量的CH2Cl2中。通过在MeOH(MeOH体积=10倍CH2Cl2的体积)再沉淀CH2Cl2相而得到聚合物。在玻璃过滤器上过滤沉淀的聚合物并在50℃在真空下进行干燥。
Mn=2000gmol-1;PDI=1.28
实施例3:凝胶1:在经活化的SepharoseTM 6FF上连接ω-硫醇盐端基-官能的聚苯乙烯(Mn=2000gmol-1)
根据公知的标准方法得到溴化的SepharoseTM 6 Fast Flow。然后,用溴活化5ml(0.325mmol烯丙基基团)烯丙基化的SepharoseTM 6 FastFlow(携带量是65μmol/ml凝胶)。活化之后,用丙酮洗涤凝胶并吸干。
将实施例2的ω-硫醇盐端基-官能的聚苯乙烯(3.25g,1.625mmol,相对于烯丙基基团5eq.)溶于丙酮(10ml)中并将三乙胺(0.33g,3.25mmol,相对于烯丙基基团10eq.)加入该溶液中。将经活化的凝胶和所述聚合物溶液混合在一起并将混合物在50℃振荡过夜。然后用丙酮、乙醇和水洗涤凝胶1直到除去没有连接的聚合物。
实施例4:HIC的色谱评价
所有的实验都在室温下使用装有Unicorn 3.1软件的KTATMExplorer 100色谱系统(Amersham Biosciences AB)进行。
使用运行于1ml/min的在来自Amersham Biosciences AB的5/5HR柱中的1-2ml凝胶。所述方法包括使用2M(NH4)2SO4+0.1M磷酸钾(pH7)的A缓冲液,加上另一种0.1M磷酸钾(pH7)的B缓冲液。四种蛋白质,肌红蛋白(0.5mg/ml)、核糖核酸酶A(2mg/ml)、α-乳白蛋白(0.5mg/ml)和α-糜蛋白酶原A(0.8mg/ml),在A缓冲液中混合并施加到柱子上。然后柱子用A缓冲液2ml运行,接着施加在20ml中从100%A到100%B的梯度。
参比凝胶的色谱图,Low Sub Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow和High Sub Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow,分别示于图4和图5中。
用SepharoseTM 6 Fast Flow基础基质制备的凝胶1色谱图示于图6中。本发明的凝胶工作于上述测试HIC条件下并表现出与现有技术参比凝胶不同的洗脱曲线。
色谱图的图标:
1:肌红蛋白
2:核糖核酸酶A
3:α-乳白蛋白
4:α-糜蛋白酶原A

Claims (15)

1.一种制备分离基质的方法,所述方法包括
a)提供包含一个或多个色谱官能团的不饱和单体;
b)使所述单体与引发剂和催化剂接触;
c)对所述单体实施可控自由基聚合;和
d)将所得聚合物连接到基础基质上。
2.权利要求1的方法,其包括提供具有对经活化的基础基质具有反应性的基团的所述聚合物。
3.权利要求1或2的方法,其中在步骤(a)中,提供包含一个或多个疏水色谱官能团的单体。
4.权利要求3的方法,其中步骤(a)包括苯乙烯类单体,和任选的一种或多种额外的不饱和单体。
5.前述权利要求任一项的方法,其中在步骤(b)中,所述引发剂包含卤化物基团。
6.权利要求5的方法,其中所述催化剂是过渡金属络合物并且所述可控聚合是原子转移自由基聚合(ATRP)。
7.权利要求1-4任一项的方法,其中所述可控聚合是硝基氧调控的聚合(NMP)。
8.权利要求1-4任一项的方法,其中所述可控聚合是可逆加成断链链转移(RAFT)聚合。
9.前述权利要求任一项的方法,其中聚合步骤(c)的产物的多分散指数(PDI)低于约1.4,优选低于约1.3。
10.前述权利要求任一项的方法,其中所述基础基质包含多孔颗粒。
11.权利要求1-9任一项的方法,其中所述基础基质包含多孔薄膜。
12.根据权利要求1-11任一项制备的分离基质。
13.权利要求12的分离基质,其是疏水相互作用(HIC)基质。
14.权利要求12的分离基质,其中从步骤(c)得到的聚合物是刺激-响应聚合物。
15.一种色谱柱,填充有权利要求12-14任一项的基质。
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