RU2665442C2 - Способ получения хроматографического материала - Google Patents
Способ получения хроматографического материала Download PDFInfo
- Publication number
- RU2665442C2 RU2665442C2 RU2016110532A RU2016110532A RU2665442C2 RU 2665442 C2 RU2665442 C2 RU 2665442C2 RU 2016110532 A RU2016110532 A RU 2016110532A RU 2016110532 A RU2016110532 A RU 2016110532A RU 2665442 C2 RU2665442 C2 RU 2665442C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- particles
- styrene
- separation
- ofc
- mobile phase
- Prior art date
Links
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 52
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- DXIJHCSGLOHNES-UHFFFAOYSA-N 3,3-dimethylbut-1-enylbenzene Chemical compound CC(C)(C)C=CC1=CC=CC=C1 DXIJHCSGLOHNES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- LVJZCPNIJXVIAT-UHFFFAOYSA-N 1-ethenyl-2,3,4,5,6-pentafluorobenzene Chemical compound FC1=C(F)C(F)=C(C=C)C(F)=C1F LVJZCPNIJXVIAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- STMDPCBYJCIZOD-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dinitroanilino)-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O STMDPCBYJCIZOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 claims abstract description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 23
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 18
- 238000005937 allylation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 125000003011 styrenyl group Chemical group [H]\C(*)=C(/[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 43
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 36
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 34
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 11
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 11
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 8
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 6
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- -1 for example Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 3
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogenphosphate monohydrate Chemical compound O.[Na+].OP(O)([O-])=O BBMHARZCALWXSL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- QMMRCKSBBNJCMR-KMZPNFOHSA-N Angiotensin III Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 QMMRCKSBBNJCMR-KMZPNFOHSA-N 0.000 description 1
- 102400000344 Angiotensin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800000734 Angiotensin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102400000348 Angiotensin-3 Human genes 0.000 description 1
- 101800000738 Angiotensin-3 Proteins 0.000 description 1
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- ORWYRWWVDCYOMK-HBZPZAIKSA-N angiotensin I Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 ORWYRWWVDCYOMK-HBZPZAIKSA-N 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011095 buffer preparation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229920005613 synthetic organic polymer Polymers 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
- B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
- B01J20/3268—Macromolecular compounds
- B01J20/3278—Polymers being grafted on the carrier
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/282—Porous sorbents
- B01J20/285—Porous sorbents based on polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/32—Bonded phase chromatography
- B01D15/325—Reversed phase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
- B01J20/287—Non-polar phases; Reversed phases
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
- B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
- B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
- B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
- B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
- B01J20/3212—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0036—Galactans; Derivatives thereof
- C08B37/0039—Agar; Agarose, i.e. D-galactose, 3,6-anhydro-D-galactose, methylated, sulfated, e.g. from the red algae Gelidium and Gracilaria; Agaropectin; Derivatives thereof, e.g. Sepharose, i.e. crosslinked agarose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F290/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers modified by introduction of aliphatic unsaturated end or side groups
- C08F290/08—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers modified by introduction of aliphatic unsaturated end or side groups on to polymers modified by introduction of unsaturated side groups
- C08F290/10—Polymers provided for in subclass C08B
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Graft Or Block Polymers (AREA)
- Processes Of Treating Macromolecular Substances (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения материала для хроматографии. Предложен способ получения материала для хроматографии (ОФХ), включающий следующие стадии: аллилирование частиц пористого полисахаридного материала с помощью аллилглицидилового эфира и прививание стирольных мономеров, выбранных из стирола, трет-бутилстирола и пентафторстирола, на указанные частицы, содержащие аллильную группу. Материал обеспечивает улучшенное разделение пептидов. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 17 ил., 3 табл.
Description
Область техники
Изобретение относится к способу получения материала для хроматографии. Более конкретно, изобретение относится к способу получения материала для обращенно-фазной хроматографии (ОФХ) посредством модификации поверхности частиц для хроматографии.
Предпосылки создания изобретения
Адсорбционная хроматография зависит от химических взаимодействий между молекулами растворенного вещества и специально разработанными лигандами, привитыми на хроматографическую матрицу. За прошедшие годы множество различных типов лигандов были привиты на хроматографические носители для очистки биомолекул, используя с этой целью различные биохимические свойства от электронного заряда до биологического сродства. Важным дополнением к арсеналу адсорбционных методик для препаративной хроматографии биомолекул стала обращенно-фазная хроматография, в которой связывание вещества, растворенного в подвижной фазе, с н-алкил-углеводородным или ароматическим лигандом происходит через гидрофобное взаимодействие. Обращенно-фазная хроматография нашла применение как в аналитических, так и в препаративных целях в области биохимического разделения и очистки. Молекулы, которые проявляют некоторую степень гидрофобное™, такие как, например, белки, пептиды и нуклеиновые кислоты, можно разделить с помощью обращенно-фазной хроматографии с прекрасной степенью извлечения и разделения. Кроме того, применение ион-парных модификаторов в подвижной фазе позволяет применять обращенно-фазную хроматографию в случае растворенных веществ, имеющих заряд, таких как, например, полностью незащищенные олигонуклеотиды и гидрофильные пептиды. Препаративная обращенно-фазная хроматография нашла широкое применение от области микроочистки фрагментов белков при секвенировании до процесса очистки рекомбинантных белковых продуктов в промышленном масштабе.
Механизм разделения в обращенно-фазной хроматографии зависит от гидрофобного связывания между молекулами вещества, растворенного в подвижной фазе, и привитым гидрофобным лигандом, то есть неподвижной фазой. Сама по себе действительная природа гидрофобного связывания является предметом горячих дискуссий, но в свете традиционных представлений допускается, что связывание является результатом положительного энтропийного эффекта. Обязательным условием в отношении начальной подвижной фазы, используемой в обращенно-фазной хроматографии, в первую очередь, является ее водная основа, о чем свидетельствует высокая степень структурированной воды, окружающей как молекулу растворенного вещества, так и привитого лиганда. Поскольку растворенное вещество связывается с привитым гидрофобным лигандом, гидрофобная область, подверженная действию растворителя, минимизирована. Следовательно, степень структурированной воды уменьшается при соответствующем положительном росте энтропии системы. Таким образом, связывание является преимущественным с энергетической точки зрения для гидрофобных составляющих, то есть растворенного вещества и лиганда.
По экспериментальному воплощению обращенно-фазовая хроматография представляет собой адсорбционный процесс, основанный на механизме распределения для осуществления разделения. Молекулы растворенного вещества распределяются (то есть устанавливается равновесие) между подвижной фазой и неподвижной фазой. Распределение растворенного вещества между двумя фазами зависит от связывающих свойств среды, гидрофобности растворенного вещества и состава подвижной фазы. Первоначально условия эксперимента подбираются для предпочтительной адсорбции растворенного вещества из подвижной фазы на неподвижную фазу. После этого состав подвижной фазы модифицируется для предпочтительной десорбции растворенного вещества с неподвижной фазы обратно в подвижную фазу. В данном случае адсорбция считается крайним вариантом состояния равновесия, когда распределение молекул растворенного вещества в неподвижной фазе составляет по существу 100%. С другой стороны, десорбция представляет собой крайний вариант состояния равновесия, когда растворенное вещество по существу на 100% распределено в подвижной фазе.
При обращенно-фазной хроматографии биомолекул обычно используют градиентное, а не изократическое элюирование. Поскольку биомолекулы прочно адсорбируются поверхностью обращенно-фазной матрицы в условиях водной среды, их десорбция с матрицы проходит в очень узком диапазоне концентраций органических модификаторов. Наряду с такими высокомолекулярными биомолекулами, имеющими уникальные адсорбционные свойства, типичные биологические образцы содержат смесь разнообразных биомолекул с соответствующим разнообразным диапазоном адсорбционных свойств. Единственным практическим способом обращенно-фазного разделения сложных биологических образцов является, таким образом, градиентное элюирование.
Вкратце, разделение в методе обращенно-фазной хроматографии зависит от обратимой адсорбции/десорбции молекул растворенного вещества с различающейся степенью гидрофобности на гидрофобной неподвижной фазе.
Первая стадия в хроматографическом процессе состоит в уравновешивании набитой колонки, содержащей среду с обращенной фазой, при подходящих для начальной подвижной фазы условиях pH, ионной силы и полярности (гидрофобности подвижной фазы). Полярность подвижной фазы контролируют путем добавления органических модификаторов, таких как, например, ацетонитрил. Ион-парные агенты, такие как, например, трифторуксусная кислота, тоже могут подойти. Полярность начальной подвижной фазы (обычно называемой подвижной фазой А) должна быть достаточно низкой, чтобы растворить частично гидрофобное растворенное вещество, но достаточно высокой, чтобы обеспечить связывание растворенного вещества с обращенно-фазной хроматографической матрицей. На второй стадии вводят образец, содержащий растворенные вещества, подлежащие разделению. Идеально, если образец растворяют в той же подвижной фазе, которую используют для установления равновесия в хроматографическом слое. Образец вводят в колонку при скорости потока, при которой происходит оптимальное связывание. После того, как образец введен, хроматографический слой продолжают промывать подвижной фазой A для того, чтобы удалить любые несвязанные и нежелательные молекулы растворенных веществ.
Связанные растворенные вещества затем десорбируются из обращенно-фазной среды путем регулирования полярности подвижной фазы таким образом, что связанные молекулы растворенного вещества последовательно десорбируются и вымываются из колонки. В обращенно-фазном варианте хроматографии для этого обычно уменьшают полярность подвижной фазы путем увеличения процентного содержания органического модификатора в подвижной фазе. Это приводит к обеспечению высокой концентрации органического модификатора в конечной подвижной фазе (подвижная фаза В). Как правило, pH растворов начальной и конечной подвижной фаз остается постоянным. Градиентное уменьшение полярности подвижной фазы (увеличение гидрофобности подвижной фазы) достигается путем увеличения линейного градиента от 100% начальной фазы А, содержащей небольшое количество или не содержащей органического модификатора, до 100% (или менее) подвижной фазы В, содержащей более высокую концентрацию органического модификатора. Связанные растворенные вещества десорбируются со среды с обращенной фазой в соответствии с характерной для них гидрофобностью.
Четвертая стадия процесса включает извлечение веществ, не десорбировавшихся ранее. Обычно это осуществляют путем изменения подвижной фазы В на практически 100% органический модификатор для того, чтобы обеспечить полное удаление всех связанных веществ перед тем, как повторно использовать эту же колонку.
Пятая стадия представляет собой повторное уравновешивание хроматографической среды от состояния со 100% подвижной фазой В обратно к условиям с начальной подвижной фазы. Разделение в обращенно-фазной хроматографии происходит благодаря различным связывающим свойствам растворенных веществ, присутствующих в образце, являющимся результатом различий в их гидрофобных свойствах. Степень связывания молекулы растворенного вещества со средой с обращенной фазой можно регулировать путем варьирования гидрофобных свойств начальной подвижной фазы. Хотя гидрофобность молекулы растворенного вещества трудно оценить количественно, разделение растворенных веществ, гидрофобные свойства которых лишь немного различаются, легко осуществимо. Благодаря своей превосходной разрешающей способности, обращенно-фазная хроматография является незаменимым методом для высокоэффективного разделения сложных биомолекул.
Обычно обращенно-фазное разделение первоначально достигается с помощью градиента в широком диапазоне от 100% подвижной фазы A до 100% подвижной фазы В. Количество органического модификатора в начальной и конечной подвижных фазах тоже может сильно варьировать. Однако рабочее процентное содержание органического модификатора составляет 5% или менее в подвижной фазе А и 95% или более в подвижной фазе В.
Метод обращенно-фазной хроматографии допускает существенную гибкость условий разделения, так что исследователь может выбирать, связать представляющее интерес растворенное вещество, позволив примесям без задержки пройти через колонку, или связать примеси, позволив представляющему интерес растворенному веществу свободно пройти. Как правило, более рационально связать представляющее интерес растворенное вещество, поскольку десорбированное растворенное вещество вымывается с хроматографической среды в концентрированном виде. Кроме того, поскольку связывание завершается в условиях начальной подвижной фазы, начальная концентрация целевого растворенного вещества в растворе образца не является важной, позволяя вводить в колонку разбавленные образцы.
Хроматографическая среда с обращенной фазой состоит из гидрофобных лигандов, привитых на пористую нерастворимую послойную матрицу. Матрица должна быть химически и механически стабильной. Основная матрица для приемлемой в промышленных масштабах среды с обращенной фазой обычно состоит из силикагеля или синтетического органического полимера, такого как, например, полистирол.
Когда выбирают буферные условия для обращенно-фазного разделения, pH является одним из параметров, оказывающих существенное влияние на профиль разделения. Кроме того, стабильность целевой молекулы тоже должна быть принята во внимание. Следовательно, существует необходимость в хроматографической среде обращенной фазой, которую можно использовать в широком диапазоне pH, таком как, например, pH от 3 до 12, чтобы предоставить потребителю полную свободу в выборе наиболее оптимального pH.
Хотя ОФХ среды из силикагеля и полистирола удовлетворительно функционируют во многих случаях, их невозможно использовать в широком диапазоне pH. Ранее в US 7048858 В2 было показано, что прививание стирола на полимерную (например, сшитый полистирол) подложку, приводящее к изменению пористой структуры, дает некоторые улучшения при разделении инсулина. Полистирол - химически стабилен в широком диапазоне pH, но, в сравнении с силикагелем при многих значениях pH, обладает меньшей селективностью. С другой стороны, силикагель не стабилен при длительном использовании при pH более ~8.
Таким образом, по-прежнему существует необходимость в улучшенных ОФХ средах, которые проявляют хорошую селективность в широком диапазоне pH.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения ОФХ материала на основе частиц пористого углевода, который соответствует требованиям механической прочности и дает высокую селективность в широком диапазоне pH.
Первый аспект настоящего изобретения относится к способу получения материала для обращенно-фазной хроматографии (ОФХ), включающему следующие стадии: введение ненасыщенных групп на поверхность частиц пористого углевода и прививание стирольных мономеров на указанные частицы, содержащие ненасыщенную группу.
Частицы пористого углевода предпочтительно сделаны из полисахаридного материала, наиболее предпочтительно из агарозы.
Агарозу прежде удачно использовали для метода гидрофобной хроматографии (ГХ), и на рынке доступны многие продукты промышленного назначения, как, например, Butyl Sepharose Fast Flow (производства компании GE Healthcare). Продукты для ГХ должны быть лишь умеренно гидрофобными, поэтому агарозу не рассматривали для применения в методе обращенно-фазной хроматографии, где требуется высоко гидрофобная подложка, из-за присущей ей гидрофильности и сложности сделать ее в достаточной степени гидрофобной.
Авторы изобретения случайно обнаружили, что путем прививания стирола на поверхность частиц сшитой агарозы можно получить приемлемую гидрофобность в комбинации с хорошей селективностью во всем диапазоне pH, которую не проявляют ни силикагель, ни полистирол.
Предпочтительно, чтобы ненасыщенные группы в заявленном способе получения представляли собой аллильные группы.
В одном из воплощений способа аллилирование осуществляют с помощью аллилглицидилового эфира (АГЭ).
Стирольные мономеры могут быть выбраны, например, из стирола, трет-бутилстирола или пентафторстирола.
Предпочтительно, чтобы объемное содержание стирольного мономера в прививающем растворе составляло от 5 до 95% об./об., предпочтительно от 25 до 75%.
В предпочтительном воплощении аллилирование проводят с помощью АГЭ и стирольный мономер представляет собой стирол или трет-бутилстирол, присутствующий в прививающем растворе в количестве 50% об./об.
Второй аспект настоящего изобретения относится к ОФХ материалу, полученному в соответствии с указанным выше способом.
Третий аспект настоящего изобретения относится к использованию указанного выше полученного ОФХ материала для осуществления обращенно-фазной хроматографии.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 представлена хроматограмма разделения четырех тестовых пептидов (смотри ниже Таблицу 3) на прототипе ОФХ LS002597 (смотри ниже Таблицу 6) при pH 7.
На Фиг. 2 представлена хроматограмма разделения четырех тестовых пептидов (смотри ниже Таблицу 3) на прототипе ОФХ LS002597 (смотри ниже Таблицу 6) при pH 3.
На Фиг. 3 представлена хроматограмма разделения четырех тестовых пептидов (смотри ниже Таблицу 3) на прототипе ОФХ LS002597 (смотри ниже Таблицу 6) при pH 12.
На Фиг. 4 представлена хроматограмма разделения четырех тестовых пептидов (смотри ниже Таблицу 3) на прототипе ОФХ LS002980 (смотри ниже Таблицу 6) при pH 7.
На Фиг. 5 представлена хроматограмма разделения четырех тестовых пептидов (смотри ниже Таблицу 3) на прототипе ОФХ LS002980 (смотри ниже Таблицу 6) при pH 3.
На Фиг. 6 представлена хроматограмма разделения четырех тестовых пептидов (смотри ниже Таблицу 3) на прототипе ОФХ LS002980 (смотри ниже Таблицу 6) при pH 12.
На Фиг. 7 представлена хроматограмма разделения четырех тестовых пептидов (смотри ниже Таблицу 3) на прототипе ОФХ LS002889 (смотри ниже Таблицу 6) при pH 7.
На Фиг.8 представлена хроматограмма разделения четырех тестовых пептидов (смотри ниже Таблицу 3) на прототипе ОФХ LS002889 (смотри ниже Таблицу 6) при pH 3.
На Фиг. 9 представлена хроматограмма разделения четырех тестовых пептидов (смотри ниже Таблицу 3) на прототипе ОФХ LS002889 (смотри ниже Таблицу 6) при pH 12.
На Фиг. 10 представлена хроматограмма разделения четырех тестовых пептидов (смотри ниже Таблицу 3) на прототипе ОФХ LS003147A (смотри ниже Таблицу 6) при pH 7.
На Фиг. 11 представлена хроматограмма разделения четырех тестовых пептидов (смотри ниже Таблицу 3) на прототипе ОФХ LS003147A (смотри ниже Таблицу 6) при pH 3.
На Фиг. 12 представлена хроматограмма разделения четырех тестовых пептидов (смотри ниже Таблицу 3) на прототипе ОФХ LS003147A (смотри ниже Таблицу 6) при pH 12.
На Фиг. 13 представлена хроматограмма сравнительного испытания тех же четырех тестовых пептидов (Таблица 3) на колонке с силикагелем (уровень техники) при pH 7.
На Фиг. 14 представлена хроматограмма сравнительного испытания тех же четырех тестовых пептидов (Таблица 3) на колонке с силикагелем (уровень техники) при pH 3.
На Фиг. 15 представлена хроматограмма сравнительного испытания тех же четырех тестовых пептидов (Таблица 3) на колонке с полистиролом при pH 7.
На Фиг. 16 представлена хроматограмма сравнительного испытания тех же четырех тестовых пептидов (Таблица 3) на колонке с полистиролом при pH 3.
На Фиг. 17 представлена хроматограмма сравнительного испытания тех же четырех тестовых пептидов (Таблица 3) на колонке с полистиролом при pH 12.
Подробное описание изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано более подробное со ссылкой на некоторые неограничивающие примеры и прилагаемые графические материалы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
Для всех экспериментов использовали частицы пористой сшитой агарозы со средним размером частиц 8,35 мкм.
Модифицирующие реагенты перечислены в Таблице 1.
ЭКСПЕРИМЕНТ 1: LS002597 Аллилирование и прививание полистирола на частицы агарозы
Аллилирование
50 мл частиц агарозы промывали на фильтре из пористого стекла 500 мл дистиллированной воды. Готовили раствор гидроксида натрия в дистиллированной воде с концентрацией 50% масс, и промывали частицы 300 мл 50%-ного раствора гидроксида натрия. Частицы высушивали над вакуумом и переносили в круглодонную колбу объемом 250 мл, снабженную механической мешалкой. Добавляли 40 мл 50%-ного раствора гидроксида натрия и повышали температуру до 50°C. Скорость перемешивания устанавливали 250 оборотов/мин. Когда устанавливалась температура, добавляли 50 мл аллилглицидилового эфира. Реакционную смесь выдерживали в течение ночи.
Суспензию, содержащую частицы, переносили на фильтр из пористого стекла и частицы промывали 500 мл дистиллированной воды, 500 мл этанола и 500 мл 20%-ного этанола.
Количество привитых аллильных групп определяли методом титрования и обнаружили, что оно составляет 625 мкмоль/мл частиц. Прививание полистирола
10 мл аллилированных частиц агарозы, полученных как описано выше, промывали на фильтре из пористого стекла 100 мл толуола. Частицы высушивали над вакуумом и переносили во флакон фирмы Falcon объемом 50 мл. Добавляли 15 мл толуола, 15 мл стирола и 270 мг ДАК (толуол и стирол образуют прививающий раствор). Газообразный азот пропускали через суспензию частиц в течение 5 минут. Флакон закрывали крышкой и размещали на нагреваемом вибростоле при 70°C. Реакционную смесь выдерживали в течение 18 часов.
Суспензию частиц переносили на фильтр из пористого стекла, и частицы промывали 300 мл толуола, 300 мл этанола и 100 мл 20%-ного этанола.
ЭКСПЕРИМЕНТ 2: LS002980 Привитая полимеризация частиц аллилированной агарозы с полистиролом (увеличенное количество стирола)
10 мл аллилированных частиц агарозы, полученных как описано в эксперименте 1, промывали на фильтре из пористого стекла 100 мл толуола. Частицы высушивали над вакуумом и переносили во флакон фирмы Falcon объемом 50 мл. Добавляли 10 мл толуола, 20 мл стирола и 360 мг ДАК (толуол и стирол образуют прививающий раствор). Газообразный азот пропускали через суспензию частиц в течение 5 минут. Флакон закрывали крышкой и размещали на нагреваемом концентрирующем вибростоле при 70°C. Реакционную смесь выдерживали в течение 18 часов.
Суспензию частиц переносили на фильтр из пористого стекла и частицы промывали 300 мл толуола, 300 мл этанола и 100 мл 20%-ного этанола.
ЭКСПЕРИМЕНТ 3: LS002597 Аллилирование и прививание поли(пентафторстирола) на частицы агарозы
Аллилирование
200 мл частиц агарозы промывали на фильтре из пористого стекла 2000 мл дистиллированной воды. Готовили раствор гидроксида натрия в дистиллированной воде с концентрацией 50% масс, и промывали частицы 1200 мл 50%-ного раствора гидроксида натрия. Частицы высушивали над вакуумом и переносили в круглодонную колбу объемом 1000 мл, снабженную механической мешалкой. Добавляли 160 мл 50%-ного раствора гидроксида натрия и 1,2 г боргидрида натрия, а температуру повышали до 50°C. Скорость перемешивания устанавливали 600 оборотов/мин. Когда устанавливалась температура, добавляли 200 мл аллилглицидилового эфира. Реакционную смесь выдерживали в течение ночи.
Суспензию, содержащую частицы, переносили на фильтр из пористого стекла и частицы промывали 500 мл дистиллированной воды, 500 мл этанола и 500 мл 20%-ного этанола.
Количество привитых аллильных групп определяли методом титрования и обнаружили, что оно составляет 501 мкмоль/мл частиц. Прививание поли(пентафторстирола)
10 мл аллилированных частиц агарозы промывали на фильтре из пористого стекла 100 мл толуола. Частицы высушивали над вакуумом и переносили во флакон фирмы Falcon объемом 50 мл. Добавляли 15 мл толуола, 15 мл пентафторстирола и 270 мг ДАК (толуол и стирол образуют прививающий раствор). Газообразный азот пропускали через суспензию частиц в течение 5 минут. Флакон закрывали крышкой и размещали на нагреваемом концентрирующем вибростоле при 70°C. Реакционную смесь выдерживали в течение 18 часов.
Суспензию частиц переносили на фильтр из пористого стекла и частицы промывали 300 мл ацетона, 300 мл этанола и 100 мл 20%-ного этанола.
ЭКСПЕРИМЕНТ 4: LS003147A Аллилирование и прививание поли(трет-бутилстирола) на частицы агарозы
Аллилирование
200 мл частиц агарозы аллилировали, как описано в Эксперименте 3. Количество привитых аллильных групп определяли методом титрования и обнаружили, что оно составляет 501 мкмоль/мл частиц. Прививание поли(трет-бутилстирола)
10 мл аллилированных частиц агарозы промывали на фильтре из пористого стекла 100 мл толуола. Частицы высушивали над вакуумом и переносили во флакон фирмы Falcon объемом 50 мл. Добавляли 15 мл толуола, 15 мл трет-бутилстирола и 270 мг ДАК (толуол и стирол образуют прививающий раствор). Газообразный азот пропускали через суспензию частиц в течение 5 минут.Флакон закрывали крышкой и размещали на нагреваемом концентрирующем вибростоле при 70°C. Реакционную смесь выдерживали в течение 18 часов.
Суспензию частиц переносили на фильтр из пористого стекла и частицы промывали 300 мл толуола, 300 мл этанола и 100 мл 20%-ного этанола.
ЭКСПЕРИМЕНТ 5: Разделение пептидов на прототипах и материалах сравнения
Четыре пептида с различными значениями pH использовали в качестве испытуемых пептидов для способа хроматографического анализа. Некоторые свойства пептидов представлены в Таблице.
Прототипы и колонки
Прототипы ОФХ материалов согласно настоящему изобретению (см. Эксперименты 1-4) набивали в колонки Tricorn 5/50 (производства GE Healthcare Bio-Sciences АВ) с объемом колонки (ОК) 0,98 мл. Кроме того, с целью сравнения SOURCE 15 RPC (производства GE Healthcare Bio-Sciences АВ) и Krornasil 100-13-С4 (производства Akzo Nobel) набивали в колонки Tricorn 5/50. Для осуществления метода разделения использовали систему АКТА (ТМ) Explorer 10S (производства GE Healthcare Bio-Sciences АВ).
Материалы, используемые в способе разделения, перечислены в Таблице 3.
Приготовление буферного раствора
15 мМ буферный раствор фосфата натрия с pH 3,0:
0,176 мл фосфорной кислоты и 1,71 г дигидрофосфата натрия моногидрата растворяли до конечного объема в 1 л в воде, подвергнутой очистке в системе Milli Q.
15 мМ буферный раствор фосфата натрия с pH 7,0:
1,032 г дигидрофосфата натрия моногидрата и 1,068 г гидрофосфата динатрия растворяли до конечного объема в 1 л.
10 мМ раствор гидроксида натрия использовали в качестве раствора с pH 12. Раствор готовили с помощью ампулы фирмы Titrisol, которую разбавляли водой, подвергнутой очистке в системе Milli Q, до конечного объема в 1 л.
Способ разделения пептидов
Испытуемые пептиды: Ангиотензин I, IIе7-Ангиотензин III, VaI4-Ангиотензин III и Ангиотензин III растворяли в воде, подвергнутой очистке в системе Milli Q, до конечной концентрации 0,125 мг/мл для каждого пептида.
Разделение проводили при pH 3,0, pH 7,0 и pH 12,0.
Буферный раствор фазы А представляет собой 15 мМ раствор фосфата натрия с pH 3,0 или pH 7,0 или 10 мМ раствор NaOH с pH 12. Буферный раствор фазы В представляет собой ацетонитрил.
Общее представление о способе приведено ниже.
УФ 215 нм использовали в качестве детектирующей длины волны.
В зависимости от pH пептиды будут иметь положительный заряд (pH 3), будут почти нейтральны (pH 7) или отрицательно заряжены (pH 12). Заряд пептидов может влиять на разделение. Если, например, в частицах присутствуют отрицательно заряженные группы, это может привести к уширению пиков при низких pH, поскольку тогда положительно заряженные пептиды будут удерживаться как за счет ионного, так и за счет гидрофобного взаимодействия.
На Фиг. 1-3 приведены хроматограммы разделения на прототипе LS002597 при pH 7, pH 3 и pH 12, соответственно.
LS002597 обладает очень хорошими рабочими характеристиками с острыми пиками при всех значениях pH. Один из пептидов не связывается при значении pH 12, когда пептиды сильно отрицательно заряжены.
На Фиг. 4-6 приведены хроматограммы разделения на прототипе LS002980 при pH 7, pH 3 и pH 12, соответственно. LS002980 обладает очень хорошими рабочими характеристиками и является одним из нескольких прототипов, обладающих приемлемой гидрофобностью для удержания всех четырех пептидов при pH 12, когда получают прекрасное разделение. Разделение при pH 3 дает несколько более широкие пики, чем, например, LS002597, разделение при pH 7 вполне сопоставимо с таковым на Kromasil С4 100 А.
На Фиг. 7-9 приведены хроматограммы разделения на прототипе LS002889 при pH 7, pH 3 и pH 12, соответственно.
Этот прототип, с привитым поли(пентафторстиролом), (LS002889) дает хорошее разделение при всех значениях pH, характер разделения похож на наблюдаемый с прототипом LS 002597.
На Фиг. 10-12 приведены хроматограммы разделения на прототипе LS003147A при pH 7, pH 3 и pH 12, соответственно. Трет-бутилстирол (LS003147A) дает очень хорошие рабочие характеристики.
Фиг. 13-14 являются фигурами сравнения, на которых представлены хроматограммы с Kromasil С4 100 А при pH 7 и pH 3, соответственно.
Колонка с Kromasil дает хорошее разделение при pH 7, но не может разделить пептиды при pH 3, при этом наблюдается только три пика. Времена удерживания для всех пептидов значительно более высокие, чем для прототипов на основе агарозы. Это означает, что в этом случае, чтобы выделить пептиды, придется использовать больше органических растворителей. Разделение на колонке с Kromasil при pH 12 не проводили, поскольку продукты на основе силикагеля не стабильны при pH выше ~8.
Фиг. 15-17 являются фигурами сравнения, на которых представлены хроматограммы с Source 15 RPC при pH 7, pH 3 и pH 12, соответственно. Колонка с SOURCE 15 RPC демонстрирует хорошее разделение при pH3, но дает плохое разделение и широкие пики как при pH 7, так и при 12.
Claims (7)
1. Способ получения материала для обращенно-фазной хроматографии, ОФХ, включающий следующие стадии: аллилирование частиц пористого полисахаридного материала с помощью аллилглицидилового эфира и прививание стирольных мономеров, выбранных из стирола, трет-бутилстирола и пентафторстирола, на указанные частицы, содержащие аллильную группу.
2. Способ по п. 1, в котором частицы пористого полисахаридного материала сделаны из агарозы.
3. Способ по п. 1, в котором объемное содержание стирольного мономера в прививающем растворе составляет от 5 до 95% об./об., предпочтительно от 25 до 75%.
4. Способ по одному из пп. 1-3, в котором стирольный мономер представляет собой стирол или трет-бутилстирол, объемное содержание которого в прививающем растворе составляет 50% об./об.
5. Материал для ОФХ, полученный в соответствии с одним из пп. 1-4.
6. Материал для ОФХ, полученный в соответствии с п. 4.
7. Применение материала для ОФХ по п. 5 или 6 для осуществления обращенно-фазной хроматографии.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE1351198 | 2013-10-10 | ||
| SE1351198-5 | 2013-10-10 | ||
| PCT/SE2014/051194 WO2015053701A1 (en) | 2013-10-10 | 2014-10-09 | Method for production of a chromatography material |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016110532A RU2016110532A (ru) | 2017-11-15 |
| RU2665442C2 true RU2665442C2 (ru) | 2018-08-29 |
Family
ID=52813417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016110532A RU2665442C2 (ru) | 2013-10-10 | 2014-10-09 | Способ получения хроматографического материала |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20160243526A1 (ru) |
| EP (1) | EP3055060A4 (ru) |
| JP (1) | JP2016535669A (ru) |
| CN (1) | CN105658325A (ru) |
| RU (1) | RU2665442C2 (ru) |
| WO (1) | WO2015053701A1 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115044068A (zh) * | 2022-03-24 | 2022-09-13 | 苏州星谱生物科技有限公司 | 一种高强度琼脂糖微球的制备方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6602990B1 (en) * | 1996-04-11 | 2003-08-05 | Amersham Biosciences Ab | Process for the production of a porous cross-linked polysaccharide gel and its use as a gel filtration media and in chromatography |
| US7048858B2 (en) * | 2001-11-26 | 2006-05-23 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Post-modification of a porous support |
| US20070193954A1 (en) * | 2004-04-05 | 2007-08-23 | Philippe Busson | Method of preparing a separation matrix |
| RU2367517C2 (ru) * | 2004-09-22 | 2009-09-20 | Джи-И Хелткер Байо-Сайенсиз АБ | Способ получения хроматографической матрицы |
| US20120202976A1 (en) * | 2009-10-12 | 2012-08-09 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Separation matrices |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE441363B (sv) * | 1984-01-23 | 1985-09-30 | Stellan Hjerten | Metod for tverbindning av agarprodukter i alkalisk miljo |
| US5141634A (en) * | 1988-02-03 | 1992-08-25 | Regents Of The University Of Minnesota | High stability porous zirconium oxide spherules |
| SE9700383D0 (sv) * | 1997-02-04 | 1997-02-04 | Pharmacia Biotech Ab | An adsorption/separation method and a medium for adsorption/separation |
| SE9803225D0 (sv) * | 1998-09-23 | 1998-09-23 | Amersham Pharm Biotech Ab | Process for production of polysaccharide beads |
| JP4996791B2 (ja) * | 2001-03-14 | 2012-08-08 | Ｊｎｃ株式会社 | エンドトキシン吸着体、及びそれを用いたエンドトキシンの除去方法 |
| JP2005510609A (ja) * | 2001-11-26 | 2005-04-21 | アメルシャム・バイオサイエンシーズ・アクチボラグ | 多孔性支持体の後修飾 |
| JP2004031185A (ja) * | 2002-06-27 | 2004-01-29 | Yazaki Corp | 薄型スイッチ |
| SE0202067D0 (sv) * | 2002-06-28 | 2002-06-28 | Amersham Biosciences Ab | Surface-modified base matrices |
| SE0202551D0 (sv) * | 2002-08-27 | 2002-08-27 | Amersham Biosciences Ab | Chromatographic two-layer particles |
| US6830217B2 (en) * | 2002-09-26 | 2004-12-14 | The Boeing Company | Integrated cockpit door lock and access system |
| SE0300612D0 (sv) * | 2003-03-05 | 2003-03-05 | Amersham Biosciences Ab | A method of preparing ligands for hydrophobic interaction chromatography |
| CN103275210B (zh) * | 2013-06-25 | 2015-02-25 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法 |
-
2014
- 2014-10-09 US US15/027,146 patent/US20160243526A1/en not_active Abandoned
- 2014-10-09 CN CN201480055709.XA patent/CN105658325A/zh active Pending
- 2014-10-09 RU RU2016110532A patent/RU2665442C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2014-10-09 JP JP2016547825A patent/JP2016535669A/ja active Pending
- 2014-10-09 WO PCT/SE2014/051194 patent/WO2015053701A1/en active Application Filing
- 2014-10-09 EP EP14852563.7A patent/EP3055060A4/en not_active Withdrawn
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6602990B1 (en) * | 1996-04-11 | 2003-08-05 | Amersham Biosciences Ab | Process for the production of a porous cross-linked polysaccharide gel and its use as a gel filtration media and in chromatography |
| US7048858B2 (en) * | 2001-11-26 | 2006-05-23 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Post-modification of a porous support |
| US20070193954A1 (en) * | 2004-04-05 | 2007-08-23 | Philippe Busson | Method of preparing a separation matrix |
| RU2367517C2 (ru) * | 2004-09-22 | 2009-09-20 | Джи-И Хелткер Байо-Сайенсиз АБ | Способ получения хроматографической матрицы |
| US20120202976A1 (en) * | 2009-10-12 | 2012-08-09 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Separation matrices |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015053701A1 (en) | 2015-04-16 |
| EP3055060A1 (en) | 2016-08-17 |
| JP2016535669A (ja) | 2016-11-17 |
| CN105658325A (zh) | 2016-06-08 |
| EP3055060A4 (en) | 2017-05-24 |
| US20160243526A1 (en) | 2016-08-25 |
| RU2016110532A (ru) | 2017-11-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hong et al. | Recent advances in the preparation and application of monolithic capillary columns in separation science | |
| Wu et al. | Polyhedral oligomeric silsesquioxane as a cross-linker for preparation of inorganic− organic hybrid monolithic columns | |
| Masini et al. | Porous monoliths for on-line sample preparation: a review | |
| Zou et al. | Monolithic stationary phases for liquid chromatography and capillary electrochromatography | |
| Gama et al. | Monoliths: Synthetic routes, functionalization and innovative analytical applications | |
| Svec et al. | Monolithic materials: promises, challenges, achievements | |
| Guihen et al. | Recent highlights in stationary phase design for open-tubular capillary electrochromatography | |
| Potter et al. | Porous polymer monoliths for extraction: Diverse applications and platforms | |
| Tang et al. | Preparation of hybrid molecularly imprinted polymer with double-templates for rapid simultaneous purification of theophylline and chlorogenic acid in green tea | |
| JP4440474B2 (ja) | クロマトグラフィー分離法および選択吸着体 | |
| EP1817109B1 (en) | Mixed-modal anion-exchange type separation material | |
| Gunasena et al. | Organic monoliths for hydrophilic interaction electrochromatography/chromatography and immunoaffinity chromatography | |
| Arrua et al. | Macroporous monolithic supports for affinity chromatography | |
| Liu et al. | Preparation of polypropylene spin tips filled with immobilized titanium (IV) ion monolithic adsorbent for robust phosphoproteome analysis | |
| Tang et al. | Nanoparticle-based monoliths for chromatographic separations | |
| Perçin et al. | Strong cation-exchange chromatography of proteins on a sulfoalkylated monolithic cryogel | |
| Krenkova et al. | Less common applications of monoliths: V. Monolithic scaffolds modified with nanostructures for chromatographic separations and tissue engineering | |
| Astefanei et al. | Different stationary phase selectivities and morphologies for intact protein separations | |
| Iacob et al. | Recent advances in capillary electrochromatography using molecularly imprinted polymers | |
| Lan et al. | In situ synthesis of a monolithic material with multi-sized pores and its chromatographic properties for the separation of intact proteins from human plasma | |
| Bakry et al. | Recent applications of organic monoliths in capillary liquid chromatographic separation of biomolecules | |
| US6664305B2 (en) | Chromatography material and a process of manufacturing that material | |
| He et al. | Preparation of a novel Zr4+-immobilized metal affinity membrane for selective adsorption of phosphoprotein | |
| RU2665442C2 (ru) | Способ получения хроматографического материала | |
| Yu et al. | RECENT DEVELOPMENT AND APPLICATION OF MONOLITHIC COLUMNS. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20201010 |