KR101354473B1

KR101354473B1 - 개선된 크로마토그래피 매질의 제조방법 및 사용방법

Info

Publication number: KR101354473B1
Application number: KR1020110074630A
Authority: KR
Inventors: 마틴 제이. 디츠; 존 제이. 마이크너
Original assignee: 롬 앤드 하아스 컴패니
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2011-07-27
Publication date: 2014-02-18
Also published as: KR20120031869A; JP2012032390A; CN102343257B; US20120024791A1; CN102343257A; EP2412435A3; EP2412435A2; JP5474881B2

Abstract

본 발명은 공유결합된 폴리머 리간드 사슬을 갖는 단분산(monodisperse),매크로다공성(macroporous) 폴리머 매질을 자유 라디칼 중합(free radical polymerization)으로 제조하는 개선된 방법에 관한 것으로서, 상기 매질을 크로마토그래피 정제에 적용하여, 개선된 단백질 결합 용량(binding capacity) 및 수지 선택성을 갖는 폴리머 지지체를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 매질의 제조 및 사용과 관련된 방법에 관한 것이다.

Description

개선된 크로마토그래피 매질의 제조방법 및 사용방법{PROCESS FOR MAKING IMPROVED CHROMATOGRAPHY MEDIA AND METHOD OF USE}

본 발명은 공유결합된 폴리머 리간드 사슬을 갖는 단분산(monodisperse),매크로다공성(macroporous) 폴리머 매질을 자유 라디칼 중합(free radical polymerization)으로 제조하는 개선된 방법에 관한 것으로서, 상기 매질을 크로마토그래피 정제에 적용하여, 개선된 단백질 결합 용량(binding capacity), 결합 역학(kinetics) 및 결합 선택성을 갖는 폴리머 지지체를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 매질의 제조 및 사용과 관련된 방법에 관한 것이다.

생체(living organism)로부터 생성된 치료 단백질(therapeutic protein)은 현대의 건강 관리에서 점점 중요한 역할을 하고 있다. 이러한 단백질들은 전통적인 약학에 있어서 질병 타겟에 대한 특이성과 효율성을 증가시키는 등, 많은 이점들을 제공한다. 포유류 면역 시스템은 다양한 단백질들을 사용하여 질병의 위협을 억제하고 제어한다. 유전공학 및 단백질 공학의 출현으로 많은 "설계된" 또는 재조합 단백질 치료법의 발전이 가능하게 되었다. 이러한 치료법들은 단일 단백질, 화학적 개질된 단백질, 단백질 절편 또는 단백질 컨쥬게이트에 기초한 것일 수 있다. 크로마토 그래피 분리법은 이러한 생물 약제학상의 제조에 널리 사용되고 있다. 산업이 발전함에 따라서, 분리기술을 강화하기 위한 신규/선진 기술 및 방법들이 이행되어 생물치료의 생산자들이 보다 적은 비용으로 더 많은 환자들에게 이러한 약제를 제공할 수 있도록 하였다.

단백질을 정제하기 위해 사용되는 일반적인 크로마토그래피 방법에는, 친화성, 생체친화성(bioaffinity), 이온 교환, 역상(reversed phase), 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 크기 배제(size exclusion) 및 다른 것들과의 혼합 모드(상술한 카테고리의 조합을 포함하는 수지)가 포함된다. 각 타입의 크로마토그래피 과정의 적용 및 효율은, 용질 분자와, 각각이 액체 이동상(mobile liquid phase)과 상호작용하는 크로마토그래피 시스템의 고정상(stationary phase)(크로마토그래피 매질) 간의 표면-표면 상호작용의 선택성에 의존한다. 다양한 고정상 크로마토그래피 지지체 물질이 상업적으로 이용가능하다.

불순물로부터 생성물의 성공적으로 분리하는 비결은 종종, 고정상, 베이스 매트릭스(base matrix)(화학 조성 및 공극 구조) 및 리간드 특성(리간드 타입, 리간드 밀도, 공극 구조, 리간드 분포, 리간드 길이 및 물질 조성), 및 이동상 또는 용액 특성(버퍼 타입, pH 및 전도성)의 올바른 조합에 의존된다. 베이스 매트릭스 및 리간드의 특정적인 설계에 의해, 단백질 결합 용량, 공정 스루풋(throughput), 선택성, 베드 투과성(bed permeability) 및 화학적 안정성 등의 몇 가지 핵심적인 속성들로 특징될 수 있는 크로마토 그래피 매질을 얻게 된다. 정제 방법에는, 생성물에 우세하게 결합하는 것(결합 및 용출), 불순물에 우세하게 결합하는 것(플로-스루) 및 상술한 것들의 조합(소위, 약한 분할 및 기타) 등이 포함된다. 이러한 기술을 설계하는데 있어서는, 확실하게 분리될 수 있도록 앞서 언급된 크로마토그래피 매질 특성을 제어하여 정제된 단백질 생성물을 얻는 것이 매우 중요하다.

단백질 분리는 다양한 폴리머 지지체 또는 베이스 매트릭스에서 수행될 수 있다. 수지 또는 비드(bead) 구조를 위한 통상적인 물질에는, 다당류(아가로오스, 셀룰로오스), 합성 폴리머(폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리비닐에테르 및 폴리아크릴아미드) 및 세라믹, 예컨대, 실리카, 지르코니아 및 제어된 공극 글래스(controlled pore glass) 등이 포함된다. 이들 물질들은, 전형적으로 약 200Å 내지 3,000Å의 "확산 공극(diffusive pore)"을 통하여 단백질을 우세하게 흡수한다.

또한, 막(membrane)과 모노리스(monolith) 물질이 일반적으로 크로마토그래피용으로, 특히 플로-스루 적용에 사용된다. 전형적인 막 조성물에는, 합성 폴리머, 예컨대, 폴리비닐리덴플루오라이드, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰, 나일론, 및 다당류, 예컨대, 셀룰로오스가 포함된다. 모노리스는 폴리스티렌, 다당류, 폴리메타크릴레이트 및 기타 합성 폴리머, 다당류 및 세라믹으로부터 개발되어 왔다. 막과 모노리스 크로마토그래피는 이들 물질이, 막과 모노리스 물질의 투과성을 조절하는 동일한 "대류 공극(convective pore)"에서 단백질을 흡수한다는 점에서 비드와 다르다. 전형적인 막과 모노리스 대류 공극 크기는 약 0.6μm 내지 약 10μm이다. 이들 기재와 더불어 리간드 역시 다양한 개발 기술을 통하여 수행될 수 있다.

단백질 결합 용량을 개선하고 수지 선택성을 조정하기 위해 폴리머 리간드 "텐터클(tentacle)" 또는 "익스텐더"를 사용하는 것은, 예컨대, 베이스 매트릭스로부터 확장시키는 그라프팅(grafting)에 의해 베이스 매트릭스로 폴리머 리간드를 커플링하는 것을 포함한다. 폴리머 리간드 익스텐더는 전형적으로 보다 우수한 결합 용량 및 결합 역학을 제공하는데, 이는 폴리머 리간드에 결합하는 타겟 분자가 폴리머 지지체 표면상 단백질의 단층(monolayer) 흡착을 초과하여, 익스텐더가 리간드의 이용을 증가시키기 때문이다.

그라프팅 폴리머 익스텐더를 위한 두 가지 표준 방법론은 단백질 분리 등을 위해 크로마토그래피에 사용되는 것과 같이 폴리머 지지체상에 표면 익스텐더를 생성하기 위해 개발되어 왔다: 1) 표면 라디칼을 통해 지지체로부터 모노머의 그라프팅("~로부터 그라프팅 모노머") 및 2) 미리 형성된 폴리머를 활성기를 통해 지지체로 그라프팅("~으로 그라프팅 폴리머").

라디칼 중합 반응을 사용하는 폴리머 물질로부터 그라프팅 모노머는 잘 발전된 기술이다. 일반적으로, 반응을 폴리머 표면 물질로부터, 또는 용액내 개시제로부터 개시한다.

표면으로부터 라디칼 중합의 개시는, 온도, 복사, 금속 산화 등의 반응 환경으로의 노출을 통해 표면에서 라디칼을 발생시키거나 흡수된 개시 종들을 통해 개시하여 수행될 수 있다. 그러나, 이러한 "~로부터 그라프팅 모노머" 접근법은 매우 통제된 용액 조건의 특별 장치를 요구하고/하거나 지지체를 어떠한 방식으로, 예컨대 중합성 링커(polimerizable linker), 개시 종 또는 이들을 복잡한 것으로 수행하게 하는 특정 작용기로 전처리(pretreatment)하여 미리 활성화하는 것과 시간 소비를 요구한다.

다공성 물질(porous material)로부터 폴리머를 그라프팅하기 위한 한가지 방법이 US5453186에 개시되어 있다. 상기 선행기술에는 디하이드록실 작용성을 갖는 폴리머 지지체상으로 폴리머 리간드를 그라프팅하는 방법이 개시되어 있다. 상기 선행기술은 사슬 길이를 제어하는 방법과 산화환원 중합을 사용하여 하이드록실기를 포함하는 지지체로 그라프팅하는 방법을 개시하고 있다. Ce(IV) 산화환원 방법은 불활성 분위기하에서 세륨(IV)염을 사용하여 폴리머 지지체 표면으로부터 폴리머 리간드를 그라프팅하는 것이다. 폴리머 리간드 사슬 길이는 혼합물에 첨가되는 모노머 및 세륨염의 농도 레벨을 조절하여 제어한다.

상기 선행기술은 폴리머 물질로부터 폴리머를 그라프팅하는 방법이 개시되어 있지만, 특정 작용기로 폴리머 지지체를 전처리하는 것이 요구된다. 따라서, 전체 폴리머 크로마토그래피 물질의 실시 결과를 유지하면서, 공정으로부터 이와 같은 추가적인 전처리 단계를 제거할 수 있는 방법이 요구된다.

폴리머 리간드를 폴리머 지지체 물질 표면에 첨가하는 것은 개선된 단백질 결합 용량, 단백질 결합 역학 및 단백질 선택성에서 퍼텐셜 변화를 제공하게 된다. 그러나, 단백질 분리가 더욱 요구됨에 따라, 새로운 기술 및 방법을 개발하여 신규한 폴리머 구조를 창출하는 것이 보다 중요하다. 따라서, 단백질 결합 특성 및 단백질 분리에 사용되는 다양한 폴리머 지지체 기재의 단백질 선택성을 개선시키는 것이 바람직하다.

새로운 폴리머 기재에 대한 상기 필요성들에 대하여, 단백질 분리에 유용하고, 개선된 단백질 결합 용량 및 수지 선택성을 갖는, 폴리머 지지체 기재상으로 폴리머 리간드를 그라프팅하는 새로운 방법이 개발되어 왔다.

본 발명에 따르면, 폴리머 지지체상에 고정된 폴리머 리간드를 포함하는 크로마토그래피용 흡착 물질이 제공되고, 여기에서 상기 폴리머 지지체는 적절한 자유 라디칼 그라프팅 부위를 포함하고, 또한, 상기 폴리머 리간드는 하나 이상의 공유 결합에 의해 폴리머 지지체의 적절한 자유 라디칼 그라프팅 부위에 결합한다.

본 발명의 제2면에 있어서,

(i) 적절한 자유 라디칼 그라프팅 부위를 포함하는 폴리머 지지체를 제공하는 단계;

(ii) 작용성 모노머의 중합에 의해 폴리머 리간드를 발생시키는 단계; 및

(iii) 폴리머 지지체와 폴리머 리간드 간에 반응을 개시하는 단계를 포함하는 크로마토그래피용 흡착 물질의 제조 방법이 제공되고,

여기에서, 상기 폴리머 리간드는 폴리머 지지체상의 적절한 자유 라디칼 그라프팅 부위와 반응한다.

본 발명의 제3면에 있어서,

(i) 혼합물을 제공하는 단계 및

(ii) 혼합물을 폴리머 지지체상에 고정된 폴리머 리간드를 포함하는 크로마토그래피용 흡착 물질과 접촉하는 단계를 포함하는, 혼합물로부터 화학적 화합물을 분리하는 방법이 제공되고,

여기에서, 폴리머 지지체는 적절한 자유 라디칼 그라프팅 부위를 포함하고, 또한, 상기 폴리머 리간드는 하나 이상의 공유 결합에 의해 폴리머 지지체의 적절한 자유 라디칼 그라프팅 부위에 결합된다.

본원에 교시된 모든 범위들은, 그 안에 속하는 모든 범위들도 포함하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들면, "1 내지 10"의 범위에는 1의 최소값과 10의 최대값 사이의(포함하는) 임의의 모든 범위, 즉, 1 이상의 최소값 또는 10 이하의 최대값을 갖는 임의의 모든 범위, 예를 들면, 5.5 내지 10이 포함된다.

본원에서 사용되는 용어의 단수형은 문맥에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리머 리간드" 및 "폴리머성 리간드"는, 용어 "폴리머성 지지체" 및 "폴리머 지지체"와 마찬가지로 동일한 용어이다.

본원에서 사용되는 용어 "바람직하게", "보다 바람직하게", 및 "가장 바람직하게"는 보다 우수한 것으로 간주되는 방식을 암시하고자 하는 것은 아니며, 보다 넓은 범위 또는 그룹의 보다 적절한 좁은 범위를 구체화하는 것을 의미한다.

본 발명은 선행기술의 공정과 비교하여, 폴리머 지지체 전처리 또는 폴리머 지지체에 중합성 링커를 첨가하는 것을 필요로 하지 않는다. 작용성 모노머 및/또는 사슬 전달제(chain transfer reagent) 및 개시제를 중합하여 발생되는 폴리머 리간드는, 폴리머 지지체 및/똔느 폴리머 지지체 골격(backbone)상의 적절한 자유 라디칼 그라프팅 부위와 반응하여, 공유적으로 결합된다. 개시제는 용액내 모노머의 중합을 개시하여, 폴리머 지지체의 적절한 자유 라디칼 그라프팅 부위에서 표면상으로 그라프팅될 것이다.

본 발명의 폴리머 지지체에는 자유 라디칼 종을 갖는 폴리머 리간드를 그라프팅하기에 적절한 표면을 갖는 임의의 폴리머 물질이 포함된다. 중합성 링커는 본 발명에서 필요로 하지 않지만, 시스템 내에서 임의의 파괴 효과를 나타내지 않는다면 존재할 수 있다. 본 발명의 폴리머 지지체는 현탁, 에멀젼 또는 분산 중합 또는 이들의 조합으로 제조될 수 있다.

폴리머 지지체 물질은 입자성(particulate) 물질이거나, 또는 피스(piece), 시트, 튜브, 로드(rod), 또는 모세관 코팅의 형태일 수 있다. 바람직하게, 지지체 물질은 입자성 물질이고, 적절하게 약 0.5 내지 약 1500μm, 바람직하게 약 0.7 내지 약 800μm, 가장 바람직하게 약 10 내지 약 150μm의 부피 평균 입자 크기를 갖는다. 입자는 바람직하게 실질적으로 구형이다. 입자성 물질은 적절하게 공극을 포함한다. 입자성 지지체 물질의 공극 크기, 공극 부피 및 구체적인 표면적은, 사용되는 지지체 물질의 타입, 지지체에 연결되는 폴리머의 특성 및 사용되는 경우 원하는 분리의 특성에 따라서 변할 수 있다. 입자성 입자의 공극 크기 범위는 약 20 내지 약 4000Å, 바람직하게 약 200 내지 약 4000Å, 가장 바람직하게 약 300 내지 약 1500Å이다. 공극 부피는 적절하게 약 0.1 내지 약 4 ml/g, 바람직하게 약 0.3 내지 약 2 ml/g, 가장 바람직하게, 약 0.5 내지 약 1.5 ml/g이다. 구체적인 표면적은 적절하게 약 1 내지 약 1000 m²/g, 바람직하게 약 25 내지 약 700 m²/g, 가장 바람직하게 약 50 내지 약 500 m²/g이다.

본원에서 사용될 수 있는 기타 "폴리머 지지체" 또는 "베이스 매트릭스"에는 확산 공극을 갖는 임의의 물질들이 포함되나, 이에 한하지 않는다. 본원에서 사용될 수 있는 폴리머 지지체 또는 베이스 매트릭스용으로 바람직한 물질에는, 다당류, 합성 폴리머, 아가로오스, 셀룰로오스, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐에테르, 및 상술한 것들의 혼성 또는 조합 등이 포함된다. 본 발명의 폴리머 지지체는 폴리머 리간드가 공유 결합으로 결합할 수 있는 적절한 자유 라디칼 그라프팅 부위를 갖는다.

자유 라디칼 폴리머 리간드 그라프팅 반응 중의 온도는 적절하게 약 0 내지 약 100℃, 바람직하게 15 내지 50℃ 및 다르게는 50 내지 90℃이다. 적절하게, 반응 혼합물을 대기 분위기하에서 유지시키지만, 불활성 분위기하에서 수행할 수도 있다.

일부 구체예로서, 폴리머 리간드는 작용기를 포함할 수 있다. 본원에서 사용될 수 있는 "작용기"의 예에는, 이온 교환기(ion exchange group), 생체친화성기, 소수성기, 친황성(thiophilic) 상호작용기, 킬레이트 또는 킬레이팅기, 타겟 화합물과 소위 pi-pi 상호작용을 하는 작용기, 수소 결합기, 친수성기 및 다른 작용기로의 추가 변형이 가능한 비작용성 모노머 또는 매개(intermediary) 모노머(예: 이온 교환 리간드로 변형되는 글리시딜 메타크릴레이트), 및 이들의 혼합물 등이 포함되나, 이에 한하지 않는다.

본원에서 사용될 수 있는 "폴리머 리간드"의 예에는, 이온 교환기, 소수성 상호작용기, 친수성 상호작용기, 친황성 상호작용기, 금속 친화성기, 친화성기, 생체친화성기, 혼합 모드기(mixed mode group) 및 다른 작용기로의 추가 변형이 가능한 비작용성 폴리머 또는 매개 폴리머(예: 이온 교환 폴리머 리간드로 변형되는 폴리 글리시딜 메타크릴레이트), 및 이들의 혼합물 등을 포함하는 폴리머가 포함되나, 이에 한하지 않는다. 본원에서 사용될 수 있는 일부 바람직한 리간드에는, 강한 양이온 교환기, 예컨대, 설포프로필, 설폰산; 강한 음이온 교환기, 예컨대, 트리메틸암모늄 클로라이드; 약한 양이온 교환기, 예컨대, 카복시산; 약한 음이온 교환기, 예컨대, N,N-디에틸아미노에틸을 함유하는 폴리머가 포함되나, 이에 한하지 않는다.

본 화학의 일부 구체예로서, 폴리머 리간드가 발생되는 경우 반응 매질에 사슬 전달제를 첨가하는 것이 적절할 수 있다. 적절한 사슬 전달제에는, 예를 들면, 할로메탄, 디설파이드, 티올(머캅탄이라고도 함), 및 금속 복합체가 포함된다. 추가적으로 적절한 사슬 전달제에는 적어도 하나의 쉽게 앱스트랙트 할 수 있는(abstractable) 수소 원자를 갖는 다양한 기타 화합물들 및 이들의 혼합물들이 포함된다. 사슬 전달제를, 하나 이상의 첨가로, 또는 연속적으로, 선형으로(linearly) 또는 그렇지 않게, 전체 반응 시간의 대부분 또는 전부에 걸쳐 또는 반응 시간의 제한된 부분에만 첨가할 수 있다. 사슬 전달제는, 0.01% 내지 15%, 보다 바람직하게 0.1% 내지 3%, 가장 바람직하게 약 0.1% 내지 1%의 수준으로 반응에 첨가될 수 있다.

본원에서 사용될 수 있는 "자유 라디칼 개시제"의 예에는, 폴리머 리간드, 예컨대, 퍼옥사이드, 예컨대, t-부틸하이드로퍼옥사이드, 큐멘 하이드로퍼옥사이드; 퍼옥시아세테이트, 예컨대, 퍼아세트산, 클로로퍼벤조산; 퍼설페이트, 예컨대, 암모늄 퍼설페이트, 소듐 퍼설페이트, 포타슘 퍼옥소디설페이트, 아조 개시제, 예컨대, 4,4'-아조비스(4-시아노발레르산), Irgacure® 2959(Ciba-Geigy, Hawthorn, N.Y.), 2,2'-아조비스(2-아미노-프로판)하이드로클로라이드 등 및 이들의 혼합물을 형성하기 위하여 비닐 모노머와 반응할 수 있는 임의의 자유 라디칼 개시제가 포함되나, 이에 한하지 않는다. 그라프팅 반응은 업계에 공지된 방법으로, 바람직하게 열 개시(가열) 또는 UV 조사(irradiation)로 개시할 수 있다. 자유 라디칼 개시제는 수용해성 또는 유용해성(oil soluble)일 수 있다. 개시제는 0.01% 내지 5%, 보다 바람직하게 0.1% 내지 2%의 수준으로 반응에 첨가될 수 있다.

본원에서 폴리머 리간드를 제조하기 위하여 사용될 수 있는 "작용성 모노머" 또는 "그라프팅 모노머의 혼합물"의 예에는, 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 메타크릴아미드 및 아크릴아미드가 포함되나, 이에 한하지 않는다. 작용성 모노머에는, 아크릴산, 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산, [3-(메타크릴로일아미노)프로필]트리메틸암모늄 클로라이드, 2-아크릴아미도-글리콜산, 이타콘산 또는 에틸 비닐 케톤, 글리시딜 메타크릴레이트, N,N-디메틸아크릴아미드, 아크릴아미드, 하이드록시프로필 메타크릴레이트, N-페닐아크릴아미드, 하이드록시에틸 아크릴아미드, 및 이들의 조합이 포함되나, 이에 한하지 않는다.

본원에 교시된 그라프팅 방법에 있어서, 폴리머 리간드의 중합은, 폴리머 지지체의 표면으로부터 폴리머 리간드의 성장보다 덜 제한적인 조건하에서 용액내에서 개시된다.

가교제, 가지화제(branching agent) 및 비작용성 모노머는, 폴리머 리간드의 형태학 또는 상호작용을 제어하기 위한 목적으로 폴리머 리간드에 결합될 수 있다. 그러나, 폴리머 리간드 상의 이러한 가교제 또는 가지화제는, 적절하게 5% 미만, 보다 바람직하게 1% 미만의 낮은 수준으로 존재한다. 적절한 가교제 또는 가지화제에는, 모노머, 예컨대, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 디비닐 벤젠, 트리메틸프로필 트리메타크릴레이트 및 메틸렌 비스아크릴아미드 또는 다작용성 사슬 전달제가 포함되나, 이에 한하지 않는다.

본 발명은 추가적으로, 크로마토그래피 분리 방법에 있어서 크로마토그래피용 흡착 물질을 사용하는 것을 포함한다. 이러한 크로마토그래피 분리 방법은, 예를 들면, 저압 액체 크로마토그래피(low pressure liquid chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), HPLC, 초임계 유체 크로마토그래피(supercritical fluid chromatography; SFC), 및 모사 이동 베드(simulating moving bed; SMB) 일 수 있다.

본 발명은 추가적으로, 본 발명에 따른 크로마토그래피를 위하여 혼합물을 흡착 물질과 접촉하는 것을 포함하는 화학적 화합물을 분리하는 방법을 포함한다.

본 발명의 1차적인 이점은 크로마토그래피 캡쳐(capture) 및/또는 분자, 보다 상세하게는 생체분자의 정제를 위해 리간드 그라프팅을 사용하여 고용량 이온 교환 수지를 생성하는 것이다.

테스트 방법

흡수 결합 용량(uptake binding capicity)의 측정:

용액 1(50 mM 트리스/HCl, pH 8.8)의 제조

12.1 g의 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Fisher Scientific으로부터 상업적으로 이용가능)을 2 L 용량 플라스크(volumetric flask)에 첨가하였다. 0.01N HCl 용액(Fisher Scientific으로부터 상업적으로 이용가능)을 적용하여 2 리터 마크까지 채웠다. 용량 플라스크를 캡핑(capping)한 후 내용물을 흔들었다. 용액을 5분간 방치하고, 용액의 부피를 다시 체크하였다. 추가의 HCl을 첨가하여 2 L 마크까지 부피를 조정하였다. 8.8±0.05에서 pH를 측정하였다. 용액에 라벨을 붙이고 4℃에서 냉장하였다.

용액 2의 제조:

2 mg/ml BSA(소혈청(bovine serum)으로부터의 알부민, Sigma-Aldrich로부터 상업적으로 이용가능) 용액

0.806 g의 BSA를 유리 쟈(glass jar)무게를 달고, 403 g의 용액 1에 첨가하였다. 내용물을 부드럽게 흔들어 용해시켰다. 0.5시간 동안 용액을 가라 앉혀 BSA 용해를 확실하게 하였다.

BSA 용량 흡수 과정

1 ml의 DI 수를 하나의 Bio-Rad Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼에 천천히 첨가하여 임의의 트랩핑된(trapped) 공기를 방지하였다. 물의 높이를 표시하였다. 컬럼으로부터 말단 플러그(end-plug)를 제거하였다. 컬럼을 환기 후드(ventilation hood) 내 매니폴드(manifold)에 연결하였다. 보다 많은 DI 수를 컬럼에 첨가하고, 물의 수준이 컬럼의 바닥까지 1-2 cm가 될 때까지 온화한 진공을 컬럼에 적용하여 공기 갇힘(air entrapment)을 방지하였다. 실시예 7의 슬러리 용액을 컬럼에 첨가하였다. 물의 헤드는 항상 수지 위로 유지시켰다. 컬럼내 1 ml의 수지를 측정하였다. 용액이 수지 위로 1-2 cm가 될 때까지 온화한 진공을 컬럼에 적용하여 제거하였다. 수지의 수준이 1 ml 마크 미만으로 떨어졌을 때, 더 많은 수지 슬러리를 추가로 진공을 유지하면서 첨가하였다. 수지 비드를 절대 공기에 노출시키지 않았다. 패킹된 1 ml 수지를 약 10 ml의 DI 수로 헹구어 슬러리 용액을 교체하고, 패킹된 베드 위로 물의 수준이 1-2 cm가 될 때까지 액체를 부어 내었다. 그 후, 패킹된 1 ml 수지를 10 ml의 실시예 6의 용액 1로 씻어내었다. 용액 1을 컬럼으로부터 진공으로 제거하고, 1분간 컬럼을 통해 공기를 빨아들였다. 웨트 케이크(wet cake)를 포함하는 1회용 컬럼을 매니폴드로부터 제거하였다.

컬럼으로부터의 웨트 케이크를 스파츌라(spatula)로 8 oz 유리 쟈로 옮기고, 200 mL의 용액 2(2 mg/mL BSA 용액)을 첨가하였다. 유리 쟈 내 샘플을 18시간 동안 부드럽게 흔들었다.

18시간 후, 쉐이커로부터 샘플을 제거하고, 수지를 15분간 가라앉혔다.

18시간의 인큐베이션 후, 여과된 표면상의 BSA 용액의 278 nm UV 흡수로부터 BSA 결합 용량을 측정하였다. 용액 1로 채워진 큐벳을 사용하여 UV 분광기를 0으로 하였다. 278 nm에서 흡수를 모든 샘플, 표준 용액, 및 대조 샘플(Q Sepharos™ Fast Flow Ion Exchange Resin, GE Healthcare로부터 상업적으로 이용가능)에 대하여 측정하였다.

BSA 결합 용량의 계산:

샘플 및 대조군에 대한 풀린(unbound) BSA의 값을 기록하였다(Q Sepharose FF). 다음 식을 적용하여 결합 용량을 측정하였다:

식 1

BSA 용량 = [400-(샘플 mg/mL × 200)] × 1 mL = BSA의 mg/수지의 mL

실시예

실시예 1

60μm GMA/GlyDMA 다공성 음이온 교환제의 제조

오버헤드(overhead) 교반기, 콘덴서 및 온도 프로브(probe)가 장착된 250 ml 유리 반응기에, 50 g의 단일크기의(monosized) GMA/GlyDMA(미국 특허 출원 11/521,668의 실시예 25: 60 마이크로미터 GMA/EGDMA 폴리머 수지의 제조에 개시된 방법으로 제조된, 60μm 폴리GMA-GlyDMA 비드 글리시딜 메타크릴레이트(GMA) 및 글리세롤-1,3-디메타크릴레이트(GlyDMA)) 코폴리머 웨트 케이크(~ 25% 고체)를 충전하고, 웨트 케이크에 18 그램 충전의 75% (3-아크릴아미도프로필)-트리메틸암모늄 클로라이드(Sigma-Aldrich Chemical Company로부터 상업적으로 이용가능)를 첨가하였다. 그 후, 0.6 그램의 암모늄 퍼설페이트(Acros organics-Fisher Scientific에서 상업적으로 이용가능), 0.6 그램의 2,2-아조비스(2-메틸프리피온 아미딘)디하이드로클로라이드(Sigma-Aldrich Chemical company에서 상업적으로 이용가능) 및 68 그램의 D.I. 수를 반응기에 첨가하였다.

반응기의 온도를 25℃로 유지하면서 30분간 교반하였다. 반응기를 대기에서 45분에 걸쳐 80℃로 가열하였다. 대기에서 반응기를 5시간 동안 80℃의 온도로 유지하고 50℃로 냉각하였다. 60 ml 첨가 깔때기를 사용하여 1시간에 걸쳐 120 ml의 D.I. 수를 첨가하고, 교반하면서 50℃의 온도로 일정하게 유지시켰다. 반응 혼합물을 500 ml 용융 부흐너(fritted buchner) 깔때기를 사용하여 여과하고, 폴리머 용액의 비드를 세척하였다. 1 리터의 D.I. 수를 사용하였다. 수지에 대하여 소혈청 알부민(BSA) 평형 결합 용량을 측정하였다. BSA 용량 141 mg/ml.

실시예 2

N,N,N,N-테트라메틸 에틸렌디아민을 갖는 60μm GMA/GlyDMA 다공성 음이온 교환제의 제조

오버헤드 교반기, 콘덴서 및 온도 프로브가 장착된 250 ml 유리 반응기에, 50 g의 단일크기의 GMA/GlyDMA 코폴리머 웨트 케이크(~ 25% 고체)를 충전하고, 웨트 케이크에 30 그램 충전의 75% (3-아크릴아미도프로필)-트리메틸암모늄 클로라이드(Sigma-Aldrich Chemical Company에서 상업적으로 이용가능)를 첨가하였다. 그 후, 0.6 그램의 암모늄 퍼설페이트(Acros organics-Fisher Scientific에서 상업적으로 이용가능), 0.6 그램의 2,2-아조비스(2-메틸프리피온 아미딘)디하이드로클로라이드(Sigma-Aldrich Chemical company에서 상업적으로 이용가능), 20μl의 N,N,N,N-테트라메틸 에틸렌디아민(Sigma-Aldrich Chemical Company에서 상업적으로 이용가능) 및 68 그램의 D.I. 수를 반응기에 첨가하였다.

반응기의 온도를 25℃로 유지하면서 30분간 교반한 후, 반응기를 대기에서 45분에 걸쳐 80℃로 가열하였다. 대기에서 반응기를 5시간 동안 80℃의 온도로 유지하고 50℃로 냉각하였다. 60 ml 첨가 깔때기를 사용하여 1시간에 걸쳐 120 ml의 D.I. 수를 첨가하고, 교반하면서 50℃의 온도로 일정하게 유지시켰다. 반응 혼합물을 500 ml 용융 부흐너 깔때기를 사용하여 여과하고, 비드의 폴리머 용액을 세척하였다. 1 리터의 D.I. 수를 사용하여 비드를 세척하였다. 수지에 대하여 BSA 배치 평형 결합 용량을 측정하였다. BSA 용량 188 mg/ml.

실시예 3

가수분해 코폴리머를 통한 60μm GMA/GlyDMA 다공성 음이온 교환제의 제조

오버헤드 교반기, 콘덴서 및 온도 프로브가 장착된 250 ml 유리 반응기에, 50 g의 단일크기의 GMA/GlyDMA 코폴리머 웨트 케이크(~ 25% 고체)를 충전하고, 반응기에 1 M 소듐 하이드록시드 용액(Fisher Scientific company에서 상업적으로 이용가능)을 첨가하였다. 25℃에서 48시간 동안 혼합물을 교반하고, 반응 혼합물을 500 ml 용융 부흐너 깔때기를 사용하여 여과하여, 비드의 소듐 하이드록시드 용액을 세척하였다. 1 리터의 D.I. 수를 사용하여 비드를 세척하였다.

그 후, 30 g의 이 웨트 케이크 물질을 다시 250 ml 유리 반응기에 충전하고, 18 g 충전의 75% (3-아크릴아미도프로필)-트리메틸암모늄 클로라이드(Sigma-Aldrich Chemical Company에서 상업적으로 이용가능)를 반응기에 첨가하였다. 그 후, 0.36 g의 암모늄 퍼설페이트(Acros organics-Fisher Scientific에서 상업적으로 이용가능), 40.5 그램의 D.I. 수를 반응기에 첨가하였다.

반응기의 온도를 25℃로 유지하면서 30분간 교반하였다. 반응기를 대기에서 45분에 걸쳐 80℃로 가열하였다. 대기에서 반응기를 18시간 동안 80℃의 온도로 유지하고 50℃로 냉각하였다. 60 ml 첨가 깔때기를 사용하여 1시간에 걸쳐 120 ml의 D.I. 수를 첨가하고, 교반하면서 50℃의 온도로 일정하게 유지시켰다. 반응 혼합물을 500 ml 용융 부흐너 깔때기를 사용하여 여과하고, 비드의 폴리머 용액을 세척하였다. 1 리터의 D.I. 수를 사용하였다. 수지에 대하여 BSA(소혈청으로부터의 알부민, Sigma-Aldrich에서 상업적으로 이용가능) 배치 평형 결합 용량을 측정하였다. 소혈청 알부민 BSA 용량 101 mg/ml.

실시예 4

60μm GMA/GlyDMA 다공성 약염기 음이온 교환제의 제조

오버헤드 교반기, 콘덴서 및 온도 프로브가 장착된 250 ml 유리 반응기에, 30 g의 단일크기의 GMA/GlyDMA 코폴리머 웨트 케이크(~ 25% 고체)를 충전하였다.

18 그램의 N-[3-(디메틸아미노)프로필]메타크릴아미드(Aldrich Chemical Company에서 상업적으로 이용가능), 0.36 그램의 암모늄 퍼설페이트(Acros Organics-Fisher Scientific company에서 상업적으로 이용가능), 40.5 그램의 D.I. 수를 반응기에 첨가하였다.

반응기를 실온에서 30분간 교반한 후, 45분에 걸쳐 80℃로 가열하였다. 대기에서 반응기를 22시간 동안 80℃의 온도로 유지한 후, 반응기를 50℃로 냉각하였다. 60 ml의 D.I. 수를 첨가하여 깔때기로 30분에 걸쳐 교반하면서 여과하고, 50℃의 온도로 일정하게 유지시켰다.

반응 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 그 후, 반응 혼합물을 600 ml 용융 부흐너 깔때기로 옮겨서 여과하여 비드의 폴리머 용액을 세척하였다. 비드의 세척은 1시간에 걸쳐 1 리터의 D.I.수를 사용하였다. BSA 용량(소혈청 알부민) 110 mg/ml.

실시예 5

사슬 전달제를 갖는 60μm GMA/GlyDMA 다공성 음이온 교환제의 제조

오버헤드 교반기, 콘덴서 및 온도 프로브가 장착된 2000 ml 유리 반응기에, 300 g의 단일크기의 GMA/GlyDMA 코폴리머 웨트 케이크(~ 25% 고체)를 충전하고, 웨트 케이크에 180g 충전의 75% (3-아크릴아미도프로필)-트리메틸암모늄 클로라이드(Sigma-Aldrich Chemical Company)를 첨가하였다. 그 후, 0.9 그램의 암모늄 퍼설페이트(Acros organics-Fisher Scientific Company), 60 mg의 부틸 3-머캅토 프로피오네이트(Sigma-Aldrich Chemical Company) 및 405 그램의 D.I.수를 반응기에 첨가하였다.

반응기의 온도를 25℃로 유지하면서 30분간 교반하였다. 반응기를 대기에서 45분에 걸쳐 80℃로 가열하였다. 대기에서 반응기를 22시간 동안 80℃의 온도로 유지하고 50℃로 냉각하였다. 600 ml 첨가 깔때기를 사용하여 1시간에 걸쳐 500 ml의 D.I.수를 첨가하고, 교반하면서 50℃의 온도로 일정하게 유지시켰다. 반응 혼합물을 2000 ml 용융 부흐너 깔때기를 사용하여 여과하고, 비드의 폴리머 용액을 세척하였다. 10 리터의 D.I.수를 사용하였다. BSA (소혈청 알부민, Sigma-Aldrich) 배치 171 mg/ml.

Claims

(i) 적절한 자유 라디칼 그라프팅 부위를 포함하는 폴리머 지지체를, 용액 내에서 작용성 모노머의 존재하에 제공하는 단계;
(ii) 상기 작용성 모노머의 중합을 일으키는 개시제와 작용성 모노머의 반응에 의해 폴리머 리간드를 발생시켜, 자유 라디칼 종을 갖는 폴리머 리간드를 형성시키는 단계; 및
(iii) 상기 폴리머 지지체와 상기 자유 라디칼 종을 갖는 폴리머 리간드 사이에 반응이 일어나도록 하는 단계를 포함하고,
여기에서, 상기 자유 라디칼 종을 갖는 폴리머 리간드가 상기 폴리머 지지체상의 적절한 자유 라디칼 그라프팅 부위와 반응하는,
크로마토그래피용 흡착 물질의 제조방법.
제1항에 있어서, 자유 라디칼 개시제를 첨가하여 폴리머 지지체와 폴리머 리간드 사이의 반응을 개시하는, 크로마토그래피용 흡착 물질의 제조방법.
제2항에 있어서, 자유 라디칼 개시제가 퍼옥사이드, 퍼옥시아세테이트, 퍼설페이트, 아조 개시제, 또는 이들의 혼합물인, 크로마토그래피용 흡착 물질의 제조방법.
제1항에 있어서, 폴리머 지지체가 0.5 내지 1500μm의 부피 평균 입자 크기를 갖는, 크로마토그래피용 흡착 물질의 제조방법.
제1항의 방법에 의해 제조된 크로마토그래피용 흡착 물질.
제5항에 있어서, 폴리머 리간드가 작용기를 포함하는, 크로마토그래피용 흡착 물질.
제5항에 있어서, 폴리머 리간드가 이온 교환기, 소수성 상호작용기, 친수성 상호작용기, 친황성(thiophilic) 상호작용기, 금속 친화성기, 친화성기, 생체친화성기, 혼합 모드기(mixed mode group) 및 다른 작용기로의 추가 변형가능한 비작용성 모노머 또는 매개 모노머 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 크로마토그래피용 흡착 물질.
제5항에 있어서, 폴리머 지지체가 0.5 내지 1500μm의 부피 평균 입자 크기를 갖는, 크로마토그래피용 흡착 물질.
(i) 혼합물을 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 혼합물을 제1항의 방법에 의해 제조된 크로마토그래피용 흡착 물질과 접촉시키는 단계를 포함하는, 혼합물로부터 화학적 화합물을 분리하는 방법.
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