KR20200043990A - 크로마토그래피용 담체, 리간드 고정 담체, 크로마토그래피 칼럼, 표적 물질의 정제 방법 및 크로마토그래피용 담체의 제조 방법 - Google Patents

크로마토그래피용 담체, 리간드 고정 담체, 크로마토그래피 칼럼, 표적 물질의 정제 방법 및 크로마토그래피용 담체의 제조 방법 Download PDF

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제이에스알 가부시끼가이샤
제이에스알 마이크로, 인크.
제이에스알 마이크로 엔.브이.
제이에스알 라이프 사이엔스 가부시끼가이샤
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Abstract

우수한 방오성을 갖고, 또한 내압 성능 및 내파손 성능이 우수한 크로마토그래피용 담체를 제공하는 것. -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 적어도 2개 포함하는 부분 구조를 갖는 중합체를 포함하는, 크로마토그래피용 담체.

Description

크로마토그래피용 담체, 리간드 고정 담체, 크로마토그래피 칼럼, 표적 물질의 정제 방법 및 크로마토그래피용 담체의 제조 방법
본 발명은, 크로마토그래피용 담체, 리간드 고정 담체, 크로마토그래피 칼럼, 표적 물질의 정제 방법 및 크로마토그래피용 담체의 제조 방법에 관한 것이다.
근년, 항체 의약 등으로 대표되는 바이오 의약품의 분야에서는, 단백질 등의 표적 물질의 발현 기술이 현저하게 진전되고, 그에 따른 크로마토그래피 등에 의한 정제 공정에서의 생산성의 향상이 요구되고 있다. 생산성을 향상시키는 방법으로서, 숙주 세포 유래 단백질, 데옥시리보핵산과 같은, 의약품 원료에 혼재하는 불순물의 농도를 1회의 정제로 가능한 한 저감시켜서, 정제 횟수나 공정을 적게 하는 것을 들 수 있으며, 이것을 실현할 수 있는 크로마토그래피용 충전제(리간드 고정 담체)의 수요가 높아지고 있다.
정제 공정에서의 불순물 제거 효율을 향상시키기 위해서는, 담체의 방오성을 개선시켜서, 불순물과 충전제의 소수성 상호 작용에 의한 비특이 흡착을 억제하여, 충전제에 대한 불순물의 부착을 억제할 필요가 있다. 이러한 부착을 억제하는 유효한 수단으로서, 충전제의 담체의 친수화가 알려져 있다(특허문헌 1).
그 때문에, 친수성을 높인 담체로서, 수용성 중합체로 세공 내부가 고정된 특정한 고체상 담체(특허문헌 2)나, 아크릴아미드 모노머 등의 친수성 모노머를 역상 현탁 중합해서 형성한 고체상 담체, 친수성 모노머를 보호기 등으로 소수화 처리한 후에 중합하여, 탈보호하여 얻은 고체상 담체가 개발되어 있다(특허문헌 3 내지 5).
국제공개 제2005/010529호 팸플릿 일본특허 제5250985호 일본특허공표 제2003-511659호 공보 일본특허공표 제2009-503203호 공보 일본특허공개 제2006-111717호 공보 국제공개 제2015/119255호 팸플릿
그러나, 종래 채용되고 있던 기술로 담체의 방오성을 개선시킨 경우에는, 내압 성능이나 내파손 성능이 저하된다는 문제가 있었다. 담체의 내압 성능이 불충분한 경우에는, 스케일이 큰 칼럼을 사용해서 정제를 행할 때 압밀화가 일어나, 통액하지 않게 될 가능성이 있다. 또한, 칼럼 압력 손실이 커지고, 고선 유속 하에서 사용하는 것이 곤란해지기 때문에, 조작에 요하는 시간이 장시간화된다. 한편, 내파손 성능이 불충분한 경우에는, 일정한 유속을 초과했을 때 압궤나 소성 변형이 급격하게 발생해버려, 재이용할 수 없게 된다고 하는 문제가 있다.
이러한 배경 하에, 3,6-디옥사-1,8-옥탄디티올를 사용해서 가교 구조를 도입한 담체가 제안되어 있지만(특허문헌 6), 이 담체는 친수성이 불충분해서, 방오성의 가일층 개선이 요망되는 것이었다. 또한, 내압 성능이나 내파손 성능에도 개선의 여지가 있었다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 우수한 방오성을 갖고, 또한 내압 성능 및 내파손 성능이 우수한 크로마토그래피용 담체를 제공하는 데 있다.
그래서, 본 발명자는 예의 검토한 결과, 크로마토그래피용 담체에 포함되는 중합체에, -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 적어도 2개 포함하는 부분 구조를 도입함으로써, 우수한 방오성과, 우수한 내압 성능 및 내파손 성능이 양립되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성했다.
즉, 본 발명은, 이하의 <1> 내지 <15>를 제공하는 것이다.
<1> -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 적어도 2개 포함하는 부분 구조(이하, 특정 부분 구조라고도 칭한다)를 갖는 중합체(이하, 특정 중합체라고도 칭한다)를 포함하는, 크로마토그래피용 담체(이하, 본 발명의 크로마토그래피용 담체라고도 칭한다).
<2> 상기 부분 구조가, 하기 식 (1)로 표시되는 2가 이상의 가교 구조인, <1>에 기재된 담체.
Figure pct00001
[식 (1) 중,
R1은 n가의 유기기를 나타내고,
X1은 -C(=O)-NH-를 나타내고,
X2는 단결합 또는 2가의 연결기를 나타내고,
n은 2 이상의 정수를 나타내고,
*은 결합손을 나타낸다.
단, n이 2인 경우, R1은 단결합이어도 된다.]
<3> 상기 부분 구조가, 하기 식 (1-2)로 표시되는 가교 구조인, <1> 또는 <2>에 기재된 담체.
Figure pct00002
[식 (1-2) 중,
R2는 단결합 또는 2가의 유기기를 나타내고,
X1a 및 X1b는 -C(=O)-NH-를 나타내고,
X2a 및 X2b는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 연결기를 나타내고,
*은 결합손을 나타낸다.]
<4> R2가 탄소수 1 내지 40의 2가의 탄화수소기, 또는 탄소수 2 내지 40의 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기인, <3>에 기재된 담체.
<5> R2가 탄소수 1 내지 40의 알칸디일기, 또는 탄소수 2 내지 40의 알칸디일기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기인, <3> 또는 <4>에 기재된 담체.
<6> X2a 및 X2b가 각각 독립적으로, 단결합, -NH-, 또는 -R4-C(=O)O-(R4는, 2가의 유기기를 나타낸다)인, <3> 내지 <5> 중 어느 하나에 기재된 담체.
<7> 입자상의 담체인, <1> 내지 <6> 중 어느 하나에 기재된 담체.
<8> 다공질 담체인, <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 기재된 담체.
<9> 상기 중합체가, 리간드를 고정 가능한 관능기를 더 갖는, <1> 내지 <8> 중 어느 하나에 기재된 담체.
<10> <1> 내지 <9> 중 어느 하나에 기재된 담체에 리간드를 고정해서 이루어지는, 리간드 고정 담체(이하, 본 발명의 리간드 고정 담체라고도 칭한다).
<11> 상기 리간드가 단백질 또는 펩티드인, <10>에 기재된 리간드 고정 담체.
<12> <10> 또는 <11>에 기재된 리간드 고정 담체가 칼럼 용기에 충전되어 있는, 크로마토그래피 칼럼(이하, 본 발명의 크로마토그래피 칼럼이라고도 칭한다).
<13> 크로마토그래피에 의해 표적 물질을 정제하는 방법으로서, <10> 또는 <11>에 기재된 리간드 고정 담체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 표적 물질의 정제 방법(이하, 본 발명의 표적 물질의 정제 방법이라고도 칭한다).
<14> 크로마토그래피에 의해 표적 물질을 정제하는 방법으로서, <10> 또는 <11>에 기재된 리간드 고정 담체와, 표적 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 공정을 포함하는, 표적 물질의 정제 방법.
<15> 환상 에테르기, 카르복시기, -C(=O)-O-C(=O)-, 숙신산이미드옥시카르보닐기, 포르밀기 및 이소시아네이트기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 관능기를 갖는 고체상과, -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함하는 가교제를 접촉시키는 공정을 포함하는, 크로마토그래피용 담체의 제조 방법(이하, 본 발명의 크로마토그래피용 담체의 제조 방법이라고도 칭한다).
본 발명의 크로마토그래피용 담체는, 우수한 방오성을 갖고, 또한 내압 성능 및 내파손 성능이 우수하다. 또한, 리간드를 고정한 경우의 표적 물질에 대한 동적 결합 용량이 크다.
따라서, 본 발명에 따르면, 우수한 방오성을 갖고, 또한 내압 성능 및 내파손 성능이 우수하고, 또한 표적 물질에 대한 동적 결합 용량이 큰 리간드 고정 담체 및 크로마토그래피 칼럼을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 크로마토그래피용 담체의 제조 방법 일례를 도시하는 도면이다.
<크로마토그래피용 담체>
본 발명의 크로마토그래피용 담체는, -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 적어도 2개 포함하는 부분 구조를 갖는 중합체를 포함하는 것이다.
특정 부분 구조로서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 하기 식 (1)로 표시되는 2가 이상의 가교 구조가 바람직하다.
Figure pct00003
[식 (1) 중,
R1은 n가의 유기기를 나타내고,
X1은 -C(=O)-NH-를 나타내고,
X2는 단결합 또는 2가의 연결기를 나타내고,
n은 2 이상의 정수를 나타내고,
*은 결합손을 나타낸다.
단, n이 2인 경우, R1은 단결합이어도 된다.]
식 (1) 중, R1로 나타나는 n가의 유기기의 탄소수는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 바람직하게는 1 내지 60 이고, 보다 바람직하게는 1 내지 40 이고, 특히 바람직하게는 1 내지 20이다.
n은 2 이상의 정수를 나타내지만, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 2 내지 6이 바람직하고, 2 내지 4가 보다 바람직하고, 2 또는 3이 더욱 바람직하고, 2가 특히 바람직하다. 부언하면, n개의 X1은 동일하거나 상이해도 되고, 또한 n개의 X2도 동일하거나 상이해도 된다.
X1로 나타나는 -C(=O)-NH-는, 당해 화학 구조 중 탄소 원자가 R1과 결합하고, 또한 화학 구조 중 질소 원자가 X2와 결합하고 있어도 되고, 또한 화학 구조 중 탄소 원자가 X2와 결합하고, 또한 화학 구조 중 질소 원자가 R1과 결합하고 있어도 된다.
X2로서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 2가의 연결기가 바람직하다. 당해 2가의 연결기로서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, -NH-, -R4-C(=O)O-가 바람직하고, -NH-가 특히 바람직하다. 특히 X2가 -NH-인 경우에, 내압 성능이 더욱 양호한 것이 된다.
또한, 상기 R4는, 2가의 유기기를 나타낸다. 또한, -R4-C(=O)O-는, 당해 화학 구조 중 R4가 X1과 결합하고 있어도 되고, 또한 화학 구조 중 산소 원자가 X1과 결합하고 있어도 된다.
R4로 나타나는 2가의 유기기로서는, 2가의 탄화수소기, 탄소수 2 이상의 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기를 들 수 있다.
R4로 나타나는 2가의 유기기가, 2가의 탄화수소기인 경우, 그의 탄소수는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 바람직하게는 1 내지 20, 보다 바람직하게는 1 내지 14, 더욱 바람직하게는 1 내지 8, 특히 바람직하게는 1 내지 4이다. 한편, 2가의 유기기가, 「탄소수 2 이상의 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기」인 경우, 이러한 기에 있어서의 2가의 탄화수소기의 탄소수는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 바람직하게는 2 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 14, 더욱 바람직하게는 2 내지 8, 특히 바람직하게는 2 내지 4이다.
부언하면, R4로 나타나는 2가의 탄화수소기, 「탄소수 2 이상의 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기」에 있어서의 2가의 탄화수소기는, 치환기를 갖고 있어도 된다. 당해 치환기로서는, 예를 들어 염소 원자, 브롬 원자 등의 할로겐 원자, 히드록시기 등을 들 수 있다. 부언하면, 치환기의 치환 위치 및 개수는 임의이며, 치환기를 2개 이상 갖는 경우, 해당 치환기는 동일하거나 상이해도 된다.
R4로 나타나는 2가의 탄화수소기, 「탄소수 2 이상의 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기」에 있어서의 2가의 탄화수소기로서는, 2가의 지방족 탄화수소기, 2가의 지환식 탄화수소기, 2가의 방향족 탄화수소기를 들 수 있지만, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 2가의 지방족 탄화수소기가 바람직하다. 부언하면, 2가의 지방족 탄화수소기는, 직쇄상이거나 분지쇄상이어도 된다.
R4로 나타나는 2가의 유기기가, 2가의 지방족 탄화수소기인 경우, 그의 탄소수는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 바람직하게는 1 내지 20, 보다 바람직하게는 1 내지 14, 더욱 바람직하게는 1 내지 8, 특히 바람직하게는 1 내지 4이다. 한편, 2가의 유기기가, 「탄소수 2 이상의 2가의 지방족 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기」인 경우, 이러한 기에 있어서의 2가의 지방족 탄화수소기의 탄소수는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 바람직하게는 2 내지 20, 보다 바람직하게는 2 내지 14, 더욱 바람직하게는 2 내지 8, 특히 바람직하게는 2 내지 4이다.
또한, 2가의 지방족 탄화수소기는 분자 내에 불포화 결합을 갖고 있어도 되지만, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 바람직하게는 알칸디일기이다. 알칸디일기의 구체예로서는, 메탄-1,1-디일기, 에탄-1,1-디일기, 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,1-디일기, 프로판-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 프로판-2,2-디일기, 부탄-1,1-디일기, 부탄-1,2-디일기, 부탄-1,3-디일기, 부탄-1,4-디일기, 펜탄-1,1-디일기, 펜탄-1,2-디일기, 펜탄-1,3-디일기, 펜탄-1,4-디일기, 펜탄-1,5-디일기, 헥산-1,1-디일기, 헥산-1,2-디일기, 헥산-1,3-디일기, 헥산-1,4-디일기, 헥산-1,5-디일기, 헥산-1,6-디일기, 헵탄-1,7-디일기, 옥탄-1,8-디일기 등을 들 수 있다. 이들 중에서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 메탄-1,1-디일기, 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 부탄-1,4-디일기, 펜탄-1,5-디일기, 헥산-1,6-디일기, 헵탄-1,7-디일기, 옥탄-1,8-디일기가 특히 바람직하다.
상기 2가의 지환식 탄화수소기의 탄소수는, 바람직하게는 3 내지 20이고, 보다 바람직하게는 3 내지 16이고, 더욱 바람직하게는 3 내지 12이고, 특히 바람직하게는 3 내지 8이다. 구체적으로는, 시클로프로필렌기, 시클로부틸렌기, 시클로펜틸렌기, 시클로헥실렌기 등의 시클로알킬렌기를 들 수 있다.
상기 2가의 방향족 탄화수소기의 탄소수는, 바람직하게는 6 내지 18이고, 보다 바람직하게는 6 내지 12이다. 구체적으로는, 페닐렌기, 나프틸렌기 등의 아릴렌기를 들 수 있다.
또한, 2가의 지환식 탄화수소기의 결합 부위 및 2가의 방향족 탄화수소기의 결합 부위는, 환 상의 어느 탄소 상이어도 된다.
상기와 같은 특정 부분 구조로서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 하기 식 (1-2) 또는 (1-3)으로 표시되는 가교 구조가 바람직하고, 식 (1-2)로 표시되는 가교 구조가 보다 바람직하고, 하기 식 (2-1) 내지 (2-6)으로 표시되는 가교 구조가 더욱 바람직하고, 식 (2-1) 내지 (2-4)로 표시되는 가교 구조가 더욱 바람직하고, 식 (2-1) 또는 (2-4)로 표시되는 가교 구조가 더욱 바람직하고, 식 (2-1)로 표시되는 가교 구조가 특히 바람직하다. 식 (2-1)로 표시되는 가교 구조인 경우에, 내압 성능이 특히 양호해진다.
Figure pct00004
[식 (1-2) 중,
R2는 단결합 또는 2가의 유기기를 나타내고,
X1a 및 X1b는 -C(=O)-NH-를 나타내고,
X2a 및 X2b는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 연결기를 나타내고,
*은 결합손을 나타낸다.]
Figure pct00005
[식 (1-3) 중,
R3은 m가의 유기기를 나타내고,
X1은 -C(=O)-NH-를 나타내고,
X2는 단결합 또는 2가의 연결기를 나타내고,
m은 3 이상의 정수를 나타내고,
*은 결합손을 나타낸다.]
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
[식 (2-1) 내지 (2-6) 중, R2 및 *은 식 (1-2) 중 R2 및 *과 동일한 의미이고, R2는 단결합 또는 2가의 유기기를 나타내고, *은 결합손을 나타낸다. 또한, 식 (2-3) 내지 (2-4) 중, R4a 및 R4b는 각각 독립적으로, 2가의 유기기를 나타낸다.]
여기서, 식 (1-2), (1-3), (2-1) 내지 (2-6) 중의 각 기호에 대해서 설명한다.
식 (1-2) 중 X1a 및 X1b, 식 (1-3) 중 X1은 -C(=O)-NH-를 나타낸다. 식 (1-2) 중 X1a 및 X1b, 식 (1-3) 중 X1은 상기 식 (1) 중 X1과 동일한 의미이다.
식 (1-2) 중 X2a 및 X2b, 식 (1-3) 중 X2는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 연결기를 나타낸다. 식 (1-2) 중 X2a 및 X2b, 식 (1-3) 중 X2는 식 (1) 중 X2와 동일한 의미이고, 이들에서 나타나는 2가의 연결기로서는, -NH-, -R4-C(=O)O-가 바람직하고, -NH-가 특히 바람직하다. 특히 X2가 -NH-인 경우에, 내압 성능이 더욱 양호한 것이 된다. 부언하면, R4는 상술한 바와 같고, 2가의 유기기를 나타낸다.
식 (2-3) 내지 (2-4) 중 R4a 및 R4b는 각각 독립적으로, 2가의 유기기를 나타낸다. 식 (2-3) 내지 (2-4) 중 R4a 및 R4b는, 상기 식 (1)에 있어서의 R4와 동일한 의미이다.
식 (1-2), (2-1) 내지 (2-6) 중, R2는 단결합 또는 2가의 유기기를 나타내지만, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 2가의 유기기가 바람직하다. 당해 2가의 유기기 탄소수로서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 1 내지 40이 바람직하고, 1 내지 30이 보다 바람직하고, 1 내지 20이 더욱 바람직하고, 1 내지 10이 특히 바람직하다.
R2로 나타나는 2가의 유기기로서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 2가의 탄화수소기, 탄소수 2 이상의 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기, 2가의 질소 함유 복소환기가 바람직하고, 2가의 탄화수소기, 탄소수 2 이상의 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기가 보다 바람직하다. 부언하면, R2로 나타나는 2가의 탄화수소기, 「탄소수 2 이상의 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기」에 있어서의 2가의 탄화수소기, 2가의 질소 함유 복소환기는, 치환기를 갖고 있어도 된다. 당해 치환기로서는, 예를 들어 염소 원자, 브롬 원자 등의 할로겐 원자, 히드록시기 등을 들 수 있다. 부언하면, 치환기의 치환 위치 및 개수는 임의이며, 치환기를 2개 이상 갖는 경우, 해당 치환기는 동일하거나 상이해도 된다.
R2로 나타나는 2가의 유기기가, 2가의 탄화수소기인 경우, 그의 탄소수는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 바람직하게는 1 내지 40, 보다 바람직하게는 1 내지 30, 더욱 바람직하게는 1 내지 20, 특히 바람직하게는 1 내지 10이다. 한편, R2로 나타나는 2가의 유기기가, 「탄소수 2 이상의 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기」인 경우, 이러한 기에 있어서의 2가의 탄화수소기의 탄소수는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 바람직하게는 2 내지 40, 보다 바람직하게는 2 내지 30, 더욱 바람직하게는 2 내지 20, 특히 바람직하게는 2 내지 10이다.
R2로 나타나는 2가의 탄화수소기, 「탄소수 2 이상의 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기」에 있어서의 2가의 탄화수소기로서는, 2가의 지방족 탄화수소기, 2가의 지환식 탄화수소기, 2가의 방향족 탄화수소기를 들 수 있지만, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 2가의 지방족 탄화수소기가 바람직하다. 부언하면, 2가의 지방족 탄화수소기는, 직쇄상이거나 분지쇄상이어도 된다.
R2로 나타나는 2가의 유기기가, 2가의 지방족 탄화수소기인 경우, 그의 탄소수는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 바람직하게는 1 내지 40, 보다 바람직하게는 1 내지 30, 더욱 바람직하게는 1 내지 20, 더욱 바람직하게는 1 내지 10, 더욱 바람직하게는 1 내지 8, 특히 바람직하게는 2 내지 6이다. 한편, R2로 나타나는 2가의 유기기가, 「탄소수 2 이상의 2가의 지방족 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기」인 경우, 이러한 기에 있어서의 2가의 지방족 탄화수소기의 탄소수는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 바람직하게는 2 내지 40, 보다 바람직하게는 2 내지 30, 더욱 바람직하게는 2 내지 20, 더욱 바람직하게는 2 내지 10, 더욱 바람직하게는 2 내지 8, 특히 바람직하게는 2 내지 6이다.
또한, 「탄소수 2 이상의 2가의 지방족 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기」로서는, 탄소수 2 이상의 2가의 지방족 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에스테르 결합을 갖는 기가 바람직하다. 예를 들어, -(CH2)2-OC(=O)-CH2-를 들 수 있다.
또한, 2가의 지방족 탄화수소기는 분자 내에 불포화 결합을 갖고 있어도 되지만, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 바람직하게는 알칸디일기이다. 알칸디일기의 구체예로서는, 메탄-1,1-디일기, 에탄-1,1-디일기, 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,1-디일기, 프로판-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 프로판-2,2-디일기, 부탄-1,1-디일기, 부탄-1,2-디일기, 부탄-1,3-디일기, 부탄-1,4-디일기, 펜탄-1,1-디일기, 펜탄-1,2-디일기, 펜탄-1,3-디일기, 펜탄-1,4-디일기, 펜탄-1,5-디일기, 헥산-1,1-디일기, 헥산-1,2-디일기, 헥산-1,3-디일기, 헥산-1,4-디일기, 헥산-1,5-디일기, 헥산-1,6-디일기, 헵탄-1,7-디일기, 옥탄-1,8-디일기 등을 들 수 있다. 이들 중에서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 메탄-1,1-디일기, 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 부탄-1,4-디일기, 펜탄-1,5-디일기, 헥산-1,6-디일기, 헵탄-1,7-디일기, 옥탄-1,8-디일기가 특히 바람직하다.
상기 2가의 지환식 탄화수소기의 탄소수는, 바람직하게는 3 내지 20이고, 보다 바람직하게는 3 내지 16이고, 더욱 바람직하게는 3 내지 12이고, 특히 바람직하게는 3 내지 8이다. 구체적으로는, 시클로프로필렌기, 시클로부틸렌기, 시클로펜틸렌기, 시클로헥실렌기 등의 시클로알킬렌기를 들 수 있다.
상기 2가의 방향족 탄화수소기의 탄소수는, 바람직하게는 6 내지 18이고, 보다 바람직하게는 6 내지 12이다. 구체적으로는, 페닐렌기, 나프틸렌기 등의 아릴렌기를 들 수 있다.
상기 2가의 질소 함유 복소환기의 탄소수는, 바람직하게는 4 내지 18이고, 보다 바람직하게는 4 내지 10 이고, 특히 바람직하게는 4 내지 6이다. 구체적으로는, 피리디닐렌기(피리딘환 유래의 2가의 기), 피리미디닐렌기(피리미딘환 유래의 2가의 기) 등을 들 수 있다.
부언하면, 2가의 지환식 탄화수소기의 결합 부위, 2가의 방향족 탄화수소기의 결합 부위 및 2가의 질소 함유 복소환기의 결합 부위는, 환 상의 어느 탄소 상이어도 된다.
식 (1-3) 중, m은 3 이상의 정수를 나타내지만, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 3 내지 6이 바람직하고, 3 또는 4가 보다 바람직하고, 3이 특히 바람직하다. 부언하면, m개의 X1은 동일하거나 상이해도 되고, 또한 m개의 X2도 동일하거나 상이해도 된다.
m이 3인 경우, R3은 3가의 유기기이지만, 당해 3가의 유기기로서는, 3가의 탄화수소기를 들 수 있다. 3가의 탄화수소기는, 치환기를 갖고 있어도 된다. 당해 치환기로서는, 상기 2가의 탄화수소기가 갖고 있어도 되는 것과 마찬가지 것을 들 수 있다.
3가의 탄화수소기의 탄소수로서는, 1 내지 40이 바람직하고, 1 내지 30이 보다 바람직하고, 1 내지 20이 더욱 바람직하고, 1 내지 10이 특히 바람직하다.
3가의 탄화수소기로서는, 3가의 지방족 탄화수소기, 3가의 지환식 탄화수소기, 3가의 방향족 탄화수소기를 들 수 있지만, 3가의 지방족 탄화수소기, 3가의 지환식 탄화수소기가 바람직하다. 또한, 3가의 지환식 탄화수소기의 결합 부위 및 3가의 방향족 탄화수소기의 결합 부위는, 환 상의 어느 탄소 상이어도 된다.
3가의 지방족 탄화수소기의 탄소수로서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 1 내지 40이 바람직하고, 1 내지 30이 보다 바람직하고, 1 내지 20이 더욱 바람직하고, 1 내지 10이 더욱 바람직하고, 1 내지 8이 더욱 바람직하고, 2 내지 6이 특히 바람직하다. 또한, 3가의 지방족 탄화수소기는 분자 내에 불포화 결합을 갖고 있어도 되지만, 바람직하게는 알칸트리일기이다. 알칸트리일기의 구체예로서는, 메탄-1,1,1-트리일기, 에탄-1,1,1-트리일기, 에탄-1,1,2-트리일기, 프로판-1,2,3-트리일기, 프로판-1,2,2-트리일기 등을 들 수 있다.
3가의 지환식 탄화수소기의 탄소수는, 바람직하게는 3 내지 20이고, 보다 바람직하게는 3 내지 16이고, 더욱 바람직하게는 3 내지 12이고, 특히 바람직하게는 3 내지 8이다. 구체적으로는, 시클로프로판트리일기, 시클로부탄트리일기, 시클로펜탄트리일기, 시클로헥산트리일기 등의 시클로알칸트리일기를 들 수 있다.
특정 부분 구조로서는, -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함하는 가교제 유래의 구조를 들 수 있다. 이러한 가교제로서는, -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함함과 함께, 리간드를 고정 가능한 관능기와 반응해서 가교 구조를 도입할 수 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 옥살릴디히드라지드, 말론산디히드라지드, 숙신산디히드라지드, 2,3-디히드록시숙신산디히드라지드, 글루타르산디히드라지드, 아디프산디히드라지드, 피멜산디히드라지드, 옥탄이산디히드라지드, 노난이산디히드라지드, 세바스산디히드라지드, 도데칸이산디히드라지드, 프탈산디히드라지드, 이소프탈산디히드라지드, 테레프탈산디히드라지드, 퀴놀린산디히드라지드 등의 디카르복실산디히드라지드류; 시클로헥산트리카르복실산트리히드라지드 등의 트리카르복실산트리히드라지드류; N1,N1-(에탄-1,2-디일)비스(숙신산모노아미드) 등의(알킬렌비스이미노)비스(옥소알칸산)류 등을 들 수 있다. 가교제는, 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이들 가교제 중에서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 디카르복실산디히드라지드류, (알킬렌비스이미노)비스(옥소알칸산)류가 바람직하고, 디카르복실산디히드라지드류가 보다 바람직하다. 디카르복실산디히드라지드류를 사용한 경우에 내압 성능이 특히 양호해진다.
또한, 특정 중합체로서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 리간드를 고정 가능한 관능기를 더 갖는 것이 바람직하다.
리간드를 고정 가능한 관능기로서는, 환상 에테르기, 카르복시기, -C(=O)-O-C(=O)-, 숙신산이미드옥시카르보닐기, 포르밀기 및 이소시아네이트기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 관능기를 들 수 있지만, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 환상 에테르기가 바람직하다.
여기서, 「환상 에테르기」로서는, 환을 구성하는 원자수가 3 내지 7개인 환상 에테르기가 바람직하다. 환상 에테르기는, 치환기로서 알킬기를 갖고 있어도 된다. 환상 에테르기의 구체예로서는, 이하의 식 (3) 내지 (8)로 표시되는 환상 에테르기를 들 수 있지만, 식 (3), (5) 또는 (8)로 표시되는 환상 에테르기가 바람직하고, 식 (3)으로 표시되는 환상 에테르기가 보다 바람직하다.
Figure pct00012
〔식 중, R5a, R5b, R5c 및 R6은 각각 독립적으로, 수소 원자 또는 알킬기를 나타내고, *은 결합손을 나타낸다.]
R5a, R5b, R5c 및 R6으로 나타나는 알킬기의 탄소수는, 바람직하게는 1 내지 4 이고, 보다 바람직하게는 1 또는 2이다. 알킬기는 직쇄상이거나 분지쇄상이어도 되고, 예를 들어 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기 등을 들 수 있다. 또한, R5a, R5b, R5c 및 R6으로서는, 수소 원자가 바람직하다.
또한, 특정 중합체로서는, 리간드를 고정 가능한 관능기의 잔기를 2개 이상 갖고, 당해 2개 이상의 잔기가, 특정 부분 구조로 가교되어 있는 것이 바람직하고, 리간드를 고정 가능한 관능기의 잔기 2개 이상과, 리간드를 고정 가능한 관능기를 갖고, 또한 2개 이상의 잔기가, 특정 부분 구조로 가교되어 있는 것이 보다 바람직하다.
리간드를 고정 가능한 관능기의 잔기는, 상기 리간드를 고정 가능한 관능기가 가교제에 의해 가교되었을 때 남는 잔기를 의미한다. 당해 잔기로서는, 구체적으로는, 환상 에테르기가 개환해서 이루어지는 2가의 기, -C(=O)-, -NH-C(=O)-을 들 수 있고, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 환상 에테르기가 개환해서 이루어지는 2가의 기가 바람직하다. 당해 환상 에테르기가 개환해서 이루어지는 2가의 기에 있어서의 「환상 에테르기」로서는, 리간드를 고정 가능한 관능기로서 예로 든 것과 마찬가지 것이 바람직하다.
특정 부분 구조의 함유량은, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 특정 중합체 중, 바람직하게는 0.5 내지 50질량%이고, 보다 바람직하게는 1 내지 40질량%이고, 특히 바람직하게는 10 내지 35질량%이다.
특정 중합체 중의 리간드를 고정 가능한 관능기와 그의 잔기의 합계 함유량(α)에 대한 특정 중합체 중의 특정 부분 구조의 함유량(β)의 몰비〔(β)/(α)〕는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 바람직하게는 0.01 내지 0.8이고, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.7이고, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.6이고, 특히 바람직하게는 0.2 내지 0.5이다. 본 발명에 따르면, 몰비〔(β)/(α)〕가 0.2 이상인 경우에도 우수한 방오성이 얻어진다.
부언하면, 특정 중합체 중의 각 구조의 함유량은, 원소 분석이나 열분해 가스 크로마토그래피 등에 의해 측정 가능하다.
특정 중합체로서는, 리간드를 고정 가능한 관능기를 갖는 구조 단위 (A) 및 리간드를 고정 가능한 관능기의 잔기를 갖는 구조 단위 (B)를 갖고, 구조 단위 (B) 중 상기 잔기끼리가, 특정 부분 구조로 가교되어 있는 것이 바람직하다. 구조 단위 (A)로서는, 하기 식 (9)로 표시되는 구조 단위가 바람직하고, 구조 단위 (B)로서는, 하기 식 (10)으로 표시되는 구조 단위가 바람직하다.
Figure pct00013
[식 (9) 중,
R8은 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고,
R9는 단결합 또는 2가의 연결기를 나타내고,
Z1은 리간드를 고정 가능한 관능기를 나타낸다.]
Figure pct00014
[식 (10) 중,
R10은 수소 원자 또는 메틸기를 나타내고,
R11은 단결합 또는 2가의 연결기를 나타내고,
Z2는 리간드를 고정 가능한 관능기의 잔기를 나타내고,
**은 특정 부분 구조와 결합하는 결합손을 나타낸다.]
식 (9) 중 Z1로 나타나는 리간드를 고정 가능한 관능기, 식 (10) 중 Z2로 나타나는 리간드를 고정 가능한 관능기의 잔기로서는, 상기와 마찬가지 것을 들 수 있다. 또한, 식 (10) 중 **은 특정 부분 구조와 결합하는 결합손을 나타내고, 특정 부분 구조에서 가교되어 있는 것을 의미한다.
식 (9) 중 R9, 식 (10) 중 R11로 나타나는 2가의 연결기로서는, 예를 들어 알칸디일기, 탄소수 2 이상의 알칸디일기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합을 갖는 기, 아릴렌기, -C(=O)O-R12-*, -C(=O)NH-R13-*, -Ar-R14-*, 또는 -Ar-OR15-* 등을 들 수 있다. 여기서, Ar은, 아릴렌기를 나타내고, R9, R11에 있어서의 *은 상기 Z1 또는 Z2에 결합하는 결합손을 나타낸다. R9, R11, Ar로 나타나는 아릴렌기로서는, 페닐렌기, 나프틸렌기, 페난트레닐렌기 등을 들 수 있다.
또한, R12 내지 R15는 각각 독립적으로, 알칸디일기, 또는 탄소수 2 이상의 알칸디일기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합을 갖는 기를 나타낸다.
R9, R11, R12 내지 R15로 나타나는 알칸디일기의 탄소수로서는, 1 내지 12가 바람직하고, 1 내지 6이 보다 바람직하고, 1 내지 3이 특히 바람직하다. 당해 알칸디일기는, 직쇄상이거나 분지쇄상이어도 된다. 알칸디일기의 구체예로서는, 메탄-1,1-디일기, 에탄-1,1-디일기, 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,1-디일기, 프로판-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 프로판-2,2-디일기, 부탄-1,1-디일기, 부탄-1,2-디일기, 부탄-1,3-디일기, 부탄-1,4-디일기, 펜탄-1,1-디일기, 펜탄-1,2-디일기, 펜탄-1,3-디일기, 펜탄-1,4-디일기, 펜탄-1,5-디일기, 헥산-1,1-디일기, 헥산-1,2-디일기, 헥산-1,3-디일기, 헥산-1,4-디일기, 헥산-1,5-디일기, 헥산-1,6-디일기, 헵탄-1,7-디일기, 옥탄-1,8-디일기 등을 들 수 있다.
R9, R11, R12 내지 R15로 나타나는 「탄소수 2 이상의 알칸디일기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합을 갖는 기」로서는, -Ra(ORb)pORc-로 표현되는 기가 바람직하다(Ra, Rb 및 Rc는 각각 독립적으로, 탄소수 1 내지 4의 알칸디일기를 나타내고, p는 0 내지 30의 정수를 나타낸다.).
Ra, Rb 및 Rc로 나타나는 알칸디일기는 직쇄상이거나 분지쇄상이어도 된다. 구체적으로는, 메탄-1,1-디일기, 에탄-1,1-디일기, 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,1-디일기, 프로판-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 프로판-2,2-디일기, 부탄-1,1-디일기, 부탄-1,2-디일기, 부탄-1,3-디일기, 부탄-1,4-디일기를 들 수 있다. p로서는, 0 내지 20의 정수가 바람직하고, 0 내지 10의 정수가 보다 바람직하고, 0 내지 5의 정수가 더욱 바람직하고, 0이 특히 바람직하다. 또한, p가 2 내지 30의 정수인 경우, p개의 Rb는 동일하거나 상이해도 된다. 탄소수 2 이상의 알칸디일기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합을 갖는 기의 적합한 구체예로서는, C1-4알칸디일옥시C1-4알칸디일기를 들 수 있다.
또한, R9, R11, R12 내지 R15로 나타나는 알칸디일기, 탄소수 2 이상의 알칸디일기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합을 갖는 기는, 치환기를 갖고 있어도 된다. 당해 치환기로서는, 예를 들어 히드록시기 등을 들 수 있다.
상기와 같은 R9, R11 중에서는, 특정 중합체를 제조하기 쉽다는 등의 점에서, -C(=O)O-R12-*가 특히 바람직하다.
구조 단위 (A)나 구조 단위 (B)를 구성하는 모노머로서는, 리간드를 고정 가능한 관능기 및 중합성 불포화기를 갖는 모노머가 바람직하다. 이러한 모노머로서는, 예를 들어 글리시딜(메트)아크릴레이트, 3-옥시라닐프로필(메트)아크릴레이트, 4-옥시라닐부틸(메트)아크릴레이트, 5-옥시라닐펜틸(메트)아크릴레이트, 6-옥시라닐헥실(메트)아크릴레이트, 7-옥시라닐헵틸(메트)아크릴레이트, 8-옥시라닐옥틸(메트)아크릴레이트, (3-메틸옥시라닐)메틸(메트)아크릴레이트, 4-히드록시부틸(메트)아크릴레이트글리시딜에테르, 글리세린모노(메트)아크릴레이트글리시딜에테르, 3,4-에폭시시클로헥실메틸(메트)아크릴레이트, 3,4-에폭시시클로헥실에틸(메트)아크릴레이트, 3,4-에폭시시클로헥실프로필(메트)아크릴레이트, α-(메트)아크릴-ω-글리시딜폴리에틸렌글리콜, 테트라히드로푸르푸릴(메트)아크릴레이트 등의 환상 에테르기를 갖는 (메트)아크릴레이트계 모노머; (비닐벤질)글리시딜에테르, (이소프로페닐벤질)글리시딜에테르, (비닐페네틸)글리시딜에테르, (비닐페닐부틸)글리시딜에테르, (비닐벤질옥시에틸)글리시딜에테르, (비닐페닐)글리시딜에테르, (이소프로페닐페닐)글리시딜에테르, 1,2-에폭시-3-(4-비닐벤질)프로판 등의 환상 에테르기를 갖는 방향족 비닐계 모노머; 알릴글리시딜에테르 등의 환상 에테르기를 갖는 알릴에테르계 모노머; 이소시아나토에틸(메트)아크릴레이트 등의 이소시아네이트기를 갖는 (메트)아크릴레이트계 모노머; 말레산 무수물, 메틸 말레산 무수물, 글루타콘산 무수물 등의 불포화 디카르복실산 무수물계 모노머 외에, (메트)아크릴산, 3,4-에폭시-1-부텐, 3,4-에폭시-3-메틸-1-부텐 등을 들 수 있다. 이들 모노머는, 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
이들 모노머 중에서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 환상 에테르기를 갖는 (메트)아크릴레이트계 모노머가 바람직하고, 글리시딜(메트)아크릴레이트가 특히 바람직하다.
특정 중합체 중 구조 단위 (A) 및 (B)의 합계 함유 비율은, 특정 부분 구조 100질량부에 대하여, 바람직하게는 100 내지 1500질량부이고, 보다 바람직하게는 100 내지 1000질량부이다.
또한, 특정 중합체는, 특정 부분 구조 그리고 구조 단위 (A) 및 (B) 외에도 구조 단위를 갖고 있어도 된다. 이러한 구조 단위를 구성하는 모노머(이하, 다른 모노머라고도 칭한다)로서는, 리간드를 고정 가능한 관능기를 갖지 않는 중합성 불포화기 함유 모노머를 들 수 있다. 다른 모노머는, 비가교성 모노머, 가교성 모노머로 크게 구별되고, 이들 중 한쪽을 사용해도 병용해도 된다. 또한, 본 발명에 따르면, 히드록시기 등의 친수성기를 포함하지 않는 모노머를 다른 모노머로서 사용한 경우에도, 방오성 등의 본 발명의 원하는 효과를 충족시킬 수 있어, 광범위한 모노머 조성에 적용 가능하다.
상기 비가교성 모노머로서는, 예를 들어 (메트)아크릴레이트계 비가교성 모노머, (메트)아크릴아미드계 비가교성 모노머, 방향족 비닐계 비가교성 모노머, 비닐케톤계 비가교성 모노머, (메트)아크릴로니트릴계 비가교성 모노머, N-비닐아미드계 비가교성 모노머 등을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 비가교성 모노머 중에서는, (메트)아크릴레이트계 비가교성 모노머, 방향족 비닐계 비가교성 모노머가 바람직하다.
상기 (메트)아크릴레이트계 비가교성 모노머로서는, 예를 들어 메틸(메트)아크릴레이트, 에틸(메트)아크릴레이트, n-부틸(메트)아크릴레이트, 4-tert-부틸(메트)아크릴레이트, 이소부틸(메트)아크릴레이트, n-옥틸(메트)아크릴레이트, 2-에틸헥실(메트)아크릴레이트, 시클로헥실(메트)아크릴레이트, 메톡시에틸(메트)아크릴레이트, 히드록시에틸(메트)아크릴레이트, 히드록시프로필(메트)아크릴레이트, 글리세롤모노(메트)아크릴레이트, 트리메틸올에탄모노(메트)아크릴레이트, 트리메틸올프로판모노(메트)아크릴레이트, 부탄트리올모노(메트)아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜모노(메트)아크릴레이트, 메톡시폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨모노(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨모노(메트)아크릴레이트, 이노시톨모노(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 (메트)아크릴아미드계 비가교성 모노머로서는, 예를 들어 (메트)아크릴아미드, 디메틸(메트)아크릴아미드, 히드록시에틸(메트)아크릴아미드, (메트)아크릴로일모르폴린, 다이아세톤(메트)아크릴아미드 등을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 방향족 비닐계 비가교성 모노머로서는, 예를 들어 스티렌, α-메틸스티렌, 할로겐화 스티렌, 4-메틸스티렌, 2,4-디메틸스티렌, 2,4,6-트리메틸스티렌, 에틸비닐벤젠, 4-이소프로필스티렌, 4-n-부틸스티렌, 4-이소부틸스티렌, 4-tert-부틸스티렌 등의 스티렌류; 1-비닐나프탈렌, 2-비닐나프탈렌 등의 비닐나프탈렌류 등을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 비닐케톤계 비가교성 모노머로서는, 예를 들어 에틸비닐케톤, 프로필비닐케톤, 이소프로필비닐케톤 등을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 (메트)아크릴로니트릴계 비가교성 모노머로서는, 예를 들어 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴 등을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 N-비닐아미드계 비가교성 모노머로서는, 예를 들어 N-비닐아세트아미드, N-비닐프로피온아미드 등을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
특정 중합체 중의 비가교성 모노머로 구성되는 구조 단위의 함유 비율은, 특정 부분 구조 100질량부에 대하여, 바람직하게는 1 내지 500질량부이고, 보다 바람직하게는 1 내지 100질량부이다.
또한, 상기 가교성 모노머로서는, 예를 들어 (메트)아크릴레이트계 가교성 모노머, 방향족 비닐계 가교성 모노머, 알릴계 가교성 모노머 등을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 가교성 모노머로서는, 2 내지 5관능의 가교성 모노머가 바람직하고, 2 또는 3관능의 가교성 모노머가 보다 바람직하다. 가교성 모노머 중에서는, (메트)아크릴레이트계 가교성 모노머, 방향족 비닐계 가교성 모노머가 바람직하다.
상기 (메트)아크릴레이트계 가교성 모노머로서는, 예를 들어 에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 디에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 트리에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 테트라에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 디프로필렌글리콜디 (메트)아크릴레이트, 트리프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 테트라프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 1,4-부탄디올디(메트)아크릴레이트, 1,6-헥산디올디(메트)아크릴레이트, 글리세린디(메트)아크릴레이트, 트리메틸올에탄디(메트)아크릴레이트, 트리메틸올프로판디(메트)아크릴레이트, 트리메틸올프로판트리(메트)아크릴레이트, 부탄트리올디(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨디(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨트리(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨테트라(메트)아크릴레이트, 글루코오스디(메트)아크릴레이트, 글루코오스트리(메트)아크릴레이트, 글루코오스테트라(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨디(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨트리(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨테트라(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨펜타(메트)아크릴레이트, 이노시톨디(메트)아크릴레이트, 이노시톨트리(메트)아크릴레이트, 이노시톨테트라(메트)아크릴레이트, 만니톨디(메트)아크릴레이트, 만니톨트리(메트)아크릴레이트, 만니톨테트라(메트)아크릴레이트, 만니톨펜타(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 방향족 비닐계 가교성 모노머로서는, 예를 들어 디비닐벤젠, 트리비닐벤젠, 디비닐톨루엔, 디비닐크실렌, 디비닐에틸벤젠, 디비닐나프탈렌 등을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 알릴계 가교성 모노머로서는, 예를 들어 프탈산디알릴, 이소프탈산디알릴, 테레프탈산디알릴, 말레산디알릴, 푸마르산디알릴, 이타콘산디알릴, 트리멜리트산디알릴, 트리멜리트산트리알릴, 시아누르산트리알릴, 이소시아누르산디알릴, 이소시아누르산트리알릴 등을 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 가교성 모노머로서는, 상기 예시한 것 외에, 디아미노프로판올, 트리스히드록시메틸아미노메탄, 글루코사민 등의 아미노알코올과 (메트)아크릴산의 탈수 축합 반응물이나, 부타디엔, 이소프렌 등의 공액 디올레핀 등을 들 수 있다.
특정 중합체 중의 가교성 모노머로 구성되는 구조 단위의 함유 비율은, 특정 부분 구조 100질량부에 대하여, 바람직하게는 1 내지 1000질량부이고, 보다 바람직하게는 10 내지 500질량부이다.
특정 중합체는, 특정 부분 구조를 갖는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스 등의 다당류로 구성되는 천연 고분자이거나 합성 고분자여도 되지만, 바람직하게는 합성 고분자이다. 또한, 특정 중합체는, 바람직하게는 수불용성 중합체이다.
또한, 특정 중합체의 함유량은, 본 발명의 크로마토그래피용 담체 중, 바람직하게는 80 내지 100질량%이고, 보다 바람직하게는 90 내지 100질량%이고, 특히 바람직하게는 99 내지 100질량%이다.
또한, 본 발명의 크로마토그래피용 담체는, 지지체(고체상 담체)로서 사용할 수 있는 형태이면 된다. 이러한 형태로 해서는, 예를 들어 입자상, 모놀리스상, 판상, 막상(중공사를 포함한다), 섬유상, 카세트상, 칩상 등을 들 수 있고, 바람직하게는 입자상이다. 또한, 본 발명의 크로마토그래피용 담체로서는, 다공질 입자 등의 다공질 담체가 바람직하다. 또한, 다공질 입자로서는, 다공질 중합체 입자가 바람직하다.
또한, 본 발명의 크로마토그래피용 담체가 입자상의 담체인 경우, 평균 입경(체적 평균 입경)은, 내압 성능이나 내파손 성능의 점에서, 바람직하게는 20 내지 150㎛이고, 보다 바람직하게는 40 내지 100㎛이다. 또한, 평균 입경의 변동 계수는, 바람직하게는 40% 이하이고, 보다 바람직하게는 30% 이하이다.
또한, 본 발명의 크로마토그래피용 담체의 비표면적은, 바람직하게는 1 내지 500㎡/g이며, 보다 바람직하게는 10 내지 300㎡/g이다.
또한, 본 발명의 크로마토그래피용 담체의 체적 평균 세공 직경은, 바람직하게는 10 내지 300㎚이다.
또한, 상기 평균 입경, 변동 계수, 비표면적 및 체적 평균 세공 직경은, 레이저 회절· 산란 입자경 분포 측정 등에 의해 측정할 수 있다.
<크로마토그래피용 담체의 제조 방법>
본 발명의 크로마토그래피용 담체는, 통상의 방법을 적절히 조합하여 제조할 수 있지만, 환상 에테르기, 카르복시기, -C(=O)-O-C(=O)-, 숙신산이미드옥시카르보닐기, 포르밀기 및 이소시아네이트기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 관능기를 갖는 고체상과, -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함하는 가교제를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법에 의해, 간편하고 또한 효율적으로 제조할 수 있다.
상기 제법의 구체적인 방법으로서는, 예를 들어, (공정 1) 원료 입자 등의 고체상을 통상법에 따라서 얻고, 도 1에 예시되는 바와 같이, (공정 2) 얻어진 고체상과, -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함하는 가교제를 접촉시키는 방법을 들 수 있다.
이하, 상기 각 공정에 대해서, 구체적으로 설명한다.
(공정 1)
공정 1은, 환상 에테르기, 카르복시기, -C(=O)-O-C(=O)-, 숙신산이미드옥시카르보닐기, 포르밀기 및 이소시아네이트기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 관능기를 갖는 모노머(이하, 관능기 함유 모노머라고도 칭한다)를 (공)중합시켜서, 상기 관능기를 갖는 고체상을 얻는 공정이다. (공)중합의 방법은, 바람직하게는 현탁 중합이다.
관능기 함유 모노머로서는, 구조 단위 (A), (B)를 구성하는 모노머로서 예시한 것을 들 수 있다. 또한, 관능기 함유 모노머와 함께 상기 다른 모노머(비가교성 모노머, 가교성 모노머)를 공중합시켜도 된다.
관능기 함유 모노머의 합계 사용량으로서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 공정 1에서 사용하는 모노머 총량 100질량부에 대하여, 1 내지 99질량부가 바람직하고, 20 내지 95질량부가 보다 바람직하고, 40 내지 90질량부가 특히 바람직하다.
가교성 모노머의 합계 사용량으로서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 공정 1에서 사용하는 모노머 총량 100질량부에 대하여, 1 내지 70질량부가 바람직하고, 3 내지 60질량부가 보다 바람직하고, 5 내지 50질량부가 특히 바람직하다.
또한, 비가교성 모노머를 사용하는 경우, 그의 합계 사용량은, 관능기 함유 모노머나 가교성 모노머 이외의 잔여의 양이다.
또한, 공정 1의 구체적인 방법으로서는, 예를 들어, 모노머 및 필요에 따라 다공화제를 포함하는 혼합 용액(단량체 용액)에 중합 개시제를 용해시키고, 수계 매체 중에 현탁시켜서 소정 온도까지 가열해서 중합시키는 방법이나, 모노머 및 필요에 따라 다공화제를 포함하는 혼합 용액(단량체 용액)에 중합 개시제를 용해시키고, 소정 온도까지 가열한 수계 매체 중에 첨가해서 중합시키는 방법, 모노머 및 필요에 따라 다공화제를 포함하는 혼합 용액(단량체 용액)을, 수계 매체 중에 현탁시켜서 소정 온도까지 가열하여, 중합 개시제를 첨가하여 중합시키는 방법 등을 들 수 있다.
중합 개시제로서는 라디칼 중합 개시제가 바람직하다. 라디칼 중합 개시제로서는, 예를 들어 아조계 개시제, 과산화물계 개시제, 산화 환원계 개시제 등을 들 수 있고, 구체적으로는, 아조비스이소부티로니트릴, 아조비스이소부티르산메틸, 아조비스-2,4-디메틸발레로니트릴, 과산화벤조일, 과산화디-tert-부틸, 과산화벤조일-디메틸아닐린 등을 들 수 있다. 중합 개시제의 합계 사용량은, 통상, 모노머 총량 100질량부에 대하여 0.01 내지 10질량부 정도이다.
상기 다공화제는, 다공질 입자를 제조하기 위해 사용되며, 유적(油滴) 내의 중합에 있어서, 모노머와 함께 존재하고, 비중합 성분으로서 구멍을 형성하는 역할을 갖는다. 다공화제는, 다공질 표면에 있어서 용이하게 제거 가능한 것이면 특별히 한정되는 것이 아니고, 예를 들어 각종 유기 용제나 혼합 모노머에 가용인 선상 중합물 등을 들 수 있고, 이들을 병용해도 된다.
상기 다공화제로서는, 예를 들어 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸, 운데칸 등의 지방족 탄화수소류; 시클로펜탄, 시클로헥산 등의 지환식 탄화수소류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 나프탈렌, 에틸벤젠 등의 방향족 탄화수소류; 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 테트라클로로에탄, 클로로벤젠 등의 할로겐화 탄화수소류; 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-에틸-1-헥산올 등의 지방족 알코올류; 시클로헥산올 등의 지환식 알코올류; 2-페닐에틸알코올, 벤질알코올 등의 방향족 알코올류; 디에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 디이소부틸케톤, 아세토페논, 2-옥타논, 시클로헥사논 등의 케톤류; 디부틸에테르, 디이소부틸에테르, 아니솔, 에톡시벤젠 등의 에테르류; 아세트산이소펜틸, 아세트산부틸, 아세트산-3-메톡시부틸, 말론산디에틸 등의 에스테르류 외에, 비가교성 비닐모노머의 단독중합체 등의 선상 중합물을 들 수 있다. 다공화제는 단독으로 또는 2종 이상을 혼합해서 사용할 수 있다.
상기 다공화제의 합계 사용량은, 통상, 모노머 총량 100질량부에 대하여 40 내지 600질량부 정도이다.
상기 수계 매체로서는, 예를 들어 수용성 고분자 수용액 등을 들 수 있고, 수용성 고분자로서는, 예를 들어 히드록시에틸셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 전분, 젤라틴 등을 들 수 있다.
수계 매체의 합계 사용량은, 통상, 모노머 총량 100질량부에 대하여 200 내지 7000질량부 정도이다.
또한, 수계 매체의 분산매로서 물을 사용하는 경우, 예를 들어 탄산나트륨, 탄산칼슘, 황산나트륨, 인산칼슘, 염화나트륨 등의 분산 안정제를 사용해도 된다.
또한, 공정 1에는, 알킬황산에스테르염, 알킬아릴황산에스테르염, 알킬인산에스테르염, 지방산염 등의 음이온성 계면 활성제를 비롯한 각종 계면 활성제를 사용해도 된다. 또한, 아질산나트륨 등의 아질산염, 요오드화칼륨 등의 요오드화물염, tert-부틸피로카테콜, 벤조퀴논, 피크르산, 하이드로퀴논, 염화구리, 염화제2철 등의 중합 금지제를 사용할 수도 있다. 또한, 도데실머캅탄 등의 중합 제조제를 사용해도 된다.
또한, 공정 1의 중합 온도는 중합 개시제에 따라서 결정하면 되지만, 통상 2 내지 100℃ 정도이고, 아조비스이소부티로니트릴을 중합 개시제로서 사용하는 경우에는, 50 내지 100℃가 바람직하고, 60 내지 90℃가 보다 바람직하다. 또한, 중합 시간은 통상 5분간 내지 48시간, 바람직하게는 10분간 내지 24시간이다.
(공정 2)
공정 2는 관능기 함유 모노머에서 유래하는 관능기의 일부에, -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함하는 가교제를 부가 반응시켜서, 당해 가교제 유래의 특정 부분 구조를 도입하는 공정이다. 이에 의해, 상기 관능기의 잔기끼리가 특정 부분 구조를 통해서 가교된다.
공정 2에서 사용하는 가교제로서는, -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함하는 가교제로서 상기에서 예시한 것을 들 수 있고, -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함함과 함께, 리간드를 고정 가능한 관능기와 반응해서 가교 구조를 도입할 수 있는 것이 바람직하다.
고체상이 환상 에테르기를 갖는 경우에는, 구체적으로는, 가교성기로서 -C(=O)-NH-NH2로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함하는 가교제, -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함함과 함께, 가교성기로서 카르복시기를 분자 내에 적어도 2개 포함하는 가교제 등을 사용할 수 있다.
고체상이 카르복시기, -C(=O)-O-C(=O)-, 숙신산이미드옥시카르보닐기, 포르밀기를 갖는 경우에는, 구체적으로는, 가교성기로서 -C(=O)-NH-NH2로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함하는 가교제 등을 사용할 수 있다.
고체상이 이소시아네이트기를 갖는 경우에는, 구체적으로는, 가교성기로서 -C(=O)-NH-NH2로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함하는 가교제 등을 사용할 수 있다.
또한, 가교제는, 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
가교제의 합계 사용량은, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 관능기 함유 모노머에서 유래하는 관능기 1몰에 대하여, 바람직하게는 0.01 내지 0.8몰 당량이며, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.7몰 당량이며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 0.6몰 당량이며, 특히 바람직하게는 0.2 내지 0.5몰 당량이다. 본 발명에 따르면, 가교제의 합계 사용량이 0.2몰 당량 이상인 경우에도 우수한 방오성이 얻어진다.
부언하면, 공정 2는 염기성 촉매 존재 하에서 행해도 된다. 염기성 촉매로서는, 트리에틸아민, N,N-디메틸-4-아미노피리딘, 디이소프로필에틸아민 등을 들 수 있고, 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 공정 2의 반응 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.5 내지 72시간 정도이고, 바람직하게는 0.5 내지 48시간이다. 또한, 반응 온도는, 용매의 비점이하로 적절히 선택하면 되지만, 통상 2 내지 100℃ 정도이다.
또한, 상기 각 공정에서 얻어지는 반응 생성물을, 증류, 추출, 세정 등의 분리 수단으로 정제해도 된다.
그리고, 상기와 같이 해서 제조할 수 있는 본 발명의 크로마토그래피용 담체는, 친수성이 높고 우수한 방오성을 갖고, 또한 내압 성능 및 내파손 성능이 우수하다. 또한, 리간드를 고정한 경우의 표적 물질에 대한 동적 결합 용량이 크다. 또한, 모노머 조성에 따르지 않고 이러한 효과를 얻을 수 있고, 게다가 제조도 간편하다.
본 발명의 크로마토그래피용 담체는, 친화성 크로마토그래피용 담체로서 특히 유용하다.
<리간드 고정 담체>
본 발명의 리간드 고정 담체는, 본 발명의 크로마토그래피용 담체에, 리간드를 고정하여 이루어지는 것이다. 즉, 본 발명의 크로마토그래피용 담체를 지지체(고체상 담체)로 한 것이다. 지지체로 하는 담체로서는, 본 발명의 원하는 효과를 높이는 점에서, 특정 부분 구조와 리간드를 고정 가능한 관능기를 갖는 중합체를 포함하는 담체가 바람직하다.
상기 리간드는, 표적 물질과 결합하는 분자이면 되지만, 예를 들어 단백질 A, 단백질 G, 아비딘 등의 단백질; 인슐린 등의 펩티드; DNA, RNA 등의 핵산; 효소; 이미노디아세트산 등의 킬레이트 화합물; 항체; 항원; 호르몬; 헤파린, 루이스 X, 강글리오시드 등의 당질; 리셉터; 앱타머; 비오틴이나 그의 유도체 등의 비타민류; 금속 이온; 합성 색소 외에, 2-아미노페닐붕소산, 4-아미노벤즈아미딘, 글루타티온과 같은 저분자 화합물 등을 들 수 있다. 부언하면, 상기에 예시한 리간드는 그 전체를 사용해도 되지만, 리콤비넌트, 효소 처리 등에 의해 얻어지는 그의 프래그먼트를 사용해도 된다. 또한, 인공적으로 합성된 펩티드나 펩티드 유도체여도 된다.
상기 리간드 중에서도, 단백질, 펩티드, 핵산, 효소, 킬레이트 화합물이 바람직하고, 단백질, 펩티드가 보다 바람직하고, 단백질이 특히 바람직하다. 특히, 항체를 표적 물질로 하는 항체 어피니티 리간드 중에서는, 이뮤노글로불린 결합성 단백질이 바람직하다.
항체 어피니티 리간드로서는, 펩티드성 리간드, 단백질성 리간드, 화학 합성성 리간드(합성 화합물)를 들 수 있고, 바람직하게는 펩티드성 또는 단백질성 리간드이다. 그 중에서도, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 단백질 H, 단백질 D, 단백질 Arp, 단백질 FcγR, 항체 결합성 합성 펩티드 리간드, 이들의 유연 물질이 바람직하고, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 이들의 유연 물질이 보다 바람직하고, 단백질 A, 그의 유연 물질이 특히 바람직하다.
리간드의 고정량은, 동적 결합 용량의 점에서, 크로마토그래피용 담체의 건조 중량 1g당, 바람직하게는 10 내지 300㎎, 보다 바람직하게는 25 내지 150㎎이다. 리간드의 고정량은, 후술하는 실시예와 마찬가지 방법으로 측정하면 된다.
담체에 대한 리간드의 고정은 통상의 방법과 마찬가지로 하여 행하면 된다. 리간드 고정법으로서는, 예를 들어 리간드를 고정 가능한 관능기에 리간드를 결합시키는 방법을 들 수 있다. 이 방법은, 국제공개 제2015/119255호 팸플릿, 국제공개 제2015/041218호 팸플릿 등의 기재를 참고로 해서 행하면 된다. 구체적으로는, 담체의 환상 에테르기나 카르복시기, -C(=O)-O-C(=O)-, 포르밀기 등과 리간드의 아미노기 등을 결합시키는 방법을 들 수 있다.
또한, 리간드의 배향성을 제어하는 방법(미국특허 제6,399,750호, LjungquistC. 외 저술, rEur.J.Biochem.」, 1989년, 186권, 557-561페이지)이나, 링커(스페이서)를 통해서 리간드를 담체에 고정하는 방법(미국특허 제5,260,373호, 일본특허공개 제2010-133733호 공보, 일본특허공개 제2010-133734호 공보), 회합성기에 의해 리간드를 담체 상에 집적시키는 방법(일본특허공개 제2011-256176호 공보) 등을 이용해서 고정해도 된다.
부언하면, 리간드가 고정된 담체를, 메탄티올, 티오글리세롤 등의 티올 화합물과 접촉시켜서, 미반응의 관능기를 개환시키거나 해도 된다. 이 처리는, 국제공개 제2015/119255호 팸플릿 등의 기재를 참고로 해서 행하면 된다.
그리고, 본 발명의 리간드 고정 담체는, 우수한 방오성을 갖고, 또한 내압 성능 및 내파손 성능이 우수하며, 또한 표적 물질에 대한 동적 결합 용량이 크다.
본 발명의 리간드 고정 담체는, 크로마토그래피로의 사용에 적합하고, 친화성 크로마토그래피로의 사용에 특히 적합하다.
<크로마토그래피 칼럼>
본 발명의 크로마토그래피 칼럼은, 본 발명의 리간드 고정 담체가 칼럼 용기에 충전되어 있는 것이다.
본 발명의 크로마토그래피 칼럼은, 친화성 크로마토그래피로의 사용에 적합하다.
<표적 물질의 정제 방법>
본 발명의 표적 물질의 정제 방법은, 크로마토그래피에 의해 표적 물질을 정제하는 방법으로서, 본 발명의 리간드 고정 담체를 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 표적 물질의 정제 방법은, 본 발명의 리간드 고정 담체를 사용하는 것 이외에는 통상법에 따라 행하면 되지만, 본 발명의 리간드 고정 담체와, 표적 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다. 또한, 당해 공정에 의해 담체에 포착된 표적 물질을 용출시키는 용출 공정을 더 포함하고 있어도 된다. 용출 공정에는, 리간드와 표적 물질을 해리시키는 해리액이 통상 사용된다.
또한, 정제는 본 발명의 크로마토그래피 칼럼을 사용해서 행해도 된다. 이러한 방법으로서는, 본 발명의 크로마토그래피 칼럼에 표적 물질을 포함하는 시료를 통액하는 공정을 포함하는 방법을 들 수 있고, 상기와 마찬가지로 용출 공정을 더 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 표적 물질로서는, 예를 들어 항원; 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 등의 항체; 세포(정상 세포; 대장암 세포, 혈중 순환 암세포 등의 암 세포); DNA, RNA 등의 핵산; 단백질, 펩티드, 아미노산, 당, 다당, 지질, 비타민 등의 생체 관련 물질을 들 수 있고, 창약 타깃이 되는 약물, 비오틴 등의 저분자 화합물이어도 된다.
실시예
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
(1) 448g의 순수에 폴리비닐알코올(쿠라레사제 PVA-217) 2.69g을 첨가하고, 가열 교반해서 폴리비닐알코올을 용해시켜서, 냉각한 후, 도데실황산나트륨(와코 쥰야꾸 고교제) 0.045g을 첨가하고, 교반해서 수용액 S를 제조했다.
한편, 디비닐벤젠(와코 쥰야꾸 고교제) 3.63g, 1-에틸-4-비닐벤젠(ChemSampCo사제) 0.36g 및 글리시딜메타크릴레이트(미쯔비시 가스 가가꾸사제) 14.15g으로 이루어지는 단량체 조성물을, 2-옥타논(도요 고세이사제) 29.38g에 용해시켜서, 단량체 용액을 제조했다.
이어서, 상기 수용액 S를, 세퍼러블 플라스크 내에 전량 투입하고, 온도계, 교반 날개 및 냉각관을 장착하여, 온수 배스에 세트하고, 질소 분위기 하에서 교반을 개시했다. 세퍼러블 플라스크 내에 상기 단량체 용액을 전량 투입하여, 온수 배스에 의해 가온하고 내온이 85℃에 도달한 시점에서 2,2'-아조이소부티로니트릴(와코 쥰야꾸 고교사제) 1.34g을 첨가하고, 내온을 86℃로 했다.
(2) 그 후, 86℃로 온도를 유지한 채, 3시간 교반을 행하였다. 이어서, 반응액을 냉각한 후, 이러한 반응액을 여과하고, 순수와 에탄올로 세정했다. 세정한 입자를 순수에 분산시켜서 데칸테이션을 3회 행하고, 소 입자를 제외했다. 이어서, 입자의 농도가 10질량%가 되도록 입자를 순수에 분산시키고, 다공질 입자 분산액을 얻었다. 이 분산액에 포함되는 다공질 입자를, 「다공질 담체 1」이라고 칭한다.
(3) 그 후, 다공질 입자 분산액 100g에 아디프산디히드라지드(도꾜 가세이 고교 가부시키가이샤제) 0.956g 및 디이소프로필에틸아민 1.418g을 추가하고, 70℃까지 가온하고, 70℃를 유지한 채, 8시간 교반을 행하였다. 이어서, 반응액을 냉각한 후, 이러한 반응액을 여과하고, 순수와 에탄올로 세정했다. 이어서, 입자의 농도가 10질량%가 되도록 입자를 순수에 분산시키고, 다공질 가교 입자 분산액을 얻었다. 이 분산액에 포함되는 다공질 가교 입자를, 「크로마토그래피용 담체 V1」이라고 칭한다.
(4) 이어서, 개변 단백질 A(Repligen제 rSPA) 0.15g을, 1.2M 황산나트륨/0.1M 인산나트륨 버퍼(pH6.6) 40mL에 용해시켜 단백질 A 용해액을 얻고, 이 단백질 A 용해액에 다공질 가교 입자 분산액(입자 건조 질량 환산으로 1g 상당)을 첨가했다. 이 분산액을 25℃에서 10시간 진탕 교반하고, 단백질 A를 입자에 고정했다.
이어서, 생성한 단백질 A 고정 입자를, 1.0M α-티오글리세롤(도꾜 가세이 고교 가부시키가이샤제)/0.1M 황산나트륨(pH8.3) 40mL에 분산시키고, 25℃에서 17시간 진탕 교반함으로써, 미반응의 에폭시기를 개환시켰다. 또한, 얻어진 미반응의 에폭시기가 개환한 단백질 A 고정 입자를, 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH6.6), 0.1M 수산화나트륨 수용액, 0.1M 시트르산나트륨 버퍼(pH3.2)로 세정하고, 친화성 크로마토그래피용 충전제 함유액을 얻었다. 이 액에 포함되는 충전제를, 「리간드 고정 담체 W1」이라고 칭한다.
(실시예 2)
실시예 1의 공정 (3)에 있어서, 아디프산디히드라지드의 사용량을 2.390g으로, 디이소프로필에틸아민의 사용량을 3.546g으로 각각 변경한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 (1) 내지 (3)과 마찬가지 조작을 행하여, 다공질 가교 입자 분산액을 얻었다. 이 분산액에 포함되는 다공질 가교 입자를, 「크로마토그래피용 담체 V2」라고 칭한다.
이어서, 실시예 1의 공정 (4)와 마찬가지 공정을 실시함으로써, 친화성 크로마토그래피용 충전제 함유액을 얻었다. 이 액에 포함되는 충전제를, 「리간드 고정 담체 W2」라고 칭한다.
(실시예 3)
실시예 1의 공정 (3)에 있어서, 아디프산디히드라지드의 사용량을 3.823g으로, 디이소프로필에틸아민의 사용량을 5.673g으로 각각 변경한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 (1) 내지 (3)과 마찬가지 조작을 행하여, 다공질 가교 입자 분산액을 얻었다. 이 분산액에 포함되는 다공질 가교 입자를, 「크로마토그래피용 담체 V3」이라고 칭한다.
이어서, 실시예 1의 공정 (4)와 마찬가지 공정을 실시함으로써, 친화성 크로마토그래피용 충전제 함유액을 얻었다. 이 액에 포함되는 충전제를, 「리간드 고정 담체 W3」이라고 칭한다.
(실시예 4)
실시예 1의 공정 (3)에 있어서, 아디프산디히드라지드를 숙신산디히드라지드(도꾜 가세이 고교 가부시키가이샤제) 0.802g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 (1) 내지 (3)과 마찬가지 조작을 행하여, 다공질 가교 입자 분산액을 얻었다. 이 분산액에 포함되는 다공질 가교 입자를, 「크로마토그래피용 담체 V4」라고 칭한다.
이어서, 실시예 1의 공정 (4)와 마찬가지 공정을 실시함으로써, 친화성 크로마토그래피용 충전제 함유액을 얻었다. 이 액에 포함되는 충전제를, 「리간드 고정 담체 W4」라고 칭한다.
(실시예 5)
실시예 1의 공정 (3)에 있어서, 아디프산디히드라지드를 세바스산디히드라지드(도꾜 가세이 고교 가부시키가이샤제) 1.264g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 (1) 내지 (3)과 마찬가지 조작을 행하여, 다공질 가교 입자 분산액을 얻었다. 이 분산액에 포함되는 다공질 가교 입자를, 「크로마토그래피용 담체 V5」라고 칭한다.
이어서, 실시예 1의 공정 (4)와 마찬가지 공정을 실시함으로써, 친화성 크로마토그래피용 충전제 함유액을 얻었다. 이 액에 포함되는 충전제를, 「리간드 고정 담체 W5」라고 칭한다.
(실시예 6)
실시예 1의 공정 (3)에 있어서, 아디프산디히드라지드를, 하기 식으로 나타나는 N1,N1-(에탄-1,2-디일)비스(숙신산모노아미드) 1.428g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 (1) 내지 (3)과 마찬가지 조작을 행하여, 다공질 가교 입자 분산액을 얻었다(또한, N1,N1-(에탄-1,2-디일)비스(숙신산모노아미드)는, 숙신산무수물과 에틸렌디아민으로부터 합성했다). 이 분산액에 포함되는 다공질 가교 입자를, 「크로마토그래피용 담체 V6」이라고 칭한다.
이어서, 실시예 1의 공정 (4)와 마찬가지 공정을 실시함으로써, 친화성 크로마토그래피용 충전제 함유액을 얻었다. 이 액에 포함되는 충전제를, 「리간드 고정 담체 W6」이라고 칭한다.
Figure pct00015
(비교예 1)
실시예 1의 공정 (1) 내지 (2)과 마찬가지 조작을 행하고, 「다공질 담체 1」을 얻었다. 이 담체를, 「크로마토그래피용 담체 X1」이라고 칭한다.
이어서, 실시예 1의 공정 (4)와 마찬가지 공정을 실시함으로써, 친화성 크로마토그래피용 충전제 함유액을 얻었다. 이 액에 포함되는 충전제를, 「리간드 고정 담체 Y1」이라고 칭한다.
(비교예 2)
실시예 1의 공정 (3)에 있어서, 아디프산디히드라지드를 3,6-디옥사-1,8-옥탄디티올(도꾜 가세이 고교 가부시키가이샤제) 1.000g으로 변경한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 (1) 내지 (3)과 마찬가지 조작을 행하여, 다공질 가교 입자 분산액을 얻었다. 이 분산액에 포함되는 다공질 가교 입자를, 「크로마토그래피용 담체 X2」라고 칭한다.
이어서, 실시예 1의 공정 (4)와 마찬가지 공정을 실시함으로써, 친화성 크로마토그래피용 충전제 함유액을 얻었다. 이 액에 포함되는 충전제를, 「리간드 고정 담체 Y2」라고 칭한다.
시험예 1(압밀 선 유속의 측정)
각 실시예 및 비교예에서 얻어진 담체 V1 내지 V3, X1 내지 X2를 내경 16㎜, 충전 높이 100㎜가 되도록 칼럼 용기에 충전하고, 이 칼럼을 GE 헬스케어 바이오사이언스사제 AKTA pilot에 접속했다. 이어서, 선 유속 100㎝/hr로 순수의 통액을 개시하여, 선 유속을 100㎝/hr씩 1분간마다 단계적으로 높여 가서, 2.0㎫에 도달했을 때의 선 유속을 압밀 선 유속으로서 기록했다. 그리고, 압밀 선 유속에 대해서 이하의 기준으로 평가했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
(압밀 선 유속의 평가 기준)
AAA: 압밀 선 유속이 3500㎝/hr 이상
AA: 압밀 선 유속이 3100㎝/hr 이상 3500㎝/hr 미만
A: 압밀 선 유속이 2900㎝/hr 이상 3100㎝/hr 미만
B: 압밀 선 유속이 2900㎝/hr 미만
시험예 2(내파손 성능의 평가)
각 실시예 및 비교예에서 얻어진 담체 V1 내지 V3, X1 내지 X2를, 고형분 농도 10질량%가 되도록 순수에 더하여, 정량 제어 다이어프램 펌프(다쿠미나사제)를 사용해서 6L/min의 토출 속도로 60회의 순환 처리를 행하였다.
그 후, 순환 처리 후의 담체를, 고형분 농도가 2.5질량% 정도가 되도록 순수로 희석하고, 시스멕스사제 플로우식 입자상 분석 장치(형번 FPIA-3000)를 사용해서 토탈 카운트 500개로 세트해서 각 입자의 원형도(=(입자 투영 면적과 동일한 면적의 원의 주위 길이/입자 투영상의 주위 길이)×100)를 측정했다.
이어서, 전체 측정 대상 입자 중 원형도 0.95 이상인 입자의 개수를 전체 측정 입자수로 제산함으로써 원형도 0.95 이상인 입자 분포(=원형도 0.95 이상인 입자수/측정 입자수×100)를 산출하여, 이하의 기준으로 평가했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
(내파손 성능의 평가 기준)
AA: 원형도 0.95 이상인 입자 분포가 93% 이상
A: 원형도 0.95 이상인 입자 분포가 89% 이상 93% 미만
B: 원형도 0.95 이상인 입자 분포가 89% 미만
Figure pct00016
시험예 3(단백질 A 결합량의 정량)
각 실시예 및 비교예에서 얻어진 담체 W1 내지 W3, Y1 내지 Y2에 결합한 단백질 A의 결합량을, 비신코닌산(BCA) 시약을 사용해서 정량했다.
구체적으로는, 고형분 환산으로 1㎎의 담체 W1 내지 W3, Y1 내지 Y2와, 참조값을 측정하기 위해서 단백질 A를 결합하기 전의 담체 V1 내지 V3, X1 내지 X2를 테스트 튜브에 각각 채취하고, ThermoFisher Scientific사의 BCA Protein Assay액에 침투시켜서, 37℃에서 30분간, 전도 혼화했다.
그 후, 각 반응액의 흡광도(파장:570㎚)과 검량선(담체에 결합시킨 단백질 A와 동일)의 흡광도로부터 결합량을 산출했다. 표 2에 나타내는 결합량은 참조값을 차감한 값이다.
시험예 4(친수성의 평가)
각 실시예 및 비교예의 담체 W1 내지 W3, Y1 내지 Y2의 친수성을 평가했다.
즉, GE 헬스케어사제 AKTAprime plus를 사용하여, 20mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨 수용액(pH7.5)을 선 유속 300㎝/hr로 통액함으로써, 각각의 담체를 용량 4mL(5㎜φ×200㎜길이)의 칼럼에 충전 높이 약 20㎝로 패킹했다.
그 후, 1체적% 아세톤/1M 나트륨 수용액(100μL)을 칼럼에 주입하고, 이어서 20mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨 수용액(pH7.5)을 선 유속 300㎝/hr로 통액함으로써, 아세톤의 유지 시간(RT(아세톤))을 UV 검출기에서 측정했다. 이어서, 1체적% 시클로헥사논/1M 나트륨 수용액(100μL)을 사용하여, 마찬가지로 시클로헥사논의 유지 시간(RT(시클로헥사논))을 측정한 후, RT(시클로헥사논)/RT(아세톤)의 값(CHN/ACN)을 산출하고, 친수성을 이하의 기준으로 평가했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 부언하면, CHN/ACN이 작을수록 친수성이 높다고 할 수 있다.
(친수성의 평가 기준)
AA: CHN/ACN이 1.060 이하
A: CHN/ACN이 1.060 초과 1.078 이하
B: CHN/ACN이 1.078 초과
시험예 5(DBC의 측정)
GE 헬스케어사제 AKTAprime plus를 사용하여, 선 유속 300㎝/hr에 있어서의 단백질(인간 IgG 항체, Equitech Bio사제 HGG-1000)에 대한 각 실시예 및 비교예의 담체 W1 내지 W3, Y1 내지 Y2의 DBC를 측정했다. 칼럼 용기는 용량 4mL(5㎜φ×200㎜길이)의 것을, 단백질은 20mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨 수용액(pH7.5)에 단백질을 5㎎/mL 용해한 것을 각각 사용하고, 용출 선단 10% 브레이크 스루 시의 단백질 포착량과 칼럼 충전 체적으로부터 DBC를 구했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
시험예 6(HCP의 측정)
칼럼 용기(GE 헬스케어사제 Tricorn 10/50 column)에, 각 실시예 및 비교예의 담체 W1 내지 W3, Y1 내지 Y2를, 충전 높이 약 5㎝로 충전해서 칼럼을 제작했다. 얻어진 칼럼을 GE 헬스케어사제 AKTA Prime Plus에 각각 접속하고, 20mM 인산나트륨 버퍼(pH7.5)를 5칼럼 용량(칼럼 용적의 5배), 유속 1mL/분으로 통액하고, 평형화시켰다.
이어서, 모노클로날 항체 트라스투주맙(Trastuzumab)을 함유하는 CHO 세포 배양 상청을, 약 23㎎ 항체/mL 담체의 부하량으로, 유속 1mL/분으로 칼럼에 통액했다.
이어서, 20mM 인산나트륨 버퍼(pH7.5), 20mM 인산나트륨/1M 염화나트륨 버퍼(pH7.5) 및 20mM 인산나트륨 버퍼(pH7.5)를, 각각 5칼럼 용량, 유속 1mL/분으로 칼럼에 순차 통액했다.
그 후, 50mM 시트르산나트륨 버퍼(pH3.2)를, 유속 1mL/분으로 칼럼에 통액하고, 칼럼 내에 포착되어 있던 모노클로날 항체를 용출시켜서, Abs.280＞100mAu의 용출 프랙션을 회수했다.
그리고, 분광 광도계를 사용하여, 회수한 프랙션 중에 함유되는 항체 농도(㎎/mL)를 측정했다. 또한, Cygnus Technologies사제 CHO HCP ELISA kit, 3G를 사용하여, 회수한 프랙션 중에 함유되는 숙주 세포 단백질(Host Cell Protein(HCP))의 농도(ng/mL)를 측정했다. 또한 HCP의 농도를 항체 농도로 제산함으로써, 단위 항체량당 HCP양을 산출하고, 이하의 기준으로 평가했다. 결과를 표 2에 나타낸다.
(HCP의 평가 기준)
A: HCP가 3300ppm 이하
B: HCP가 3300ppm 초과
Figure pct00017

Claims (15)

  1. -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 적어도 2개 포함하는 부분 구조를 갖는 중합체를 포함하는, 크로마토그래피용 담체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 부분 구조가, 하기 식 (1)로 표시되는 2가 이상의 가교 구조인, 담체.
    Figure pct00018

    [식 (1) 중,
    R1은 n가의 유기기를 나타내고,
    X1은 -C(=O)-NH-를 나타내고,
    X2는 단결합 또는 2가의 연결기를 나타내고,
    n은 2 이상의 정수를 나타내고,
    *은 결합손을 나타낸다.
    단, n이 2인 경우, R1은 단결합이어도 된다.]
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 부분 구조가, 하기 식 (1-2)로 표시되는 가교 구조인, 담체.
    Figure pct00019

    [식 (1-2) 중,
    R2는 단결합 또는 2가의 유기기를 나타내고,
    X1a 및 X1b는 -C(=O)-NH-를 나타내고,
    X2a 및 X2b는 각각 독립적으로, 단결합 또는 2가의 연결기를 나타내고,
    *은 결합손을 나타낸다.]
  4. 제3항에 있어서, R2가 탄소수 1 내지 40의 2가의 탄화수소기, 또는 탄소수 2 내지 40의 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기인, 담체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, R2가 탄소수 1 내지 40의 알칸디일기, 또는 탄소수 2 내지 40의 알칸디일기의 탄소-탄소 원자간에 에테르 결합, 아미드 결합 및 에스테르 결합에서 선택되는 1종 이상을 갖는 기인, 담체.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, X2a 및 X2b가 각각 독립적으로, 단결합, -NH-, 또는 -R4-C(=O)O-(R4는, 2가의 유기기를 나타낸다)인, 담체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 입자상의 담체인, 담체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 다공질 담체인, 담체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체가, 리간드를 고정 가능한 관능기를 더 갖는, 담체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 담체에 리간드를 고정해서 이루어지는, 리간드 고정 담체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 리간드가 단백질 또는 펩티드인, 리간드 고정 담체.
  12. 제10항 또는 제11항에 기재된 리간드 고정 담체가 칼럼 용기에 충전되어 있는, 크로마토그래피 칼럼.
  13. 크로마토그래피에 의해 표적 물질을 정제하는 방법으로서, 제10항 또는 제11항에 기재된 리간드 고정 담체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 표적 물질의 정제 방법.
  14. 크로마토그래피에 의해 표적 물질을 정제하는 방법으로서, 제10항 또는 제11항에 기재된 리간드 고정 담체와, 표적 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 공정을 포함하는, 표적 물질의 정제 방법.
  15. 환상 에테르기, 카르복시기, -C(=O)-O-C(=O)-, 숙신산이미드옥시카르보닐기, 포르밀기 및 이소시아네이트기로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 관능기를 갖는 고체상과, -C(=O)-NH-로 나타나는 기를 분자 내에 적어도 2개 포함하는 가교제를 접촉시키는 공정을 포함하는, 크로마토그래피용 담체의 제조 방법.
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