JP2019070528A - 多孔質担体、アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体、標的物の精製方法、及び抗体 - Google Patents
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Abstract
【課題】硬さと靱性とのバランスに優れた多孔質担体を提供すること。【解決手段】（成分Ａ）ポリビニルモノマーに由来するモノマー単位と、（成分Ｂ）炭素数１〜８のアルキル基を側鎖に有するモノマー単位と、を有するポリマーを含み、前記ポリマー中における成分Ａと成分Ｂとの含有割合〔（Ａ）：（Ｂ）〕が、質量比で９５：５〜５０：５０であり、成分Ａの含有量が、前記ポリマー中の全モノマー単位に対して、０．５〜４０質量％であることを特徴とする、多孔質担体。【選択図】なし
Description
本発明は、多孔質担体、アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体、標的物の精製方法、及び抗体に関する。
アフィニティクロマトグラフィーは、モノクローナル抗体を含めたタンパク質の研究、開発および製造において重要な役割を担っている。アフィニティクロマトグラフィーは、固相担体上のリガンドが標的物に対して高い選択性を有するため、イオンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィーなどの他のクロマトグラフィーに比べて、優れた収率で且つ高速で経済的な精製が可能となる。また、抗体医薬品の主成分であるモノクローナル抗体は、主に哺乳類培養細胞等を用いて組換え蛋白質として培養液中に発現し、数段のクロマトグラフィーや膜工程により高純度に精製された後に製剤化される。近年の抗体医薬の生産量の増大とともに、高流速での処理に耐えうる多孔質担体が求められている。
また、この培養、精製、製剤化の工程で形成又は残留する凝集体（２量体以上の多量体）が副作用の主要原因となるため、その低減が抗体医薬品生産の重要課題となっている。凝集体の生成抑制やその除去は、培養、精製、製剤化の工程で、複雑な管理手法や添加剤の使用により制御する試みがなされてきた。特に精製工程では、凝集体の生成を抑制する他にその除去が重要である。よって、精製工程では、簡便で効率的な凝集体除去技術の開発が求められてきている（特許文献１〜５）。
抗体の精製においては高流速での処理が必要となり、高流速下で潰れない耐圧性に優れた多孔質粒子が必要となる。単に硬質な多孔質担体を使用した場合、一定の流速までは圧潰しないが、一定の流速を超えると急に圧潰してしまうか塑性変形してしまいクロマトグラフィー担体として再利用ができないという問題がある。
本発明が解決しようとする課題は、硬さと靱性とのバランスに優れた多孔質担体を提供することにある。
本発明が解決しようとする課題は、硬さと靱性とのバランスに優れた多孔質担体を提供することにある。
また、上述の通り、抗体医薬の製造にあたっては凝集体を除去したいという要望がある。
本発明が解決しようとするもう１つの課題は、硬さと靱性とのバランスに優れ、さらに優れた凝集体の除去効率が得られる多孔質担体やクロマトグラフィー用多孔質担体、精製方法を提供することにある。
本発明が解決しようとするもう１つの課題は、硬さと靱性とのバランスに優れ、さらに優れた凝集体の除去効率が得られる多孔質担体やクロマトグラフィー用多孔質担体、精製方法を提供することにある。
本発明が解決しようとする課題は、下記の手段により解決された。
〔１〕 （成分Ａ）ポリビニルモノマーに由来するモノマー単位と、（成分Ｂ）炭素数１〜８のアルキル基を側鎖に有するモノマー単位と、を有するポリマーを含み、前記ポリマー中における成分Ａと成分Ｂとの含有割合〔（Ａ）：（Ｂ）〕が、質量比で９５：５〜５０：５０であり、成分Ａの含有量が、前記ポリマー中の全モノマー単位に対して、０．５〜４０質量％であることを特徴とする、多孔質担体。
〔２〕 成分Ａが、芳香族系多官能モノマーに由来するモノマー単位及び多官能（メタ）アクリレート類に由来するモノマー単位から選ばれる１種以上である、上記〔１〕に記載の多孔質担体。
〔３〕 成分Ａが、ジビニルベンゼンに由来するモノマー単位、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位、及びエチレングリコールジ（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位から選ばれる１種以上である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の多孔質担体。
〔３〕 成分Ａが、ジビニルベンゼンに由来するモノマー単位、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位、及びエチレングリコールジ（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位から選ばれる１種以上である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の多孔質担体。
〔４〕 成分Ｂが、モノビニルモノマーに由来するモノマー単位である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の多孔質担体。
〔５〕 成分Ｂが、炭素数１〜８のアルキル基を有する芳香族系モノマーに由来するモノマー単位及び炭素数１〜８のアルキル基を有するアルキル（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位から選ばれる１種以上である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の多孔質担体。
〔６〕 前記アルキル基が２価の連結基を介して前記ポリマーの主鎖に結合している、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の多孔質担体。
〔７〕 前記アルキル基の炭素数が２〜８である、上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の多孔質担体。
〔８〕 成分Ｂが、アルキルビニルベンゼンに由来するモノマー単位である、上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の多孔質担体。
〔５〕 成分Ｂが、炭素数１〜８のアルキル基を有する芳香族系モノマーに由来するモノマー単位及び炭素数１〜８のアルキル基を有するアルキル（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位から選ばれる１種以上である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の多孔質担体。
〔６〕 前記アルキル基が２価の連結基を介して前記ポリマーの主鎖に結合している、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の多孔質担体。
〔７〕 前記アルキル基の炭素数が２〜８である、上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の多孔質担体。
〔８〕 成分Ｂが、アルキルビニルベンゼンに由来するモノマー単位である、上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の多孔質担体。
〔９〕 前記ポリマーが、さらに（成分Ｃ）成分Ａ及び成分Ｂを除く単官能モノマーに由来するモノマー単位を含む、上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の多孔質担体。
〔１０〕 成分Ｃの含有量が、前記ポリマー中の全モノマー単位に対して、２０〜９９．５質量％である、上記〔９〕に記載の多孔質担体。
〔１１〕 成分Ｃが、グリシジル（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位、グリセロールモノ（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテルに由来するモノマー単位、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位、ビニルベンジルグリシジルエーテルに由来するモノマー単位、及びスチレンに由来するモノマー単位から選ばれる１種以上である、上記〔９〕又は〔１０〕に記載の多孔質担体。
〔１２〕 粒子状、モノリス状、板状、繊維状又は膜状である、上記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の多孔質担体。
〔１０〕 成分Ｃの含有量が、前記ポリマー中の全モノマー単位に対して、２０〜９９．５質量％である、上記〔９〕に記載の多孔質担体。
〔１１〕 成分Ｃが、グリシジル（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位、グリセロールモノ（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテルに由来するモノマー単位、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位、ビニルベンジルグリシジルエーテルに由来するモノマー単位、及びスチレンに由来するモノマー単位から選ばれる１種以上である、上記〔９〕又は〔１０〕に記載の多孔質担体。
〔１２〕 粒子状、モノリス状、板状、繊維状又は膜状である、上記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の多孔質担体。
〔１３〕 上記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の多孔質担体にアフィニティリガンドを結合させたことを特徴とする、アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体。
〔１４〕 上記〔１３〕に記載のクロマトグラフィー用多孔質担体を用いる、標的物の精製方法。
〔１５〕 上記〔１３〕に記載のクロマトグラフィー用多孔質担体と、アフィニティリガンドが捕捉しうる標的物とを接触させる工程Ａと、前記リガンドと前記標的物とを解離させる解離液と、前記工程Ａで標的物を捕捉した担体とを接触させて標的物を解離させる工程Ｂと、を含む、標的物の精製方法。
〔１６〕 前記工程Ｂが、アフィニティリガンドから標的物が解離する条件下で、イオン強度が段階的に高くなる塩濃度を２種類以上使用するステップワイズ方式、又は勾配的に塩濃度を高くするグラジェント方式により解離する工程である、上記〔１５〕に記載の精製方法。
〔１７〕 上記〔１４〕〜〔１６〕のいずれかに記載の精製方法により精製された、抗体。
〔１５〕 上記〔１３〕に記載のクロマトグラフィー用多孔質担体と、アフィニティリガンドが捕捉しうる標的物とを接触させる工程Ａと、前記リガンドと前記標的物とを解離させる解離液と、前記工程Ａで標的物を捕捉した担体とを接触させて標的物を解離させる工程Ｂと、を含む、標的物の精製方法。
〔１６〕 前記工程Ｂが、アフィニティリガンドから標的物が解離する条件下で、イオン強度が段階的に高くなる塩濃度を２種類以上使用するステップワイズ方式、又は勾配的に塩濃度を高くするグラジェント方式により解離する工程である、上記〔１５〕に記載の精製方法。
〔１７〕 上記〔１４〕〜〔１６〕のいずれかに記載の精製方法により精製された、抗体。
本発明により、硬さと靱性とのバランスに優れた多孔質担体を提供することができた。また、本発明により、硬さと靱性とのバランスに優れ、さらに優れた凝集体の除去効率が得られる多孔質担体やクロマトグラフィー用多孔質担体、精製方法を提供することができた。
＜多孔質担体＞
本発明の多孔質担体は、（成分Ａ）ポリビニルモノマーに由来するモノマー単位と、（成分Ｂ）炭素数１〜８のアルキル基を側鎖に有するモノマー単位と、を有するポリマーを含み、前記ポリマー中における成分Ａと成分Ｂとの含有割合〔（Ａ）：（Ｂ）〕が、質量比で９５：５〜５０：５０であり、成分Ａの含有量が、前記ポリマー中の全モノマー単位に対して、０．５〜４０質量％であることを特徴とする。以下、まずは本発明の多孔質担体について説明し、その後に本発明の標的物の精製方法（以下、本発明の精製方法ともいう。）について説明する。なお、本明細書において、数値範囲を表すａ〜ｂ等の記載は、ａ以上、ｂ以下と同義であり、ａ及びｂを数値範囲内に含む。
本発明の多孔質担体は、（成分Ａ）ポリビニルモノマーに由来するモノマー単位と、（成分Ｂ）炭素数１〜８のアルキル基を側鎖に有するモノマー単位と、を有するポリマーを含み、前記ポリマー中における成分Ａと成分Ｂとの含有割合〔（Ａ）：（Ｂ）〕が、質量比で９５：５〜５０：５０であり、成分Ａの含有量が、前記ポリマー中の全モノマー単位に対して、０．５〜４０質量％であることを特徴とする。以下、まずは本発明の多孔質担体について説明し、その後に本発明の標的物の精製方法（以下、本発明の精製方法ともいう。）について説明する。なお、本明細書において、数値範囲を表すａ〜ｂ等の記載は、ａ以上、ｂ以下と同義であり、ａ及びｂを数値範囲内に含む。
本発明の多孔質担体を構成するポリマーは、水に不溶性のものが好ましい。また、合成高分子が好ましい。
また、上記ポリマーを誘導する各モノマーとしては、スチレン類等の芳香族系モノマー；ビニルアルコール類；（メタ）アクリレート類；（メタ）アクリルアミド類；エチレン類；無水マレイン酸等が挙げられる（以下、これらをモノマー群αと総称する）。また、ポリマーは、これらモノマーに由来するモノマー単位のうち１種を含んでいても２種以上を含んでいてもよく、また、本発明の多孔質担体は、このようなポリマーを１種含んでいても２種以上含んでいてもよい。
これらモノマーの中でも、耐圧性の観点から、芳香族系モノマー、ビニルアルコール類、（メタ）アクリレート類及び（メタ）アクリルアミド類から選ばれる１種以上のモノマーが好ましく、芳香族系モノマー及び（メタ）アクリレート類から選ばれる１種以上のモノマーがより好ましい。
また、多孔質担体は上記ポリマーを主成分とするものが好ましく、ポリマーの含有量は、多孔質担体全量に対して、好ましくは７０〜１００質量％、より好ましくは９０〜１００質量％である。
また、上記ポリマーを誘導する各モノマーとしては、スチレン類等の芳香族系モノマー；ビニルアルコール類；（メタ）アクリレート類；（メタ）アクリルアミド類；エチレン類；無水マレイン酸等が挙げられる（以下、これらをモノマー群αと総称する）。また、ポリマーは、これらモノマーに由来するモノマー単位のうち１種を含んでいても２種以上を含んでいてもよく、また、本発明の多孔質担体は、このようなポリマーを１種含んでいても２種以上含んでいてもよい。
これらモノマーの中でも、耐圧性の観点から、芳香族系モノマー、ビニルアルコール類、（メタ）アクリレート類及び（メタ）アクリルアミド類から選ばれる１種以上のモノマーが好ましく、芳香族系モノマー及び（メタ）アクリレート類から選ばれる１種以上のモノマーがより好ましい。
また、多孔質担体は上記ポリマーを主成分とするものが好ましく、ポリマーの含有量は、多孔質担体全量に対して、好ましくは７０〜１００質量％、より好ましくは９０〜１００質量％である。
（成分Ａ）ポリビニルモノマーに由来するモノマー単位
ポリビニルモノマーは、１分子中に、２個以上の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）を有するビニルモノマーである。ポリビニルモノマーは、上記モノマー群αに該当するモノマーのうち２個以上の重合性ビニル基を１分子中に有するものであればよいが、芳香族系多官能モノマー、多官能（メタ）アクリレート類及び多官能（メタ）アクリルアミド類から選ばれる１種以上のモノマーが好ましく、芳香族系多官能モノマー及び多官能（メタ）アクリレート類から選ばれる１種以上のモノマーがより好ましい。
以下、当該ポリビニルモノマーを、ヒドロキシ基非含有ポリビニルモノマーと、ヒドロキシ基含有ポリビニルモノマーとに分けて説明する。なお、ポリビニルモノマーは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
ポリビニルモノマーは、１分子中に、２個以上の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）を有するビニルモノマーである。ポリビニルモノマーは、上記モノマー群αに該当するモノマーのうち２個以上の重合性ビニル基を１分子中に有するものであればよいが、芳香族系多官能モノマー、多官能（メタ）アクリレート類及び多官能（メタ）アクリルアミド類から選ばれる１種以上のモノマーが好ましく、芳香族系多官能モノマー及び多官能（メタ）アクリレート類から選ばれる１種以上のモノマーがより好ましい。
以下、当該ポリビニルモノマーを、ヒドロキシ基非含有ポリビニルモノマーと、ヒドロキシ基含有ポリビニルモノマーとに分けて説明する。なお、ポリビニルモノマーは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
ヒドロキシ基非含有ポリビニルモノマーとしては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレートなどの多官能（メタ）アクリレート類；ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレンなどの芳香族系多官能モノマー；ブタジエン、イソシアヌル酸ジアリル、イソシアヌル酸トリアリルなどのアリル化合物などが挙げられ、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
これらの中でも、ヒドロキシ基非含有ポリビニルモノマーとしては、多官能（メタ）アクリレート類、芳香族系多官能モノマーが好ましい。また、多官能（メタ）アクリレート類としては、多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類が好ましい。
また、上記ヒドロキシ基非含有ポリビニルモノマーに含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子中に、２〜５個が好ましく、２又は３個がより好ましい。
これらの中でも、ヒドロキシ基非含有ポリビニルモノマーとしては、多官能（メタ）アクリレート類、芳香族系多官能モノマーが好ましい。また、多官能（メタ）アクリレート類としては、多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類が好ましい。
また、上記ヒドロキシ基非含有ポリビニルモノマーに含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子中に、２〜５個が好ましく、２又は３個がより好ましい。
ヒドロキシ基含有ポリビニルモノマーとしては、多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類、各種糖類の２置換以上の（メタ）アクリル酸エステル類、多価アルコールの（メタ）アクリルアミド類が好ましい。
多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類としては、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステル類としては、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
各種糖類の２置換以上の（メタ）アクリル酸エステル類としては、例えば、グルコースジ（メタ）アクリレート、グルコーストリ（メタ）アクリレート、グルコーステトラ（メタ）アクリレート、マンニトールジ（メタ）アクリレート、マンニトールトリ（メタ）アクリレート、マンニトールテトラ（メタ）アクリレート、マンニトールペンタ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
さらに、ヒドロキシ基含有ポリビニルモノマーとしては、上記例示したものの他に、ジアミノプロパノール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グルコサミンなどのアミノアルコールと（メタ）アクリル酸との脱水縮合反応物なども挙げることができる。
また、上記ヒドロキシ基含有ポリビニルモノマーに含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子中に、２〜５個が好ましく、２又は３個がより好ましく、２個が特に好ましい。
さらに、ヒドロキシ基含有ポリビニルモノマーとしては、上記例示したものの他に、ジアミノプロパノール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グルコサミンなどのアミノアルコールと（メタ）アクリル酸との脱水縮合反応物なども挙げることができる。
また、上記ヒドロキシ基含有ポリビニルモノマーに含まれる重合性ビニル基の個数としては、１分子中に、２〜５個が好ましく、２又は３個がより好ましく、２個が特に好ましい。
これらの中でも、ポリビニルモノマーとしては、比較的少量の使用で良好な多孔性と機械的強度が得られ、エポキシ基含有モノビニルモノマーの使用量を制限することが少ないなどの観点から、ヒドロキシ基非含有ポリビニルモノマーが好ましく、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼンがより好ましく、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼンが特に好ましい。
成分Ａの含有量は、ポリマー中の全モノマー単位に対して、０．５〜４０質量％である。ポリビニルモノマーに由来するモノマー単位の含有量が０．５質量％未満であると、固相担体の機械的強度が低くなるか、多孔質粒子の形成が困難になる。また、４０質量％を超えると、親水性が低下して、ＨＣＰの低減効果が得られず、また、アフィニティリガンドの活性が低下することがある。
成分Ａの含有量は、ポリマー中の全モノマー単位に対して、好ましくは１質量％以上、より好ましくは５質量％以上、特に好ましくは１０質量％以上であり、また、ポリマー中の全モノマー単位に対して、好ましくは３５質量％以下、より好ましくは３０質量％以下、さらに好ましくは２５質量％以下、特に好ましくは２０質量％以下である。
ポリマー中の各モノマー単位の含有量は、ＮＭＲ等により測定すればよい。
成分Ａの含有量は、ポリマー中の全モノマー単位に対して、好ましくは１質量％以上、より好ましくは５質量％以上、特に好ましくは１０質量％以上であり、また、ポリマー中の全モノマー単位に対して、好ましくは３５質量％以下、より好ましくは３０質量％以下、さらに好ましくは２５質量％以下、特に好ましくは２０質量％以下である。
ポリマー中の各モノマー単位の含有量は、ＮＭＲ等により測定すればよい。
（成分Ｂ）炭素数１〜８のアルキル基を側鎖に有するモノマー単位
成分Ｂは、重合させたときに側鎖となる部分に炭素数１〜８のアルキル基を有するモノマーに由来する。当該モノマーのアルキル基の炭素数が８を超えると、非特異吸着が増加する。
上記モノマーとしては、精製時の不純物の非特異吸着を防ぐ点から、非イオン性モノマーが好ましい。また、モノビニルモノマーが好ましい。
成分Ｂは、重合させたときに側鎖となる部分に炭素数１〜８のアルキル基を有するモノマーに由来する。当該モノマーのアルキル基の炭素数が８を超えると、非特異吸着が増加する。
上記モノマーとしては、精製時の不純物の非特異吸着を防ぐ点から、非イオン性モノマーが好ましい。また、モノビニルモノマーが好ましい。
成分Ｂを誘導するモノマーとしては、例えば、炭素数１〜８のアルキル基を有する（メタ）アクリレート類、炭素数１〜８のアルキル基を有する（メタ）アクリルアミド類、炭素数１〜８のアルキル基を有する芳香族系モノマーが挙げられ、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
これらの中でも、炭素数１〜８のアルキル基を有する（メタ）アクリレート類、炭素数１〜８のアルキル基を有する芳香族系モノマーが好ましい。
これらの中でも、炭素数１〜８のアルキル基を有する（メタ）アクリレート類、炭素数１〜８のアルキル基を有する芳香族系モノマーが好ましい。
炭素数１〜８のアルキル基としては、炭素数２〜８のアルキル基が好ましい。また、アルキル基は、直鎖状、分岐状、環状のいずれでもよい。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、ヘプチル基、シクロヘプチル基、オクチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。
また、上記アルキル基は、親水性基などの置換基を有していないものが好ましい。
また、上記アルキル基は、２価の連結基を介してポリマーの主鎖に結合しているのが好ましい。２価の連結基としては、例えば、２価の芳香族炭化水素基（フェニレン基等）、エステル結合、アミド結合などが挙げられる。
また、上記アルキル基は、親水性基などの置換基を有していないものが好ましい。
また、上記アルキル基は、２価の連結基を介してポリマーの主鎖に結合しているのが好ましい。２価の連結基としては、例えば、２価の芳香族炭化水素基（フェニレン基等）、エステル結合、アミド結合などが挙げられる。
炭素数１〜８のアルキル基を有する（メタ）アクリレート類としては、炭素数１〜８のアルキル基を有するアルキル（メタ）アクリレートが好ましい。例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、４−ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらの中でも、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、４−ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレートが好ましい。
また、炭素数１〜８のアルキル基を有する芳香族系モノマーとしては、炭素数１〜８のアルキル基を有する芳香族ビニル化合物類が好ましく、炭素数１〜８のアルキル基を有するスチレン系モノマーがより好ましい。
また、上記芳香族系モノマーに由来するモノマー単位としては、下記式（５）で表されるモノマー単位が好ましい。
また、上記芳香族系モノマーに由来するモノマー単位としては、下記式（５）で表されるモノマー単位が好ましい。
〔式（５）中、
Ｒ8は、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を示し、
Ｒ9は、炭素数１〜８のアルキル基を示し、
ｔは、１〜５の整数を示す。〕
Ｒ8は、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を示し、
Ｒ9は、炭素数１〜８のアルキル基を示し、
ｔは、１〜５の整数を示す。〕
式（５）中、Ｒ8で示されるアルキル基の炭素数としては、１または２が好ましい。また、当該アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でも環状でもよい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
また、Ｒ8としては、水素原子が好ましい。
また、Ｒ8としては、水素原子が好ましい。
Ｒ9で示されるアルキル基の炭素数は、固相担体の疎水性を抑える観点および適度な疎水性相互作用を発現させる観点から、好ましくは１〜８であり、より好ましくは１〜６であり、特に好ましくは１または２である。
また、アルキル基は、直鎖状、分岐状、環状のいずれでもよい。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、ヘプチル基、シクロヘプチル基、オクチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。
また、上記アルキル基は、親水性基などの置換基を有していないものが好ましい。
また、アルキル基は、直鎖状、分岐状、環状のいずれでもよい。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロブチル基、ペンチル基、シクロペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、ヘプチル基、シクロヘプチル基、オクチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。
また、上記アルキル基は、親水性基などの置換基を有していないものが好ましい。
また、ｔは、１〜５の整数を示すが、固相担体の疎水性を抑える観点および適度な疎水性相互作用を発現させる観点から、１〜３が好ましく、１がより好ましい。なお、ｔが２〜５の整数の場合、ｔ個のＲ9は同一であっても異なっていてもよい。
芳香族ビニル化合物類を誘導するモノマーとしては、アルキルビニルベンゼンが特に好ましく、例えば、４−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、２，４，６−トリメチルスチレン、エチルビニルベンゼン（４−エチルスチレン）、４−ｎ−ブチルスチレン、４−イソブチルスチレン、４−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、４−イソプロピルスチレンが挙げられ、これらは１種を単独で、または２種以上を組み合わせて使用できる。
成分Ｂの含有量としては、ポリマー中の全モノマー単位に対して、４０質量％以下が好ましい。成分Ｂの含有量を４０質量％以下とすることにより、不純物の非特異吸着が改善される。
また、成分Ｂの含有量は、ポリマー中の全モノマー単位に対して、好ましくは０．０５質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上であり、また、ポリマー中の全モノマー単位に対して、より好ましくは３５質量％以下、さらに好ましくは３０質量％以下、特に好ましくは２５質量％以下である。このような成分Ｂの含有量が２０質量％程度の場合でも本発明の所望の効果が得られる。
また、成分Ｂの含有量は、ポリマー中の全モノマー単位に対して、好ましくは０．０５質量％以上、より好ましくは０．５質量％以上であり、また、ポリマー中の全モノマー単位に対して、より好ましくは３５質量％以下、さらに好ましくは３０質量％以下、特に好ましくは２５質量％以下である。このような成分Ｂの含有量が２０質量％程度の場合でも本発明の所望の効果が得られる。
また、上記ポリマー中における成分Ａと成分Ｂとの含有割合〔（Ａ）：（Ｂ）〕は、質量比で９５：５〜５０：５０である。成分Ａの含有割合が９５質量部を超えると粒子の脆性が高くなり、割れが生じやすくなる。一方で、成分Ａの含有割合が５０質量部未満であると、粒子表面に成分Ｂに由来するアルキル基が多数存在し、夾雑物が多孔質担体表面に吸着しやすくなる。
すなわち、含有割合〔（Ａ）：（Ｂ）〕が９５：５〜５０：５０の範囲内であると、粒子の割れが抑制されるだけでなく、抗体結合性のリガンドを使用した際には、成分Ｂが有するアルキル基と抗体との相互作用により、担体の抗体がより強く保持され、凝集体の方が先に溶出される。
本発明においては、含有割合〔（Ａ）：（Ｂ）〕は、質量比で、９０：１０〜５５：４５が好ましく、８５：１５〜５５：４５がより好ましく、８０：２０〜６０：４０が特に好ましい。
すなわち、含有割合〔（Ａ）：（Ｂ）〕が９５：５〜５０：５０の範囲内であると、粒子の割れが抑制されるだけでなく、抗体結合性のリガンドを使用した際には、成分Ｂが有するアルキル基と抗体との相互作用により、担体の抗体がより強く保持され、凝集体の方が先に溶出される。
本発明においては、含有割合〔（Ａ）：（Ｂ）〕は、質量比で、９０：１０〜５５：４５が好ましく、８５：１５〜５５：４５がより好ましく、８０：２０〜６０：４０が特に好ましい。
（成分Ｃ）
また、上記ポリマーは、さらに（成分Ｃ）成分Ａ及び成分Ｂを除く単官能モノマーに由来するモノマー単位を含むことが好ましい。
成分Ｃの含有量としては、ポリマー中の全モノマー単位に対して、２０〜９９．５質量％が好ましい。上記の範囲内であれば、親水性、機械的強度に優れた多孔質担体が得られる。
また、成分Ｃの含有量は、ポリマー中の全モノマー単位に対して、より好ましくは２５質量％以上、さらに好ましくは３０質量％以上、さらに好ましくは４０質量％以上、特に好ましくは５０質量％以上であり、また、ポリマー中の全モノマー単位に対して、好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、特に好ましくは８０質量％以下である。
また、上記ポリマーは、さらに（成分Ｃ）成分Ａ及び成分Ｂを除く単官能モノマーに由来するモノマー単位を含むことが好ましい。
成分Ｃの含有量としては、ポリマー中の全モノマー単位に対して、２０〜９９．５質量％が好ましい。上記の範囲内であれば、親水性、機械的強度に優れた多孔質担体が得られる。
また、成分Ｃの含有量は、ポリマー中の全モノマー単位に対して、より好ましくは２５質量％以上、さらに好ましくは３０質量％以上、さらに好ましくは４０質量％以上、特に好ましくは５０質量％以上であり、また、ポリマー中の全モノマー単位に対して、好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、特に好ましくは８０質量％以下である。
また、成分Ｃとしては、（成分Ｃ−１）エポキシ基含有モノビニルモノマーに由来するモノマー単位、（成分Ｃ−２）エポキシ基を含有しないモノビニルモノマーに由来するモノマー単位が挙げられる。上記ポリマーは、これらモノマー単位のうち１種を含んでいても２種以上を含んでいてもよい。
（成分Ｃ−１）エポキシ基含有モノビニルモノマーに由来するモノマー単位
エポキシ基含有モノビニルモノマーは、１分子中に、１個の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）と、１個以上のエポキシ基とを有するモノマーである。エポキシ基含有モノビニルモノマーは、固相担体に適切な量のエポキシ基を導入し、適切なリガンド結合量を得るための成分である。
エポキシ基含有モノビニルモノマーは、１分子中に、１個の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）と、１個以上のエポキシ基とを有するモノマーである。エポキシ基含有モノビニルモノマーは、固相担体に適切な量のエポキシ基を導入し、適切なリガンド結合量を得るための成分である。
エポキシ基含有モノビニルモノマーとしては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート、α−（メタ）アクリル−ω−グリシジルポリエチレングリコール等のヒドロキシ基非含有（メタ）アクリル酸エステル類；グリセリンモノ（メタ）アクリレートグリシジルエーテル等のヒドロキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類；ビニルベンジルグリシジルエーテル、イソプロペニルベンジルグリシジルエーテル、ビニルフェニルブチルグリシジルエーテル、ビニルベンジルオキシエチルグリシジルエーテル等の芳香族モノビニル化合物の他、アリルグリシジルエーテル、３，４−エポキシ−１−ブテン、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブテン等が挙げられる。これらのうち１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
これらの中でも、エポキシ基含有モノビニルモノマーとしては、エポキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類、エポキシ基含有芳香族モノビニル化合物が好ましく、エポキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類がより好ましく、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテルがさらに好ましく、グリシジル（メタ）アクリレートが特に好ましい。また、エポキシ基含有芳香族モノビニル化合物の中では、ビニルベンジルグリシジルエーテルが好ましく、（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテルが特に好ましい。
これらの中でも、エポキシ基含有モノビニルモノマーとしては、エポキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類、エポキシ基含有芳香族モノビニル化合物が好ましく、エポキシ基含有（メタ）アクリル酸エステル類がより好ましく、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテルがさらに好ましく、グリシジル（メタ）アクリレートが特に好ましい。また、エポキシ基含有芳香族モノビニル化合物の中では、ビニルベンジルグリシジルエーテルが好ましく、（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテルが特に好ましい。
また、エポキシ基含有芳香族モノビニル化合物としては、エポキシ基含有スチレン系モノビニル化合物が好ましく、具体的には、式（４）で表される化合物が挙げられる。
〔式（４）中、
Ｒ4は、置換または非置換の炭素数１または２のアルカンジイル基を示し、
Ｒ5は、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を示し、
Ｒ6は、炭素数２または３のアルカンジイル基を示し、
Ｒ7は、炭素数１〜１０のアルキル基を示し、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、０〜６の整数を示し、
ｑは、０〜４の整数を示す。〕
Ｒ4は、置換または非置換の炭素数１または２のアルカンジイル基を示し、
Ｒ5は、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を示し、
Ｒ6は、炭素数２または３のアルカンジイル基を示し、
Ｒ7は、炭素数１〜１０のアルキル基を示し、
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、０〜６の整数を示し、
ｑは、０〜４の整数を示す。〕
式（４）中、Ｒ4で示されるアルカンジイル基は、直鎖状でも分岐状でもよく、例えば、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基が挙げられる。これらの中でも、アフィニティリガンドを結合させる際の反応性を向上させる観点から、メタン−１，１−ジイル基が好ましい。なお、アルカンジイル基が有していてもよい置換基としては、メチル基、エチル基等が挙げられる。
式（４）中、Ｒ5は、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を示す。Ｒ5で示されるアルキル基の炭素数としては、１または２が好ましい。また、当該アルキル基は、直鎖状でも分岐状でもよい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基等が挙げられる。
これらの中でも、Ｒ5としては、重合反応の反応性の観点から、水素原子が好ましい。
これらの中でも、Ｒ5としては、重合反応の反応性の観点から、水素原子が好ましい。
また、Ｒ6で示されるアルカンジイル基としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基が挙げられるが、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基が好ましい。
また、Ｒ7で示されるアルキル基の炭素数は、固相担体の疎水性を抑える観点から、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１または２である。
また、上記アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキル基としては、例えば、上記Ｒ5で示されるアルキル基と同様のものが挙げられる。
また、上記アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキル基としては、例えば、上記Ｒ5で示されるアルキル基と同様のものが挙げられる。
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、０〜６の整数を示すが、ｍとしては、０〜３の整数が好ましい。また、ｎとしては、０〜３の整数が好ましく、０または１がより好ましい。なお、ｎが２〜６の整数の場合、ｎ個のＲ6は同一であっても異なっていてもよい。
また、ｑは、０〜４の整数を示すが、固相担体の疎水性を抑える観点から、０または１が好ましい。なお、ｑが２〜４の整数の場合、ｑ個のＲ7は同一であっても異なっていてもよい。
また、ｑは、０〜４の整数を示すが、固相担体の疎水性を抑える観点から、０または１が好ましい。なお、ｑが２〜４の整数の場合、ｑ個のＲ7は同一であっても異なっていてもよい。
なお、担体を順相懸濁重合により粒子状にする場合には、エポキシ基含有モノビニルモノマーとしては、開環エポキシ基量のコントロールが容易となることから、水不溶性のものが好ましい。ここで水不溶性とは水１００ｍＬに対して室温（２５℃）で１０ｇ以上は溶解しないことをいう。なお、エポキシ基含有モノビニルモノマーは市販品を用いてもよく、公知の方法に従い合成して使用してもよい。
成分Ｃ−１の含有量としては、ポリマー中の全モノマー単位に対して、２０〜９９．５質量％が好ましい。上記の範囲内であれば、親水性、機械的強度に優れた多孔質担体が得られる。
また、成分Ｃ−１の含有量は、ポリマー中の全モノマー単位に対して、より好ましくは２５質量％以上、さらに好ましくは３０質量％以上、さらに好ましくは４０質量％以上、特に好ましくは５０質量％以上であり、また、ポリマー中の全モノマー単位に対して、好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、特に好ましくは８０質量％以下である。
また、成分Ｃ−１の含有量は、ポリマー中の全モノマー単位に対して、より好ましくは２５質量％以上、さらに好ましくは３０質量％以上、さらに好ましくは４０質量％以上、特に好ましくは５０質量％以上であり、また、ポリマー中の全モノマー単位に対して、好ましくは９５質量％以下、より好ましくは９０質量％以下、特に好ましくは８０質量％以下である。
（成分Ｃ−２）エポキシ基を含有しないモノビニルモノマーに由来するモノマー単位
エポキシ基を含有しないモノビニルモノマーは、１分子中に、１個の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）を有し、エポキシ基を含有しないビニルモノマーである。以下、エポキシ基を含有しないモノビニルモノマーを、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基非含有モノビニルモノマーと、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニルモノマーとに分けて説明する。
エポキシ基を含有しないモノビニルモノマーは、１分子中に、１個の重合性ビニル基（エチレン性不飽和結合を有する基）を有し、エポキシ基を含有しないビニルモノマーである。以下、エポキシ基を含有しないモノビニルモノマーを、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基非含有モノビニルモノマーと、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニルモノマーとに分けて説明する。
エポキシ基を含有しないヒドロキシ基非含有モノビニルモノマーとしては、精製時の不純物の非特異吸着を防ぐ点から、非イオン性モノマーが好ましい。このような非イオン性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレンのような芳香族ビニル化合物が挙げられる。
また、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニルモノマーとしては、例えば、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレートなどの（メタ）アクリル酸エステル類；ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドなどの（メタ）アクリルアミド類などが挙げられ、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
また、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニルモノマーに含まれるヒドロキシ基の個数としては、１分子中に、１〜５個が好ましく、１〜３個がより好ましい。
また、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニルモノマーに含まれるヒドロキシ基の個数としては、１分子中に、１〜５個が好ましく、１〜３個がより好ましい。
これらの中でも、エポキシ基を含有しないモノビニルモノマーとしては、エポキシ基を含有しないヒドロキシ基含有モノビニルモノマーが好ましく、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドがより好ましく、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミドが特に好ましい。
成分Ｃ−２の含有量としては、ポリマー中の全モノマー単位に対して、４０質量％以下が好ましい。成分Ｃ−２の含有量を４０質量％以下とすることにより、ヒドロキシ基含有モノビニルモノマーの場合には多孔質粒子の親水性が向上し、凝集が抑制され、アフィニティリガンドの活性が高くなり標的物の動的結合量が改善される。また、機械的強度も改善される。
成分Ｃ−２の含有量としては、ポリマー中の全モノマー単位に対して、より好ましくは３５質量％以下、さらに好ましくは３０質量％以下、特に好ましくは２０質量％以下である。また、成分Ｃ−２の含有量は０質量％でもよいが、成分Ｃ−２を含有する場合は、ポリマー中の全モノマー単位に対して、５質量％以上が好ましい。
成分Ｃ−２の含有量としては、ポリマー中の全モノマー単位に対して、より好ましくは３５質量％以下、さらに好ましくは３０質量％以下、特に好ましくは２０質量％以下である。また、成分Ｃ−２の含有量は０質量％でもよいが、成分Ｃ−２を含有する場合は、ポリマー中の全モノマー単位に対して、５質量％以上が好ましい。
（担体の形状）
本発明の多孔質担体は、単位時間当たりの処理容量の観点から、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。
担体の形態としては、粒子状、モノリス状、板状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれでもよく、任意の形態を選ぶことができる。水不溶性担体としては、多孔性ビーズ、モノリス又は膜が好ましく、特に水不溶性の担体上に配置された抗体アフィニティリガンドと成分Ｂにおけるアルキル基とが協奏的に機能するために、一定の滞留時間が得られる多孔性ビーズ（多孔質ビーズ）が好ましい。
本発明の多孔質担体は、単位時間当たりの処理容量の観点から、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。
担体の形態としては、粒子状、モノリス状、板状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれでもよく、任意の形態を選ぶことができる。水不溶性担体としては、多孔性ビーズ、モノリス又は膜が好ましく、特に水不溶性の担体上に配置された抗体アフィニティリガンドと成分Ｂにおけるアルキル基とが協奏的に機能するために、一定の滞留時間が得られる多孔性ビーズ（多孔質ビーズ）が好ましい。
本発明の多孔質担体の円形度０．９５以上の粒子分布としては、６０〜１００％が好ましく、７０〜１００％がより好ましく、８０〜１００％が特に好ましい。
なお、円形度、その分布は、実施例に記載の方法で測定された値を意味する。
なお、円形度、その分布は、実施例に記載の方法で測定された値を意味する。
また、本発明の多孔質担体の体積平均粒径としては、標的物の動的結合量と圧力特性の観点から、３５〜１００μｍが好ましく、４０〜９０μｍがより好ましく、４０〜８０μｍが特に好ましい。
上記体積平均粒径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定した値をいい、具体的には実施例に記載の方法で測定された値を意味する。
上記体積平均粒径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定した値をいい、具体的には実施例に記載の方法で測定された値を意味する。
また、体積平均粒径の変動係数は、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは３０％以下である。
また、本発明の多孔質担体の比表面積としては、７０ｍ2／ｇ以上が好ましく、８０ｍ2／ｇ以上がより好ましく、９０ｍ2／ｇ以上がさらに好ましい。本発明の多孔質担体は、固相担体の比表面積が上記のような範囲であると、標的物の動的結合量が高く、しかも凝集体の除去に優れた担体が得られる。
また、本発明の多孔質担体の体積平均細孔径としては、標的物の動的結合量と凝集体除去能の観点から、１０〜３００ｎｍが好ましく、２０〜２００ｎｍがより好ましく、３０〜１００ｎｍが特に好ましい。
上記変動係数、比表面積、体積平均細孔径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定した値をいう。
また、本発明の多孔質担体の比表面積としては、７０ｍ2／ｇ以上が好ましく、８０ｍ2／ｇ以上がより好ましく、９０ｍ2／ｇ以上がさらに好ましい。本発明の多孔質担体は、固相担体の比表面積が上記のような範囲であると、標的物の動的結合量が高く、しかも凝集体の除去に優れた担体が得られる。
また、本発明の多孔質担体の体積平均細孔径としては、標的物の動的結合量と凝集体除去能の観点から、１０〜３００ｎｍが好ましく、２０〜２００ｎｍがより好ましく、３０〜１００ｎｍが特に好ましい。
上記変動係数、比表面積、体積平均細孔径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定した値をいう。
＜アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体＞
本発明のアフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体は、本発明の多孔質担体にアフィニティリガンドを結合させたことを特徴とする。なお、本明細書においては、このアフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体を、本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体とも称する。
本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体としては、円形度０．９５以上の粒子分布、体積平均粒径、変動係数、比表面積、体積平均細孔径が上記多孔質担体と同様の範囲であるものが好ましい。
本発明のアフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体は、本発明の多孔質担体にアフィニティリガンドを結合させたことを特徴とする。なお、本明細書においては、このアフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体を、本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体とも称する。
本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体としては、円形度０．９５以上の粒子分布、体積平均粒径、変動係数、比表面積、体積平均細孔径が上記多孔質担体と同様の範囲であるものが好ましい。
（アフィニティリガンド）
本発明におけるアフィニティリガンドとは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から標的（目的）の分子を選択的に捕集（結合）する物質を示す。本発明において、アフィニティリガンドは、標的物と特異的に結合するものであればよいが、例えば、タンパク質、核酸、ペプチド、酵素、キレート化合物、レセプター、アプタマー、抗体、抗原、ビタミン、金属イオン等が挙げられる。斯様なアフィニティリガンドの中でも、タンパク質、核酸、ペプチド、酵素、キレート化合物が好ましく、タンパク質、ペプチドがより好ましい。また、精製の標的物を抗体とする抗体アフィニティリガンドの中では、イムノグロブリン結合タンパク質がより好ましい。
本発明におけるアフィニティリガンドとは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から標的（目的）の分子を選択的に捕集（結合）する物質を示す。本発明において、アフィニティリガンドは、標的物と特異的に結合するものであればよいが、例えば、タンパク質、核酸、ペプチド、酵素、キレート化合物、レセプター、アプタマー、抗体、抗原、ビタミン、金属イオン等が挙げられる。斯様なアフィニティリガンドの中でも、タンパク質、核酸、ペプチド、酵素、キレート化合物が好ましく、タンパク質、ペプチドがより好ましい。また、精製の標的物を抗体とする抗体アフィニティリガンドの中では、イムノグロブリン結合タンパク質がより好ましい。
本発明に用いることができる抗体アフィニティリガンドは、抗体又は抗体の定常領域であるＦｃ含有分子に特異的に結合しうる特徴を有していれば特に限定されないが、ペプチド性リガンド、蛋白質性リガンド、化学合成性リガンド（合成化合物）が好ましい。標的分子に対する特異性の視点からペプチド性又は蛋白質性リガンドが更に好ましい。中でも、抗体アフィニティリガンドとしては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＨ、プロテインＤ、プロテインＡｒｐ、プロテインＦｃγＲ、抗体結合性合成ペプチドリガンド及びそれら類縁物質であることが好ましい。抗体アフィニティリガンドとしては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ及びそれら類縁物質がより好ましく、プロテインＡ及びその類縁物質が最も好ましい。抗体アフィニティリガンドは、標的分子結合ドメイン（ペプチドモノマー又は蛋白質、単ドメイン）を有していれば特に制限されないが、２個以上のドメインが連結された多量体ペプチド又は蛋白質（複ドメイン）が好ましく、２〜１０個がより好ましく、２〜８個、更に２〜６個が好ましく、特に３〜６個のドメインが連結された多量体蛋白質であることが好ましい。これらの多量体蛋白質は、単一の標的分子結合ドメインの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、標的分子が同一であれば、複数種類の標的分子結合ドメインの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
抗体アフィニティリガンドの標的分子結合ドメインを連結する方法としては、多量体蛋白質の３次元立体構造を不安定化しない方法が好ましく、たとえば、ドメイン配列の末端アミノ酸を介する連結方法、ドメイン配列のアミノ酸残基を介さず連結する方法、１又は複数のドメイン配列以外のアミノ酸残基で連結する方法が挙げられ、これらの方法に限定されるものではない。
抗体アフィニティリガンドとしては、多量体蛋白質を１つの構成成分として、機能の異なる他の蛋白質と融合させた融合蛋白質を好ましく用いることができる。融合蛋白質としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ一トランスフェラーゼ）が融合した蛋白質やＤＮＡアプタマー等の核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている蛋白質等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
アフィニティリガンド結合量は、動的結合容量の観点から、担体の乾燥重量１ｇあたり、好ましくは１０〜２００ｍｇ、より好ましくは２５〜１６０ｍｇ、更に好ましくは３０〜１４０ｍｇ、特に好ましくは４０〜１００ｍｇである。アフィニティリガンド結合量は、後述する実施例と同様の方法で測定すればよい。
アフィニティリガンドを多孔質担体に結合させる方法としては、一般的な方法を用いることができる。例えば、アフィニティリガンドのアミノ基が担体上に導入されたホルミル基を介して合成高分子支持体に結合してもよく、アフィニティリガンドのアミノ基が合成高分子支持体上の活性化されたカルボキシ基を介して担体に結合してもよく、アフィニティリガンドのアミノ基が合成高分子支持体上のエポキシ基を介して担体に結合してもよい。
合成高分子支持体に導入される官能基としては、アフィニティリガンドと共有結合を形成することができる官能基であれば特に限定されないが、例えばエポキシ基（エピクロルヒドリン）、臭化シアン、Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジル炭酸塩（ＤＳＣ）などで活性化されるヒドロキシ基、アルデヒド基又は活性化力ルボン酸基（例えば、Ｎ一ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）活性化エステル）などの反応性官能基（ｒ活性化基）等を挙げることができる（ＨｅｒｍａｎｓｏｎＧ．Ｔ．他著、ｒＩｍｍｏｂｉＩｉｚｅｄＡｆｆｉｎｉｔｙＬｉｇａｎｄＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ」、１９９２年、米国特許第５，８７４，１６５号、米国特許第３，９３２，５５７号、米国特許第４，７７２，６５３号、米国特許第４，２１０，７２３号、米国特許第５，２５０，６１２３号、欧州特許公開第１３５２９５７号、ＷＯ２００４／０７４４７１）。これらの中には、アフィニティリガンドが合成高分子支持体に直接共有結合するものと、直鎖、分岐鎖、又は環状のリンカー又はスペーサーが用いられるものが含まれる。なお、アフィニティリガンドが導入された合成高分子支持体を活性化する場合はアフィニティリガンドと直接反応しない活性化手法が好ましい。
アフィニティリガンドのうち、蛋白質性リガンドを担体に固定化する方法は、蛋白質の官能基の一部と担体の官能基の一部を反応させる方法を用いることができるが、その反応に利用できる蛋白質側の主な官能基（活性基）は、Ｎ末端アミノ酸およびリジン（Ｌｙｓ）側鎖のアミノ基；システイン（Ｃｙｓ）側鎖のチオール基；Ｃ末端アミノ酸やグルタミン酸（ＧＩｕ）側鎖、アスパラギン酸（Ａｓｐ）側鎖のカルボキシ基等があげられるがこれらに限定されるものではない。
また、リガンドの配向性を制御して蛋白質性抗体アフィニティリガンドを合成高分子支持体に固定化する方法として、Ｃ末端にシステインを有するプロテインＡを利用する方法が提案されており（米国特許第６，３９９，７５０号、ＬｊｕｎｇｑｕｉｓｔＣ．他著，ｒＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」，１９８９年，１８６巻，５５７−５６１頁）、これを採用してもよい。
リンカーを利用する固定化技術としては、合成高分子支持体とアフィニティリガンドとの距離を確保し、立体障害を排除して高性能化を図る方法の他、リンカー又はスペーサーの中に官能基（例えば、帯電アミン）を付与、形成させる方法等が挙げられる。
また、抗体アフィニティリガンドの固定化時にリンカー又はスペーサー部分に抗体アフィニティリガンドを効果的に集積し、固定化収率の向上による分離性能の向上が検討されてきている。たとえば、リンカーアームの一部としてＮＨＳ活性化されたカルボン酸で誘導体化されたアガロース担体への蛋白質性リガンドの固定化技術が挙げられ（米国特許第５，２６０，３７３号、特開２０１０−１３３７３３号公報、特開２０１０−１３３７３４号公報）、これを採用してもよい。
また、抗体アフィニティリガンドの固定化時にリンカー又はスペーサー部分に抗体アフィニティリガンドを効果的に集積し、固定化収率の向上による分離性能の向上が検討されてきている。たとえば、リンカーアームの一部としてＮＨＳ活性化されたカルボン酸で誘導体化されたアガロース担体への蛋白質性リガンドの固定化技術が挙げられ（米国特許第５，２６０，３７３号、特開２０１０−１３３７３３号公報、特開２０１０−１３３７３４号公報）、これを採用してもよい。
また、リンカーやスペーサーとは別に担体に会合性基を利用し、アフィニティリガンドを支持体上に集積した後に、会合性基とアフィニティリガンドの間に共有結合を形成させずに支持体上に抗体アフィニティリガンドを個別に固定化する方法も提案されており（特開２０１１−２５６１７６号公報）、これを採用してもよい。
＜標的物の精製方法＞
本発明の精製方法は、本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体を用いることを特徴とするものである。本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体を用いる以外は常法と同様にして行えばよい。
具体的には、本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体と、アフィニティリガンドが捕捉しうる標的物とを接触させる工程Ａと、前記リガンドと前記標的物とを解離させる解離液と、前記工程Ａで標的物を捕捉した担体とを接触させて標的物を解離させる工程Ｂと、を含む方法が挙げられる。
本発明の精製方法は、本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体を用いることを特徴とするものである。本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体を用いる以外は常法と同様にして行えばよい。
具体的には、本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体と、アフィニティリガンドが捕捉しうる標的物とを接触させる工程Ａと、前記リガンドと前記標的物とを解離させる解離液と、前記工程Ａで標的物を捕捉した担体とを接触させて標的物を解離させる工程Ｂと、を含む方法が挙げられる。
また、例えば標的物が凝集しやすい抗体のようなものである場合、標的物の単量体と標的物の凝集体との混合物から単量体を選択的に分離する必要があることがある。その場合、本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体の表面と、標的物の単量体又は凝集体との物理的相互作用の差異を利用して、標的物の単量体を選択的に分離することができる。いわば、アフィニティリガンドとアルキル基とを利用したミックスモード用担体として本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体を使用することができる。
その一実施態様としては、前記工程Ｂが、アフィニティリガンドから標的物が解離する条件下で、イオン強度が段階的に高くなる塩濃度を２種類以上使用するステップワイズ方式、又は勾配的に塩濃度を高くするグラジェント方式（又はその両方の組合せ）により解離する工程である、ことが好ましく例示できる。これにより、イオン強度を変化させずに一定に保ったままでも分離能はやや低下するものの単量体と凝集体とを分離、溶出させることができる。
本発明の精製方法は、単量体と凝集体との分離特性を示すほか、アフィニティ精製工程とイオン交換基による精製工程との２工程のクロマトグラフィー操作を１工程に短縮可能で、使用する緩衝液の種類および使用量、更に、作業時間の短縮が期待できる。
また、本発明の精製方法は、抗体アフィニティリガンドからの標的分子が解離される狭いｐＨ域（好ましくはｐＨ３〜４、より好ましくはｐＨ３．１〜３．９、さらに好ましくはｐＨ３．２〜３．８）で、イオン強度（好ましくは１０〜５００ｍＭ、より好ましくは１５〜４００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜３５０ｍＭ、前記範囲で段階的に高くなる塩濃度を２種以上使用する「ステップワイズ方式」又は前記範囲で勾配的に高くなる塩濃度を使用する「グラジェント様式」）の設定により単量体含量の高い溶出画分を得ることが可能である。
特にモノクローナル抗体の精製においては、当該解離ｐＨは標的分子の等電点から大きく離れているため、抗体毎に解離イオン強度の幅に大きな差異がなく、狭い範囲で各種標的分子の使用条件の設定が可能であることが期待できる。更に、抗体アフィニティリガンドとしては、解離ｐＨ域を更に狭く設定可能であるほか、アルカリＣＩＰ洗浄の使用により、効果的な洗浄も可能であるため、安定的なプロセス構築の観点からは改変プロテインＡの利用が好ましい。
本発明において精製される標的分子としては、例えば免疫グロブリンＧおよびその類縁体（誘導体を含む）であり、一般的に抗体と称される分子の他、免疫グロブリン分子の定常領域であるＦｃ領域と他の機能性蛋白質又はペプチドを融合してなるＦｃ融合蛋白質（Ｆｃ含有分子）が含まれる。これらは、抗体医薬品の原料として利用される。
以下に、本発明の精製方法の詳細な説明を、標的分子が免疫グロブリンＧの場合について例示するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明の標的物の精製方法は、クロマトグラフィー用多孔質担体と、アフィニティリガンドが捕捉しうる標的物とを接触させる工程Ａを含む。免疫グロブリンＧを含む蛋白質溶液のｐＨが中性付近となるように調整した後、該溶液を本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体を充填したカラムに通過させ、アフィニティリガンドを介して免疫グロブリンＧを特異的に担体に吸着させる。
たとえば、プロテインＡをアフィニティリガンドとする場合、その負荷ｐＨは６以上が好ましく、６．３以上９以下がより好ましく、６．５以上８．５以下がさらに好ましい。哺乳類培養細胞により生産される免疫グロブリンＧの精製において、特にイオン強度の調製を必要としないほか、あらかじめイオン強度を上げて更に非特異吸着を抑制することもできる。
たとえば、プロテインＡをアフィニティリガンドとする場合、その負荷ｐＨは６以上が好ましく、６．３以上９以下がより好ましく、６．５以上８．５以下がさらに好ましい。哺乳類培養細胞により生産される免疫グロブリンＧの精製において、特にイオン強度の調製を必要としないほか、あらかじめイオン強度を上げて更に非特異吸着を抑制することもできる。
本発明においては、さらに洗浄工程を有することが好ましい。洗浄工程では、アフィニティリガンドが機能する条件範囲の緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。すなわち、ｐＨの好ましい範囲は前記負荷時と同じ範囲（中性付近のｐＨ）であってもよく、例えば、６以上が好ましい。この時点では標的分子である免疫グロブリンＧは本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体に吸着されている。この時、中性付近のｐＨでイオン強度や組成物の最適化により、不純物を効果的に除去できる場合がある。負荷、洗浄時において、中性付近のｐＨにすると共に一定以上のイオン強度の洗浄液の利用が好ましく、この過程で該分離マトリックスおよび／又は、免疫グロブリンＧを介して非特異的にカラムに残留する不純物を洗浄することができる。イオン強度は、例えば、０．２Ｍ以上が好ましく、０．５Ｍ以上がより好ましい。
また、この精製方法が上記工程Ｂを含む場合、上記と同様に、工程Ｂは、ステップワイズ方式、グラジェント方式、これらの組み合わせのいずれでもよい。
工程Ｂでは、中性付近でイオン強度が低い緩衝液にカラムを置換し、解離時の陽イオン交換基によるイオン強度依存的解離機能の発現に備える。
解離液のｐＨは抗体アフィニティリガンドからの免疫グロブリンＧの解離ｐＨが適用できる。当該ｐＨは、アフィニティリガンドと免疫グロブリンＧの種類により決定される分離条件を中心に決定される。
解離液のｐＨは抗体アフィニティリガンドからの免疫グロブリンＧの解離ｐＨが適用できる。当該ｐＨは、アフィニティリガンドと免疫グロブリンＧの種類により決定される分離条件を中心に決定される。
抗体アフィニティリガンドにプロテインＡを用いた場合は、ｐＨは２〜６の間に設定されることが好ましい。ただし、標的分子の酸変性を避ける目的から、ｐＨ３．０以上がより好ましく、ｐＨ３．３以上がより好ましく、ｐＨ３．５以上が特に好ましい。ｐＨは、好ましくは５．５以下、より好ましくは５．０以下である。アルカリ耐性型のプロテインＡリガンドを使用する場合は、一般的にその解離ｐＨは３．５〜４．０の間を中心に設定されるが、これに限定されるものではない。
また、解離イオン強度は、抗体アフィニティリガンドと成分Ｂに由来するアルキル基の導入比率に依存するほか、単位体積当たりの免疫グロブリンＧの負荷量にも依存するが、グラジエント実験やステップワイズ解離実験により最適化ポイントを容易に設定しうる。
本発明により調製されるクロマトグラフィー用多孔質担体からの抗体解離は、塩濃度グラジエント方式でもステップワイズ方式でも適用可能であるが、溶出液量の低減を目的にした場合はイオン強度によるステップワイズ方式が好ましい。更に、操作の単純化のためには、ワンステップで抗体の回収と高単量体含量化を達成できる条件設定が好ましい。
本発明により調製されたクロマトグラフィー用多孔質担体を用いて精製された免疫グロブリンＧは、高いモノマー選択性を示し、その溶出液中のモノマー含量が高い。
本発明のクロマトグラフィー用多孔質担体を用いることにより、特異性の高いアフィニティ精製と、主に陽イオン交換クロマトグラフィーにより達成しうるモノマー含量の向上を、高回収率を維持したまま単一のクロマト操作で効率的に達成可能であることから、後段プロセスヘの負荷の低減が可能となり、プロセス全体の収率向上と単量体含量の向上に貢献できる。すなわち、本発明により、抗体医薬品の製造プロセスの生産性向上と高純度化に寄与できる。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
（１）４４８ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製 ＰＶＡ−２１７）２．６９ｇを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．０４５ｇを添加し、撹拌して水溶液Ｓを調製した。
一方、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．６３ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．３６ｇ及びスチレン（和光純薬工業製）１４．１５ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２９．３８ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、前記水溶液Ｓを、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．３４ｇを添加し、内温を８６℃にした。
（１）４４８ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製 ＰＶＡ−２１７）２．６９ｇを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．０４５ｇを添加し、撹拌して水溶液Ｓを調製した。
一方、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．６３ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．３６ｇ及びスチレン（和光純薬工業製）１４．１５ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２９．３８ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、前記水溶液Ｓを、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．３４ｇを添加し、内温を８６℃にした。
（２）その後、８６℃に温度を維持したまま、３時間撹拌を行った。次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、多孔質粒子分散液を得た。
（３）その後、多孔質粒子分散液２００ｍＬに酢酸ナトリウム２８．０ｇを加え、その５分後に、Ｂｒ2／Ｈ2Ｏ（飽和濃度）を８５ｍＬ加え、１５分間反応させ、蟻酸ナトリウム０．５ｇを加えた。次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水で洗浄し、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、活性化多孔質粒子分散液を得た。
次いで、得られた活性化多孔質粒子５ｍＬ（沈降体積）をサクションドライし、水を加えて計７ｍＬの懸濁液とした。この懸濁液に５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．８ｍＬ、ＮａＢＨ4 ２４ｍｇ、及びエピクロロヒドリン４ｍＬを加え、２５℃で８時間振とうした。上記の反応液を純水、エタノール、純水の順で濾過洗浄を行い、エポキシ化多孔質粒子を得た。次に、粒子の濃度が１０質量％となるようにエポキシ化多孔質粒子を純水に分散させ、エポキシ化多孔質粒子分散液を得た。
（３）その後、多孔質粒子分散液２００ｍＬに酢酸ナトリウム２８．０ｇを加え、その５分後に、Ｂｒ2／Ｈ2Ｏ（飽和濃度）を８５ｍＬ加え、１５分間反応させ、蟻酸ナトリウム０．５ｇを加えた。次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水で洗浄し、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、活性化多孔質粒子分散液を得た。
次いで、得られた活性化多孔質粒子５ｍＬ（沈降体積）をサクションドライし、水を加えて計７ｍＬの懸濁液とした。この懸濁液に５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．８ｍＬ、ＮａＢＨ4 ２４ｍｇ、及びエピクロロヒドリン４ｍＬを加え、２５℃で８時間振とうした。上記の反応液を純水、エタノール、純水の順で濾過洗浄を行い、エポキシ化多孔質粒子を得た。次に、粒子の濃度が１０質量％となるようにエポキシ化多孔質粒子を純水に分散させ、エポキシ化多孔質粒子分散液を得た。
（４）次いで、改変プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製 ｒＳＰＡ）０．１５ｇを、１．２Ｍ 硫酸ナトリウム／０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに分散させプロテインＡ分散液を得て、このプロテインＡ分散液にエポキシ化多孔質粒子分散液（粒子乾燥質量換算で１ｇ相当）を添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
次いで、生成したプロテインＡ固定粒子を、１．０Ｍ ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業社製）／０．１Ｍ 硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１を得た。
次いで、生成したプロテインＡ固定粒子を、１．０Ｍ ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業社製）／０．１Ｍ 硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１を得た。
（実施例２）
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．６３ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．３６ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）１４．１５ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２９．３８ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、改変プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製 ｒＳＰＡ）０．１５ｇを、１．２Ｍ 硫酸ナトリウム／０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに分散させプロテインＡ分散液を得て、このプロテインＡ分散液に上記多孔質粒子分散液（粒子乾燥質量換算で１ｇ相当）を添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
次いで、生成したプロテインＡ固定粒子を、１．０Ｍ ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業社製）／０．１Ｍ 硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤２を得た。
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．６３ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．３６ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）１４．１５ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２９．３８ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、改変プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製 ｒＳＰＡ）０．１５ｇを、１．２Ｍ 硫酸ナトリウム／０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに分散させプロテインＡ分散液を得て、このプロテインＡ分散液に上記多孔質粒子分散液（粒子乾燥質量換算で１ｇ相当）を添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
次いで、生成したプロテインＡ固定粒子を、１．０Ｍ ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業社製）／０．１Ｍ 硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤２を得た。
（実施例３）
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．５９ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）３．４１ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）１０．９４ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２９．３９ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤３を得た。
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．５９ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）３．４１ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）１０．９４ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２９．３９ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤３を得た。
（実施例４）
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）６．２９ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）５．３９ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）６．２９ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２９．３９ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤４を得た。
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）６．２９ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）５．３９ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）６．２９ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２９．３９ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤４を得た。
（実施例５）
実施例１の工程（１）において、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）０．９０ｇ、ｎ−オクチルアクリレート（共栄社化学社製）０．７２ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）１６．３３ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２９．３９ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤５を得た。
実施例１の工程（１）において、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）０．９０ｇ、ｎ−オクチルアクリレート（共栄社化学社製）０．７２ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）１６．３３ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２９．３９ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤５を得た。
（実施例６）
実施例１の工程（１）において、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）６．４１ｇ、シクロヘキシルメタクリレート（共栄社化学社製）０．３７ｇ及び４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル（日本化成社製）１１．５４ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２９．３７ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤６を得た。
実施例１の工程（１）において、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）６．４１ｇ、シクロヘキシルメタクリレート（共栄社化学社製）０．３７ｇ及び４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル（日本化成社製）１１．５４ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２９．３７ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤６を得た。
（実施例７）
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．６２ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．９１ｇ及びグリセロールモノメタクリレート（三菱ガス化学社製）１３．５８ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２９．３８ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、得られた多孔質粒子５ｍＬ（沈降体積）をサクションドライし、水を加えて計７ｍＬの懸濁液とした。この懸濁液に５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．８ｍＬ、ＮａＢＨ4 ２４ｍｇ、及びエピクロロヒドリン４ｍＬを加え、２５℃で８時間振とうした。上記の反応液を純水、エタノール、純水の順で濾過洗浄を行い、エポキシ化多孔質粒子を得た。次に、粒子の濃度が１０質量％となるようにエポキシ化多孔質粒子を純水に分散させ、エポキシ化多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を得た。
次いで、未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、１．０Ｍ ２−メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム（東京化成工業社製）／０．１Ｍ 硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤７を得た。
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．６２ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．９１ｇ及びグリセロールモノメタクリレート（三菱ガス化学社製）１３．５８ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン（三井化学社製）２９．３８ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、得られた多孔質粒子５ｍＬ（沈降体積）をサクションドライし、水を加えて計７ｍＬの懸濁液とした。この懸濁液に５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．８ｍＬ、ＮａＢＨ4 ２４ｍｇ、及びエピクロロヒドリン４ｍＬを加え、２５℃で８時間振とうした。上記の反応液を純水、エタノール、純水の順で濾過洗浄を行い、エポキシ化多孔質粒子を得た。次に、粒子の濃度が１０質量％となるようにエポキシ化多孔質粒子を純水に分散させ、エポキシ化多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を得た。
次いで、未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、１．０Ｍ ２−メルカプトプロパンスルホン酸ナトリウム（東京化成工業社製）／０．１Ｍ 硫酸ナトリウム（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌することで、未反応のエポキシ基を開環させた。さらに、得られた未反応のエポキシ基が開環したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ 水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤７を得た。
（実施例８）
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）２．７０ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）１．８０ｇ及び（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル（東レ・ファインケミカル社製）１３．４９ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５２ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３５ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤８を得た。
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）２．７０ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）１．８０ｇ及び（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル（東レ・ファインケミカル社製）１３．４９ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５２ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３５ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤８を得た。
（比較例１）
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）５．４９ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）１２．８０ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５２ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３５ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤９を得た。
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）５．４９ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）１２．８０ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５２ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３５ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤９を得た。
（比較例２）
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）５．３４ｇ、イソブチルメタクリレート（共栄社化学社製）７．１１ｇ及び４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル（日本化成社製）５．３４ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５０ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３４ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１０を得た。
実施例１の工程（１）において、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）５．３４ｇ、イソブチルメタクリレート（共栄社化学社製）７．１１ｇ及び４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル（日本化成社製）５．３４ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５０ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３４ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１０を得た。
（比較例３）
実施例１の工程（１）において、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）６．２９ｇ、ラウリルメタクリレート（共栄社化学社製）５．３９ｇ及び（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル（東レ・ファインケミカル社製）６．２９ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５０ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３４ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１１を得た。
実施例１の工程（１）において、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）６．２９ｇ、ラウリルメタクリレート（共栄社化学社製）５．３９ｇ及び（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル（東レ・ファインケミカル社製）６．２９ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５０ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３４ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１１を得た。
（比較例４）
実施例１の工程（１）において、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）６．４１ｇ、イソブチルメタクリレート（共栄社化学社製）０．１８ｇ及び（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル（東レ・ファインケミカル社製）１１．７３ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５０ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３４ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１２を得た。
実施例１の工程（１）において、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）６．４１ｇ、イソブチルメタクリレート（共栄社化学社製）０．１８ｇ及び（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル（東レ・ファインケミカル社製）１１．７３ｇからなる単量体組成物を、アセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．５０ｇ及び２−オクタノン（東洋合成社製）７．３４ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した以外は、実施例１の工程（１）及び（２）と同様の操作を行い、多孔質粒子分散液を得た。
その後、実施例２と同様の操作でプロテインＡの固定、未反応のエポキシ基の開環、及び洗浄を実施し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤１２を得た。
試験例１（粒径の測定）
各実施例および比較例で得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤の平均粒子径を、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製 ＬＳ１３３２０）により測定した。結果を表１、２に示す。
各実施例および比較例で得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤の平均粒子径を、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製 ＬＳ１３３２０）により測定した。結果を表１、２に示す。
試験例２ （円形度分布の評価）
各実施例および比較例で得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤を純水で固形分濃度１０質量％に調整し、定量制御ダイヤフラムポンプ（タクミナ社製）を用いて６Ｌ／ｍｉｎの吐出速度で６０回の循環処理を行った。
その後、循環処理後のアフィニティクロマトグラフィー用充填剤を、固形分濃度が２．５質量％程度となるように水で希釈し、シスメックス社製フロー式粒子像分析装置（型番 ＦＰＩＡ−３０００）を用いてトータルカウント５００個にセットして各粒子の円形度（＝（粒子投影面積と同じ面積の円の周囲長／粒子投影像の周囲長）×１００）を測定した。
次いで、全測定対象粒子のうち円形度０．９５以上の粒子の個数を全測定粒子数で除することにより円形度０．９５以上の粒子分布（＝円形度０．９５以上の粒子数／測定粒子数×１００）を算出し、以下の基準で評価した。結果を表１、２に示す。
（円形度分布の評価基準）
８０％以上：良
８０％未満：不良
各実施例および比較例で得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤を純水で固形分濃度１０質量％に調整し、定量制御ダイヤフラムポンプ（タクミナ社製）を用いて６Ｌ／ｍｉｎの吐出速度で６０回の循環処理を行った。
その後、循環処理後のアフィニティクロマトグラフィー用充填剤を、固形分濃度が２．５質量％程度となるように水で希釈し、シスメックス社製フロー式粒子像分析装置（型番 ＦＰＩＡ−３０００）を用いてトータルカウント５００個にセットして各粒子の円形度（＝（粒子投影面積と同じ面積の円の周囲長／粒子投影像の周囲長）×１００）を測定した。
次いで、全測定対象粒子のうち円形度０．９５以上の粒子の個数を全測定粒子数で除することにより円形度０．９５以上の粒子分布（＝円形度０．９５以上の粒子数／測定粒子数×１００）を算出し、以下の基準で評価した。結果を表１、２に示す。
（円形度分布の評価基準）
８０％以上：良
８０％未満：不良
試験例３ （プロテインＡ結合量の定量）
各実施例および比較例で得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤に結合したリガンドであるプロテインＡの結合量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬を用いて定量した。具体的には、固形分換算で１ｍｇの充填剤をテストチューブに採取し、これについてＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ＫｉｔでプロテインＡの結合量を定量した。反応は、３７℃で３０分間、転倒混和することによって行った。検量線は、担体に結合させたプロテインＡと同一のものを用いて作成した。結果を表１、２に示す。
各実施例および比較例で得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤に結合したリガンドであるプロテインＡの結合量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬を用いて定量した。具体的には、固形分換算で１ｍｇの充填剤をテストチューブに採取し、これについてＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ＫｉｔでプロテインＡの結合量を定量した。反応は、３７℃で３０分間、転倒混和することによって行った。検量線は、担体に結合させたプロテインＡと同一のものを用いて作成した。結果を表１、２に示す。
試験例４ （ＤＢＣの測定）
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ Ｂｉｏ社製 ＨＧＧ−１０００）に対する実施例および比較例の各充填剤のＤＢＣを測定した。カラム容器は容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）にタンパク質を５ｍｇ／ｍＬ溶解したものをそれぞれ使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求め、以下の基準で評価した。結果を表１、２に示す。
（ＤＢＣの評価基準）
３５ｍｇ／ｍＬ以上：良
３５ｍｇ／ｍＬ未満：不良
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ Ｂｉｏ社製 ＨＧＧ−１０００）に対する実施例および比較例の各充填剤のＤＢＣを測定した。カラム容器は容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）にタンパク質を５ｍｇ／ｍＬ溶解したものをそれぞれ使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求め、以下の基準で評価した。結果を表１、２に示す。
（ＤＢＣの評価基準）
３５ｍｇ／ｍＬ以上：良
３５ｍｇ／ｍＬ未満：不良
試験例５ （ＨＣＰと凝集体の定量）
カラム容器（ＧＥヘルスケア社製Ｔｒｉｃｏｒｎ１０／５０ ｃｏｌｕｍｎ）に、実施例及び比較例の各充填剤を、充填高さ約５ｃｍで充填してカラムを作製した。得られたカラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ Ｐｌｕｓにそれぞれ接続し、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量（カラム容積の５倍）、流速１ｍＬ／分にて通液し、平衡化させた。
次いで、モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを含有するＣＨＯ細胞培養上清を、約２３ｍｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量で、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、及び２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を、それぞれ５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに順次通液した。
その後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）を、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Ａｂｓ．２８０＞１００ｍＡｕの溶出フラクションを回収した。
そして、分光光度計を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）を測定した。また、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製 ＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，３Ｇを用い、回収したフラクション中に含有されるＨｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を測定した。さらにＨＣＰの濃度を抗体濃度で除することにより、単位抗体量当たりのＨＣＰ量を算出し、以下の基準で評価した。結果を表１、２に示す。
また、各溶出液をゲルろ過クロマトグラフィーで分析し、各溶出フラクション（画分）の蛋白質ピークエリア値から抗体含量と抗体収率（ＹｉｅＩｄ）を求めた。また、蛋白質ピーク分析から単量体（モノマー）と凝集体（多量体）等の比率を求めた。精製前後での単量体と凝集体の比率より凝集体除去率を算出した。結果を表１、２に示す。
（ＨＣＰの評価基準）
４０００ｐｐｍ以下：良
４０００ｐｐｍ超：不良
（凝集体除去率の評価基準）
８０％以上：良
８０％未満：不良
カラム容器（ＧＥヘルスケア社製Ｔｒｉｃｏｒｎ１０／５０ ｃｏｌｕｍｎ）に、実施例及び比較例の各充填剤を、充填高さ約５ｃｍで充填してカラムを作製した。得られたカラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ Ｐｌｕｓにそれぞれ接続し、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量（カラム容積の５倍）、流速１ｍＬ／分にて通液し、平衡化させた。
次いで、モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを含有するＣＨＯ細胞培養上清を、約２３ｍｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量で、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、及び２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を、それぞれ５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに順次通液した。
その後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）を、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Ａｂｓ．２８０＞１００ｍＡｕの溶出フラクションを回収した。
そして、分光光度計を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）を測定した。また、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製 ＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，３Ｇを用い、回収したフラクション中に含有されるＨｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を測定した。さらにＨＣＰの濃度を抗体濃度で除することにより、単位抗体量当たりのＨＣＰ量を算出し、以下の基準で評価した。結果を表１、２に示す。
また、各溶出液をゲルろ過クロマトグラフィーで分析し、各溶出フラクション（画分）の蛋白質ピークエリア値から抗体含量と抗体収率（ＹｉｅＩｄ）を求めた。また、蛋白質ピーク分析から単量体（モノマー）と凝集体（多量体）等の比率を求めた。精製前後での単量体と凝集体の比率より凝集体除去率を算出した。結果を表１、２に示す。
（ＨＣＰの評価基準）
４０００ｐｐｍ以下：良
４０００ｐｐｍ超：不良
（凝集体除去率の評価基準）
８０％以上：良
８０％未満：不良
試験例６ （圧密線流速の測定）
各実施例および比較例で得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤を内径１６ｍｍ、充填高さ１００ｍｍとなるようにカラム容器に充填し、このカラムをＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡ ｐｉｌｏｔに接続した。次いで、線流速１００ｃｍ／ｈｒで純水の通液を開始して、線流速を５０ｃｍ／ｈｒずつ１分間毎に段階的に上げていき、一定線流速で流している１分間のあいだに０．０５ＭＰａを超える経時的な圧力増加が見られたときの線流速を圧密流速として記録した。３０００ｃｍ／ｈｒでもこのような圧力増加が見られない場合、測定を中止し、＞３０００ｃｍ／ｈｒと記録した。また、カラムの絶対圧力が１．９ＭＰａに達した場合、上記のような経時的な圧力増加が見られない場合でも測定を中止し、１．９ＭＰａに達したときの線流速を記録した。そして、圧密線流速について以下の基準で評価した。結果を表１、２に示す。
（圧密線流速の評価基準）
２０００ｃｍ／ｈｒ以上：良
２０００ｃｍ／ｈｒ未満：不良
各実施例および比較例で得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤を内径１６ｍｍ、充填高さ１００ｍｍとなるようにカラム容器に充填し、このカラムをＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡ ｐｉｌｏｔに接続した。次いで、線流速１００ｃｍ／ｈｒで純水の通液を開始して、線流速を５０ｃｍ／ｈｒずつ１分間毎に段階的に上げていき、一定線流速で流している１分間のあいだに０．０５ＭＰａを超える経時的な圧力増加が見られたときの線流速を圧密流速として記録した。３０００ｃｍ／ｈｒでもこのような圧力増加が見られない場合、測定を中止し、＞３０００ｃｍ／ｈｒと記録した。また、カラムの絶対圧力が１．９ＭＰａに達した場合、上記のような経時的な圧力増加が見られない場合でも測定を中止し、１．９ＭＰａに達したときの線流速を記録した。そして、圧密線流速について以下の基準で評価した。結果を表１、２に示す。
（圧密線流速の評価基準）
２０００ｃｍ／ｈｒ以上：良
２０００ｃｍ／ｈｒ未満：不良
表１、２中の各記号は以下の化合物を意味する。
（Ａ） ＤＶＢ：ジビニルベンゼン、ＴＭＰ：トリメチロールプロパントリメタクリレート
（Ｂ） ＥＶＢ：１−エチル−４−ビニルベンゼン、ＯＣＡＣ：ｎ−オクチルアクリレート、ＣＨＭＡ：シクロヘキシルメタクリレート、ＩＢＭＡ：イソブチルメタクリレート
（Ｂ’） ＬａｕＭＡ：ラウリルメタクリレート
（Ｃ） ＳＴ：スチレン、ＧＭＡ：グリシジルメタクリレート、ＨＢＡＧＥ：４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル、ＧＬＭ：グリセロールモノメタクリレート、ＶＢＧＥ：（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル
（Ａ） ＤＶＢ：ジビニルベンゼン、ＴＭＰ：トリメチロールプロパントリメタクリレート
（Ｂ） ＥＶＢ：１−エチル−４−ビニルベンゼン、ＯＣＡＣ：ｎ−オクチルアクリレート、ＣＨＭＡ：シクロヘキシルメタクリレート、ＩＢＭＡ：イソブチルメタクリレート
（Ｂ’） ＬａｕＭＡ：ラウリルメタクリレート
（Ｃ） ＳＴ：スチレン、ＧＭＡ：グリシジルメタクリレート、ＨＢＡＧＥ：４−ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル、ＧＬＭ：グリセロールモノメタクリレート、ＶＢＧＥ：（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル
Claims (17)
- （成分Ａ）ポリビニルモノマーに由来するモノマー単位と、（成分Ｂ）炭素数１〜８のアルキル基を側鎖に有するモノマー単位と、を有するポリマーを含み、
前記ポリマー中における成分Ａと成分Ｂとの含有割合〔（Ａ）：（Ｂ）〕が、質量比で９５：５〜５０：５０であり、
成分Ａの含有量が、前記ポリマー中の全モノマー単位に対して、０．５〜４０質量％であることを特徴とする、
多孔質担体。 - 成分Ａが、芳香族系多官能モノマーに由来するモノマー単位及び多官能（メタ）アクリレート類に由来するモノマー単位から選ばれる１種以上である、請求項１に記載の多孔質担体。
- 成分Ａが、ジビニルベンゼンに由来するモノマー単位、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位、及びエチレングリコールジ（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位から選ばれる１種以上である、請求項１又は２に記載の多孔質担体。
- 成分Ｂが、モノビニルモノマーに由来するモノマー単位である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多孔質担体。
- 成分Ｂが、炭素数１〜８のアルキル基を有する芳香族系モノマーに由来するモノマー単位及び炭素数１〜８のアルキル基を有するアルキル（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位から選ばれる１種以上である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の多孔質担体。
- 前記アルキル基が２価の連結基を介して前記ポリマーの主鎖に結合している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔質担体。
- 前記アルキル基の炭素数が２〜８である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の多孔質担体。
- 成分Ｂが、アルキルビニルベンゼンに由来するモノマー単位である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多孔質担体。
- 前記ポリマーが、さらに（成分Ｃ）成分Ａ及び成分Ｂを除く単官能モノマーに由来するモノマー単位を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の多孔質担体。
- 成分Ｃの含有量が、前記ポリマー中の全モノマー単位に対して、２０〜９９．５質量％である、請求項９に記載の多孔質担体。
- 成分Ｃが、グリシジル（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位、グリセロールモノ（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテルに由来するモノマー単位、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレートに由来するモノマー単位、ビニルベンジルグリシジルエーテルに由来するモノマー単位、及びスチレンに由来するモノマー単位から選ばれる１種以上である、請求項９又は１０に記載の多孔質担体。
- 粒子状、モノリス状、板状、繊維状又は膜状である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の多孔質担体。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多孔質担体にアフィニティリガンドを結合させたことを特徴とする、
アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体。 - 請求項１３に記載のクロマトグラフィー用多孔質担体を用いる、
標的物の精製方法。 - 請求項１３に記載のクロマトグラフィー用多孔質担体と、アフィニティリガンドが捕捉しうる標的物とを接触させる工程Ａと、
前記リガンドと前記標的物とを解離させる解離液と、前記工程Ａで標的物を捕捉した担体とを接触させて標的物を解離させる工程Ｂと、を含む、
標的物の精製方法。 - 前記工程Ｂが、アフィニティリガンドから標的物が解離する条件下で、イオン強度が段階的に高くなる塩濃度を２種類以上使用するステップワイズ方式、又は勾配的に塩濃度を高くするグラジェント方式により解離する工程である、請求項１５に記載の精製方法。
- 請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の精製方法により精製された、抗体。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| JP2016035622A JP2019070528A (ja) | 2016-02-26 | 2016-02-26 | 多孔質担体、アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体、標的物の精製方法、及び抗体 |
| TW106106503A TW201731592A (zh) | 2016-02-26 | 2017-02-24 | 親和層析用多孔質擔體、配體結合多孔質擔體、標的物之純化方法、及抗體 |
| PCT/JP2017/007172 WO2017146225A1 (ja) | 2016-02-26 | 2017-02-24 | アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体、リガンド結合多孔質担体、標的物の精製方法、及び抗体 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016035622A JP2019070528A (ja) | 2016-02-26 | 2016-02-26 | 多孔質担体、アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体、標的物の精製方法、及び抗体 |
Publications (1)
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2016035622A Pending JP2019070528A (ja) | 2016-02-26 | 2016-02-26 | 多孔質担体、アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体、標的物の精製方法、及び抗体 |
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