JP6602533B2 - 担体の製造方法、担体、クロマトグラフィーカラム、及び目的物質の精製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、担体の製造方法、担体、クロマトグラフィーカラム、及び目的物質の精製方法に関する。より詳細には、クロマトグラフィー精製用担体の製造方法、クロマトグラフィー精製用担体、クロマトグラフィーカラム、及び目的物質の精製方法に関する。
近年、抗体医薬等に代表されるバイオ医薬品の分野では、タンパク質等の目的物質の発現技術が著しく進展し、それに伴いクロマトグラフィー等による精製工程での生産性の向上が求められている。生産性を向上させる方法として、宿主細胞由来タンパク質、デオキシリボ核酸のような、医薬品原料に混在する不純物の濃度を１回の精製で可能な限り低減させ、精製回数や工程を少なくすることが挙げられる。これを実現できるクロマトグラフィー精製用担体の需要が高まっている。
そして、精製工程における不純物除去効率を向上させるためには、不純物と固相担体との疎水性相互作用による非特異吸着を抑制し、固相担体に対する不純物の付着を抑える必要がある。斯様な付着を抑える有効な方法として、固相担体の親水化が知られている（特許文献１）。
また、化学合成によって動的結合容量が高いアフィニティー精製用担体を得ることを目的として、懸濁重合により合成したエポキシ基含有ビニル単量体等の共重合体からなる固相担体にリガンドを結合した後、チオグリセロールで処理し、リガンドが結合していない残余のエポキシ基を開環させることが提案されている（特許文献２）。
また、化学合成によって動的結合容量が高いアフィニティー精製用担体を得ることを目的として、懸濁重合により合成したエポキシ基含有ビニル単量体等の共重合体からなる固相担体にリガンドを結合した後、チオグリセロールで処理し、リガンドが結合していない残余のエポキシ基を開環させることが提案されている（特許文献２）。
本発明が解決しようとする課題は、充分な動的結合容量を備えるのみならず、優れた防汚性を有する担体を製造する方法を提供することにある。
そこで、本発明者は、スルフィド基を有し且つリガンドが固定された固相担体を酸化して、スルフィド基の少なくとも一部をスルフィニル基とする酸化工程を含む製造方法により、充分な動的結合容量を備えるのみならず、優れた防汚性を有する担体を、簡便に製造できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、＜１＞スルフィド基を有し且つリガンドが固定された固相担体を酸化して、前記スルフィド基の少なくとも一部をスルフィニル基とする酸化工程を含むことを特徴とする、担体の製造方法を提供するものである。
また、本発明は、＜２＞上記＜１＞の製造方法で得られる、担体を提供するものである。
更に、本発明は、＜３＞リガンドが固定されたクロマトグラフィー精製用担体であって、担体表面の表面分析をしたときのスルフィニル基の割合が、スルフィド基とスルフィニル基との総和を１００％として、６０％以上であることを特徴とする、クロマトグラフィー精製用担体を提供するものである。
更に、本発明は、＜４＞上記＜２＞又は＜３＞の担体がカラム容器に充填された、クロマトグラフィーカラムを提供するものである。
更に、本発明は、＜５＞上記＜４＞のクロマトグラフィーカラムに、目的物質を含む組成物を通液する工程を含むことを特徴とする、目的物質の精製方法を提供するものである。
本発明の製造方法によれば、充分な動的結合容量を備えるのみならず、優れた防汚性を有する担体を簡便に製造できる。
したがって、本発明の担体は、充分な動的結合容量を備え、且つ防汚性に優れる。
したがって、本発明の担体は、充分な動的結合容量を備え、且つ防汚性に優れる。
＜担体及びその製造方法＞
本発明の担体の製造方法は、スルフィド基（−Ｓ−）を有し且つリガンドが固定された固相担体を酸化して、固相担体に含まれるスルフィド基の少なくとも一部をスルフィニル基（−（Ｓ＝Ｏ）−）とする酸化工程を含むことを特徴とするものである。
まず、酸化工程に用いる固相担体について詳細に説明する。
本発明の担体の製造方法は、スルフィド基（−Ｓ−）を有し且つリガンドが固定された固相担体を酸化して、固相担体に含まれるスルフィド基の少なくとも一部をスルフィニル基（−（Ｓ＝Ｏ）−）とする酸化工程を含むことを特徴とするものである。
まず、酸化工程に用いる固相担体について詳細に説明する。
（固相担体）
酸化工程に用いる固相担体は、スルフィド基を有し且つリガンドが固定されたものである。
上記固相担体としては、スルフィド基を有し且つリガンドが固定されたものであれば特に限定されないが、動的結合容量及び防汚性の観点から、下記式（１）、（２）又は（３）で表される２価の部分構造を有し、且つリガンドが固定された樹脂を含む固相担体が好ましく、上記部分構造を含む１価又は２価の基を有し、且つリガンドが固定された樹脂を含む固相担体がより好ましく、上記部分構造を含む１価の基を有し、且つリガンドが固定された樹脂を含む固相担体（以下、この固相担体を固相担体（Ａ）とも称する。）が更に好ましい。なお、固相担体が上記１価又は２価の基を有する場合、当該１価又は２価の基を樹脂の表面に有するのが好ましい。
酸化工程に用いる固相担体は、スルフィド基を有し且つリガンドが固定されたものである。
上記固相担体としては、スルフィド基を有し且つリガンドが固定されたものであれば特に限定されないが、動的結合容量及び防汚性の観点から、下記式（１）、（２）又は（３）で表される２価の部分構造を有し、且つリガンドが固定された樹脂を含む固相担体が好ましく、上記部分構造を含む１価又は２価の基を有し、且つリガンドが固定された樹脂を含む固相担体がより好ましく、上記部分構造を含む１価の基を有し、且つリガンドが固定された樹脂を含む固相担体（以下、この固相担体を固相担体（Ａ）とも称する。）が更に好ましい。なお、固相担体が上記１価又は２価の基を有する場合、当該１価又は２価の基を樹脂の表面に有するのが好ましい。
〔式（１）中、
Ｒ1は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
Ｒ1は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
〔式（３）中、
Ｒ2は、カルボニル基又は＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を示し、＊は、式（３）中のイオウ原子と結合する位置を示す。〕
Ｒ2は、カルボニル基又は＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を示し、＊は、式（３）中のイオウ原子と結合する位置を示す。〕
また、動的結合容量及び防汚性の観点から、式（１）で表される部分構造を含む１価の基としては、下記式（４）又（５）で表される１価の基が好ましく、式（２）で表される部分構造を含む１価の基としては、下記式（６）又（７）で表される１価の基が好ましく、式（３）で表される部分構造を含む１価の基としては、下記式（８）又（９）で表される１価の基が好ましい。
〔式（４）中、
Ｒ3は、炭素数１〜１０の１価の有機基を示し、
Ｒ1は、前記と同義であり、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
Ｒ3は、炭素数１〜１０の１価の有機基を示し、
Ｒ1は、前記と同義であり、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
〔式（５）〜（９）中の各記号は前記と同義であり、Ｒ1は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を、Ｒ2は、カルボニル基又は＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を、Ｒ3は、炭素数１〜１０の１価の有機基を、それぞれ示す。〕
各式中のＲ1は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。斯かる２価の炭化水素基の炭素数としては１が好ましい。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
各式中のＲ3は、炭素数１〜１０の１価の有機基を示す。斯かる１価の有機基の炭素数としては、動的結合容量及び防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
また、Ｒ3における上記１価の有機基としては、１価の炭化水素基、該１価の炭化水素基に含まれる水素原子の少なくとも１個以上が親水性基に置換された基、−（ＲaＯ）p−Ｈ（Ｒaは炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、ｐは１〜３０の整数を示す）が挙げられる。これらは直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、Ｒ3における上記１価の炭化水素基は、１価の脂肪族炭化水素基、１価の脂環式炭化水素基及び１価の芳香族炭化水素基を包含する概念であるが、好ましくは１価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルキル基である。斯かるアルキル基の炭素数としては、動的結合容量及び防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
上記Ｒ3におけるアルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
上記Ｒ3におけるアルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
また、Ｒ3が親水性基を有する場合の上記親水性基としては、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、リン酸基、ホルミル基等が挙げられるが、動的結合容量及び防汚性の観点から、ヒドロキシ基が好ましい。
また、親水性基の置換位置および個数は任意であるが、その個数は、動的結合容量及び防汚性の観点から、好ましくは１〜６個であり、より好ましくは１〜４個であり、特に好ましくは１〜２個である。
また、親水性基の置換位置および個数は任意であるが、その個数は、動的結合容量及び防汚性の観点から、好ましくは１〜６個であり、より好ましくは１〜４個であり、特に好ましくは１〜２個である。
また、上記−（ＲaＯ）p−Ｈにおいて、Ｒaで示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２または３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、好適な具体例としては、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基が挙げられる。
また、ｐは１〜３０の整数を示すが、１〜２５の整数が好ましく、１〜２０の整数がより好ましく、１〜１５の整数が更に好ましく、１〜１０の整数が更に好ましく、１〜５の整数が更に好ましく、１〜３の整数が特に好ましい。
また、ｐは１〜３０の整数を示すが、１〜２５の整数が好ましく、１〜２０の整数がより好ましく、１〜１５の整数が更に好ましく、１〜１０の整数が更に好ましく、１〜５の整数が更に好ましく、１〜３の整数が特に好ましい。
斯様なＲ3の中でも、１価の炭化水素基に含まれる水素原子の少なくとも１個以上が親水性基に置換された基が好ましく、好適な具体例としては、下記式（１４）で表されるものが挙げられる。
〔式（１４）中、Ｒ6は炭素数１〜１０の２価又は３価の有機基を示し、ｑは１または２を示す。〕
式（１４）中、Ｒ6で示される２価又は３価の有機基の炭素数としては、動的結合容量及び防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
また、Ｒ6における上記２価の有機基としては、２価の炭化水素基が挙げられ、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。斯かるアルカンジイル基の炭素数としては、動的結合容量及び防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
上記アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられる。
上記アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられる。
また、Ｒ6における上記３価の有機基としては、３価の炭化水素基が挙げられ、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。上記３価の炭化水素基は、好ましくは３価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。斯かるアルカントリイル基の炭素数としては、動的結合容量及び防汚性の観点から、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、２〜４が更に好ましい。
Ｒ6における上記アルカントリイル基の具体例としては、メタン−１，１，１−トリイル基、エタン−１，１，２−トリイル基、プロパン−１，２，３−トリイル基、プロパン−１，２，２−トリイル基等が挙げられる。
また、式（１４）中、ｑとしては、動的結合容量及び防汚性の観点から、２が好ましい。
上記のような式（４）〜（９）で表される１価の基の中でも、式（４）、（６）又は（８）で表される１価の基が好ましく、式（４）又は（６）で表される１価の基がより好ましく、式（４）で表される１価の基が更に好ましい。
また、固相担体（Ａ）に含まれる樹脂としては、防汚性の観点から、下記式（１０）で表される２〜４価の構造を更に有するものが好ましく、斯かる２〜４価の構造を樹脂の表面に有するものがより好ましい。
〔式（１０）中、
Ｒ4は、ｎ価の有機基を示し、
Ｘ1は、それぞれ独立して、下記式（１１）、（１２）又は（１３）で表される部分構造を示し、
ｎは２〜４の整数を示す。〕
Ｒ4は、ｎ価の有機基を示し、
Ｘ1は、それぞれ独立して、下記式（１１）、（１２）又は（１３）で表される部分構造を示し、
ｎは２〜４の整数を示す。〕
〔式（１１）中、
Ｙ1は、スルフィド基（−Ｓ−）又はオキシ基（−Ｏ−）を示し、
Ｒ1は、前記と同義であり、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
Ｙ1は、スルフィド基（−Ｓ−）又はオキシ基（−Ｏ−）を示し、
Ｒ1は、前記と同義であり、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
〔式（１２）中、
Ｙ1は、前記と同義である。〕
Ｙ1は、前記と同義である。〕
〔式（１３）中、
Ｒ5は、カルボニル基又は＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を示し、＊は、式（１３）中のＹ1と結合する位置を示し、
Ｙ1は、前記と同義である。〕
Ｒ5は、カルボニル基又は＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を示し、＊は、式（１３）中のＹ1と結合する位置を示し、
Ｙ1は、前記と同義である。〕
以下、構造（１０）について詳細に説明する。
式（１０）中、Ｒ4は、ｎ価の有機基を示す。ｎは２〜４の整数であるが、２または３が好ましく、２がより好ましい。なお、ｎが２である場合の構造（１０）は、下記式（１０−２）で表される。
式（１０）中、Ｒ4は、ｎ価の有機基を示す。ｎは２〜４の整数であるが、２または３が好ましく、２がより好ましい。なお、ｎが２である場合の構造（１０）は、下記式（１０−２）で表される。
〔式（１０−２）中、Ｒ4-2は２価の有機基を示し、Ｘ1は前記と同義であり、それぞれ独立して、式（１１）、（１２）又は（１３）で表される部分構造を示す。〕
また、Ｒ4における２価の有機基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、斯かる２価の有機基としては、２価の炭化水素基、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられ、これらは、置換基として親水性基を有していてもよい。親水性基としては、ヒドロキシ基、カルボキシ基、スルフィド基、アミノ基、スルホ基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基、シアノ基等が挙げられる。斯かる親水性基の置換位置及び個数は任意であるが、その個数は、動的結合容量及び防汚性の観点から、好ましくは０〜６個であり、より好ましくは０〜４個であり、更に好ましくは０〜２個である。
また、上記２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数は、動的結合容量及び防汚性の観点から、好ましくは１〜２０であり、より好ましくは１〜１０であり、更に好ましくは１〜６であり、特に好ましくは２〜６である。一方、２価の有機基が炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基である場合、その炭素数は、動的結合容量及び防汚性の観点から、好ましくは２〜２０であり、より好ましくは２〜１０であり、特に好ましくは２〜６である。
これらＲ4における「２価の炭化水素基」は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。
アルカンジイル基の具体例としては、例えば、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
これらＲ4における「２価の炭化水素基」は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。また、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。
アルカンジイル基の具体例としては、例えば、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
また、上記炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基としては、動的結合容量及び防汚性の観点から、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合を有する基が好ましく、−Ｒb（ＯＲc）mＯＲd−で表される基がより好ましい（Ｒb、Ｒc及びＲdは、それぞれ独立して炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、ｍは０〜３０の整数を示す）。
上記Ｒb、Ｒc及びＲdで示されるアルカンジイル基の炭素数としては、２又は３が好ましく、２がより好ましい。また、斯かるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよいが、好適な具体例としては、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基が挙げられる。
また、ｍは０〜３０の整数を示すが、動的結合容量及び防汚性の観点から、０〜２５の整数が好ましく、０〜２０の整数がより好ましく、０〜１５の整数が更に好ましく、０〜１０の整数が更に好ましく、１〜５の整数が更に好ましく、１〜３の整数が特に好ましい。
なお、上記Ｒ4-2は、Ｒ4で示される２価の有機基と同じである。
また、ｍは０〜３０の整数を示すが、動的結合容量及び防汚性の観点から、０〜２５の整数が好ましく、０〜２０の整数がより好ましく、０〜１５の整数が更に好ましく、０〜１０の整数が更に好ましく、１〜５の整数が更に好ましく、１〜３の整数が特に好ましい。
なお、上記Ｒ4-2は、Ｒ4で示される２価の有機基と同じである。
また、式（１０）中、Ｘ1は、それぞれ独立して、下記式（１１）、（１２）又は（１３）で表される２価の部分構造を示すが、式（１１）又は（１２）で表される部分構造が好ましく、式（１１）で表される部分構造がより好ましい。
〔式（１１）中、
Ｙ1は、スルフィド基（−Ｓ−）又はオキシ基（−Ｏ−）を示し、
Ｒ1は、前記と同義であり、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
Ｙ1は、スルフィド基（−Ｓ−）又はオキシ基（−Ｏ−）を示し、
Ｒ1は、前記と同義であり、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
〔式（１２）中、
Ｙ1は、前記と同義である。〕
Ｙ1は、前記と同義である。〕
〔式（１３）中、
Ｒ5は、カルボニル基又は＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を示し、＊は、式（１３）中のＹ1と結合する位置を示し、
Ｙ1は、前記と同義である。〕
Ｒ5は、カルボニル基又は＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を示し、＊は、式（１３）中のＹ1と結合する位置を示し、
Ｙ1は、前記と同義である。〕
上記式（１１）中、Ｒ1は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。斯かる２価の炭化水素基の炭素数としては１が好ましい。また、２価の炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
また、上記２価の炭化水素基は、好ましくは２価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
また、上記式（１１）〜（１３）中、Ｙ1は、スルフィド基又はオキシ基を示す。
なお、式（１１）、（１２）又は（１３）で表される２価の部分構造はＹ1側の結合手がＲ4と結合していてもよく、他方の結合手がＲ4と結合していてもよい。
また、固定されたリガンドは、目的物質と結合する分子であればよいが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクローナル抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質；イミノジ酢酸、合成色素、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物が挙げられる。なお、上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
斯様なリガンドの中でも、精製の目的物質が抗体である場合は、アミノ基を含むものが好ましく、タンパク質、ペプチドがより好ましく、タンパク質が更に好ましく、イムノグロブリン結合タンパク質が更に好ましく、プロテインＡが特に好ましい。
斯様なリガンドの中でも、精製の目的物質が抗体である場合は、アミノ基を含むものが好ましく、タンパク質、ペプチドがより好ましく、タンパク質が更に好ましく、イムノグロブリン結合タンパク質が更に好ましく、プロテインＡが特に好ましい。
また、固相担体としては、天然高分子系担体；合成高分子系担体；シリカ、ゼオライト等に由来する無機系担体が挙げられるが、天然高分子系担体、合成高分子系担体が好ましい。固相担体が天然高分子系担体である場合、固相担体に含まれる樹脂としては、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類由来のものが挙げられる。
また、固相担体が合成高分子系担体である場合、固相担体に含まれる樹脂としては、環を構成する原子数が３〜７個の環状エーテル基含有不飽和モノマー（以下、単に官能基含有モノマーとも称する）を少なくとも含むモノマー部に由来するものが好ましく、エポキシ基含有不飽和モノマー及び１，２−エポキシシクロヘキシル基含有不飽和モノマーから選ばれる官能基含有モノマーを少なくとも含むモノマー部に由来するものがより好ましい。
エポキシ基含有不飽和モノマーとしては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、α−（メタ）アクリル−ω−グリシジルポリエチレングリコール、（４−ビニルベンジル）グリシジルエーテル、アリルグリシジルエーテル、３，４−エポキシ−１−ブテン、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブテン等が挙げられる。また、１，２−エポキシシクロヘキシル基含有不飽和モノマーとしては、１−ビニル−３，４−エポキシシクロヘキサン、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記モノマー部は、これら官能基不飽和モノマーのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて含んでいてよい。
上記モノマー部は、これら官能基不飽和モノマーのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて含んでいてよい。
また、官能基含有モノマーに由来する構造単位の含有量としては、動的結合容量及び防汚性の観点から、樹脂総量１００質量部に対し、１〜９０質量部が好ましく、５〜８０質量部がより好ましく、１０〜７０質量部が特に好ましい。
また、上記モノマー部は、官能基含有モノマー以外のモノマー（以下、他のモノマーとも称する）を含んでいてもよい。他のモノマーとしては、非架橋性モノマー、架橋性モノマーのいずれも使用でき、これらを併用してもよい。
上記非架橋性モノマーとしては、（メタ）アクリレート系非架橋性モノマー、（メタ）アクリルアミド系非架橋性モノマー、スチレン系非架橋性モノマー、ビニルケトン系非架橋性モノマー、（メタ）アクリロニトリル系非架橋性モノマー、Ｎ−ビニルアミド系非架橋性モノマー等が挙げられる。
上記（メタ）アクリレート系非架橋性モノマーは、ヒドロキシ基含有（メタ）アクリレート系非架橋性モノマーと、ヒドロキシ基を含まない（メタ）アクリレート系非架橋性モノマーに大別される。
ヒドロキシ基含有（メタ）アクリレート系非架橋性モノマーとしては、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ヒドロキシ基を含まない（メタ）アクリレート系非架橋性モノマーとしては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシポリアルキレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ヒドロキシ基含有（メタ）アクリレート系非架橋性モノマーとしては、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート、ヒドロキシメチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
ヒドロキシ基を含まない（メタ）アクリレート系非架橋性モノマーとしては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシポリアルキレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。
また、上記（メタ）アクリルアミド系非架橋性モノマーとしては、（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロイルモルホリン、ダイアセトン（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
また、上記スチレン系非架橋性モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等が挙げられる。
また、上記ビニルケトン系非架橋性モノマーとしては、エチルビニルケトン、プロピルビニルケトン、イソプロピルビニルケトン等が挙げられる。
また、上記（メタ）アクリロニトリル系非架橋性モノマーとしては、例えば、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等が挙げられる。
また、上記Ｎ−ビニルアミド系非架橋性モノマーとしては、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニルプロパミド等が挙げられる。
また、非架橋性モノマーに由来する構造単位の含有量としては、動的結合容量及び防汚性の観点から、樹脂総量１００質量部に対し、０〜８０質量部が好ましく、５〜７０質量部がより好ましく、１０〜６０質量部が更に好ましく、１０〜４０質量部が特に好ましい。
また、上記架橋性モノマーとしては、（メタ）アクリレート系架橋性モノマー；ジビニルベンゼン等のビニル系架橋性モノマーが挙げられ、（メタ）アクリレート系架橋性モノマーが好ましい。また、２〜５官能のものが好ましく、２又は３官能のものがより好ましい。
上記（メタ）アクリレート系架橋性モノマーとしては、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、及びペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレートから選ばれる１種又は２種が挙げられる。
また、架橋性モノマーに由来する構造単位の含有量としては、耐圧性能の観点から、樹脂総量１００質量部に対し、１〜９０質量部が好ましく、１０〜８０質量部がより好ましく、２０〜７０質量部が特に好ましい。
また、固相担体の形状は、モノリス（連続体）、膜、中空繊維、粒子、カセット、チップ等のいずれでもよいが、モノリス、膜、粒子が好ましく、粒子がより好ましい。粒子は、球状粒子でも非球状粒子でもよい。
また、固相担体としては、表面積を大きくする観点から、多孔質粒子等の多孔質化されたものが好ましい。また、多孔質粒子としては、多孔質ポリマー粒子が好ましい。
また、固相担体としては、表面積を大きくする観点から、多孔質粒子等の多孔質化されたものが好ましい。また、多孔質粒子としては、多孔質ポリマー粒子が好ましい。
（固相担体の製法）
上記酸化工程に用いる固相担体は、国際公開第２０１１／１２５６７４号等を参考にして常法に従い製造すればよい。例えば、以下の〔ＰＲ−１〕〜〔ＰＲ−４〕の方法が挙げられる。
上記酸化工程に用いる固相担体は、国際公開第２０１１／１２５６７４号等を参考にして常法に従い製造すればよい。例えば、以下の〔ＰＲ−１〕〜〔ＰＲ−４〕の方法が挙げられる。
〔ＰＲ−１〕チオール基と反応してスルフィド基を形成する基（エポキシ基や１，２−エポキシシクロヘキシル基、カルボキシ基等）を有する樹脂を含む固相に、リガンドを固定し、さらに、チオール基を有する化合物を反応させる（スルフィド基形成反応）方法。
〔ＰＲ−２〕チオール基と反応してスルフィド基を形成する基を有する樹脂を含む固相に、チオール基を有する化合物を反応させ（スルフィド基形成反応）、さらに、リガンドを固定し、必要に応じて、チオール基を有する化合物を再度反応させる方法。
〔ＰＲ−３〕チオール基を有する樹脂を含む固相に、リガンドを固定し、さらに、チオール基と反応してスルフィド基を形成する基を有する化合物を反応させる方法。
〔ＰＲ−４〕チオール基を有する樹脂を含む固相に、チオール基と反応してスルフィド基を形成する基を有する化合物を反応させ、さらに、リガンドを固定し、必要に応じて、チオール基と反応してスルフィド基を形成する基を有する化合物を再度反応させる方法。
〔ＰＲ−２〕チオール基と反応してスルフィド基を形成する基を有する樹脂を含む固相に、チオール基を有する化合物を反応させ（スルフィド基形成反応）、さらに、リガンドを固定し、必要に応じて、チオール基を有する化合物を再度反応させる方法。
〔ＰＲ−３〕チオール基を有する樹脂を含む固相に、リガンドを固定し、さらに、チオール基と反応してスルフィド基を形成する基を有する化合物を反応させる方法。
〔ＰＲ−４〕チオール基を有する樹脂を含む固相に、チオール基と反応してスルフィド基を形成する基を有する化合物を反応させ、さらに、リガンドを固定し、必要に応じて、チオール基と反応してスルフィド基を形成する基を有する化合物を再度反応させる方法。
これら〔ＰＲ−１〕〜〔ＰＲ−４〕の方法の中でも、固相担体を簡便に得る観点からは、〔ＰＲ−１〕又は〔ＰＲ−２〕の方法が好ましい。以下、〔ＰＲ−１〕又は〔ＰＲ−２〕の方法について説明する。
上記チオール基と反応してスルフィド基を形成する基を有する樹脂を含む固相は、常法に従い懸濁重合することで得ることができる。当該固相の製法としては、例えば、モノマー部及び多孔化剤を含む混合溶液を水系媒体中に懸濁させて、重合開始剤を添加し重合させる方法等が挙げられる。
また、リガンドの固定も常法に従い行えばよい。リガンドの使用量は、固相１００質量部に対し、通常５〜３０質量部程度であるが、好ましくは９〜１８質量部である。
また、リガンドの固定も常法に従い行えばよい。リガンドの使用量は、固相１００質量部に対し、通常５〜３０質量部程度であるが、好ましくは９〜１８質量部である。
（スルフィド基形成反応）
チオール基を有する化合物としては、単官能チオール、多官能チオールが挙げられる。単官能チオールとは、分子中にチオール基を１個有するチオール化合物のことをいい、多官能チオールとは、分子中にチオール基を２個以上有するチオール化合物のことをいう。
単官能チオールとしては、メタンチオール、チオグリセロール、２−メルカプトエタノール等が挙げられる。
多官能チオールとしては、エチレンジチオール、１，６−ヘキサンジチオール、ビス（２−メルカプトエチル）エーテル、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール等の２官能チオール；トリメチロールプロパントリチオグリコラート等の３官能チオール等が挙げられる。
チオール基を有する化合物として単官能チオールを使用し、これを固相に含まれる樹脂のエポキシ基に反応させた場合には、式（１）で表される部分構造を含む１価の基を有し、且つリガンドが固定された樹脂を含む固相担体を得ることができる。また、チオール基を有する化合物として２官能チオールを使用し、これを固相に含まれる樹脂のエポキシ基に反応させた場合には、式（１）で表される部分構造を２個含む２価の基（架橋構造）を有し、且つリガンドが固定された樹脂を含む固相担体を得ることができる。
チオール基を有する化合物としては、単官能チオール、多官能チオールが挙げられる。単官能チオールとは、分子中にチオール基を１個有するチオール化合物のことをいい、多官能チオールとは、分子中にチオール基を２個以上有するチオール化合物のことをいう。
単官能チオールとしては、メタンチオール、チオグリセロール、２−メルカプトエタノール等が挙げられる。
多官能チオールとしては、エチレンジチオール、１，６−ヘキサンジチオール、ビス（２−メルカプトエチル）エーテル、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール等の２官能チオール；トリメチロールプロパントリチオグリコラート等の３官能チオール等が挙げられる。
チオール基を有する化合物として単官能チオールを使用し、これを固相に含まれる樹脂のエポキシ基に反応させた場合には、式（１）で表される部分構造を含む１価の基を有し、且つリガンドが固定された樹脂を含む固相担体を得ることができる。また、チオール基を有する化合物として２官能チオールを使用し、これを固相に含まれる樹脂のエポキシ基に反応させた場合には、式（１）で表される部分構造を２個含む２価の基（架橋構造）を有し、且つリガンドが固定された樹脂を含む固相担体を得ることができる。
〔式（１）中、
Ｒ1は、前記と同義であり、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
Ｒ1は、前記と同義であり、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示す。〕
チオール基を有する化合物の使用量は、チオール基と反応してスルフィド基を形成する基１モルに対し、通常０．１〜１２モル当量、好ましくは１〜１０モル当量である。
また、スルフィド基形成反応の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度である。また、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常２〜１００℃程度である。
（酸化）
本発明の製造方法は、固相担体に含まれるスルフィド基の少なくとも一部を酸化してスルフィニル基とするものである。当該酸化は、常法に従い行えばよく、例えば、酸化剤を用いた酸化が挙げられる。
上記酸化剤は、有機酸化剤と無機酸化剤とに大別され、有機酸化剤としては、例えば、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸等が挙げられる。一方、無機酸化剤としては、例えば、過酸化水素、クロム酸、過マンガン酸塩等が挙げられる。なお、これら酸化剤は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
また、酸化剤の使用量は、固相担体のスルフィド基１モルに対し、通常０．１〜１０モル当量程度であるが、好ましくは０．５〜５モル当量であり、より好ましくは０．５〜３モル当量である。
本発明の製造方法は、固相担体に含まれるスルフィド基の少なくとも一部を酸化してスルフィニル基とするものである。当該酸化は、常法に従い行えばよく、例えば、酸化剤を用いた酸化が挙げられる。
上記酸化剤は、有機酸化剤と無機酸化剤とに大別され、有機酸化剤としては、例えば、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸等が挙げられる。一方、無機酸化剤としては、例えば、過酸化水素、クロム酸、過マンガン酸塩等が挙げられる。なお、これら酸化剤は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
また、酸化剤の使用量は、固相担体のスルフィド基１モルに対し、通常０．１〜１０モル当量程度であるが、好ましくは０．５〜５モル当量であり、より好ましくは０．５〜３モル当量である。
なお、酸化工程は、溶媒存在下で行ってもよい。斯かる溶媒としては、水；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒等が挙げられ、これら溶媒は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。溶媒を使用する場合、その使用量は、固相担体１００質量部に対し、通常５００〜１５００質量部程度である。
また、酸化工程の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常１〜７０℃程度である。
なお、上記酸化工程で得られる反応生成物を、ろ過、洗浄等の分離手段で精製してもよい。
なお、上記酸化工程で得られる反応生成物を、ろ過、洗浄等の分離手段で精製してもよい。
そして、上記製造方法によって得られる本発明の担体は、動的結合容量、特に目的タンパク質に対する動的結合容量を充分に備え、且つ防汚性に優れるため、クロマトグラフィー精製への使用に適し、アフィニティー精製への使用に特に適する。
以下に、本発明の担体の形態について具体的に説明する。
以下に、本発明の担体の形態について具体的に説明する。
本発明の担体が粒子である場合、平均粒径（体積平均粒径）は、動的結合容量及び耐圧性能の観点から、好ましくは２０〜１５０μｍであり、より好ましくは４０〜１００μｍである。また、平均粒径の変動係数は、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは３０％以下である。
また、比表面積は、動的結合容量の観点から、ポアサイズ１０ｎｍ〜５０００ｎｍにおける比表面積で、好ましくは７０ｍ2／ｇ以上であり、より好ましくは９０ｍ2／ｇ以上である。
なお、上記平均粒径および比表面積は、レーザー回折・散乱式粒径分析測定装置や水銀ポロシメータ等により測定できる。
また、比表面積は、動的結合容量の観点から、ポアサイズ１０ｎｍ〜５０００ｎｍにおける比表面積で、好ましくは７０ｍ2／ｇ以上であり、より好ましくは９０ｍ2／ｇ以上である。
なお、上記平均粒径および比表面積は、レーザー回折・散乱式粒径分析測定装置や水銀ポロシメータ等により測定できる。
また、本発明の製造方法によれば、担体表面の表面分析をしたときのスルフィニル基の割合が、スルフィド基とスルフィニル基との総和を１００％として、６０％以上である、リガンドが固定されたクロマトグラフィー精製用担体を得ることができる。スルフィニル基の割合は、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは７５％以上である。なお、スルフィニル基の割合の上限値は１００％であればよいが、９５％程度でもよい。
スルフィニル基の割合は、後記実施例と同様にして測定した値を云うものとする。
スルフィニル基の割合は、後記実施例と同様にして測定した値を云うものとする。
＜クロマトグラフィーカラム＞
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明の担体が、カラム容器に充填されたものである。該カラムはアフィニティークロマトグラフィーへの使用に適する。
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明の担体が、カラム容器に充填されたものである。該カラムはアフィニティークロマトグラフィーへの使用に適する。
＜精製方法＞
本発明の目的物質の精製方法は、本発明のクロマトグラフィーカラムに、目的物質を含む組成物を通液する工程を含むことを特徴とするものである。
本発明の目的物質の精製方法は、本発明のクロマトグラフィーカラムを用いる以外は常法に従い行えばよい。例えば、目的物質を含む組成物を準備する工程と、本発明のクロマトグラフィーカラムに、目的物質を含む組成物を通液する工程と、当該通液によってリガンドに吸着された目的物質を溶出させる工程とを含む方法が挙げられる。なお、溶出の後に、担体をアルカリ洗浄してもよい。
また、上記目的物質としては、目的タンパク質が挙げられる。
本発明の目的物質の精製方法は、本発明のクロマトグラフィーカラムに、目的物質を含む組成物を通液する工程を含むことを特徴とするものである。
本発明の目的物質の精製方法は、本発明のクロマトグラフィーカラムを用いる以外は常法に従い行えばよい。例えば、目的物質を含む組成物を準備する工程と、本発明のクロマトグラフィーカラムに、目的物質を含む組成物を通液する工程と、当該通液によってリガンドに吸着された目的物質を溶出させる工程とを含む方法が挙げられる。なお、溶出の後に、担体をアルカリ洗浄してもよい。
また、上記目的物質としては、目的タンパク質が挙げられる。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
（１）多孔質粒子の合成
３５０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製 ＰＶＡ−２１７）０．７０ｇを添加し、加熱撹拌することでポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、この溶液に、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製 エマール１０Ｇ）０．１８ｇ、炭酸ナトリウム０．３５ｇ及び亜硝酸ナトリウム１．７５ｇを添加し、撹拌して水溶液（Ｓ−１）を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１．３９ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）２．７８ｇ及びグリセリンジメタクリレート（新中村化学工業社製）９．７３ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）７．３６ｇ及びアセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．３７ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−１）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、攪拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．１７ｇを添加し、８５℃に温度を維持したまま３．５時間撹拌した。
次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。その後、洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、粒子分散液（Ｒ−１）を得た。
（１）多孔質粒子の合成
３５０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製 ＰＶＡ−２１７）０．７０ｇを添加し、加熱撹拌することでポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、この溶液に、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製 エマール１０Ｇ）０．１８ｇ、炭酸ナトリウム０．３５ｇ及び亜硝酸ナトリウム１．７５ｇを添加し、撹拌して水溶液（Ｓ−１）を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１．３９ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）２．７８ｇ及びグリセリンジメタクリレート（新中村化学工業社製）９．７３ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）７．３６ｇ及びアセトフェノン（井上香料製造所社製）２１．３７ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−１）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、攪拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．１７ｇを添加し、８５℃に温度を維持したまま３．５時間撹拌した。
次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。その後、洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、粒子分散液（Ｒ−１）を得た。
（２）リガンドの固定
０．１Ｍホウ酸ナトリウム／０．７５Ｍ硫酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）２００ｍＬに改変プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製 ｒＳＰＡ）０．４７ｇを分散させたプロテインＡ分散液に、上記粒子分散液（Ｒ−１）を、粒子乾燥質量換算で５ｇ分添加した。この分散液を２５℃で６時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
０．１Ｍホウ酸ナトリウム／０．７５Ｍ硫酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）２００ｍＬに改変プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製 ｒＳＰＡ）０．４７ｇを分散させたプロテインＡ分散液に、上記粒子分散液（Ｒ−１）を、粒子乾燥質量換算で５ｇ分添加した。この分散液を２５℃で６時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
（３）チオグリセロールの導入
得られたプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄した後、１．０Ｍチオグリセロール／０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）２００ｍＬに分散させ、２５℃で４時間振とう撹拌した。
その後、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で順次洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用粒子を得た。
得られたプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄した後、１．０Ｍチオグリセロール／０．５Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）２００ｍＬに分散させ、２５℃で４時間振とう撹拌した。
その後、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で順次洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用粒子を得た。
（４）スルホキシド化反応
上記アフィニティークロマトグラフィー用粒子３．８７ｇを、濃度が１０質量％となるように純水に分散させて粒子分散液（Ｒ−２）を調製し、この粒子分散液（Ｒ−２）に過酸化水素（和光純薬工業社製）０．３１ｇを添加した後、２５℃で２４時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄することで、スルホキシド化されたアフィニティークロマトグラフィー精製用担体１を得た。
上記アフィニティークロマトグラフィー用粒子３．８７ｇを、濃度が１０質量％となるように純水に分散させて粒子分散液（Ｒ−２）を調製し、この粒子分散液（Ｒ−２）に過酸化水素（和光純薬工業社製）０．３１ｇを添加した後、２５℃で２４時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄することで、スルホキシド化されたアフィニティークロマトグラフィー精製用担体１を得た。
（実施例２）
過酸化水素によるスルホキシド化（実施例１（４）の工程）の温度を４℃に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、スルホキシド化されたアフィニティークロマトグラフィー精製用担体２を得た。
過酸化水素によるスルホキシド化（実施例１（４）の工程）の温度を４℃に変更した以外は、実施例１と同様の操作を行い、スルホキシド化されたアフィニティークロマトグラフィー精製用担体２を得た。
（実施例３）
（１）多孔質粒子の合成
３５８ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製 ＰＶＡ−２１７）０．７２ｇを添加し、加熱撹拌することでポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、この溶液に、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製 エマール１０Ｇ）０．１８ｇ、炭酸ナトリウム０．３６ｇ及び亜硝酸ナトリウム０．１８ｇを添加し、撹拌して水溶液（Ｓ−２）を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）８．２３ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）１．３７ｇ及びトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．１２ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２０．６３ｇ及びアセトフェノン（井上香料製造所社製）５．３０ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−２）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、攪拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５８ｇを添加し、８５℃に温度を維持した。
（１）多孔質粒子の合成
３５８ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製 ＰＶＡ−２１７）０．７２ｇを添加し、加熱撹拌することでポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、この溶液に、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製 エマール１０Ｇ）０．１８ｇ、炭酸ナトリウム０．３６ｇ及び亜硝酸ナトリウム０．１８ｇを添加し、撹拌して水溶液（Ｓ−２）を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）８．２３ｇ、グリセロールモノメタクリレート（日油社製）１．３７ｇ及びトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４．１２ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２０．６３ｇ及びアセトフェノン（井上香料製造所社製）５．３０ｇの混液に溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、上記水溶液（Ｓ−２）を、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、攪拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）０．５８ｇを添加し、８５℃に温度を維持した。
（２）チオグリセロールの導入
その後、チオグリセロール（旭化学工業社製）６．２６ｇを添加し、８５℃に温度を維持したまま３時間撹拌を行った。
その後、チオグリセロール（旭化学工業社製）６．２６ｇを添加し、８５℃に温度を維持したまま３時間撹拌を行った。
（３）架橋化反応
次いで、上記反応液を２５℃まで冷却した後、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール２１．１１ｇを反応液に添加し、その後温水バスにより加温し内温を８５℃に維持して５時間撹拌した。次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子をポリビンに移し、純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、粒子分散液（Ｒ−３）を得た。
次いで、上記反応液を２５℃まで冷却した後、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール２１．１１ｇを反応液に添加し、その後温水バスにより加温し内温を８５℃に維持して５時間撹拌した。次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子をポリビンに移し、純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように純水に分散させ、粒子分散液（Ｒ−３）を得た。
（４）リガンドの固定
１．０Ｍクエン酸三ナトリウム／０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに改変プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製 ｒＳＰＡ）０．１５ｇを分散させたプロテインＡ分散液に、上記粒子分散液（Ｒ−３）を、粒子乾燥質量換算で０．９ｇ分添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
１．０Ｍクエン酸三ナトリウム／０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに改変プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製 ｒＳＰＡ）０．１５ｇを分散させたプロテインＡ分散液に、上記粒子分散液（Ｒ−３）を、粒子乾燥質量換算で０．９ｇ分添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
（５）チオグリセロールの導入
得られたプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄した後、１．０Ｍチオグリセロール／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌した。
その後、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で順次洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用粒子を得た。
得られたプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄した後、１．０Ｍチオグリセロール／０．１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．３）４０ｍＬに分散させ、２５℃で１７時間振とう撹拌した。
その後、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で順次洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用粒子を得た。
（６）スルホキシド化反応
上記アフィニティークロマトグラフィー用粒子０．９０ｇを、濃度が１０質量％となるように純水に分散させて粒子分散液（Ｒ−４）を調製し、この粒子分散液（Ｒ−４）に過酸化水素（和光純薬工業社製）０．４３ｇを添加した後、２５℃で２４時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄することで、スルホキシド化されたアフィニティークロマトグラフィー精製用担体３を得た。
上記アフィニティークロマトグラフィー用粒子０．９０ｇを、濃度が１０質量％となるように純水に分散させて粒子分散液（Ｒ−４）を調製し、この粒子分散液（Ｒ−４）に過酸化水素（和光純薬工業社製）０．４３ｇを添加した後、２５℃で２４時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄することで、スルホキシド化されたアフィニティークロマトグラフィー精製用担体３を得た。
（比較例１）
実施例１における過酸化水素によるスルホキシド化（実施例１（４）の工程）を行わない以外は、実施例１と同様の操作を行い、アフィニティークロマトグラフィー精製用担体４を得た。
実施例１における過酸化水素によるスルホキシド化（実施例１（４）の工程）を行わない以外は、実施例１と同様の操作を行い、アフィニティークロマトグラフィー精製用担体４を得た。
（比較例２）
実施例３における過酸化水素によるスルホキシド化（実施例３（６）の工程）を行わない以外は、実施例３と同様の操作を行い、アフィニティークロマトグラフィー精製用担体５を得た。
実施例３における過酸化水素によるスルホキシド化（実施例３（６）の工程）を行わない以外は、実施例３と同様の操作を行い、アフィニティークロマトグラフィー精製用担体５を得た。
（試験例１ 動的結合容量（ＤＢＣ）測定試験）
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ Ｂｉｏ社製 ＨＧＧ−１０００）に対する実施例１〜３及び比較例１〜２の担体１〜５のＤＢＣをそれぞれ測定した。カラムは容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）で５ｍｇ／ｍＬに希釈したものをそれぞれ使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求め、ＤＢＣが３５ｍｇ／ｍＬ以上のものを合格とした。結果を表１に示す。
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ Ｂｉｏ社製 ＨＧＧ−１０００）に対する実施例１〜３及び比較例１〜２の担体１〜５のＤＢＣをそれぞれ測定した。カラムは容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）で５ｍｇ／ｍＬに希釈したものをそれぞれ使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求め、ＤＢＣが３５ｍｇ／ｍＬ以上のものを合格とした。結果を表１に示す。
（試験例２ ＨＣＰ試験）
カラム容器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製Ｔｒｉｃｏｒｎ１０／５０ ｃｏｌｕｍｎ）に、実施例１〜３及び比較例１〜２の担体１〜５を、充填高さ約５ｃｍで充填してカラムを作製した。得られたカラムをＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ Ｐｌｕｓにそれぞれ接続し、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量（カラム容積の５倍）、流速１ｍＬ／分にて通液し、平衡化させた。
次いで、モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを含有するＣＨＯ細胞培養上清を、約２３ｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量で、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、及び２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を、それぞれ５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに順次通液した。
その後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）を、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Ａｂｓ．２８０＞１００ｍＡｕの溶出フラクションを回収した。
そして、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製 ＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，３Ｇを用い、回収したフラクション中に含有されるＨｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）濃度を測定した。結果を表１に示す。
カラム容器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製Ｔｒｉｃｏｒｎ１０／５０ ｃｏｌｕｍｎ）に、実施例１〜３及び比較例１〜２の担体１〜５を、充填高さ約５ｃｍで充填してカラムを作製した。得られたカラムをＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ Ｐｌｕｓにそれぞれ接続し、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量（カラム容積の５倍）、流速１ｍＬ／分にて通液し、平衡化させた。
次いで、モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを含有するＣＨＯ細胞培養上清を、約２３ｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量で、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。
次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、及び２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を、それぞれ５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに順次通液した。
その後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）を、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Ａｂｓ．２８０＞１００ｍＡｕの溶出フラクションを回収した。
そして、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製 ＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，３Ｇを用い、回収したフラクション中に含有されるＨｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）濃度を測定した。結果を表１に示す。
（試験例３ ＳＯ比率測定）
実施例１及び３並びに比較例１〜２の担体１、３〜５を乾燥し、円形カバーガラスに導電両面テープでそれぞれ固定した。ＡＸＩＳ−Ｕｌｔｒａ ＤＬＤ（ＫＲＡＴＯＳ社製）により、Ｓ２ｐのＢｉｎｄｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙを測定し、Ｓ（スルフィド基）とＳＯ（スルフィニル基）のＢｉｎｄｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙスペクトルの面積比から、ＳＯ（スルフィニル基）比率を求めた。
実施例１及び３並びに比較例１〜２の担体１、３〜５を乾燥し、円形カバーガラスに導電両面テープでそれぞれ固定した。ＡＸＩＳ−Ｕｌｔｒａ ＤＬＤ（ＫＲＡＴＯＳ社製）により、Ｓ２ｐのＢｉｎｄｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙを測定し、Ｓ（スルフィド基）とＳＯ（スルフィニル基）のＢｉｎｄｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙスペクトルの面積比から、ＳＯ（スルフィニル基）比率を求めた。
実施例１〜３のクロマトグラフィー精製用担体は、充分な動的結合容量を有するだけでなく、防汚性にも優れるものであった。
Claims (8)
- スルフィド基を有し且つリガンドが固定された固相担体を酸化して、前記スルフィド基の少なくとも一部をスルフィニル基とする酸化工程を含み、前記固相担体が、下記式（４）〜（９）のいずれか１つで表される１価の基と下記式（１０）で表される２〜４価の構造とを有し且つリガンドが固定された樹脂を含む固相担体であることを特徴とする、
担体の製造方法。
Ｒ1は、炭素数１〜２の２価の炭化水素基を示し、
Ｒ3は、炭素数１〜１０の１価の炭化水素基に含まれる水素原子の少なくとも１個以上がヒドロキシ基に置換された基を示す。〕
Ｒ1及びＲ3は、前記と同義である。〕
Ｒ3は、前記と同義である。〕
Ｒ3は、前記と同義である。〕
Ｒ2は、カルボニル基又は＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を示し、＊は、式（８）中のイオウ原子と結合する位置を示し、
Ｒ3は、前記と同義である。〕
Ｒ2及びＲ3は、前記と同義である。〕
Ｒ 4 は、ｎ価の有機基を示し、
Ｘ 1 は、それぞれ独立して、下記式（１１）、（１２）又は（１３）で表される部分構造を示し、
ｎは２〜４の整数を示す。〕
Ｙ 1 は、スルフィド基を示し、
Ｒ 1 は、前記と同義である。〕
Ｙ 1 は、前記と同義である。〕
Ｒ 5 は、カルボニル基又は＊−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−を示し、＊は、式（１３）中のＹ 1 と結合する位置を示し、
Ｙ 1 は、前記と同義である。〕 - 前記１価の基が、式（４）又は（６）で表される１価の基である、請求項１に記載の製造方法。
- 前記リガンドがタンパク質又はペプチドである、請求項１又は２に記載の製造方法。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法で得られる、
担体。 - アフィニティー精製に使用するためのものである、請求項４に記載の担体。
- 担体表面の表面分析をしたときのスルフィニル基の割合が、スルフィド基とスルフィニル基との総和を１００％として、６０％以上であり、且つクロマトグラフィー精製用である、請求項４に記載の担体。
- 請求項４〜６のいずれか１項に記載の担体がカラム容器に充填された、
クロマトグラフィーカラム。 - 請求項７に記載のクロマトグラフィーカラムに、目的物質を含む組成物を通液する工程を含むことを特徴とする、
目的物質の精製方法。
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