JP6617169B2 - 固相担体、固相担体の製造方法、アフィニティ精製用担体、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤、クロマトグラフィーカラムおよび精製方法 - Google Patents
固相担体、固相担体の製造方法、アフィニティ精製用担体、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤、クロマトグラフィーカラムおよび精製方法 Download PDFInfo
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Description
また、本発明者らは鋭意検討した結果、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介した特定の末端構造を有する高分子化合物により構成される固相担体を有するアフィニティ精製用担体が、優れた防汚性を有し、しかも、リガンドが固定された場合には高い動的結合容量を発揮することを見出し、本発明を完成した。
R2は炭素数1〜10の1価の有機基を示し、
Yはスルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示す。〕
R1は炭素数1〜6の2価の炭化水素基を示し、
**は結合手を示し、
R2およびYは前記と同義である。〕
前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、固相担体に結合しており、
前記固相担体を構成する高分子が、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介して鎖の末端に、ヒドロキシ基、チオール基、カルボニル基、アミノ基、チオ基、ジスルフィド基、スルフィニル基、スルホニル基、カルボキシ基、硫酸基およびリン酸基から選ばれる少なくとも一つを有する末端構造を有することを特徴とする、アフィニティ精製用担体(以下、このアフィニティ精製用担体をアフィニティ精製用担体Dとも称する)を提供するものである。
また、本発明のアフィニティ精製用担体Dは、優れた防汚性を有し、宿主細胞タンパク質(HCP=Host Cell Protein)等のような不純物が非特異吸着しにくい。しかも、リガンドが固定された場合には高い動的結合容量を発揮する。
したがって、本発明のアフィニティクロマトグラフィー用充填剤およびクロマトグラフィーカラムは、リガンドに対応する標的物質の動的結合容量が大きく、優れた防汚性を有する。
また、本発明の固相担体の製造方法B、本発明のアフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法Cによれば、上記のような性能を有する固相担体、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤を簡便に製造できる。
本発明の固相担体Aは、リガンドを固定可能な官能基に加えて、スルフィニル基(>S(=O))、スルフィド基(>S)、オキシ基(>O)またはイミノ基(>NH)とヒドロキシ基(−OH)、チオール基(−SH)、アミノ基(−NH2)、カルボキシ基(−COOH)、硫酸基(−OS(=O)2(OH))、リン酸基(−OP(=O)(OH)2)またはアルカノイル基とを有する基を有することを特徴とするものである。なお、当該アルカノイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、その炭素数は、好ましくは2〜10、より好ましくは2〜6、特に好ましくは2〜4である。アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基が挙げられる。
また、本発明の固相担体Aは、リガンドを固定可能な官能基にリガンドが固定されていないものである。
R1は炭素数1〜6の2価の炭化水素基を示し、
*は結合手を示す。〕
また、上記2価の炭化水素基は、好ましくは2価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基等が挙げられる。
R2は炭素数1〜10の1価の有機基を示し、
Xはスルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示し、
**は結合手を示し、
R1は前記と同義であり、炭素数1〜6の2価の炭化水素基を示す。〕
上記アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
また、親水性基の置換位置および個数は任意であるが、その個数は、リガンドを固定した場合の動的結合容量、防汚性の観点から、好ましくは1〜6個であり、より好ましくは1〜4個であり、特に好ましくは2個である。
また、mは、1〜50の整数を示すが、防汚性、リガンドを固定した場合の動的結合容量、耐圧性能の観点から、1〜30の整数が好ましく、1〜25の整数がより好ましく、1〜20の整数が更に好ましく、1〜15の整数が更に好ましく、1〜10の整数が更に好ましく、1〜5の整数が更に好ましく、1〜3の整数が特に好ましい。
R3は炭素数1〜10の2価または3価の有機基を示し、
nは1または2を示す。〕
リガンドを固定可能な官能基の含有量は、各官能基の定量方法に従えばよく、例えばエポキシ基なら、酸で開環してアルカリで中和した後、酸で逆滴定する等により測定可能である。
また、固相担体Aがスルフィニル基を有する場合、スルフィニル基の含有量としては、リガンドを固定した場合の動的結合容量と防汚性の観点から、固相担体A1gあたり、0.1〜6.5mmolが好ましく、0.5〜4.5mmolがより好ましく、1〜3mmolが特に好ましい。
また、固相担体Aがスルフィド基を有する場合、スルフィド基の含有量としては、リガンドを固定した場合の動的結合容量と防汚性の観点から、固相担体A1gあたり、0.1〜6.5mmolが好ましく、0.5〜4.5mmolがより好ましく、1〜3mmolが特に好ましい。
また、固相担体Aがスルフィニル基およびスルフィド基を有する場合、スルフィニル基とスルフィド基との含有量の比率は、モル比で、100:0〜30:70が好ましく、100:0〜50:50がより好ましく、100:0〜70:30が特に好ましい。
また、本発明の固相担体Aとしては、上記リガンドを固定可能な官能基、および上記スルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基とヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基とを有する基を有する樹脂を含む固相担体が好ましく、上記樹脂を表面に含む固相担体がより好ましい。
また、固相担体Aの形態は、モノリス、膜、中空繊維、粒子、カセット、チップ等のいずれでもよいが、粒子が好ましい。また、固相担体Aは多孔質でも非多孔質でもよいが、表面積の向上の観点から、多孔質粒子等の多孔質化されたものが好ましい。また、多孔質粒子としては、多孔質ポリマー粒子が好ましい。また、上記樹脂は、上記リガンドを固定可能な官能基、および上記スルフィニル基、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基とヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基とを有する基を有するものであれば特に限定されるものではなく、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類で構成される天然高分子でもよく、合成高分子でもよい。樹脂としては、エチレン性不飽和モノマーに由来する構造単位を有する樹脂が好ましい。例えば、スチレン系モノマー、ビニルケトン系モノマー、(メタ)アクリロニトリル系モノマー、(メタ)アクリレート系モノマーおよび(メタ)アクリルアミド系モノマーから選ばれる1種又は2種以上のモノマーに由来する構造単位を有する樹脂などである。
また、本発明の固相担体Aの比表面積は、リガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、ポアサイズ10nm〜5000nmにおける比表面積で、好ましくは70m2/g以上であり、より好ましくは90m2/g以上である。
また、本発明の固相担体Aの比表面積は、リガンドを固定した場合の動的結合容量の観点から、ポアサイズ10nm〜5000nmにおける比表面積で、好ましくは70m2/g以上であり、より好ましくは90m2/g以上である。
平均粒径および比表面積は、レーザー回折・散乱式粒度分析測定装置や水銀ポロシメータ等により測定できる。
本発明の固相担体Aは、常法を適宜組み合わせて製造すればよく特に限定されないが、例えば、以下の方法〔PR−1〕および〔PR−2〕により得ることができる。方法〔PR−1〕および〔PR−2〕によれば、優れた防汚性を有し、しかも、リガンドを固定した場合に高い動的結合容量を発揮する固相担体Aを簡便に得ることができる。
斯かる方法〔PR−1〕によれば、リガンドを固定可能な官能基および式(5−1)、(5−2)または(5−3)で表される基を有する固相担体が得られる。
具体的には、<工程2−1>原料担体(I)を常法に従って得て、<工程2−2>原料担体(I)と、式(4)で表される化合物のうちYがスルフィド基であるものを接触させて、スルフィド基含有固相担体(II)を得て、<工程2−3>スルフィド基含有固相担体(II)と、酸化剤とを接触させる方法。
斯かる方法〔PR−2〕によれば、リガンドを固定可能な官能基および式(6−1)、(6−2)または(6−3)で表される基を有する固相担体が得られる。
Yはスルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示し、
R2は前記と同義であり、炭素数1〜10の1価の有機基を示す。〕
R1は前記と同義であり、炭素数1〜6の2価の炭化水素基を示し、
R2は前記と同義であり、炭素数1〜10の1価の有機基を示し、
Yは前記と同義であり、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示す。
また、**は結合手を示す。〕
<工程1−1および2−1>
工程1−1および2−1は、原料担体(I)を得る工程である。例えば、リガンドを固定可能な官能基を有するモノマーを(共)重合させればよい。上記(共)重合の方法は、例えば、シード重合、懸濁重合等が挙げられ、好ましくは懸濁重合である。
R1は炭素数1〜6の2価の炭化水素基を示し、
*は結合手を示す。〕
また、上記2価の炭化水素基は、好ましくは2価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基等が挙げられる。
R4は水素原子またはメチル基を示し、
R5は単結合、炭素数1〜10の2価の炭化水素基または−(R6O)m−を示し(R6は炭素数2〜4のアルカンジイル基を示し、mは1〜50の整数を示す)、
R1は前記と同義であり、炭素数1〜6の2価の炭化水素基を示す。〕
また、上記2価の炭化水素基は、好ましくは2価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。斯かるアルカンジイル基の炭素数としては、1〜8が好ましく、1〜6がより好ましく、1〜4が更に好ましい。
また、mは、1〜50の整数を示すが、1〜30の整数が好ましく、1〜25の整数がより好ましく、1〜20の整数が更に好ましく、1〜15の整数が更に好ましく、1〜10の整数が更に好ましく、1〜5の整数が更に好ましく、1〜3の整数が特に好ましい。
R7は水素原子またはメチル基を示し、
R8は炭素数1〜6の3価の炭化水素基を示す。〕
また、上記3価の炭化水素基は、好ましくは3価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、エタン−1,1,2−トリイル基等が挙げられる。
R9は水素原子またはメチル基を示し、
R10は炭素数2〜4のアルカンジイル基を示し、
R11は炭素数1〜6の1価の炭化水素基を示し、
pは0〜50の整数を示す。〕
上記1価の炭化水素基は、1価の脂肪族炭化水素基、1価の脂環式炭化水素基および1価の芳香族炭化水素基を包含する概念であるが、好ましくは1価の脂肪族炭化水素基である。1価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
1価の脂肪族炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。斯かるアルキル基の炭素数としては、1〜4が好ましく、1または2がより好ましい。
上記アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
また、ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーとしては、(メタ)アクリレート系モノマーが好ましい。中でも、下記式(10)で表される(メタ)アクリレート系モノマーが特に好ましい。
R12およびR13は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
R14は炭素数1〜8の3価の炭化水素基を示す。〕
また、上記3価の炭化水素基は、好ましくは3価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、メタン−1,1,1−トリイル基等が挙げられる。
また、ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーとしては、(メタ)アクリレート系モノマーが好ましい。中でも、下記式(11)または(12)で表される(メタ)アクリレート系モノマーが特に好ましい。
R15〜R17は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
R18は炭素数1〜6の3価の炭化水素基を示す。〕
R19およびR20は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
R21は炭素数2〜4のアルカンジイル基を示し、
rは1〜50の整数を示す。〕
また、上記3価の炭化水素基は、好ましくは3価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、プロパン−1,1,1−トリイル基等が挙げられる。
また、rは、1〜50の整数を示すが、1〜30の整数が好ましく、1〜25の整数がより好ましく、1〜20の整数が更に好ましく、1〜15の整数が更に好ましく、1〜10の整数が特に好ましい。
トリメチロールプロパントリ(メタ)アクリレート、(ポリ)エチレングリコールジ(メタ)アクリレート、(ポリ)プロピレングリコールジ(メタ)アクリレート、1,4−ブタンジオールジ(メタ)アクリレート、1,6−ヘキサンジオールジ(メタ)アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ(メタ)アクリレート等が挙げられ、1種を単独でまたは2種以上を組み合わせて使用できる。
水系媒体の合計使用量は、モノマー総量100質量部に対して、通常、200〜7000質量部程度である。
また、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、ヨウ化カリウム等のヨウ化物塩、tert−ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅、塩化第二鉄等の重合禁止剤を用いることもできる。
また、ドデシルメルカプタン等の重合調製剤を用いてもよい。
また、重合時間は通常5分〜48時間、好ましくは10分〜24時間である。
工程1−2は、原料担体(I)と下記式(4)で表される化合物とを接触させて、リガンドを固定可能な官能基および下記式(5−1)、(5−2)または(5−3)で表される基を有する固相担体を得る工程である。
また、工程2−2は、原料担体(I)と、下記式(4)で表される化合物のうちYがスルフィド基であるものを接触させて、スルフィド基含有固相担体(II)を得る工程である。
Yはスルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示し、
R2は前記と同義であり、炭素数1〜10の1価の有機基を示す。〕
R1は前記と同義であり、炭素数1〜6の2価の炭化水素基を示し、
R2は前記と同義であり、炭素数1〜10の1価の有機基を示し、
Yは前記と同義であり、スルフィド基、オキシ基またはイミノ基を示す。
また、**は結合手を示す。〕
上記化合物(4)の合計使用量は、リガンドを固定可能な官能基1モルに対し、通常0.1〜12モル当量であり、好ましくは1〜10モル当量であり、より好ましくは2〜8モル当量である。
工程2−3は、工程2−2で得たスルフィド基含有固相担体(II)と、酸化剤とを接触させ、スルフィド基をスルフィニル基に酸化し、リガンドを固定可能な官能基および下記式(6−1)、(6−2)または(6−3)で表される基を有する固相担体を得る工程である。
また、酸化剤の合計使用量は、スルフィド基1モルに対し、通常0.1〜10モル当量程度であるが、好ましくは0.5〜3モル当量である。
上記溶媒の合計使用量は、原料となる固相担体に対し、通常1〜50質量倍程度であるが、好ましくは5〜15質量倍である。
本発明の固相担体Aは、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤や流路、センサーチップ等に用いる固相担体として有用である。
本発明のアフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法Cは、本発明の固相担体Aまたは本発明の製造方法Bで得られた固相担体に、リガンドを固定する工程を含むことを特徴とするものである。
斯様なリガンドの中でも、精製の標的物質が抗体である場合は、アミノ基を含むものが好ましく、タンパク質、ペプチドがより好ましく、タンパク質が更に好ましく、イムノグロブリン結合タンパク質が更に好ましい。イムノグロブリン結合性タンパク質としては、プロテインA、プロテインG、プロテインL、Fc結合タンパクおよびそれらの機能性変異体よりなる群から選ばれる少なくとも1種以上が好ましい。中でも、好ましくはプロテインA、プロテインG、それらの機能性変異体であり、より好ましくはプロテインA、その機能性変異体である。
上記塩の種類としては、クエン酸三ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられ、上記緩衝液としては、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。
緩衝液の合計使用量は、固相担体Aに対し、通常20〜80質量倍程度であるが、好ましくは35〜45質量倍である。
これによって、リガンドが結合しなかった官能基が、式(2−1)、(2−2)または(2−3)で表される基に変換される。
本発明のアフィニティ精製用担体Dは、固相担体と、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基と、を有するアフィニティ精製用担体であって、前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、固相担体に結合しており、前記固相担体を構成する高分子が、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介して鎖の末端に、ヒドロキシ基、チオール基、カルボニル基、アミノ基、チオ基、ジスルフィド基、スルフィニル基、スルホニル基、カルボキシ基、硫酸基およびリン酸基から選ばれる少なくとも一つを有する末端構造を有することを特徴とするものである。
上記末端構造を連結するチオ基、スルフィニル基またはスルホニル基としては、チオ基またはスルホニル基が好ましい。
上記末端構造は、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介して高分子鎖の末端に位置している。末端構造としては、下記式(21)で表される末端構造が好ましい。
R51は、炭素数1〜20の有機基を示し、
Zは、ヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基を示し、
kは、1以上の整数を示す。〕
2価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましい。斯かるアルカンジイル基の炭素数としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量や防汚性等の観点から、1〜8が好ましく、1〜6がより好ましく、2〜4が更に好ましい。アルカンジイル基の具体例としては、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基、プロパン−1,1−ジイル基、プロパン−1,2−ジイル基、プロパン−1,3−ジイル基、プロパン−2,2−ジイル基等が挙げられる。
3価の脂肪族炭化水素基としては、アルカントリイル基が好ましい。斯かるアルカントリイル基の炭素数としては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量や防汚性等の観点から、1〜8が好ましく、1〜6がより好ましく、2〜4が更に好ましい。アルカントリイル基の具体例としては、メタン−1,1,1−トリイル基、エタン−1,1,2−トリイル基、プロパン−1,2,3−トリイル基、プロパン−1,2,2−トリイル基等が挙げられる。
Zとしては、リガンドを結合させた場合の動的結合容量や防汚性等の観点から、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、硫酸基、アルカノイル基が好ましく、ヒドロキシ基、カルボキシ基、硫酸基がより好ましい。これらの中でも、ヒドロキシ基が特に好ましい。
また、本発明のアフィニティ精製用担体Dは、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基を有する。
上記リガンドは標的物質と結合する分子であればよいが、例えば、プロテインA、プロテインG、プロテインL、Fc結合タンパク、アビジン等のタンパク質;インシュリン等のペプチド;モノクローナル抗体等の抗体;酵素;ホルモン;DNA;RNA;ヘパリン、ルイスX、ガングリオシド等の糖質;イミノジ酢酸、合成色素、2−アミノフェニル硼素酸、4−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物が挙げられる。なお、上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
斯様なリガンドの中でも、精製の標的物質が抗体である場合は、アミノ基を含むものが好ましく、タンパク質、ペプチドがより好ましく、タンパク質が更に好ましく、イムノグロブリン結合タンパク質が更に好ましい。イムノグロブリン結合性タンパク質としては、プロテインA、プロテインG、プロテインL、Fc結合タンパクおよびそれらの機能性変異体よりなる群から選ばれる少なくとも1種以上が好ましい。中でも、好ましくはプロテインA、プロテインG、それらの機能性変異体であり、より好ましくはプロテインA、その機能性変異体である。
リガンドの結合量は、固相担体1g当たり、好ましくは10〜200mg、より好ましくは25〜100mgである。
R53は炭素数1〜6の2価の炭化水素基を示す。〕
また、上記2価の炭化水素基は、好ましくは2価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。好適な具体例としては、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基等が挙げられる。
固相担体を構成する高分子としては、エチレン性不飽和モノマーに由来する構造単位を有する高分子が好ましい。例えば、スチレン系モノマー、ビニルケトン系モノマー、(メタ)アクリロニトリル系モノマー、(メタ)アクリレート系モノマーおよび(メタ)アクリルアミド系モノマーから選ばれる1種または2種以上のモノマーに由来する構造単位を有する高分子などである。
本発明のアフィニティ精製用担体Dを構成する固相担体が粒子である場合、その平均粒径(体積平均粒径)は、通常、35〜100μmであり、好ましくは40〜85μmである。平均粒径を35μm以上とすることにより、圧力特性が向上する。また、100μm以下とすることによりリガンドを結合した場合の動的結合容量が大きくなる。また、平均粒径の変動係数は、好ましくは40%以下であり、より好ましくは30%以下である。
平均粒径は、重合する際の条件で調整することができる。なお、平均粒径は、レーザー回折・散乱式粒度分析測定装置等により測定できる。
本発明のアフィニティ精製用担体Dの製造方法は、常法を適宜組み合わせて製造することができる。
例えば、(工程P1)リガンドを結合するための反応性基を有するモノマーと、必要に応じで当該モノマー以外のモノマー(以下、他のモノマーとも称する)を、チオール化合物および重合開始剤の存在下で(共)重合させ、必要に応じて、(工程P2−1)架橋剤を用いた架橋化反応や(工程P2−2)酸化剤を用いるなどしてチオ基をスルフィニル基に酸化をするなどして製造できる。また、(工程P3)斯様な方法で得られた固相担体にリガンドを結合させてもよい。
リガンドを結合するための反応性基を有するモノマー、他のモノマーとしては、いずれも、エチレン性不飽和モノマーが挙げられる。具体的には、スチレン系モノマー、ビニルケトン系モノマー、(メタ)アクリロニトリル系モノマー、(メタ)アクリレート系モノマーおよび(メタ)アクリルアミド系モノマーから選ばれる1種または2種以上のモノマーを例示することができる。
R54は水素原子またはメチル基を示し、
R55は単結合、炭素数1〜10の2価の炭化水素基または−(R56O)k2−を示し(R56は炭素数2〜4のアルカンジイル基を示し、k2は1〜50の整数を示す)、
R53は前記と同義であり、炭素数1〜6の2価の炭化水素基を示す。〕
また、上記2価の炭化水素基は、好ましくは2価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。斯かるアルカンジイル基の炭素数としては、1〜8が好ましく、1〜6がより好ましく、1〜4が更に好ましい。
また、上記非架橋性モノマーとしては、ヒドロキシ基含有非架橋性不飽和モノマー、ヒドロキシ基を含まない非架橋性不飽和モノマーが挙げられ、架橋性モノマーとしては、ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマー、ヒドロキシ基を含まない架橋性不飽和モノマーが挙げられる。
R57は水素原子またはメチル基を示し、
R58は炭素数1〜6の3価の炭化水素基を示す。〕
また、上記3価の炭化水素基は、好ましくは3価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、エタン−1,1,2−トリイル基等が挙げられる。
R59は、水素原子またはメチル基を示し、
R60は、炭素数2〜4のアルカンジイル基を示し、
R61は、炭素数1〜6の1価の炭化水素基を示し、
sは、0〜50の整数を示す。〕
上記1価の炭化水素基は、1価の脂肪族炭化水素基、1価の脂環式炭化水素基および1価の芳香族炭化水素基を包含する概念であるが、好ましくは1価の脂肪族炭化水素基である。1価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
1価の脂肪族炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。斯かるアルキル基の炭素数としては、1〜4が好ましく、1または2がより好ましい。
上記アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等が挙げられる。
また、上記ヒドロキシ基含有架橋性不飽和モノマーとしては、(メタ)アクリレート系モノマーが好ましく、下記式(29)で表される(メタ)アクリレート系モノマーがより好ましい。
R62およびR63は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
R64は、炭素数1〜8の3価の炭化水素基を示す。〕
また、上記3価の炭化水素基は、好ましくは3価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、メタン−1,1,1−トリイル基等が挙げられる。
R65〜R67は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
R68は、炭素数1〜6の3価の炭化水素基を示す。〕
R69およびR70は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示し、
R71は、炭素数2〜4のアルカンジイル基を示し、
tは、1〜50の整数を示す。〕
また、上記3価の炭化水素基は、好ましくは3価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカントリイル基である。具体的には、プロパン−1,1,1−トリイル基等が挙げられる。
また、tは、1〜50の整数を示すが、1〜30の整数が好ましく、1〜25の整数がより好ましく、1〜20の整数が更に好ましく、1〜15の整数が更に好ましく、1〜10の整数が特に好ましい。
上記チオール化合物の使用量は、モノマー総量100質量部に対し、0.01〜200質量部が好ましく、1〜150質量部がより好ましく、10〜100質量部が特に好ましい。
なお、上記のとおりチオール化合物の添加は重合前でも重合中でもよいが、重合開始剤の投入と同時または重合開始剤の投入後にチオール化合物を添加する場合は、重合開始剤の投入から、好ましくは0〜5時間以内、より好ましくは0〜3時間以内、さらに好ましくは0〜1時間以内にチオール化合物を添加する。また、チオール化合物の添加は、塩基性触媒存在下で行ってもよい。
重合開始剤の合計使用量は、通常、モノマー総量100質量部に対して、0.01〜10質量部程度である。
上記多孔化剤の合計使用量は、通常、モノマー総量100質量部に対して40〜400質量部程度である。
水系媒体の合計使用量は、モノマー総量100質量部に対して、通常、200〜7000質量部程度である。
また、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、ヨウ化カリウム等のヨウ化物塩、tert−ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅、塩化第二鉄等の重合禁止剤を用いることもできる。
また、重合時間は通常5分〜48時間、好ましくは10分〜24時間である。
工程P2−1は、リガンドを結合するための反応性基を有するモノマーに由来するリガンドを結合するための反応性基の一部に、架橋剤を開環付加させ、架橋剤由来の架橋構造を固相担体に導入する架橋化反応である。これにより、固相担体表面等に架橋構造が形成される。このような特定の架橋構造を固相担体に導入することによって、高い親水性と優れた耐圧性能が両立される。
R52は、炭素数1〜10の2価の有機基を示し、
X11およびX12は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基を示す。〕
また、上記2価の炭化水素基は、好ましくは2価の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはアルカンジイル基である。
アルカンジイル基の具体例としては、メタン−1,1−ジイル基、エタン−1,1−ジイル基、エタン−1,2−ジイル基、プロパン−1,1−ジイル基、プロパン−1,2−ジイル基、プロパン−1,3−ジイル基、プロパン−2,2−ジイル基、ブタン−1,4−ジイル基、ペンタン−1,5−ジイル基、ヘキサン−1,6−ジイル基等が挙げられる。
また、qは0〜30の整数を示すが、0〜25の整数が好ましく、0〜20の整数がより好ましく、0〜15の整数が更に好ましく、0〜10の整数が更に好ましく、0〜5の整数が更に好ましく、0〜3の整数が特に好ましい。
架橋反応の反応温度は、通常25〜200℃であるが、好ましくは50〜100℃である。
架橋反応の反応時間は、通常30分〜24時間程度であり、好ましくは1〜12時間程度である。
工程P2−2は、酸化剤を用いるなどして、チオール化合物由来のチオ基や架橋構造中のチオ基を酸化する工程である。工程P2−2により、これらチオ基は、スルフィニル基またはスルホニル基に、好ましくはスルフィニル基に酸化される。
また、酸化剤の合計使用量は、チオ基1モルに対し、通常0.1〜10モル当量程度であるが、好ましくは0.5〜3モル当量である。
上記溶媒の合計使用量は、原料となる固相担体に対し、通常1〜50質量倍程度であるが、好ましくは5〜15質量倍である。
リガンドの固定は、上記で得られた固相担体を用いる以外は常法と同様にして行えばよいが、塩を添加したバッファー下で行うのが好ましい。塩の種類としては、クエン酸三ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられ、上記バッファーとしては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸等が挙げられる。バッファーの合計使用量は、原料となる固相担体に対し、通常20〜80質量倍程度であるが、好ましくは35〜45質量倍である。
また、反応時間は特に限定されないが、通常0.5〜72時間程度であり、反応温度は通常1〜40℃程度である。
なお、リガンドが固定された担体を、チオール化合物と接触させ、未反応の反応性基を開環させてもよい。
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明の製造方法Cで得られるアフィニティクロマトグラフィー用充填剤、または本発明のアフィニティ精製用担体Dを担体とするクロマトグラフィーカラム用充填剤が、カラム容器に充填されているものである。該クロマトグラフィーカラムはアフィニティクロマトグラフィーへの使用に適する。
本発明の標的物質の精製方法は、標的物質を含む組成物を用意する工程と、上記クロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する工程を含むことを特徴とするものである。上記標的物質としては、タンパク質が挙げられる。
また、精製は本発明のクロマトグラフィーカラムを用いる以外は常法に従い行えばよい。例えば、標的物質を含む組成物を準備する準備工程と、上記クロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する通液工程と、該通液工程により担体に吸着された標的物質を溶出させる溶出工程を含む方法が挙げられる。なお、溶出の後に、充填剤をアルカリ洗浄してもよい。
本発明の精製方法は、タンパク質の精製に適し、イムノグロブリンの精製に特に適する。
(体積平均粒径)
平均粒径は、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置(ベックマン・コールター社製 LS13320)にて測定した。
比表面積は、水銀ポロシメーター(島津製作所社製 オートポアIV9520)を用いて、細孔径の測定範囲を10−5000nmとして測定した。
(実施例1−1)
(1)360gの純水にポリビニルアルコール(クラレ社製 PVA−217)0.72gを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム(花王社製 エマール10G)0.18g、炭酸ナトリウム(和光純薬社製)0.36g、および亜硝酸ナトリウム(和光純薬社製)0.18gを添加し、撹拌して水溶液(S−1)を調製した。
一方、グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)6.88g、グリセロールモノメタクリレート(日油社製)1.37g、トリメチロールプロパントリメタクリレート(サートマー社製)4.12gおよびポリエチレングリコール#400ジメタクリレート(新中村化学社製、9G)1.37gからなる単量体組成物を、2−オクタノン(東洋合成社製)20.63gおよびアセトフェノン(井上香料製造所社製)5.30gの混液に溶解させ、単量体溶液(M−1)を調製した。
次いで、上記水溶液(S−1)を、500mLセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、攪拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液(M−1)を全量投入して、温水バスにより加温し内温が85℃に到達したところで2,2'−アゾイソブチロニトリル(和光純薬工業社製)0.53gを添加し、内温を86℃に維持した。
(2)その後、上記反応液にチオグリセロール(旭化学工業社製)31.39gを添加し、86℃に温度を維持し、3時間撹拌を行い、チオグリセロール処理粒子(PA−1)を得た。
次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子(PA−1)を純水に分散させてデカンテーションを3回行い、小粒子を除いた。ここで得られた粒子を、チオグリセロール処理粒子(PA−2)とする。
次いで、粒子の濃度が10質量%となるように粒子を純水に分散させ、本発明の固相担体Aであるチオグリセロール処理粒子(PA−2)の分散液を得た。ここで得られた分散液を、分散液(L−1)とする。
実施例1−1で得た分散液(L−1)に過酸化水素(和光純薬工業社製)4.30gを添加した後、25℃で24時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄した。次いで、粒子の濃度が10質量%となるように粒子を純水に分散させ、本発明の固相担体Aであるスルホキシド化粒子(PA−3)の分散液を得た。ここで得られた分散液を、スルホキシド化粒子分散液(L−2)とする。
配列番号1で表される塩基配列を含むDNAがpET−24(a)に挿入されたベクターを宿主(Escherichia coli BL21(DE3))に導入して作製される遺伝子組換え大腸菌が発現する配列番号2のアミノ酸配列で表される改変プロテインA 0.15gを、1.0Mクエン酸三ナトリウム/0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)40mLに分散させプロテインA分散液を得て、このプロテインA分散液に、実施例1−2で得たスルホキシド化粒子分散液(L−2)を粒子乾燥質量換算で1g添加した。得られた分散液を25℃で5時間振とう撹拌し、プロテインAを粒子に固定した。
生成したプロテインA固定粒子を、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.6)で洗浄した後、1.0Mチオグリセロール/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)40mLに分散させ、25℃で17時間振とう撹拌することで、過剰量のチオグリセロールで未反応のエポキシ基を開環させた。
その後、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.6)、0.5M水酸化ナトリウム水溶液、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で順次洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤1を得た。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤1の体積平均粒径は、64μmであり、比表面積は、93m2/gであった。
配列番号1で表される塩基配列を含むDNAがpET−24(a)に挿入されたベクターを宿主(Escherichia coli BL21(DE3))に導入して作製される遺伝子組換え大腸菌が発現する配列番号2のアミノ酸配列で表される改変プロテインA 0.15gを、1.0Mクエン酸三ナトリウム/0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)40mLに分散させプロテインA分散液を得て、このプロテインA分散液に、実施例1−1で得た分散液(L−1)を粒子乾燥質量換算で1g添加した。得られた分散液を25℃で5時間振とう撹拌し、プロテインAを粒子に固定した。
生成したプロテインA固定粒子を、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.6)で洗浄した後、1.0Mチオグリセロール/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)40mLに分散させ、25℃で17時間振とう撹拌することで、過剰量のチオグリセロールで未反応のエポキシ基を開環させた。
その後、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.6)、0.5M水酸化ナトリウム水溶液、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤2を得た。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤2の体積平均粒径は、64μmであり、比表面積は、92m2/gであった。
単量体組成物を、グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)6.88g、グリセロールモノメタクリレート(日油社製)1.38g、トリメチロールプロパントリメタクリレート(サートマー社製)3.03gおよびポリエチレングリコール#400ジメタクリレート(新中村化学社製、9G)2.48gからなる単量体組成物に変更した以外は実施例1−1〜1−3と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤3を得た。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤3の体積平均粒径は、67μmであり、比表面積は、92m2/gであった。
単量体組成物を、グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)6.87g、グリセロールモノメタクリレート(日油社製)1.37g、トリメチロールプロパントリメタクリレート(サートマー社製)4.12gおよびメトキシポリエチレングリコール#400メタクリレート(新中村化学社製、M−90G)1.37gからなる単量体組成物に変更した以外は実施例1−1〜1−3と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤4を得た。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤4の体積平均粒径は、70μmであり、比表面積は、94m2/gであった。
単量体組成物を、グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)7.41g、グリセロールモノメタクリレート(日油社製)1.37gおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート(サートマー社製)4.94gからなる単量体組成物に変更し、2,2'−アゾイソブチロニトリルの使用量を0.53gから0.93gに、実施例1−1の(2)におけるチオグリセロールの添加量を31.39gから56.37gにそれぞれ変更した以外は実施例1−1〜1−3と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤5を得た。なお、上記チオグリセロールの添加工程を実施例5(2)とする。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤5の体積平均粒径は、67μmであり、比表面積は、95m2/gであった。
実施例1−1の(2)におけるチオグリセロールの添加と、過酸化水素によるスルホキシド化(実施例1−2の工程)を行わない以外は、実施例1−1〜1−3と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤6を得た。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤6の体積平均粒径は、86μmであり、比表面積は、97m2/gであった。
実施例5(2)におけるチオグリセロールの添加と、過酸化水素によるスルホキシド化(実施例1−2の工程)を行わない以外は、実施例5と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤7を得た。
アフィニティクロマトグラフィー用充填剤7の体積平均粒径は、74μmであり、比表面積は、95m2/gであった。
GEヘルスケア社製AKTAprime plusを用いて、線流速60cm/hrにおけるタンパク質(ヒトIgG抗体、Equitech Bio社製 HGG−1000)に対する実施例1〜5および比較例1〜2の充填剤1〜7のDBCを測定した。カラム容器は容量4mL(5mmφ×200mm長)のものを、タンパク質は20mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム水溶液(pH7.5)で25mg/mLに希釈したものをそれぞれ使用し、充填剤を4mL充填して、溶出先端10%ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からDBCを求めた。結果を表1に示す。
実施例1〜5および比較例1〜2の充填剤1〜7を2mL、シリンジカラム(内径1.5cm)にそれぞれ充填し、20mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム水溶液(pH7.5)で置換した後、濃度が0.0015質量%となるようにフェノールレッドを溶解させた20mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム水溶液(pH7.5)を10mL流した。
次いで、20mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム水溶液(pH7.5)10mLで洗浄し、50mMクエン酸ナトリウム水溶液(pH3.2)10mL、20mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム水溶液(pH7.5)10mLを順次流した。次いで、0.5M水酸化ナトリウム水溶液を10mL流し、以下の評価基準に従い充填剤の防汚性を目視で評価した。結果を表1に示す。
◎:着色がほぼ確認できない
○:着色が少し確認できる
△:着色が確認できる
×:着色がひどく、はっきりと確認できる
また、実施例1の充填剤1と比較例1の充填剤6についての試験例1および2の結果から、プロテインA固定前にチオグリセロール処理粒子をスルホキシド化しておき、スルホキシド化粒子を固相担体として用いることによって、DBCが大きく、防汚性に優れた充填剤が得られることがわかる。
(1)グリシジルメタクリレート(三菱レーヨン社製)8.23g、グリセロールモノメタクリレート(日油社製)1.37gおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート(サートマー社製)4.12gからなる単量体組成物を、2−オクタノン(東洋合成社製)20.63gおよびアセトフェノン(井上香料製造所社製)5.30gの混液に溶解させ、単量体溶液(M−2)を調製した。
次いで、実施例1−1と同様にして調製した水溶液(S−1)を、500mLセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、攪拌翼および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に上記単量体溶液(M−2)を全量投入して、温水バスにより加温し内温が85℃に到達したところで2,2'−アゾイソブチロニトリル(和光純薬工業社製)0.53gを添加し、内温を86℃に維持した。
(2)その後、上記反応液にチオグリセロール(旭化学工業社製)6.26gを添加し、86℃に温度を維持し、3時間撹拌を行うことで、チオグリセロール存在下での重合反応を行った。
(3)次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを3回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が10質量%となるように粒子を純水に分散させた。この分散液を、チオグリセロール処理粒子分散液(L−3)とする。
(4)上記チオグリセロール処理粒子分散液(L−3)に過酸化水素(和光純薬工業社製)4.30gを添加した後、25℃で24時間転倒混和し、粒子をスルホキシド化した。その後、この反応液をろ過し、純水で洗浄した。次いで、粒子の濃度が10質量%となるように粒子を純水に分散させた。この分散液を、スルホキシド化粒子分散液(L−4)とする。
(5)配列番号1で表される塩基配列を含むDNAがpET−24(a)に挿入されたベクターを宿主(Escherichia coli BL21(DE3))に導入して作製される遺伝子組換え大腸菌が発現する配列番号2のアミノ酸配列で表される改変プロテインA 0.15gを、1.0Mクエン酸三ナトリウム/0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH6.6)40mLに分散させプロテインA分散液を得て、このプロテインA分散液に上記スルホキシド化粒子分散液(L−4)(粒子乾燥質量換算で1g)を添加した。この分散液を25℃で5時間振とう撹拌し、プロテインAを粒子に固定した。
生成したプロテインA固定粒子を、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.6)で洗浄した後、1.0Mチオグリセロール/0.1M硫酸ナトリウム水溶液(pH8.3)40mLに分散させ、25℃で17時間振とう撹拌することで、過剰量のチオグリセロールで未反応のエポキシ基を開環させた。
その後、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.6)、0.5M水酸化ナトリウム水溶液、0.1Mクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)で順次洗浄し、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤8を得た。
実施例6の工程(1)の部分において、単量体組成物の組成を、グリシジルメタクリレート8.87g、グリセロールモノメタクリレート1.48gおよびグリセリンジメタクリレート(新中村化学工業社製)4.44gとし、工程(2)の部分においてチオグリセロールの添加の部分を2−メルカプトエタノール(東京化成工業社製)4.88gの添加に変更した以外は実施例6と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤9を得た。
実施例6の工程(1)の部分において、単量体組成物の組成を、グリシジルメタクリレート8.79g、グリセロールモノメタクリレート1.46gおよびエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学工業社製)4.40gとし、工程(2)の部分においてチオグリセロールの添加の部分を3−メルカプト−2−ブタノン(東京化成工業社製)5.43gの添加に変更した以外は実施例6と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤10を得た。
実施例6の工程(1)の部分において、単量体組成物の組成を、グリシジルメタクリレート8.86g、グリセロールモノメタクリレート(日油社製)0.74gおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート5.17gとし、工程(2)の部分においてチオグリセロールの添加の部分を3−メルカプト−1−プロパノール(東京化成工業社製)4.81gの添加に変更し、工程(4)の粒子のスルホキシド化を行わない以外は実施例6と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤11を得た。
実施例6の工程(1)の部分において、単量体組成物の組成を、グリシジルメタクリレート7.41g、グリセロールモノメタクリレート1.48gおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート5.93gに変更した以外は、実施例6の工程(1)および(2)と同様の操作を行った。
次いで、反応液を25℃まで冷却し、3,6−ジオキサ−1,8−オクタンジチオール(丸善油化社製)を45.56g添加して30分撹拌した後に温水バスによって再び加温し、内温が85℃に到達した時点から5時間撹拌しながら85℃に温度を維持することで、3,6−ジオキサ−1,8−オクタンジチオールを用いた架橋化を行った。
その後、実施例6の工程(3)〜(5)と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤12を得た。
実施例6の工程(1)の部分において、単量体組成物の組成を、グリシジルメタクリレート7.41g、グリセロールモノメタクリレート1.48gおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート5.93gとし、工程(2)の部分においてチオグリセロールの添加の部分を3−メルカプトイソ酪酸6.96gに変更した以外は実施例6と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤13を得た。
実施例6の工程(1)の後、工程(2)のチオグリセロールの添加を行わず、反応液を25℃まで冷却し、3,6−ジオキサ−1,8−オクタンジチオールを45.56g添加して実施例10と同様の架橋化を行った以外は、実施例6と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤14を得た。
実施例7におけるチオグリセロールの添加と、過酸化水素によるスルホキシド化(実施例6(4)の工程)を行わない以外は、実施例7と同様の操作を行い、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤15を得た。
実施例6〜11および比較例3〜4で得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤の平均粒径(体積平均粒径)について、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置(ベックマン・コールター社製 LS13320)により測定した。結果を表2に示す。
実施例6〜11および比較例3〜4で得られたアフィニティクロマトグラフィー用充填剤に結合したリガンドであるプロテインAの結合量を、ビシンコニン酸(BCA)試薬を用いて定量した。具体的には、固形分換算で1mgの充填剤をテストチューブに採取し、これをThermoFisher Scientific社のBCA Protein Assay Kitで定量した。反応は、37℃で30分間、転倒混和することによって行った。検量線は、担体に結合させたプロテインAと同一のものを用いて作成した。結果を表2に示す。
GEヘルスケア社製AKTAprime plusを用いて、線流速300cm/hrにおけるタンパク質(ヒトIgG抗体、Equitech Bio社製 HGG−1000)に対する実施例6〜11および比較例3〜4の各充填剤のDBCを測定した。カラム容器は容量4mL(5mmφ×200mm長)のものを、タンパク質は20mMリン酸ナトリウム/150mM塩化ナトリウム水溶液(pH7.5)で5mg/mLに希釈したものをそれぞれ使用し、充填剤を4mL充填して、溶出先端10%ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からDBCを求めた。結果を表2に示す。
カラム容器(GEヘルスケア社製Tricorn10/50 column)に、実施例6〜11および比較例3〜4の各充填剤を、充填高さ約5cmで充填してカラムを作製した。得られたカラムをGEヘルスケア社製AKTA Prime Plusにそれぞれ接続し、20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)を5カラム容量(カラム容積の5倍)、流速1mL/分にて通液し、平衡化させた。
次いで、モノクローナル抗体Trastuzumabを含有するCHO細胞培養上清を、約23mg抗体/mL担体の負荷量で、流速1mL/分にてカラムに通液した。
次いで、20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)、20mMリン酸ナトリウム/1M塩化ナトリウムバッファー(pH7.5)、および20mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.5)を、それぞれ5カラム容量、流速1mL/分にてカラムに順次通液した。
その後、50mMクエン酸ナトリウムバッファー(pH3.2)を、流速1mL/分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Abs.280>100mAuの溶出フラクションを回収した。
そして、分光光度計を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度(mg/mL)を測定した。また、Cygnus Technologies社製 CHO HCP ELISA kit,3Gを用い、回収したフラクション中に含有されるHost Cell Protein(HCP)の濃度(ng/mL)を測定した。さらにHCPの濃度を抗体濃度で除することにより、単位抗体量当たりのHCP量を算出した。結果を表2に示す。
Claims (20)
- 固相担体と、リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基と、を有するアフィニティ精製用担体であって、
前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、固相担体に結合しており、
前記固相担体を構成する高分子が、チオ基、スルフィニル基またはスルホニル基を介して鎖の末端に、ヒドロキシ基、チオール基、カルボニル基、アミノ基、チオ基、ジスルフィド基、スルフィニル基、スルホニル基、カルボキシ基、硫酸基およびリン酸基から選ばれる少なくとも一つを有する末端構造を有し、
前記末端構造が、固相担体の重合前或いは重合中にチオール化合物を添加して導入されるものである、アフィニティ精製用担体。 - 前記固相担体を構成する高分子が、スルフィニル基またはスルホニル基を介して鎖の末端に、ヒドロキシ基、チオール基、カルボニル基、アミノ基、チオ基、ジスルフィド基、スルフィニル基、スルホニル基、カルボキシ基、硫酸基およびリン酸基から選ばれる少なくとも一つを有する末端構造を有するものである、請求項1に記載のアフィニティ精製用担体。
- 前記固相担体を構成する高分子が、スルフィニル基またはスルホニル基を介して鎖の末端に、ヒドロキシ基、カルボニル基およびカルボキシ基から選ばれる少なくとも一つを有する末端構造を有するものである、請求項1に記載のアフィニティ精製用担体。
- 前記末端構造が、下記式(21)で表される末端構造である、請求項1に記載のアフィニティ精製用担体。
R51は、炭素数1〜20の有機基を示し、
Zは、ヒドロキシ基、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、硫酸基、リン酸基またはアルカノイル基を示し、
kは、1以上の整数を示す。〕 - Zが、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、硫酸基またはアルカノイル基である、請求項4に記載のアフィニティ精製用担体。
- Zが、ヒドロキシ基、カルボキシ基またはアルカノイル基である、請求項4に記載のアフィニティ精製用担体。
- 前記リガンドを結合するための反応性基が、環状エーテル基である、請求項4に記載のアフィニティ精製用担体。
- Zが、ヒドロキシ基、チオール基、カルボキシ基、硫酸基またはアルカノイル基であり、前記リガンドを結合するための反応性基が、環状エーテル基である、請求項4に記載のアフィニティ精製用担体。
- Zが、ヒドロキシ基、カルボキシ基またはアルカノイル基であり、前記リガンドを結合するための反応性基が、環状エーテル基である、請求項4に記載のアフィニティ精製用担体。
- kが、1〜5の整数である、請求項4〜9のいずれか1項に記載のアフィニティ精製用担体。
- 前記固相担体を構成する高分子が、スチレン系モノマー、ビニルケトン系モノマー、(メタ)アクリロニトリル系モノマー、(メタ)アクリレート系モノマーおよび(メタ)アクリルアミド系モノマーから選ばれる1種または2種以上のモノマーに由来する構造単位を有する高分子である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のアフィニティ精製用担体。
- 前記固相担体が、下記式(22)で表される架橋剤に由来する架橋構造を更に有する、請求項1〜11のいずれか1項に記載のアフィニティ精製用担体。
R52は、炭素数1〜10の2価の有機基を示し、
X11およびX12は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、アミノ基またはチオール基を示す。〕 - X11およびX12が、チオール基である、請求項12に記載のアフィニティ精製用担体。
- 式(22)で表される架橋剤に由来する架橋構造中のチオ基を酸化してなる、請求項13に記載のアフィニティ精製用担体。
- 前記リガンドまたはリガンドを結合するための反応性基が、リガンドである、請求項1〜14のいずれか1項に記載のアフィニティ精製用担体。
- 前記リガンドが、イムノグロブリン結合タンパク質である請求項15に記載のアフィニティ精製用担体。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載のアフィニティ精製用担体を担体とする、クロマトグラフィーカラム用充填剤。
- 請求項17に記載の充填剤がカラム容器に充填されている、クロマトグラフィーカラム。
- 標的物質を含む組成物を用意する工程と、
請求項18に記載のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する工程を含むことを特徴とする、
標的物質の精製方法。 - 前記標的物質が、タンパク質である、請求項19に記載の精製方法。
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