WO2018155241A1 - サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤およびその製造方法 - Google Patents

サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤およびその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018155241A1
WO2018155241A1 PCT/JP2018/004665 JP2018004665W WO2018155241A1 WO 2018155241 A1 WO2018155241 A1 WO 2018155241A1 JP 2018004665 W JP2018004665 W JP 2018004665W WO 2018155241 A1 WO2018155241 A1 WO 2018155241A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
filler
porous particles
size exclusion
exclusion chromatography
mol
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/004665
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
秀平 丸田
Original Assignee
昭和電工株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 昭和電工株式会社 filed Critical 昭和電工株式会社
Priority to JP2019501231A priority Critical patent/JPWO2018155241A1/ja
Priority to CN201880008890.7A priority patent/CN110267740B/zh
Priority to EP18758435.4A priority patent/EP3586958B1/en
Priority to US16/487,329 priority patent/US11285404B2/en
Publication of WO2018155241A1 publication Critical patent/WO2018155241A1/ja
Priority to US17/591,774 priority patent/US20220176273A1/en

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28004—Sorbent size or size distribution, e.g. particle size
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28011—Other properties, e.g. density, crush strength
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3206—Organic carriers, supports or substrates
    • B01J20/3208—Polymeric carriers, supports or substrates
    • B01J20/321—Polymeric carriers, supports or substrates consisting of a polymer obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3248—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one type of heteroatom selected from a nitrogen, oxygen or sulfur, these atoms not being part of the carrier as such
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3291—Characterised by the shape of the carrier, the coating or the obtained coated product
    • B01J20/3293—Coatings on a core, the core being particle or fiber shaped, e.g. encapsulated particles, coated fibers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
    • G01N30/52—Physical parameters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Definitions

  • the present invention relates to a filler for fractionating a biopolymer. More specifically, the present invention relates to a filler suitable for separating and separating biologically derived polymers such as polysaccharides, peptides, proteins, DNA, and RNA based on the principle of size exclusion chromatography using an aqueous eluent.
  • Size exclusion chromatography that separates molecules in order of size is widely used for separating water-soluble polymers such as polysaccharides, peptides, proteins, DNA, and RNA.
  • Size-exclusion chromatography has the advantage that separation and fractionation of biopolymers such as proteins can be performed under mild conditions because biopolymers can be processed under mild conditions. is there.
  • the separated and fractionated biopolymers are used for biochemical reaction applications and industrial applications such as food, pharmaceuticals, and chemistry, and the market has grown significantly in recent years.
  • a filler for separation and fractionation that can be processed in large quantities in accordance with an industrial scale is desired.
  • proteins such as immunoglobulin M (IgM) and immunoglobulin G (IgG), which are antibodies contained in living organisms, are attracting attention as pharmaceuticals, and can be efficiently separated and sorted. Agents are highly desired.
  • the filler particles used for analytical applications have an average particle size of approximately 3 ⁇ m to 15 ⁇ m. These fillers can also be used as sorting fillers when the amount of biopolymer to be sorted is small.
  • the packing material for analytical use has an average particle size of the packing material that is too small. There has been a problem that such back pressure becomes too high.
  • fillers already sold as preparative fillers often have insufficient mechanical strength.
  • the average particle size is small, consolidation is advanced due to insufficient mechanical strength, and there is a problem that column pressure loss is likely to increase and blockage easily occurs.
  • many commercially available preparative fillers are sold as fillers having a larger average particle diameter, for example, mainly 50 ⁇ m or more. When the average particle size is large, the back pressure does not increase and a large amount of biopolymer can be separated and separated.
  • a filler with a large average particle size has a problem that the separation performance based on the principle of size exclusion deteriorates, and in order to secure the separation performance, it must be used under a low linear flow rate, and the operation becomes longer. There is a problem.
  • Patent Document 1 consolidation is achieved by reacting a base material composed of ethylene glycol dimethacrylate and glycidyl methacrylate with ethylene glycol or glycerin in dimethyl sulfoxide or 1,4-dioxane in the presence of a base. It is disclosed that a porous carrier that does not occur and has sufficient mechanical strength can be obtained.
  • Synthetic polymer-based fillers with ion-exchange groups introduced are covalently bound to the hyperbranched hydrophilic polyhydroxy-functional polymer to the filler to provide high protein retention capacity. It is disclosed in Document 2. With this technique, the filler is reported to exhibit sufficient properties with respect to chemical stability and fastness.
  • JP 2012-141212 A Japanese Patent No. 4440771
  • the problem of the present invention is that it can be produced by a simple process, the pressure loss of the column is small even with a small particle size, and the size exclusion that can be suitably used for separation and preparative purposes requiring mass processing. It is to provide a packing material for chromatography and a method for producing the packing material.
  • the present inventors polymerized a monomer having a glycidyl group and a cross-linking agent in the presence of a polymerization initiator, and obtained from the resulting copolymer. It has been found that the intended filler can be obtained through a step of hydrophilizing the particles with sugar alcohol and then ring-opening the remaining glycidyl group with a mineral acid. That is, the present invention relates to the following matters.
  • a method for producing a packing material for size exclusion chromatography comprising the following steps (1) to (3): (1) First, a diluent is added to at least glycerin-1,3-dimethacrylate and glycidyl methacrylate as monomers and polymerized in an aqueous medium using a radical polymerization initiator to obtain porous particles having a glycidyl group Process. (2) A second method in which porous particles having a glycidyl group are dispersed in an aqueous solution in which a sugar alcohol is dissolved, an aqueous solution containing an alkali metal hydroxide is added, and heated and stirred to bind the sugar alcohol to the glycidyl group. Process.
  • the porous particle having a glycidyl group is composed of a copolymer containing 6 mol% to 29 mol% glycerin-1,3-dimethacrylate and 71 mol% to 94 mol% glycidyl methacrylate as monomer units.
  • [8] consisting of hydrophilic porous particles having a volume-converted average particle diameter of 8 to 15 ⁇ m,
  • the pressure loss per 30 cm length of the packing material is 1.2 MPa or less when the column is packed and water is flowed at a linear flow rate of 100 cm / h,
  • the hydrophilic ratio expressed as the ratio of elution volumes of 1-butanol and ethylene glycol, is 1.0 to 1.4;
  • the ionic ratio indicated by the elution volume of lysozyme and myoglobin is 0.8 to 1.2,
  • the exclusion limit molecular weight of pullulan is 1 million or more, Filler for size exclusion chromatography.
  • a column for size exclusion chromatography in which the packing material according to any one of [1] to [3] is packed in a casing for liquid chromatography.
  • a chromatography apparatus comprising the size exclusion chromatography column according to [9].
  • a small average particle size packing material with high separation performance can be used for a large column. This can speed up the separation process. Furthermore, the filler can be manufactured by an inexpensive raw material and a simple process, and can be easily applied to an industrial scale using a large amount of filler.
  • FIG. 1 is a chromatogram showing the state of separation of IgM and IgG when the filler of Example 1 is used.
  • the filler for size exclusion chromatography of the present invention is a porous material having a structure represented by the following formula (I) on the surface of a copolymer having at least glycerin-1,3-dimethacrylate and glycidyl methacrylate as monomer units.
  • Particles (However, R 1 represents a partial structure of porous particles, R 2 represents a hydrogen atom or a partial structure of porous particles, and n represents an integer of 1 to 5.)
  • the ring opening rate of the glycidyl group of the porous particles is 95% or more.
  • the packing material for size exclusion chromatography of the present invention can be produced, for example, by a method for producing a packing material for size exclusion chromatography including the following steps (1) to (3).
  • a method for producing a packing material for size exclusion chromatography including the following steps (1) to (3).
  • First step ⁇ Preparation of porous particles having a glycidyl group>
  • at least porous particles having a glycidyl group made of a copolymer having glycerin-1,3-dimethacrylate and glycidyl methacrylate as monomer units are used as a base material.
  • the porous particles can be obtained by copolymerizing glycerin-1,3-dimethacrylate, which is a hydrophilic crosslinkable monomer, and glycidyl methacrylate, which is a monomer having a glycidyl group, in the presence of a diluent. These porous particles can be produced with reference to the methods described in JP2007 / 170907, WO2006 / 132333 and the like.
  • the copolymer may contain other monomer units as long as the properties of the porous particles are not significantly changed by including 95 mol% or more of glycerin-1,3-dimethacrylate and glycidyl methacrylate in total as monomer units. It doesn't matter.
  • examples of other monomers having a glycidyl group include 3,4-epoxycyclohexylmethyl methacrylate and 4-hydroxybutyl acrylate glycidyl ether.
  • a polyhydric alcohol (meth) acrylic selected from pentaerythritol di (meth) acrylate, pentaerythritol tri (meth) acrylate, glycerin-1,3-diacrylate, and glyceryl methacrylate acrylate as the hydrophilic crosslinkable monomer. Acid esters and the like are preferably used.
  • methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, and the like can also be used.
  • “(meth) acrylate” means acrylate and methacrylate.
  • Glycidyl methacrylate is used in an amount of 70 to 95 mol%, preferably 80 to 90 mol%, based on the total amount of the monomer mixture used for copolymerization.
  • glycidyl methacrylate is 70 mol% or more, hydrophilicity is sufficient as a packing material for size exclusion chromatography, and when it is 95 mol% or less, mechanical strength is maintained and compaction of the packing material in the column is prevented. be able to.
  • Glycerin-1,3-dimethacrylate is used in an amount of 5 to 30 mol%, preferably 10 to 20 mol%, based on the total amount of the monomer mixture used for copolymerization.
  • glycerin-1,3-dimethacrylate is 30 mol% or less, hydrophilicity is sufficient as a packing agent for size exclusion chromatography, and when it is 5 mol% or more, mechanical strength is maintained and packing in the column is performed. The consolidation of the agent can be prevented.
  • the porous particles have pores.
  • a polymerization agent is added to the monomer mixture for polymerization.
  • the diluent is an organic solvent that dissolves in the monomer mixture but is inert to the polymerization reaction, and does not dissolve the produced copolymer. After completion of the polymerization, the diluent is removed by washing or the like, so that the diluent portion becomes a cavity and a pore is formed in the particles.
  • diluent examples include aromatic hydrocarbons such as toluene, xylene, diethylbenzene, dodecylbenzene and chlorobenzene; saturated hydrocarbons such as hexane, heptane, pentane, octane, nonane and decane; isoamyl alcohol and hexyl alcohol.
  • Alcohols such as heptyl alcohol, octyl alcohol, nonyl alcohol; aliphatic halogenated hydrocarbons such as dichloromethane, dichloroethane, trichloroethane; ethyl acetate, propyl acetate, butyl acetate, pentyl acetate, methyl benzoate, benzoate Aliphatic or aromatic esters such as ethyl acid and propyl benzoate can be used. These diluents can be used alone or in admixture of two or more.
  • the addition amount of the diluent affects the exclusion molecular weight limit of the filler and the volume% of the pore volume (indicating the ratio of the pore volume to the total volume of the filler particles). For this reason, the amount is appropriately adjusted and added.
  • the addition amount of these diluents is preferably 100 to 300 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the total amount of monomers.
  • a polymerization initiator is added to a monomer mixture obtained by adding a diluent.
  • the polymerization initiator is not particularly limited as long as it is a known radical polymerization initiator that generates radicals, and examples thereof include 2,2′-azobisisobutyronitrile and 2,2′-azobis (methyl isobutyrate). Azo initiators. Of these, it is desirable to use 2,2'-azobis (methyl isobutyrate) because of the affinity of the chemical structure.
  • the concentration of the polymerization initiator is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 5 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the total amount of monomers.
  • An oil phase containing the monomer is prepared by the monomer mixture, the diluent, and the polymerization initiator.
  • the oil phase is stirred and suspended in an aqueous medium containing an appropriate dispersion stabilizer to form oil droplets.
  • the copolymer is produced as porous particles having an appropriate particle size.
  • a method of dropping a monomer solvent containing a diluent into an aqueous medium through a porous film or a microchannel formed in a quartz substrate is applied to the method for producing oil droplets. be able to.
  • a well-known thing can be used as a dispersion stabilizer contained in an aqueous medium.
  • water-soluble polymer compounds such as gelatin, sodium polyacrylate and polyvinyl alcohol are used.
  • polyvinyl alcohol is used.
  • concentration of the dispersion stabilizer is preferably 0.1 to 5% by mass with respect to the aqueous medium.
  • the aqueous medium may contain salts and other water-soluble components in addition to water.
  • the salts include commonly used salts such as sodium chloride and calcium chloride. Since the solubility varies depending on the salt used, the concentration cannot be defined unconditionally. For example, it is preferable to use 0.1-15% by mass for sodium chloride and 1-40% by mass for calcium chloride.
  • the polymerization reaction in the oil droplet state is usually carried out after substitution with nitrogen gas and heated to 40 to 100 ° C. with stirring and at atmospheric pressure for 5 to 16 hours.
  • the monomer contained in each oil droplet is polymerized in a state containing a diluent, and the polymer grows in a network shape. Therefore, porous particles can be obtained by removing the diluent later.
  • the porous particles can be easily separated from the aqueous medium by filtration or the like. Further, the diluent is removed by washing with a solvent such as acetone or methanol. After drying, the obtained porous particles having a glycidyl group are classified by a sieve or an air classifier.
  • the average particle diameter of the particles is expressed as a volume-converted average particle diameter.
  • the volume conversion average particle diameter is a value obtained by an image analysis type particle size distribution measuring apparatus.
  • an image analysis type particle size distribution measuring device is used for the volume average particle diameter of particles, a two-dimensional particle image (still image is obtained by imaging 2000 or more crosslinked polymer particles with the image analysis type particle size distribution measuring device).
  • Particles obtained by obtaining the equivalent circle diameter of each particle (the diameter of a circle having the same area as the projected area of the particle image) from each particle, calculating the volume of each particle from the equivalent circle diameter, and averaging the volume based on the volume Is the diameter.
  • each particle is regarded as a sphere having the same diameter as the equivalent circle diameter.
  • the image analysis type particle size distribution measuring device for example, a flow type particle image analyzer (trade name: FPIA-3000, manufactured by Sysmex Corporation) can be used.
  • the average particle size of the porous particles is preferably 8 to 15 ⁇ m, more preferably 10 to 13 ⁇ m.
  • the partial structure of the porous particle represented by R 1 is, for example, ⁇ —CO—O—CH 2 —CH (OH) —CH 2 — derived from a glycidyl group on the porous surface.
  • ⁇ means a porous particle body.
  • R 2 in formula (I) is a partial structure of a porous particle, a similar partial structure can be exemplified. In this case, it means that the sugar alcohol is bound to the porous particles at two locations. (However, R 1 represents a partial structure of porous particles, R 2 represents a hydrogen atom or a partial structure of porous particles, and n represents an integer of 1 to 5.)
  • the reaction between the porous particles and the sugar alcohol is carried out by coexisting the porous particles wet with ion-exchanged water (sometimes referred to as water-wetting gel) and the sugar alcohol in an aqueous solvent. It can be carried out by adding a metal hydroxide and heating and stirring.
  • the water wet gel contains 1 to 3 times the mass of water relative to the mass of the porous particles when dried. The weight can be converted to approximately 2.6 times that of the gel when dried.
  • sugar alcohol various known ones can be used without particular limitation.
  • itolitols such as glycerin; tetritols such as erythritol and threitol; pentitols such as arabinitol and xylitol; hexitols such as sorbitol and mannitol; heptitols such as boremitol and perseitol. .
  • xylitol and sorbitol are preferable, and sorbitol is most preferable.
  • the amount of sugar alcohol used is preferably 200 to 3000 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the porous particles. If the sugar alcohol is less than 200 parts by mass, the amount of introduction tends to be small and hydrophilicity tends to be insufficient. If the sugar alcohol exceeds 3000 parts by mass, the amount of solvent required for dissolution may increase.
  • alkali metal hydroxide various known ones can be used without particular limitation.
  • alkali metal hydroxide include alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide.
  • the amount used is preferably 0.2 to 60 parts by mass, particularly preferably 2 to 30 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the porous particles. If the alkali metal hydroxide is 0.2 parts by mass or more, sufficient hydrophilicity is imparted, and if the alkali metal hydroxide is 60 parts by mass or less, the ester groups and amide groups of the porous particles are hydrolyzed. Therefore, it is possible to prevent the inconvenience that an ionic functional group is generated.
  • the alkali metal hydroxide can be used alone or in combination of two or more. The obtained particles are washed with water to remove excess sugar alcohol and alkali metal hydroxide.
  • the glycidyl group remains. That is, a part of the porous particles reacted with sugar alcohol is mixed with potassium bromide and pelletized by applying pressure, then FT-IR (trade name: Nicolet (registered trademark) iS10, manufactured by Thermo Scientific Co., Ltd. measured in), to confirm the peak height in absorbance 908cm -1 and 848cm -1 in the infrared absorption spectrum. These peaks are absorptions due to the epoxy structure. These peak heights in the porous particles after reacting the sugar alcohol are often 80 to 95% of the peak height of the porous particles before the reaction.
  • the residual ratio (%) of the glycidyl group is calculated by the following formula (1).
  • (Residual ratio of glycidyl group) 100 ⁇ (peak height after reaction) / (peak height of porous particles before reaction with sugar alcohol) (1)
  • the ring opening rate (%) of the glycidyl group is obtained by the formula (2).
  • (Ring opening rate of glycidyl group) 100 ⁇ (residual rate of glycidyl group) (2)
  • Ring opening of the residual glycidyl group with a mineral acid can be performed by adding a mineral acid to the particle suspended in an aqueous solvent and stirring with heating.
  • mineral acids examples include sulfuric acid, nitric acid, hydrochloric acid and the like. Of these, sulfuric acid is particularly preferred.
  • concentration of the mineral acid used may be about 0.01M to 1.0M, particularly preferably about 0.1 to 0.5M. If the mineral acid is 0.01M or more, ring-opening is sufficiently performed, and if the mineral acid is 1.0M or less, the ester group of the porous particles after the sugar alcohol reaction is hydrolyzed and ionic. Since there is no fear that a functional group is generated, it is preferable. The resulting particles are washed with water to easily remove excess mineral acid. By this treatment, the ring opening rate of the glycidyl group can be 95% or more.
  • the corresponding 908 cm -1 of the filler is compared with the absorbance peak observed in FT-IR in the porous particles obtained after polymerization.
  • the peak height needs to be 5% or less.
  • the residual amount of glycidyl groups is 5% or less.
  • the ring opening rate of glycidyl groups needs to be 95% or more. When the ring-opening rate is less than 95%, due to the hydrophobicity of the filler, adsorption of the hydrophobic protein to the filler may be observed when used as a separating agent.
  • the filler obtained as described above has low pressure loss, suitable hydrophilicity, low ionicity, and suitable exclusion limit molecular weight as described below. For this reason, a high-performance size exclusion chromatography column can be obtained by filling this packing material in a liquid chromatography housing, and further a chromatography apparatus equipped with this size exclusion chromatography column can be obtained. Can do. In addition, by using this size exclusion chromatography column, it is possible to provide a biopolymer separation method and a fractionation method, which can accurately separate a biopolymer with an aqueous eluent and further sort it. it can.
  • the pressure loss indicates how much pressure is generated at the column inlet when the eluent flows through the column packed with the packing material.
  • the pressure loss per column length of 30 cm when the column is packed with a column having a volume-converted average particle diameter of 8 to 15 ⁇ m and water is flowed at a linear flow rate of 100 cm / h. Hold and express.
  • a specific measuring method is shown in Reference Example 1 described later.
  • a small value of pressure loss means that the particles are not easily damaged or deformed by liquid flow, and the mechanical strength is high. Furthermore, when the pressure loss value is small, it can be used under larger linear flow rate conditions, so that rapid separation and fractionation can be expected.
  • the value of pressure loss is significantly reduced by incorporating a reaction process with sugar alcohol.
  • the pressure loss is desirably 1.2 MPa or less, and more preferably 1.0 MPa or less.
  • the hydrophilicity is determined by the formula (3) based on the elution volumes of ethylene glycol and 1-butanol measured under the conditions shown in Reference Example 2 described later.
  • (Hydrophilicity) (1-butanol elution volume) / (ethylene glycol elution volume) (3)
  • 1-butanol is more hydrophobic than ethylene glycol. For this reason, when the hydrophilicity of the filler is low, the elution of 1-butanol is delayed from that of ethylene glycol due to the hydrophobic interaction with the filler.
  • the hydrophilic value approaches 1, it can be determined that the particles are hydrophilic. For biomolecule separation, a value of 1.0 to 1.4 is preferable.
  • ⁇ Ionicity> One of the advantages of size exclusion chromatography is that ionic interactions occur between the charged biopolymer and the filler in the separation and fractionation of the biopolymer when the filler is ionic. There is a problem that it becomes impossible to separate in order of the size of a certain molecule. For this reason, the filler is preferably as low as possible in ionicity. Regarding ionicity, ionicity is measured and evaluated. Ionicity is calculated
  • (Ionicity) (Elution volume of lysozyme) / (Elution volume of myoglobin) (4) If the filler is ionic, basic lysozyme interacts with the filler. For this reason, a difference arises when compared with the elution time of neutral protein myoglobin having a comparable molecular size. The closer the value is to 1, it can be determined that the particles are nonionic.
  • the nonionic value is preferably 0.8 to 1.2. In the case of a filler in which the sugar alcohol reaction is not performed and only the ring-opening reaction of the glycidyl group is performed, this value becomes large, resulting in inconvenience.
  • the exclusion limit molecular weight is measured according to Reference Example 4 described later.
  • the exclusion limit molecular weight is preferably 1 million or more.
  • the exclusion limit is 1 million or less, if the exclusion limit is 1 million or less, the IgM enters the exclusion limit region and cannot be separated.
  • Degree of separation 1.18 ⁇ [(T 2 ⁇ T 1 ) / (W 2 + W 1 )] (5) (T 1 is the elution time of IgM, T 2 is the elution time of IgG, W 1 is the half width of the peak of IgM (peak width at the peak height 1 ⁇ 2 portion), W 2 is the half width of the peak of IgG To express.)
  • the degree of separation is preferably 1.5 or more, which is regarded as complete separation.
  • Reference Example 2 hydrophilicity measurement conditions
  • a column packed in the same manner as in Reference Example 1 was connected to a high-performance liquid chromatograph, and ethylene glycol (5 mg / mL) prepared using ion-exchanged water as a solvent by flowing ion-exchanged water as a mobile phase at a flow rate of 1.0 mL / min.
  • a sample containing 1-butanol (5 mg / mL) was injected into a 10 ⁇ L column for measurement.
  • the elution time of each component was measured from the chromatogram obtained using a differential refractive index detector (trade name: RI-201H, manufactured by Showa Denko KK), the elution volume was determined, the elution volume ratio, (1-butanol (Elution volume) / (elution volume of ethylene glycol) was determined, and the value was used as an indicator of hydrophilicity.
  • RI-201H differential refractive index detector
  • Reference Example 3 Ionicity measurement conditions
  • a column packed in the same manner as in Reference Example 1 was connected to a high performance liquid chromatograph, and 0.05 M phosphate buffer (pH 7) +0.3 M sodium chloride aqueous solution was used as a mobile phase at a flow rate of 1.0 mL / min. 10 ⁇ L of a sample containing 1 mg / mL (model number L6876, Sigma-Aldrich) and 10 ⁇ L of sample containing 5 mg / mL of myoglobin (model M0630, Sigma-Aldrich) were each injected into the column.
  • 0.05 M phosphate buffer (pH 7) +0.3 M sodium chloride aqueous solution was used as a mobile phase at a flow rate of 1.0 mL / min. 10 ⁇ L of a sample containing 1 mg / mL (model number L6876, Sigma-Aldrich) and 10 ⁇ L of sample containing 5 mg / mL of myoglobin (model
  • the mobile phase was used as a solvent for the preparation of lysozyme and myoglobin samples.
  • Each component from the chromatogram obtained using an ultraviolet absorption detector (trade name: SPD-20A, manufactured by Shimadzu Corporation) with a wavelength of 280 nm.
  • SPD-20A ultraviolet absorption detector
  • the elution time was measured, the elution volume was determined, the elution volume ratio, (lysozyme elution volume) / (myoglobin elution volume) was determined, and the value was used as an indicator of ionicity.
  • Example 1 ⁇ Synthesis of porous particles having a glycidyl group (first step)> Glycidyl methacrylate (trade name: Blemmer G (registered trademark) manufactured by NOF Corporation) 27.7 g, glycerin-1,3-dimethacrylate (trade name: NK ester 701, Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) 11.4 g and chlorobenzene 61.9 g 2,2′-Azobis (methyl isobutyrate) was added and dissolved by stirring to prepare an organic phase.
  • Glycidyl methacrylate trade name: Blemmer G (registered trademark) manufactured by NOF Corporation
  • glycerin-1,3-dimethacrylate trade name: NK ester 701, Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.
  • the amount of glycidyl methacrylate used is 80 mol% with respect to the total amount of monomers, the amount of glycerin-1,3-dimethacrylate used is 20 mol% with respect to the total amount of monomers, and the amount of diluent used is the total amount of monomers. It was 158 mass parts with respect to 100 mass parts.
  • An aqueous medium was prepared by stirring and dissolving 500 g of ion exchange water, 15 g of polyvinyl alcohol, and 15 g of sodium chloride.
  • the organic phase is added to this aqueous medium, and an oil droplet is adjusted to 1 to 50 ⁇ m by high-speed stirring at 1800 rpm for 5 minutes using an Excel auto homogenizer (manufactured by Nippon Seiki Seisakusho Co., Ltd.). Then, the mixture was heated to 60 ° C. while stirring at 100 rpm in a nitrogen gas atmosphere in a water bath and reacted for 15 hours. After cooling, the produced copolymer particles were filtered off, and then washed with 1 L of ion exchange water, 1 L of acetone, and 1 L of ion exchange water again. The obtained porous particles were classified to 10 to 15 ⁇ m with a sieve to obtain 40.5 g of porous particles having a glycidyl group.
  • the porous particles were wetted with water by dispersing 39.1 g (100 parts by mass) of the porous particles in 1 L of ion-exchanged water and filtering.
  • the wet porous particle was 102.7 g. (Contains 63.6 g of ion-exchanged water.) 150 mL of ion-exchanged water, 250 g (640 parts by mass) of D-sorbitol (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.) as sorbitol, and the wet porous particles were transferred to a 1 L separable flask. The mixture was dispersed with stirring.
  • ⁇ Ring-opening reaction of remaining glycidyl group (third step)> 38.4 g of the porous particles reacted with the sugar alcohol were dispersed in 1 L of ion-exchanged water and filtered to obtain porous particles wet in water.
  • 700 mL of ion-exchanged water and 24.7 g of 47% by mass sulfuric acid were transferred to a 1 L separable flask to prepare a 0.15 M aqueous sulfuric acid solution.
  • About 100 g of the porous particles wet in water were added to the sulfuric acid aqueous solution, and the temperature was raised to 60 ° C. while stirring at 200 rpm, and the reaction was performed for 2 hours. After cooling, the porous particles were filtered off and then washed with 1 L of ion exchange water. After drying, 40.5 g was obtained as a filler.
  • the pressure loss was 0.6 MPa
  • the hydrophilicity was 1.2
  • the ionicity was 1.1
  • the exclusion limit molecular weight was 1.1 million.
  • an absorbance peak at 908 cm ⁇ 1 by FT-IR was not observed.
  • the ring opening rate of the glycidyl group calculated according to the method for obtaining the ring opening rate of the glycidyl group shown in the above [Third step] was 100%.
  • the above packing material was packed into a stainless steel column having an inner diameter of 8 mm and a length of 300 mm by an equilibrium slurry method.
  • the column was connected to a high performance liquid chromatograph to evaluate biopolymer separation.
  • 0.05 mg phosphate buffer solution (pH 7) + 0.3 M sodium chloride aqueous solution was used as a mobile phase at a flow rate of 1.0 mL per minute, and 1 mg / mL IgM (model number I8135, manufactured by Sigma Aldrich) was prepared using the mobile phase as a solvent.
  • 10 ⁇ L of a sample containing 1 mg / mL IgG manufactured by Tsukuda Model No. I4506, manufactured by Sigma-Aldrich was measured.
  • FIG. 1 shows a chromatogram obtained using an ultraviolet absorptiometric detector (trade name: SPD-20A, manufactured by Shimadzu Corporation) having a wavelength of 280 nm.
  • SPD-20A ultraviolet absorptiometric detector
  • Examples 2 to 10 In the process of preparing the filler described in Example 1, as shown in Table 1, the amount of potassium hydroxide used, the concentration of sulfuric acid, the amount of glycidyl methacrylate and the amount of glycerin-1,3-dimethacrylate used The fillers were obtained in the same manner as in the Examples except that the amount of diluent and the type of sugar alcohol were changed. The evaluation results are shown in Table 1. (The xylitol of Example 10 was manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • Example 1 A filler was obtained in the same manner as in Example 1 except that the reaction with the sugar alcohol was omitted. The evaluation results are shown in Table 1. Without the sugar alcohol reaction, pressure loss was high, ionicity was high, and an undesirable filler was obtained.
  • Example 3 The porous particles obtained by polymerization in the same manner as in Example 1 were used as fillers without performing sugar alcohol reaction or glycidyl group ring-opening reaction. The evaluation results are shown in Table 1. Regarding ionicity, lysozyme and myoglobin used for measurement were not eluted due to non-specific adsorption, and measurement was not possible. A filler having unfavorable hydrophilicity was obtained.
  • Table 1 shows glycerin-1,3-dimethacrylate as GDM and glycidyl methacrylate as GMA.
  • the usage-amount of a diluent shows the mass part of a diluent with respect to 100 mass parts of total monomers.
  • the usage-amount of potassium hydroxide represents the mass part with respect to 100 mass parts of porous particles.
  • the pressure loss is 1.2 MPa or less
  • the hydrophilicity is 1.0 to 1.4
  • the ionicity is 0.8 to 1.2
  • the exclusion limit molecular weight is 1 million or more. In Examples 1 to 10, all items were satisfied.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Abstract

本発明は、簡単な工程で製造でき、小粒径であってもカラムの圧力損失が小さく、大量処理を必要とする分取目的のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤として使用するのに好適な充填剤、およびその充填剤の製造方法を提供することを課題とする。本発明では、グリセリン－１，３－ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートを、重合開始剤の存在下で重合する工程、得られた共重合体からなる多孔質粒子を糖アルコールで親水化する工程、その後に残グリシジル基を鉱酸により開環する工程を含む製造工程により、サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤を得る。

Description

サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤およびその製造方法
　本発明は、生体高分子を分取するための充填剤に関する。さらに詳しくは、多糖類、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡのような生体由来高分子を水系溶離液でサイズ排除クロマトグラフィーの原理に基づき、分離、分取するのに適した充填剤に関する。
　分子の大きさの順に分離するサイズ排除クロマトグラフィーは多糖類、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡの様な水溶性高分子を分離する際に広く利用されている。サイズ排除クロマトグラフィーは、とりわけタンパク質等の生体高分子の分離、分取においては、生体高分子を穏和な条件で処理できるため、生体高分子の変性が少ない状態で分離、分取できるといった利点がある。分離、分取された生体高分子は生化学反応への応用や食品、製薬、化学等の工業的用途に使用され、近年市場が著しく拡大成長している。その需要に対応するため工業スケールに即した大量処理可能な分離、分取用の充填剤が望まれている。特に、生体に含まれる抗体である、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）といったタンパク質は、その医薬品として用途が注目され、こうしたタンパク質の分離、分取が効率よく行うことのできる充填剤が強く望まれている。
　既に、分析用途では、多種多様のサイズ排除クロマトグラフィー用充填剤がカラムに充填されたものが販売されている。分析用途に使用される充填剤粒子は、およそ３μｍから１５μｍの平均粒径を有する。これらの充填剤は、分取したい生体高分子の量が少量の時には、分取用の充填剤として使用することもできる。しかし、工業用スケールで大量処理に用いるためには、充填剤を大きなカラムに充填する必要があり、この場合には、分析用途の充填剤では充填剤の平均粒径が小さすぎるため、装置にかかる背圧が高くなりすぎるという問題を有していた。
　一方、分取用の充填剤として、既に販売されている充填剤では、充填剤の機械的強度が十分でない場合が多い。こうした充填剤において、平均粒径が小さい場合は機械的強度不足により圧密化が進行し、カラム圧力損失の上昇、閉塞が起こりやすくなる問題があった。このため、多くの市販されている分取用の充填剤は、例えば、主に５０μｍ以上といった、より平均粒径の大きな充填剤として販売されている。平均粒径が大きい場合は、背圧が高くなることがなく、大量の生体高分子を分離、分取することができる。しかし、平均粒径が大きい充填剤では、サイズ排除の原理に基づく分離性能が低下してしまう問題があり、分離性能を確保するため低線流速下での使用が余儀なくされ、操作が長時間化してしまう課題がある。
　機械的強度の高い充填剤を得るための技術として、以下の例などが提案されている。
　特許文献１には、エチレングリコールジメタクリレートとグリシジルメタクリレートからなる基材に、ジメチルスルホキシドや１，４－ジオキサン中で、エチレングリコールやグリセリンなどを、塩基の存在下で反応させることにより、圧密化が起こらず機械的強度が十分な多孔質担体が得られることが開示されている。
　イオン交換基を導入した合成ポリマー系の充填剤において、高いタンパク質の保持容量を付与するために、充填剤に超枝分れ親水性ポリヒドロキシ官能性のポリマーを共有結合で結合することが、特許文献２に開示されている。この技術により、充填剤は化学的安定性及び堅牢性に関しても十分な特性を示すと報告されている。
特開２０１２－１４１２１２号公報 特許第４４４０７７１号公報
　このように、様々な報告があるが、依然として、機械的強度の十分な、分取に適した充填剤が望まれていた。特に、十分な機械的強度を持ち、１０～１５μｍ程度の平均粒径であっても充填した時にカラムにかかる背圧の小さな充填剤が望まれていた。
　本発明は上記に見られる問題点を解決することを課題とする。より特定すれば、本発明の課題は、簡単な工程で製造でき、小粒径であってもカラムの圧力損失が小さく、大量処理を必要とする分離、分取目的に好適に使用できるサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤、およびその充填剤の製造方法を提供することにある。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グリシジル基を持った単量体と架橋剤とを重合開始剤の存在下で重合し、得られた共重合体からなる多孔質粒子を糖アルコールで親水化し、その後に残グリシジル基を鉱酸により開環する工程を経ることで目的とする充填剤が得られることを見出し、本発明を成すに至った。すなわち本発明は以下の事項に関する。
　[１] 少なくともグリセリン－１，３－ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートをモノマー単位とする共重合体の表面に、下記式（Ｉ）で表わされる構造を有する多孔質粒子であって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （但し、Ｒ1は多孔質粒子の部分構造、Ｒ2は、水素原子または多孔質粒子の部分構造を意味し、ｎは１～５の整数を意味する。）
　前記多孔質粒子のグリシジジル基の開環率が９５％以上となっていることを特徴とするサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
　[２] 前記共重合体が、グリセリン－１，３－ジメタクリレート　６モル％～２９モル％、グリシジルメタクリレート　７１モル％～９４モル％をモノマー単位として含有する[１]に記載のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
　[３] 式（Ｉ）のｎが４である[１]または[２]に記載のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
　[４] 下記（１）～（３）の工程を含むサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤の製造方法。
（１）モノマーとして少なくともグリセリン－１，３－ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートに、希釈剤を加え、ラジカル重合開始剤を用いて水性媒体中で重合して、グリシジル基を有する多孔質粒子を得る第１の工程。
（２）グリシジル基を有する多孔質粒子を、糖アルコールが溶解した水溶液中に分散し、アルカリ金属水酸化物を含んだ水溶液を添加し、加熱撹拌してグリシジル基に糖アルコールを結合させる第２の工程。
（３）（２）で得た糖アルコールが結合された多孔質粒子を、鉱酸を含む水溶液中に分散し、加熱撹拌して残存するグリシジル基を開環する第３の工程。
　[５] 第３の工程終了後のグリシジル基の開環率が９５％以上である[４]に記載の充填剤の製造方法。
　[６] グリシジル基を有する多孔質粒子が、グリセリン－１，３－ジメタクリレート　６モル％～２９モル％、グリシジルメタクリレート　７１モル％～９４モル％をモノマー単位として含有する共重合体からなる、[４]または[５]に記載の充填剤の製造方法。
　[７] 糖アルコールが、ソルビトールである[４]～[６]のいずれかに記載の充填剤の製造方法。
　[８] 体積換算平均粒径が８～１５μｍの親水性多孔質粒子からなり、
　カラムに充填し、水を線流速１００ｃｍ/ｈで流した時の、充填剤長３０ｃｍ当たりの圧力損失が１．２ＭＰａ以下であり、
　１－ブタノールとエチレングリコールとの溶出容量の比で示される親水性の比が１．０から１．４であり、
　リゾチームとミオグロビンとの溶出容量で示されるイオン性の比が０．８から１．２であり、
　プルランの排除限界分子量が１００万以上であることを特徴とする、
　サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
　[９] [１]～[３]のいずれかに記載の充填剤が液体クロマトグラフィー用筐体に充填された、サイズ排除クロマトグラフィー用カラム。
　[１０] [９]に記載のサイズ排除クロマトグラフィー用カラムを備えたクロマトグラフィー装置。
　[１１] [９]に記載のサイズ排除クロマトグラフィー用カラムを用いて水系溶離液で生体高分子を分離することを特徴とする生体高分子の分離、分取方法。
　本発明によれば、分離性能の高い、小さな平均粒径の充填剤をサイズの大きなカラムに使用できる。このことにより分離処理の高速化が可能である。さらに、該充填剤は、安価な原料、簡便な工程で製造することが可能であり、大量の充填剤を使用する工業用スケールにおいても適用が容易である。
図１は、実施例１の充填剤を用いた時のＩｇＭとＩｇＧの分離の様子を示すクロマトグラムである。
　以下、本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下の説明において例示される材料、寸法等は一例であって、本発明はそれらに限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することが可能である。
　本発明のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤は、少なくともグリセリン－１，３－ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートをモノマー単位とする共重合体の表面に、下記式（Ｉ）で表わされる構造を有する多孔質粒子であって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （但し、Ｒ1は多孔質粒子の部分構造、Ｒ2は、水素原子または多孔質粒子の部分構造を意味し、ｎは１～５の整数を意味する。）
　前記多孔質粒子のグリシジジル基の開環率が９５％以上となっていることを特徴とする。
　本発明のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤は、例えば下記（１）～（３）の工程を含むサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤の製造方法によって製造することができる。
［第１の工程］
＜グリシジル基を有する多孔質粒子の作製＞
　本発明においては、少なくとも、グリセリン－１，３－ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートをモノマー単位とする共重合体からなるグリシジル基を有する多孔質粒子を基材として利用する。多孔質粒子は、親水性架橋性単量体であるグリセリン－１，３－ジメタクリレートとグリシジル基を持つ単量体であるグリシジルメタクリレートを希釈剤の存在下で共重合することによって得られる。これらの、多孔質粒子は、特開２００７／１７０９０７、ＷＯ２００６／１３２３３３等の記載の方法を参考に製造することができる。
　前記共重合体は、モノマー単位として、グリセリン－１，３－ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートを合計で９５モル％以上含めば、多孔質粒子の性質を大幅に変化させない範囲で、他のモノマー単位を含んでも構わない。他のモノマーとして、グリシジル基を持つ単量体としては、３、４－エポキシシクロヘキシルメチルメタクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル等があげられる。また、親水性架橋性単量体として、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、グリセリン－１，３－ジアクリレート、グリセリンメタクリレートアクリレートから選ばれる多価アルコールの（メタ）アクリル酸エステルなどが好ましく用いられる。その他、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレートなども使用できる。なお、本明細書において、「（メタ）アクリレート」は、アクリレート及びメタクリレートを意味する。
　グリシジルメタクリレートは、共重合に用いられる単量体の混合物の総量に対し７０～９５モル％、好ましくは８０～９０モル％用いられる。グリシジルメタクリレートが７０モル％以上であると、サイズ排除クロマトグラフィー用充填剤として親水性が十分であり、また９５モル％以下であると機械的強度が維持されカラム内の充填剤の圧密化を防ぐことができる。
　グリセリン－１，３－ジメタクリレートは、共重合に用いられる単量体の混合物の総量に対し５～３０モル％、好ましくは１０～２０モル％用いられる。グリセリン－１，３－ジメタクリレートが３０モル％以下であると、サイズ排除クロマトグラフィー用充填剤として親水性が十分であり、また５モル％以上であると機械的強度が維持されカラム内の充填剤の圧密化を防ぐことができる。
　前記多孔質粒子は細孔を有する。多孔性を付与する目的で前記単量体混合物に希釈剤を添加し重合する。希釈剤とは、単量体混合物に溶解するが重合反応には不活性で、さらに生成した共重合体を溶解しない性質の有機溶媒である。重合終了後、希釈剤を洗浄等により取り除くことで希釈剤部分が空洞になり粒子中に多孔を形成する。
　希釈剤としては、例えばトルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン、クロロベンゼンのような芳香族系炭化水素類；ヘキサン、ヘプタン、ペンタン、オクタン、ノナン、デカンのような飽和炭化水素類；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコール、へプチルアルコール、オクチルアルコール、ノニルアルコールのようなアルコール類；ジクロルメタン、ジクロルエタン、トリクロルエタンのような脂肪族ハロゲン化炭化水素類；酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸ペンチル、安息香酸メチル、安息香酸エチル、安息香酸プロピルのような脂肪族あるいは芳香族エステルなどを用いることができる。これらの希釈剤は単独でまたは２種類以上混合して使用することができる。
　その希釈剤の添加量は充填剤の排除限界分子量や細孔容積の体積％（充填剤粒子の全容積に対する細孔容積の割合を示す）に影響を与える。このため、適宜その量を調節して加えられる。これらの希釈剤の添加量は単量体の総量１００質量部に対して１００～３００質量部が好ましい。
　単量体混合物に希釈剤を加えたものには、重合開始剤が加えられる。重合開始剤は、ラジカルを発生する公知のラジカル重合開始剤であれば特に限定されないが、例えば、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル、２，２’－アゾビス(イソ酪酸メチル)のようなアゾ系開始剤を挙げることができる。この内、化学構造の親和性から、２，２’－アゾビス(イソ酪酸メチル)を用いることが望ましい。重合開始剤の濃度に特に限定はないが単量体の総量１００質量部に対して０．１～５質量部が好ましい。
　単量体混合物、希釈剤、重合開始剤によって、単量体を含む油相が準備される。油相は、適当な分散安定剤を含んだ水性媒体中で撹拌懸濁させ、油滴の状態にする。その状態で重合（懸濁重合）することにより、共重合体が適当な粒径を持つ多孔質粒子として生成される。油滴の作製方法には、上記の撹拌によるものの他に、希釈剤を含む単量体溶媒を多孔質膜、あるいは石英基板に形成されたマイクロ流路を通じて水性媒体中に滴下する方法を適用することができる。
　水性媒体に含まれる分散安定剤としては公知のものが使用できる。通常、ゼラチン、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコールなどの水溶性高分子化合物が用いられる。一般には、ポリビニルアルコールが用いられる。分散安定剤の濃度は、水性媒体に対して０．１～５質量％が好ましい。
　水性媒体は、水のほかに塩類その他の水溶性成分を含んでもよい。塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウムなど一般に用いられるものが挙げられる。使用する塩類により溶解度に違いがあるため、濃度は一概に規定できないが、例えば塩化ナトリウムでは０．１～１５質量％、塩化カルシウムでは１～４０質量％溶解して使用することが好ましい。
　油滴状態での重合反応は窒素ガス置換後、通常、撹拌下で４０～１００℃に加熱し、大気圧下で５～１６時間反応を行う。このときそれぞれの油滴に含まれる単量体は、希釈剤を含んだ状態で重合し、網状に重合体が成長するため、あとで希釈剤を除去することにより多孔質粒子が得られる。反応後、多孔質粒子はろ過等によって水性媒体から容易に分離することができる。さらに、アセトン、メタノールのような溶媒で洗浄し、希釈剤の除去を行う。乾燥後、得られたグリシジル基を有する多孔質粒子は、篩や風力分級装置によって分級される。
　粒子の平均粒径は、体積換算平均粒子径で表される。体積換算平均粒子径とは、画像解析式粒度分布測定装置によって得られた値である。粒子の体積平均粒子径に画像解析式粒度分布測定装置を用いる場合、２０００個以上の架橋重合体粒子を画像解析式粒度分布測定装置で撮像して得られた二次元の粒子像（静止画像が好ましい）から各粒子の円相当径（粒子像の投影面積と同じ面積を持つ円の直径）を得て、その円相当径から各粒子の体積を算出して、体積を基準に平均化した粒子径である。このとき、各粒子は、上記の円相当径と同一の直径を有する球体とみなす。画像解析式粒度分布測定装置としては、例えば、フロー式粒子像分析装置（商品名：ＦＰＩＡ－３０００、シスメックス株式会社製）を用いることができる。
　好ましい多孔質粒子の平均粒径は、８～１５μｍであり、より好ましくは１０～１３μｍである。
［第２の工程］
＜グリシジル基を有する多孔質粒子と糖アルコールとの反応＞
　このようにして得られたグリシジル基を有する多孔質粒子に対し、親水化及び架橋処理を目的として、アルカリ金属水酸化物を含んだ水溶液の存在下、糖アルコールを反応させる。糖アルコールは、主に１級水酸基の部分で、多孔質粒子の表面の部分構造に存在するグリシジル基と反応し、エーテル結合により多孔質粒子に結合し、多孔質粒子表面に親水性を付与する。結合した糖アルコール由来の構造には他末端に１級水酸基が存在する。この１級水酸基の近くに、反応可能な別のグリシジル基がある場合には、さらに、反応が起こり、架橋が起こる。こうした糖アルコールとの反応によって、多孔質粒子の機械的強度が大きくなる。また、多孔質粒子の化学安定性が向上し、後に残存するグリシジル基を開環する際に単量体を構成するエステル基やアミド基等の加水分解が進行しにくくなり、充填剤においてイオン性官能基が発生することを抑制し、充填剤を非イオン性に保つことが出来る。このように糖アルコールとの反応によりこれまでは不十分であった機械強度の向上と粒子特性の改善を同時に行うことが出来る。
　糖アルコールとの反応の結果、多孔質粒子表面に形成される構造を、化学式であらわすと、式（Ｉ）のように表現できる。Ｒ1が示す多孔質粒子の部分構造としては、多孔質表面のグリシジル基に由来する、●－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ2－等である。但し「●」は多孔質粒子体を意味する。式（Ｉ）のＲ2が多孔質粒子の部分構造である時は、同様の部分構造が例示できる。この場合は、糖アルコールが２か所で多孔質粒子と結合していることを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （但し、Ｒ1は多孔質粒子の部分構造、Ｒ2は、水素原子または多孔質粒子の部分構造を意味し、ｎは１～５の整数を意味する。）
　多孔質粒子と糖アルコールとの反応は、イオン交換水にて湿潤状態の前記多孔質粒子（水湿潤ゲルと呼ぶことがある。）と糖アルコールとを水溶媒中に共存させたところに、アルカリ金属水酸化物を添加し、加熱撹拌することにより行うことができる。水湿潤ゲルは乾燥させた際の多孔質粒子質量に対して１倍から３倍質量の水を含む。その重量は、乾燥時のゲルのおよそ２．６倍と換算できる。
　糖アルコールとしては種々の公知のものを特に制限なく使用できる。例えば、グリセリンのようなトリトール類；エリトリトール、トレイトールのようなテトリトール類；アラビニトール、キシリトールのようなペンチトール類；ソルビトール、マンニトールのようなヘキシトール類；ボレミトール、ペルセイトールのようなヘプチトール類などが挙げられる。この内、キシリトール、ソルビトールが好ましく、ソルビトールが最も好ましい。糖アルコールは単独で使用することも、２種以上のものを組み合わせて使用することもできる。この内、炭素数が６個～７個である糖アルコールが好ましく、ソルビトールが最も好ましい。即ち式（Ｉ）においてｎ＝４～５が好ましく、ｎ＝４がさらに好ましい。
　糖アルコールの使用量としては、多孔質粒子１００質量部に対して２００質量部から３０００質量部とすることが好ましい。糖アルコールが２００質量部未満では、導入量が少なく親水性が不十分となる傾向があり、また糖アルコールが３０００質量部を超えると、溶解に必要な溶媒量が増えることがある。
　アルカリ金属水酸化物としては、種々の公知のものを特に制限なく使用できるが、一例として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物を例示することができる。その使用量としては、多孔質粒子１００質量部に対して０．２質量部から６０質量部であることが好ましく、２質量部から３０質量部とすることが特に好ましい。アルカリ金属水酸化物が０．２質量部以上であれば、親水性が十分付与され、またアルカリ金属水酸化物が６０質量部以下であれば、多孔質粒子のエステル基やアミド基が加水分解され、イオン性の官能基が生成する不都合を防ぐことができる。アルカリ金属水酸化物は単独で使用することも、２種以上のものを組み合わせて使用することもできる。得られた粒子は水で洗浄することにより、余分な糖アルコール、アルカリ金属水酸化物が取り除かれる。
［第３の工程］
＜残存するグリシジル基の開環＞
　糖アルコールを反応させた多孔質粒子中には未反応のグリシジル基が残存している。グリシジル基が残存すると多孔質粒子の疎水性が上がり、例えばタンパク質のような疎水性の高い水溶性化合物を疎水的吸着する懸念がある。そのため親水性をより高めるために残存するグリシジル基を鉱酸で開環することが望ましい。
　グリシジル基が残存していることは、以下の操作により確認できる。即ち、糖アルコールを反応させた多孔質粒子の一部を、臭化カリウムと混合し、圧力をかけペレット化した後にＦＴ－ＩＲ（商品名：Ｎｉｃｏｌｅｔ（登録商標）　ｉＳ１０、サーモサイエンティフィック社製）で測定し、赤外吸収スペクトルにおける９０８ｃｍ-1と８４８ｃｍ-1の吸光度のピーク高さを確認する。これらのピークは、エポキシ構造に起因する吸収である。糖アルコールを反応させた後の多孔質粒子におけるこれらのピーク高さは、反応前の多孔質粒子の時の該当ピークに対し、８０～９５％のピーク高さであることが多い。実際に、ピーク高さを比較する場合には、ベースラインが平らで計測しやすいため、９０８ｃｍ-1のピークを用いることができる。
　グリシジル基の残存率（％）は下記式（１）で計算される。
（グリシジル基の残存率）＝１００×（反応後のピーク高さ）／（糖アルコールとの反応前の多孔質粒子のピーク高さ）　　　（１）
グリシジル基の開環率（％）は式（２）により得られる。
（グリシジル基の開環率）＝１００－（グリシジル基の残存率）　　　（２）
　この糖アルコールを反応させた多孔質粒子に対し、鉱酸で開環を行い、同様の測定を行うと、反応前の多孔質粒子の時には確認された２つのピークがほとんど消失した。残グリシジル基の鉱酸による開環は前記粒子を水溶媒中に懸濁させたところに鉱酸を添加し、加熱撹拌することにより行うことができる。
　鉱酸としては、一例として、硫酸、硝酸、塩酸等を例示することができる。この内、硫酸が特に好ましい。使用される鉱酸の濃度は、０．０１Ｍから１．０Ｍ程度であれば良く、０．１から０．５Ｍ程度とすることが特に好ましい。鉱酸が０．０１Ｍ以上であれば、開環が十分に行われ、また鉱酸が１．０Ｍ以下であれば、糖アルコール反応後の多孔質粒子のエステル基等が加水分解されイオン性の官能基が生成する恐れが無いため好ましい。得られた粒子は水で洗浄することにより、余分な鉱酸が容易に取り除かれる。この処理により、グリシジル基の開環率を９５％以上にすることができる。
　疎水性によるタンパク質の吸着が起こらないで、十分な性能を示すためには、重合後に得られた多孔質粒子でＦＴ－ＩＲにおいて観測された吸光度ピークと比べ、充填剤の該当する９０８ｃｍ-1のピーク高さが５％以下になっていることが必要である。（グリシジル基の残存量が５％以下。）即ち、グリシジル基の開環率は、９５％以上であることが必要である。開環率が９５％未満の時は、充填剤の疎水性のため、分離剤としての使用の際に、疎水性タンパク質の充填剤への吸着が観測されることがある。
　上記のようにして得られた充填剤は、下記のとおり、低い圧力損失、好適な親水性、低いイオン性、および好適な排除限界分子量を有する。このため、この充填剤を液体クロマトグラフィー用筐体に充填することにより高性能のサイズ排除クロマトグラフィー用カラムを得ることができ、さらにこのサイズ排除クロマトグラフィー用カラムを備えたクロマトグラフィー装置を得ることができる。また、このサイズ排除クロマトグラフィー用カラムを用いることにより、水系溶離液で生体高分子を精度よく分離し、さらに分取することができる、生体高分子の分離方法および分取方法を提供することができる。
＜カラムの圧力損失＞
　圧力損失は、充填剤を充填したカラムに溶離液を流した時に、カラム入口にどれだけの圧力が生じるかを示すものである。本発明では、カラムの圧力損失を、体積換算平均粒径が８～１５μｍの充填剤を、カラムに充填し、水を線流速１００ｃｍ/ｈで流した時の充填剤長３０ｃｍ当たりの圧力損失を持って表現する。具体的な測定法は、後述する参考例１に示した。圧力損失の値が小さいことは、通液による粒子の破損、変形が起こりにくく機械的強度が高いことを意味する。さらに、圧力損失の値が小さいと、より大きな線流速条件下で使用できるので、迅速な分離、分取が期待できる。圧力損失の値は、糖アルコールとの反応工程を取り入れることで著しく低下する。圧力損失は、１．２ＭＰａ以下であることが望ましく、１．０ＭＰａ以下であることがより好ましい。
＜親水性＞
　親水性は、後述する参考例２に示す条件で測定された、エチレングリコールと１－ブタノールの溶出容量をもとに、式（３）により求める。
（親水性）＝（１－ブタノールの溶出容量）／（エチレングリコールの溶出容量）　(３)
　１－ブタノールはエチレングリコールよりも疎水性が高い。このため、充填剤の親水性が低い場合は充填剤との疎水性相互作用により、１－ブタノールの溶出がエチレングリコールよりも遅れる。親水性の値が１に近づくほど、粒子は親水性であると判断できる。生体分子分離用としては１．０～１．４の値である事が好ましい。１．５以上であると生体高分子との間に非特異吸着が起こり、回収率が低下する懸念がある。残存するグリシジル基の開環の工程の効果により、親水性が好ましい充填剤が得られるようになる。
＜イオン性＞
　充填剤がイオン性を有すると、生体高分子の分離、分取において、電荷を持つ生体高分子と充填剤との間に、イオン的相互作用が働き、サイズ排除クロマトグラフィーの利点の一つである分子の大きさの順に分離することが出来なくなるといった問題がある。このため、充填剤はイオン性ができるだけ低いことが好ましい。イオン性に関しては、イオン性を測定して評価する。イオン性は、式（４）によって求められる。リゾチームやミオグロビンの溶出容量は、後述する参考例３に示す方法によって求めることができる。
（イオン性）＝（リゾチームの溶出容量）／（ミオグロビンの溶出容量）　（４）
　充填剤にイオン性が有る場合、塩基性のリゾチームは充填剤と相互作用する。このため、同程度の分子サイズである中性タンパク質のミオグロビンの溶出時間と比較した場合に、差が生じる。値が１に近づくほど、粒子は非イオン性であると判断できる。
　非イオン性の数値は０．８～１．２であることが好ましい。糖アルコールの反応を行わず、グリシジル基の開環反応のみを行った充填剤では、この値が大きくなってしまうため、不都合が生じる。
＜排除限界分子量＞
　排除限界分子量は、後述する参考例４に従って測定される。巨大なタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーで分離するためには排除限界分子量が１００万以上であることが好ましい。例えば分子量約９０万のＩｇＭと分子量約１５万のＩｇＧといった巨大なタンパク質を分離する際、排除限界が１００万以下であるとＩｇＭが排除限界領域に入ってしまい分離が不可能となる。
＜ＩｇＭとＩｇＧの分離度＞
　ＩｇＭとＩｇＧの分離の様子は、後述する実施例1に記載の方法で確認できる。測定結果から、ＩｇＭとＩｇＧの分離度が計算される。分離度は、式（５）で計算される。
分離度＝１．１８×［（Ｔ2－Ｔ1）／（Ｗ2＋Ｗ1）］　　　　（５）
（Ｔ1はＩｇＭの溶出時間、Ｔ2はＩｇＧの溶出時間、Ｗ1はＩｇＭのピークの半値幅（ピーク高さ１／２の部分でのピーク幅）、Ｗ2はＩｇＧのピーク半値幅を表す。）
分離度は完全分離とされる１．５以上が好ましい。
以下、実施例により本発明の効果をより明らかなものとする。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することができる。
（参考例１　圧力損失測定条件）
　水に分散した湿潤状態の充填剤を、８ｍｍ内径×３００ｍｍ長のステンレスカラムに平衡スラリー法で満充填した。ポンプを接続したラインに圧力計と上記、充填剤を充填したカラム入り口を直列に接続した。カラムの出口は解放あるいは、圧力損失が無視できる様な内径の大きな配管を接続した。ポンプにより、イオン交換水を０．８５ｍＬ／ｍｉｎで流した。このとき溶離液に相当する水の線速度は、１００ｃｍ／ｈｒとなった。送液を開始して５分後圧力が安定したことを確認して圧力を読み取り、その圧力をカラムの圧力損失とした。
（参考例２　親水性測定条件）
　参考例１と同様に充填したカラムを高速液体クロマトグラフに接続し、イオン交換水を移動相として１．０ｍＬ毎分の流速で流し、イオン交換水を溶媒として作製したエチレングリコール（５ｍｇ／ｍＬ）、１－ブタノール（５ｍｇ／ｍＬ）を含有する試料を１０μＬカラムに注入して測定を行った。示差屈折率検出器（商品名：ＲＩ－２０１Ｈ、昭和電工社製）を用いて得られたクロマトグラムから各成分の溶出時間を測定し、溶出容量を求め、溶出容量比、（１－ブタノールの溶出容量）／（エチレングリコールの溶出容量）を求め、その値を、親水性を示す指標とした。
（参考例３　イオン性測定条件）
　参考例１と同様に充填したカラムを高速液体クロマトグラフに接続し、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）＋０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液を移動相として１．０ｍＬ毎分の流速で流し、リゾチーム（型番Ｌ６８７６　シグマアルドリッチ社製）１ｍｇ／ｍＬを含む試料１０μＬ、ミオグロビン（型番Ｍ０６３０　シグマアルドリッチ社製）５ｍｇ／ｍＬを含む試料１０μＬを、各々カラムに注入した。（リゾチームとミオグロビンの試料作製には、移動相を溶媒として用いた。）波長２８０ｎｍの紫外吸光光度検出器（商品名：ＳＰＤ－２０Ａ、島津製作所製）を用いて得られたクロマトグラムから各成分の溶出時間を測定し、溶出容量を求め、溶出容量比、（リゾチームの溶出容量）／（ミオグロビンの溶出容量）を求め、その値を、イオン性を示す指標とした。
（参考例４　プルランによる排除限界分子量の測定）
　参考例１と同様に充填したカラムを高速液体クロマトグラフに接続し、イオン交換水を移動相として１．０ｍＬ毎分の流速で、種々の分子量の標準物質をカラムに注入し、その溶出容量を用いて、一般に知られた方法により、排除限界分子量を求めた。検出には示差屈折率検出器（商品名：ＲＩ－２０１Ｈ、昭和電工社製）を使用し、標準物質にはプルランスタンダード（商品名：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標） ＳＴＡＮＤＡＲＤ　Ｐ－８２、昭和電工社製）を使用した。
［実施例１］
＜グリシジル基を有する多孔質粒子の合成（第１の工程）＞
　グリシジルメタクリレート（商品名：ブレンマーＧ（登録商標）　日本油脂製）　２７．７ｇ、グリセリン－１，３－ジメタクリレート（商品名：ＮＫエステル７０１、新中村化学工業）　１１．４ｇおよびクロロベンゼン　６１.９ｇに２，２’－アゾビス(イソ酪酸メチル)を加え、撹拌溶解して有機相を準備した。グリシジルメタクリレートの使用量は、単量体総量に対し８０モル％、グリセリン－１，３－ジメタクリレートの使用量は単量体総量に対し２０モル％、希釈剤の使用量は、単量体総量１００質量部に対して１５８質量部であった。イオン交換水５００ｇ、ポリビニルアルコール１５ｇ、塩化ナトリウム１５ｇを撹拌溶解して水性媒体を準備した。この水性媒体中に前記有機相を加え、エクセルオートホモジナイザー（株式会社 日本精機製作所製）を用い５分間、１８００ｒｐｍで高速撹拌して油滴を１～５０μｍに調整した後、１Ｌセパラブルフラスコに移し、水浴中で窒素ガス雰囲気下１００ｒｐｍにて撹拌しながら６０℃へ昇温して１５時間反応を行った。冷却後、生成した共重合体粒子をろ別した後、イオン交換水１Ｌ、更にアセトン１Ｌ、再度イオン交換水１Ｌで洗浄した。得られた多孔質粒子を篩にて１０～１５μｍに分級し、４０．５ｇのグリシジル基を有する多孔質粒子を得た。
＜グリシジル基を有する多孔質粒子と糖アルコールとの反応（第２の工程）＞
　上記多孔質粒子３９．１ｇ（１００質量部）をイオン交換水１Ｌ中に分散し、ろ別することにより、多孔質粒子を水で湿潤状態にした。湿潤状態の多孔性粒子は、１０２．７ｇであった。（６３．６ｇのイオン交換水を含む。）イオン交換水１５０ｍＬ、ソルビトールとして、Ｄ－ソルビトール（関東化学社製）２５０ｇ（６４０質量部）および前記湿潤状態の多孔性粒子を１Ｌセパラブルフラスコに移し、撹拌分散した。その後、水酸化カリウム２．５ｇ（６．４質量部）を加え２００ｒｐｍにて撹拌しながら６０℃へ昇温して１５時間反応を行った。冷却後、多孔質粒子をろ別した後、イオン交換水１Ｌで洗浄した。乾燥後、糖アルコール反応後の多孔質粒子３９．８ｇを得た。
＜残存するグリシジル基の開環反応（第３の工程）＞
　上記糖アルコールを反応させた多孔質粒子３８．４ｇをイオン交換水１Ｌ中に分散し、ろ別することにより、水に湿潤状態の多孔質粒子を得た。イオン交換水７００ｍＬ、４７質量％硫酸２４．７ｇを１Ｌセパラブルフラスコに移し０．１５Ｍ硫酸水溶液を調製した。上記、水に湿潤状態の多孔質粒子約１００ｇを、前記硫酸水溶液に加え２００ｒｐｍにて撹拌しながら６０℃へ昇温して２時間反応を行った。冷却後、多孔質粒子をろ別した後、イオン交換水１Ｌで洗浄した。乾燥後、充填剤として、４０．５ｇを得た。
　得られた充填剤を参考例１から４に従い測定した結果、圧力損失は０．６ＭＰａ、親水性は１．２、イオン性は１．１、排除限界分子量は１１０万であった。また、ＦＴ－ＩＲによる９０８ｃｍ-1の吸光度ピークは観測されなかった。前記［第３の工程］の項で示したグリシジル基の開環率の求め方に従って算出されたグリシジル基の開環率は１００％であった。
　上記充填剤を、８ｍｍ内径×３００ｍｍ長のステンレスカラムに平衡スラリー法で充填した。カラムを高速液体クロマトグラフに接続し、生体高分子の分離を評価した。０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）＋０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液を移動相として１．０ｍＬ毎分の流速で流し、移動相を溶媒として作製した、１ｍｇ／ｍＬのＩｇＭ（型番Ｉ８１３５　シグマアルドリッチ社製）と１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ（社製 型番Ｉ４５０６　シグマアルドリッチ社製）を含む試料１０μＬを注入して測定を行った。波長２８０ｎｍの紫外吸光光度検出器（商品名：ＳＰＤ－２０Ａ、島津製作所製）を用いて得られたクロマトグラムを図１に示す。前述の方法によりＩｇＭとＩｇＧの分離度を計算すると１．６５であり良好な分離を示した。
［実施例２～１０］
　実施例１に記述の充填剤を作製する過程において、表１に示した通りに、水酸化カリウムの使用量、硫酸の濃度、グリシジルメタクリレートの使用量とグリセリン－１，３－ジメタクリレートの使用量、希釈剤の量、糖アルコールの種類を変更した以外は、実施例と同様にしてそれぞれ充填剤を得た。評価結果を表１に示す。（実施例１０のキシリトールは、和光純薬社製のものを用いた。）
［比較例１］
　糖アルコールの反応を省略した以外は実施例１と同様に実施し、充填剤を得た。評価結果を表１に示す。糖アルコールの反応を行わないと、圧力損失が高く、イオン性が大きく、好ましくない充填剤が得られた。
［比較例２］
　グリシジル基の開環反応を省略した以外は、実施例１と同様に反応を行い、充填剤を得た。評価結果を表１に示す。鉱酸による開環反応を行わないと、親水性の値が好ましくない充填剤が得られた。
［比較例３］
　実施例１と同様の方法で重合して得た多孔質粒子について、糖アルコールの反応、グリシジル基の開環反応を行わず、充填剤とした。評価の結果を表１に示す。
　イオン性については測定に用いるリゾチーム及びミオグロビンが非特異吸着のため溶出せず、測定が出来なかった。親水性も好ましくない充填剤が得られた。
［比較例４］
　市販品であるＳｈｏｄｅｘ（登録商標）　ＯＨｐａｋ（登録商標）　ＳＢ－８０４ＨＱ（昭和電工株式会社製、粒径カタログ値１０μｍ）に関して、評価を行った。結果を表１に示す。
　圧力損失の値は分析用途では何ら問題の無いレベルであるが、実施例１～１０の充填剤の方が、圧力損失がより低く、分取目的には優れていることがわかる。
　表１では、グリセリン－１，３－ジメタクリレートをＧＤＭ、グリシジルメタクリレートをＧＭＡとして表した。希釈剤の使用量は、単量体総量１００質量部に対する希釈剤の質量部を示す。水酸化カリウムの使用量は、多孔質粒子１００質量部に対する質量部を表す。
　生体高分子精製の際には本測定方法において、圧力損失１．２ＭＰａ以下、親水性１．０から１．４以下、イオン性０．８から１．２、排除限界分子量１００万以上が好ましいが、実施例１から１０においては全ての項目を満たした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005

Claims (11)

  1. 　少なくともグリセリン－１，３－ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートをモノマー単位とする共重合体の表面に、下記式（Ｉ）で表わされる構造を有する多孔質粒子であって、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （但し、Ｒ1は多孔質粒子の部分構造、Ｒ2は、水素原子または多孔質粒子の部分構造を意味し、ｎは１～５の整数を意味する。）
    　前記多孔質粒子のグリシジジル基の開環率が９５％以上となっていることを特徴とする、サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
  2. 　前記共重合体が、グリセリン－１，３－ジメタクリレート　６モル％～２９モル％、グリシジルメタクリレート　７１モル％～９４モル％をモノマー単位として含有する、請求項１に記載のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
  3. 　式（Ｉ）のｎが４である請求項１または２に記載のサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
  4. 　下記（１）～（３）の工程を含むサイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤の製造方法。
    （１）モノマーとして、少なくともグリセリン－１，３－ジメタクリレートとグリシジルメタクリレートに、希釈剤を加え、ラジカル重合開始剤を用いて水性媒体中で重合して、グリシジル基を有する多孔質粒子を得る第１の工程。
    （２）第１の工程で得たグリシジル基を有する多孔質粒子を、糖アルコールが溶解した水溶液中に分散し、アルカリ金属水酸化物を含んだ水溶液を添加し、加熱撹拌してグリシジル基に糖アルコールを結合させる第２の工程。
    （３）第２の工程で得た糖アルコールが結合された多孔質粒子を、鉱酸を含む水溶液中に分散し、加熱撹拌して残存するグリシジル基を開環する第３の工程。
  5. 　第３の工程終了後のグリシジル基の開環率が９５％以上である請求項４に記載の充填剤の製造方法。
  6. 　グリシジル基を有する多孔質粒子が、グリセリン－１，３－ジメタクリレート　６モル％～２９モル％、グリシジルメタクリレート　７１モル％～９４モル％をモノマー単位として含有する共重合体からなる、請求項４または５に記載の充填剤の製造方法。
  7. 　糖アルコールが、ソルビトールである請求項４～６のいずれかに記載の充填剤の製造方法。
  8. 　体積換算平均粒径が８～１５μｍの親水性多孔質粒子からなり、
    　カラムに充填し、水を線流速１００ｃｍ/ｈで流した時の、充填剤長３０ｃｍ当たりの圧力損失が１．２ＭＰａ以下であり、
    　１-ブタノールとエチレングリコールとの溶出容量の比で示される親水性の値が１．０から１．４であり、
    　リゾチームとミオグロビンとの溶出容量の比で示されるイオン性の値が０．８から１．２であり、
    　プルランの排除限界分子量が１００万以上であることを特徴とする、
    　サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤。
  9. 　請求項１～３のいずれかに記載の充填剤が液体クロマトグラフィー用筐体に充填された、サイズ排除クロマトグラフィー用カラム。
  10. 　請求項９に記載の前記サイズ排除クロマトグラフィー用カラムを備えたクロマトグラフィー装置。
  11. 　請求項９に記載の前記サイズ排除クロマトグラフィー用カラムを用いて水系溶離液で生体高分子を分離することを特徴とする生体高分子の分離、分取方法。
PCT/JP2018/004665 2017-02-27 2018-02-09 サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤およびその製造方法 WO2018155241A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019501231A JPWO2018155241A1 (ja) 2017-02-27 2018-02-09 サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤およびその製造方法
CN201880008890.7A CN110267740B (zh) 2017-02-27 2018-02-09 体积排阻色谱用填充剂和其制造方法
EP18758435.4A EP3586958B1 (en) 2017-02-27 2018-02-09 Packing material for size exclusion chromatography and method for producing the same
US16/487,329 US11285404B2 (en) 2017-02-27 2018-02-09 Packing material for size exclusion chromatography and method for producing the same
US17/591,774 US20220176273A1 (en) 2017-02-27 2022-02-03 Packing material for size exclusion chromatography and method for producing the same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-034792 2017-02-27
JP2017034792 2017-02-27

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/487,329 A-371-Of-International US11285404B2 (en) 2017-02-27 2018-02-09 Packing material for size exclusion chromatography and method for producing the same
US17/591,774 Division US20220176273A1 (en) 2017-02-27 2022-02-03 Packing material for size exclusion chromatography and method for producing the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018155241A1 true WO2018155241A1 (ja) 2018-08-30

Family

ID=63252630

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/004665 WO2018155241A1 (ja) 2017-02-27 2018-02-09 サイズ排除クロマトグラフィー用の充填剤およびその製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (2) US11285404B2 (ja)
EP (1) EP3586958B1 (ja)
JP (1) JPWO2018155241A1 (ja)
CN (1) CN110267740B (ja)
WO (1) WO2018155241A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7186338B1 (ja) * 2021-06-28 2022-12-08 昭和電工株式会社 充填剤およびその製造方法、並びにサイズ排除クロマトグラフィー用カラム
WO2023276549A1 (ja) 2021-06-28 2023-01-05 昭和電工株式会社 充填剤およびその製造方法、並びにサイズ排除クロマトグラフィー用カラム
WO2023276550A1 (ja) 2021-06-29 2023-01-05 昭和電工株式会社 充填剤およびその製造方法、並びにサイズ排除クロマトグラフィー用カラム

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6138462A (ja) * 1984-07-30 1986-02-24 Japan Exlan Co Ltd 液体クロマトグラフイ−用充填剤の製造法
JPS6279356A (ja) * 1985-10-02 1987-04-11 Showa Denko Kk 陰イオン交換クロマトグラフイ−用胆体及びその製造方法
JPS633006A (ja) * 1986-06-23 1988-01-08 Yokogawa Electric Corp 陰イオン交換樹脂の製造方法
JP2000074894A (ja) * 1998-08-28 2000-03-14 Shiseido Co Ltd 液体クロマトグラフィー用ポリマー充填剤およびその製造方法
WO2006132333A1 (ja) 2005-06-09 2006-12-14 Tosoh Corporation 親水性に優れた新規充填剤、及びその製造方法
JP2007170907A (ja) 2005-12-20 2007-07-05 Showa Denko Kk アルコキシアルキルアクリレートがグラフト重合した充填剤
JP4440771B2 (ja) 2002-06-28 2010-03-24 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ 表面改質ベースマトリックス
JP2010137207A (ja) * 2008-12-15 2010-06-24 Hitachi High-Technologies Corp ミックスモード型吸着剤
JP2012141212A (ja) 2010-12-28 2012-07-26 Tosoh Corp 多孔質担体及びその製造方法
WO2015199196A1 (ja) * 2014-06-27 2015-12-30 Jsr株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用担体
US20160068651A1 (en) * 2013-05-17 2016-03-10 3M Innovative Properties Company Reaction mixture, porous particles and methods of making

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992001721A1 (en) * 1990-07-20 1992-02-06 Mitsubishi Kasei Corporation Crosslinked copolymer particle and process for preparing the same
US6482867B1 (en) * 1998-08-28 2002-11-19 Shiseido Co., Ltd. Polymer packing material for liquid chromatography and a producing method thereof
KR20040039422A (ko) * 2001-09-28 2004-05-10 쇼와 덴코 가부시키가이샤 입상 소수성 중합체, 그 제조방법 및 역상 고성능 액체크로마토그래피용 칼럼
DE60217150T2 (de) * 2001-09-28 2007-10-25 Showa Denko K.K. Hydrophober polymerpartikel, verfahren zur herstellung und eine kolonne geeignet für umkehrphasenflüssigkeitschromatographie mit hoher leistung
TW200738331A (en) 2005-07-26 2007-10-16 Showa Denko Kk Method for analyzing low-molecular-weight compound in sample containing water-soluble polymer and low-molecular-weight compound
JP2007057526A (ja) 2005-07-26 2007-03-08 Showa Denko Kk 水溶性高分子と低分子化合物を含む試料中の低分子化合物の分析方法
EP2602021B1 (en) 2005-12-02 2016-01-06 Sekisui Chemical Co., Ltd. Filler for ion exchange liquid chromatography, method for production of filler for ion exchange liquid chromatography and method for analyzing a glycosylated hemoglobin
US9051355B2 (en) 2010-03-24 2015-06-09 Jsr Corporation Filler for affinity chromatography and method for isolating immunoglobulin
JP5354094B2 (ja) 2010-03-31 2013-11-27 Ｊｓｒ株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
WO2011125674A1 (ja) * 2010-03-31 2011-10-13 Jsr株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
JP6111569B2 (ja) * 2012-09-04 2017-04-12 Jsr株式会社 無機材料で構成される表面用の表面処理剤、該表面処理剤でコーティングされた器具、その製造方法、及び新規重合体
JP6387015B2 (ja) * 2013-11-27 2018-09-05 Jsr株式会社 固相担体、固相担体の製造方法、アフィニティ精製用担体、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤の製造方法、アフィニティクロマトグラフィー用充填剤、クロマトグラフィーカラムおよび精製方法

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6138462A (ja) * 1984-07-30 1986-02-24 Japan Exlan Co Ltd 液体クロマトグラフイ−用充填剤の製造法
JPS6279356A (ja) * 1985-10-02 1987-04-11 Showa Denko Kk 陰イオン交換クロマトグラフイ−用胆体及びその製造方法
JPS633006A (ja) * 1986-06-23 1988-01-08 Yokogawa Electric Corp 陰イオン交換樹脂の製造方法
JP2000074894A (ja) * 1998-08-28 2000-03-14 Shiseido Co Ltd 液体クロマトグラフィー用ポリマー充填剤およびその製造方法
JP4440771B2 (ja) 2002-06-28 2010-03-24 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ 表面改質ベースマトリックス
WO2006132333A1 (ja) 2005-06-09 2006-12-14 Tosoh Corporation 親水性に優れた新規充填剤、及びその製造方法
JP2007170907A (ja) 2005-12-20 2007-07-05 Showa Denko Kk アルコキシアルキルアクリレートがグラフト重合した充填剤
JP2010137207A (ja) * 2008-12-15 2010-06-24 Hitachi High-Technologies Corp ミックスモード型吸着剤
JP2012141212A (ja) 2010-12-28 2012-07-26 Tosoh Corp 多孔質担体及びその製造方法
US20160068651A1 (en) * 2013-05-17 2016-03-10 3M Innovative Properties Company Reaction mixture, porous particles and methods of making
WO2015199196A1 (ja) * 2014-06-27 2015-12-30 Jsr株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用担体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3586958A4

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7186338B1 (ja) * 2021-06-28 2022-12-08 昭和電工株式会社 充填剤およびその製造方法、並びにサイズ排除クロマトグラフィー用カラム
WO2023276549A1 (ja) 2021-06-28 2023-01-05 昭和電工株式会社 充填剤およびその製造方法、並びにサイズ排除クロマトグラフィー用カラム
US11857949B2 (en) 2021-06-28 2024-01-02 Resonac Corporation Packing material and method for producing the same, and column for size exclusion chromatography
WO2023276550A1 (ja) 2021-06-29 2023-01-05 昭和電工株式会社 充填剤およびその製造方法、並びにサイズ排除クロマトグラフィー用カラム

Also Published As

Publication number Publication date
EP3586958B1 (en) 2022-04-06
CN110267740A (zh) 2019-09-20
EP3586958A1 (en) 2020-01-01
US11285404B2 (en) 2022-03-29
US20220176273A1 (en) 2022-06-09
JPWO2018155241A1 (ja) 2019-12-19
US20200054967A1 (en) 2020-02-20
CN110267740B (zh) 2022-03-15
EP3586958A4 (en) 2021-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1966287B1 (en) Method of making macroporous cation exchange resins
US20220176273A1 (en) Packing material for size exclusion chromatography and method for producing the same
JP5426564B2 (ja) 多孔質高分子樹脂
JP6266597B2 (ja) 分離方法及び分離マトリックス
JP5336368B2 (ja) マクロ孔質カチオン交換樹脂を製造する方法
JP5715953B2 (ja) タンパク質分離処理における温度応答性重合体粒子
JP5475284B2 (ja) 親水性架橋ポリマー
JP5315691B2 (ja) 親水性に優れた新規充填剤、及びその製造方法
KR102017649B1 (ko) 알릴아민에 기반한, 단백질 정제용 신규한 크로마토그래피 매체 및 이의 유도체
WO2015119255A1 (ja) 固相担体、該固相担体の製造方法、アフィニティ精製用担体、充填剤、クロマトグラフィーカラム及び精製方法
WO2008058349A1 (en) Materials, methods and systems for purification and/or seperation
JP2005510593A5 (ja)
JP2012141212A (ja) 多孔質担体及びその製造方法
US7540962B2 (en) Method of preparing spheroid polymer particles having a narrow size distribution by dispersion polymerization, particles obtainable by the method and use of these particles
JPS58177140A (ja) 液体クロマトグラフイ−用多孔質充填剤及びその製造方法
EP1507808A1 (en) Macroporous cross-linked polymer particles
Çaglayan et al. Monodisperse porous poly (vinyl acetate‐co‐divinylbenzene) particles by single‐stage seeded polymerization: A packing material for reversed phase HPLC
JP7186338B1 (ja) 充填剤およびその製造方法、並びにサイズ排除クロマトグラフィー用カラム
CN109642893B (zh) Hilic柱用填充剂、填充了该hilic柱用填充剂的hilic柱及使用了该hilic柱的寡糖的分析方法
JP6731402B2 (ja) 液体クロマトグラフィー用充填剤、液体クロマトグラフィー用充填剤の製造方法、サイズ排除液体クロマトグラフィー
WO2023276549A1 (ja) 充填剤およびその製造方法、並びにサイズ排除クロマトグラフィー用カラム
WO2019187377A1 (ja) 充填剤用基材、充填剤用基材の製造方法、充填剤およびタンパク質の精製方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18758435

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019501231

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2018758435

Country of ref document: EP