WO2006132333A1 - 親水性に優れた新規充填剤、及びその製造方法 - Google Patents

親水性に優れた新規充填剤、及びその製造方法 Download PDF

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Katsuo Komiya
Yuji Kubo
Masazumi Hasegawa
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Tosoh Corporation
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    • C08F2810/20—Chemical modification of a polymer leading to a crosslinking, either explicitly or inherently

Definitions

  • the present invention shows an adsorption / desorption action with a substance (particularly protein) dissolved in an aqueous solution, and is packed with an organic compound suitable for collecting the target substance or separating and purifying it by liquid chromatography. It relates to the agent. More specifically, the present invention relates to a novel filler that has high chemical stability with respect to a high-concentration alkaline aqueous solution, is excellent in hydrophilicity, and can be used for protein separation and purification.
  • Chromatographic fillers used for protein adsorption, separation, and purification include inorganic fillers typified by silica compounds and the like, and organic fillers composed of organic polymers.
  • Organic fillers are synthetic fillers that use synthetic compounds represented by styrene, (meth) acrylic acid esters, and (meth) acrylamides, and natural polysaccharides such as agarose, dextran, and mannan. Broadly divided into system fillers.
  • a synthetic filler is a mixture of a monofunctional monomer and a polyfunctional monomer such as glycidyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate.
  • a polyfunctional monomer such as glycidyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate.
  • it is produced by a suspension polymerization method or the like, and then subjected to hydrophilization with a water-soluble polyhydric alcohol or the like to produce a substrate. Due to recent advances in hydrophilization technology in synthetic fillers, methods have been found to produce synthetic fillers that are comparable to natural ones in terms of hydrophilicity.
  • the main use of these fillers is separation and purification of proteins by liquid chromatography.
  • the main use of purified protein is pharmaceuticals (protein preparations for injection), and in this field, it is required to thoroughly eliminate the risk of side effects due to contaminant contamination.
  • heterologous proteins for example, heterologous proteins, nucleic acids, endotoxins, viruses,
  • the packing material is packed in a column and used in the purification process, but is always cleaned by a cleaning method verified before the first use and before reuse.
  • the most common purification method for cleaning the inside of equipment is cleaning with 1N sodium hydroxide. This is because proteins, endotoxins and the like can be decomposed and washed. This cleaning method is recommended as a guideline by the US Food and Drug Administration, and is an effective method for initial and re-use. In other words, it is common practice in GMP facilities that purify pharmaceutical proteins to clean the inside of the column device for each batch used. Also, when there is a batch interval, the device may be stopped by enclosing a sodium hydroxide solution diluted to 0.1N with 0.01N force. Furthermore, in order to remove abnormal proteins such as prions, it is also necessary to wash with a higher concentration (for example, 2 N concentration) of sodium hydroxide aqueous solution.
  • a higher concentration for example, 2 N concentration
  • the synthetic filler is hard (high mechanical strength), it has the advantage that it is suitable for high-speed and high separation, and has the advantage of high hydrophilicity, while being further alkaline. At present, development of synthetic fillers with resistance is expected.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 58-058026
  • Patent Document 2 JP-A-53-090991
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 05-009233
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a filler that is suitable for high-speed and high-separation, is rich in hydrophilicity, and is resistant to a high-concentration alkaline aqueous solution.
  • Is Rukoto More specifically, it has mechanical strength applicable to high-speed and high-separation, has sufficient hydrophilicity not to cause non-specific adsorption to proteins, and has a high concentration of alkaline aqueous solution. It is to provide a new filler with little change in the amount of protein adsorbed and retention even when immersed.
  • the present invention is a novel filler having excellent hydrophilicity, a method for producing the same, and a method for separating proteins using the same as described below.
  • R 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R 1 represents a -NR 3 -R 4-or over 0-1 ⁇ 4-.
  • R 3 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R 4 represents an alkylene group having 6 to 15 carbon atoms including an aliphatic ring, or a linear alkylene group having 4 to 8 carbon atoms.
  • R 5 represents a halogen atom, an alcoholic OH group, an amino group, a glycidyl group or an epoxy group.
  • R 5 is a glycidyl group, it binds to R 4 in the form of glycidyl ether.
  • the repeating unit derived from the (meth) atalyloyl monomer represented by the above formula (1) is 20 to 95 mol%
  • the repeating unit from which the polyfunctional monomer force is also derived is 80 to 5 mol%
  • R 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R 1 is - NR 3 -R represents a 4-or over 0-1 ⁇ 4-.
  • R 3 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R 4 represents an alkylene group having 6 to 15 carbon atoms including an aliphatic ring, or a linear alkylene group having 4 to 8 carbon atoms.
  • R 5 represents a halogen atom, an alcoholic OH group, an amino group, a glycidyl group or an epoxy group.
  • R 5 is an epoxy group
  • the epoxy group is attached to the aliphatic ring in a pendant form even if the epoxy group is directly introduced into a part of the aliphatic ring contained in R 4. You may hesitate.
  • R 5 is a glycidyl group, it binds to R 4 in the form of glycidyl ether. ]
  • R 6 and R 7 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms
  • R 8 is a bifunctional group having an aryl group, an oxycarbonyl group or a strong rubermoyl group.
  • the organic Re represents a group.
  • the filler is characterized by comprising crosslinked polymer particles containing 80 to 5 mol% of a repeating unit represented by
  • a monomer mixture containing 20 to 95 mol% of a (meth) atalyloyl monomer represented by the above formula (1) and 80 to 5 mol% of a multifunctional monomer, and a suspension stabilizer are suspended in an aqueous phase.
  • the polyfunctional monomer is one or more selected from the group consisting of ethylene glycol dimetatalate, 1,3 adamantane dimetatalate, dibutenebenzene, and trimethylolpropane tritalate.
  • the ion exchange group is selected from the group consisting of a sulfonic acid group, a carboxyl group, a primary amino group, a secondary amino group, a tertiary amino group, and a quaternary ammonium group.
  • the filler according to any one of the above [13] to [15], which is at least one kind.
  • [0031] [17] A method for separating a protein, wherein the packing material according to [13] to [16] is used as a packing material for chromatography.
  • the filler of the present invention is hard and has high mechanical strength, it can be used at a high speed, and has high chemical stability with respect to a high concentration alkaline aqueous solution.
  • a filler having excellent hydrophilicity or a filler having an ion exchange group can be easily prepared, and protein separation and purification It is suitable for.
  • the filler of the present invention is characterized in that it also has a crosslinked polymer particle force containing 20 to 95 mol% of repeating units derived from the (meth) atalyloyl monomer represented by the above formula (1). [Hereinafter referred to as filler (1). ] Will be described.
  • the filler (1) is not particularly limited. For example, 20 to 95 mol% of a repeating unit that is also induced by the (meth) atallyloyl monomer power represented by the above formula (1) is used. And a filler composed of crosslinked polymer particles containing 80 to 5 mol% of repeating units derived from a polyfunctional monomer. More specifically, a crosslinked polymer particle containing 20 to 95 mol% of the repeating unit represented by the above formula (2) and 80 to 5 mol% of the repeating unit represented by the above formula (3) is obtained. A filler is mentioned as a suitable thing.
  • the method for producing the filler (1) is not particularly limited.
  • 20 to 95 mol% of the (meth) ataryloyl monomer represented by the above formula (1) and a crosslinking agent can be produced by suspending a monomer mixture containing a sulfite and a suspension stabilizer in an aqueous phase, followed by polymerization.
  • a general method for producing the filler (1) using the (meth) attalyloyl monomer represented by the above formula (1) will be described below, but the production method is not limited thereto.
  • a predetermined surfactant and, if necessary, an inorganic salt are added to distilled water, and the mixture is thoroughly stirred and dissolved to obtain an aqueous solution. Thereafter, the aqueous solution is heated to a predetermined temperature.
  • the adjusted mixed solution is dropped into a stirred aqueous solution containing a surfactant to form droplets, and at the same time, polymerization is performed at a predetermined temperature to produce polymer particles.
  • the polymerization temperature at this time is not particularly limited as long as the polymerization initiator is decomposed and radicals are generated. In general, the polymerization may be performed within a range of 20 ° C to 80 ° C, more preferably 40 ° C to 70 ° C.
  • the (meth) atalyloyl monomer used in the filler (1) of the present invention corresponds to the above formula (1), and has a reaction starting point for introducing a substituent after forming a crosslinked polymer particle.
  • the (meth) acryloyl monomer is not particularly limited.
  • 4-Epoxycyclohexylethyl (meth) acrylate, 3,4-dihydroxycyclohexylethyl (meth) acrylate and some or all of its dihydroxy groups are substituted with glycidyl groups Compound; 3,4-epoxycyclohexylpropi (Meth) Atari rate, 3,
  • the proportion of the (meth) atalyloyl monomer represented by the above formula (1) is usually in the range of 20 mol% or more and 95 mol% or less, preferably in the total monomers.
  • the range is from 30 mol% to 93 mol%.
  • This ratio is preferable is that when the amount of the (meth) atalyloyl monomer is less than 20 mol%, there are the following problems.
  • (b) The base point of reaction for introducing substituents in the generated particles is reduced, and even if hydrophilicity is imparted by a hydrophilizing agent, it is necessary for separation of proteins, etc. The hydrophilicity cannot be obtained, and (c) when the proportion is larger than 95 mol%, the proportion of the polyfunctional monomer copolymerized as a crosslinking agent is too small, and the filler becomes soft.
  • the polyfunctional monomer used in the filler (1) of the present invention is not particularly limited.
  • the polyfunctional monomer is not limited to these as long as it can be copolymerized with the (meth) atallyloyl monomer represented by the above formula (1).
  • a bifunctional compound produced as a by-product may be used as a polyfunctional monomer that is copolymerized as a crosslinking agent.
  • the polyfunctional monomer include dibutenebenzene, dibutyltoluene, dibutylxylene, 1,3-adamantane dimetatalylate, ethylene glycol di (meth) atalylate, diethylene.
  • Glycol di (meth) acrylate triethylene glycol di (meth) acrylate, polyethylene glycol di (meth) acrylate, glycerol di (meth) acrylate, trimethylol propane tri (meth) acrylate, ethylene bisacrylamide, etc. Is mentioned.
  • the ratio of the polyfunctional monomer is not particularly limited, but is usually in the range of 5 mol% to 80 mol%, preferably 7 mol% or more in the total monomers.
  • the range is 70 mol% or less.
  • the reason why this ratio is preferable is that if the multifunctional monomer is less than 5 mol%, sufficient hardness cannot be obtained in the filler, and the filler may be crushed at a high pressure.
  • the cross-linking agent is 80 mol% or more, the base point of the reaction for introducing the substituent in the generated particles is reduced, and even if hydrophilicity is imparted with a hydrophilizing agent, hydrophilicity necessary for separation of proteins and the like is obtained. I can't.
  • the packing material may become brittle, causing problems such as the generation of fine particles during packing operation and stirring.
  • the filler (1) of the present invention in addition to the (meth) atalyloyl monomer represented by the above formula (1), the above-described polyfunctional monomer, the scope of the present invention is not deviated.
  • Other monomers other than these can also be used. Examples of such other polymers include, for example, hydroxyethyl (meth) acrylate, hydroxypropyl (meth) acrylate, glycidyl (meth) acrylate, linear or branched chain having 1 to 3 carbon atoms.
  • Alkyl (meth) acrylates and other (meth) atelate toy compounds hydroxyethyl (meth) acrylamide, hydroxypropyl (meth) acrylamide, hydroxybutyl (meth) acrylamide, straight chain consisting of 1 to 3 carbon atoms
  • Polymerizable (meth) acrylamide compounds such as linear or branched alkyl (meth) acrylamides
  • Polymerizable aryl compounds such as arylamine, aryl chloride, and arylglycidyl ether
  • Haloalkyl (1 to 4 carbon atoms) butyl ether Hydroxyalkyl (1 to 4 carbon atoms) heavy ether such as butyl ether and vinyl acetate Sex Binirui ⁇ , etc. can be mentioned up.
  • Other monomers used in combination are not particularly limited as long as the functions of the present invention are satisfied. Further, other monomers used in combination can be used alone or in combination.
  • Examples of the polymerization initiator used in the production of the filler (1) of the present invention include organic peroxides and azo compounds used in usual suspension polymerization. Above organic excess T-Butylperoxyneodecanoate as an oxide
  • amyl peroxide system include tertamyl peroxide 2-ethylhexanoate, tertamyl peroxide n octate, tertamyl peroxide acetate, tertamyl peroxide benzoate, and the like.
  • Dialkyl peroxides include dicumyl peroxide, 2,5dimethyl 2,5 di (t-butyloxy) hexane, di-t-butyl peroxide, di-t-amyl peroxide and the like.
  • 1,1-di (t-butylperoxy) cyclohexane 1,2 di (t-butylperoxy) butane, ethyl-3,3 di (t-butyl)
  • 1,1-di (tert-amylperoxy) cyclohexane 1,1-di (tert-amylperoxy) cyclohexane.
  • azo compounds 2,2'-azobis (4-methoxy 2,4 dimethylvale-tolyl), 2,2'-azobis (2,4 dimethylvale-tolyl), 2, 2-azobis (2-methylpropio-tolyl), 2,2, -azobis (2-methylbutyoxy-tolyl), 1,1, -azobis (cyclohexane-1-carbo-tolyl) and the like.
  • azoamide series 2, 2, azobis [N— (2-probe) 2-methylpropionamide], 2, 2, monoazobis [N butyl 2-methylpropionamide], 2, 2'-azobis [ N-cyclohexyl 2-methylpropionamide] and the like.
  • azo compounds include 2, 2'-azobis (2-methylpropionamidoxime), dimethyl 2,2'-azobis (2 methylpropionate), 4, 4, azobis (4 Cyanoberic acid), 2, 2, 1-azobis (2, 4, 4 trimethylpentane) and the like.
  • any polymerization initiator can be used as long as it is a polymerization initiator that can polymerize (meth) atalyloyl monomers, and is not particularly limited to the above compounds. If the amount of such a polymerization initiator added is too small, the polymerization rate will increase. The amount of the monomer may decrease and may remain.
  • the polymerization initiator may remain in the polymer particles and adversely affect the adsorption and separation of proteins and the like. Therefore, it is usually used in the range of 0.05 to 20% by weight, more preferably in the range of 0.2 to 10% by weight, based on the total monomers.
  • the suspension stabilizer used for suspension polymerization is not particularly limited as long as it is a surfactant that dissolves in a continuous phase.
  • a surfactant that dissolves in a continuous phase.
  • an anionic surfactant, a cationic surfactant, a non-ionic surfactant and the like can be mentioned, and any of them can be used.
  • the molecular weight of the suspension stabilizer is not particularly limited, and either a low molecular compound or a high molecular compound can be used.
  • the surfactants include fatty acid salts, sulfates of higher alcohols, phosphates of fatty alcohols, alkylaryl sulfonates, formalin condensed naphthalene sulfonates, and the like.
  • Examples of the cationic surfactant include alkyl primary amine salts, alkyl secondary amine salts, tertiary tertiary amine salts, quaternary ammonium salts, pyridinium salts, and the like.
  • Nonionic surfactants include polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene alkyl esters, sorbitan alkyl esters, polyoxyethylene sorbitan alkyl esters, and the like.
  • examples of the polymeric surfactant include partially saponified polyvinyl alcohol, starch, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, and partially saponified polymethacrylate.
  • an inorganic salt such as barium sulfate, calcium sulfate, aluminum sulfate, calcium carbonate, talc and the like may be further added as necessary in addition to these surfactants.
  • the addition amount of the suspension stabilizer is not particularly limited, but is usually in the range of 0.01 to 30% by weight, preferably 0.1 to 15% by weight, based on the continuous phase. It is a range.
  • the chromatographic packing material includes a porous packing material having a relatively large adsorption load and a high separation by suppressing the wide force ⁇ of the separation zone due to diffusion of solute molecules in the pores.
  • Non-porous fillers used for the purpose of producing performance are known.
  • the filler of the present invention can be produced as a porous or non-porous filler by a production method that is not particularly limited.
  • a porous filler it is necessary to adjust the pore diameter.
  • An example of the adjustment is shown below, but the present invention is not limited to this method.
  • the organic solvent to be added for the purpose of pore control is the amount and type of the (meth) atalyloyl monomer used in the present invention, the amount ratio of the multifunctional monomer and other monomers, the type of multifunctional monomer, Since it is affected by the amount, the type and amount of the polymerization initiator, the polymerization temperature, etc., it cannot be determined unconditionally.
  • polymer particles that are highly swellable with respect to the produced polymer particles and have a small pore size when using an organic solvent, and a poor solvent that dissolves the monomer but does not dissolve the polymer have a large pore size.
  • Polymer particles can be produced.
  • organic solvents added for the purpose of pore control include aromatic hydrocarbons such as toluene, xylene, jetylbenzene, and dodecylbenzene; saturated hydrocarbons such as hexane, heptane, and decane; isoamyl alcohol And alcohols such as hexyl alcohol and octyl alcohol.
  • the organic solvent is not particularly limited as long as it is insoluble in water and can dissolve the used monomer and polymerization initiator.
  • the amount of organic solvent added for the purpose of pore adjustment affects the porosity of the filler (which indicates the ratio of the pore volume to the total volume of the filler particles).
  • the porosity varies depending on the purpose of use of the filler, it cannot be determined unconditionally. Generally, a filler having a porosity of 40% to 90%, more preferably about 55% to 80% is used. If the porosity is out of this range, the purpose of adsorbing more water-soluble compounds such as proteins to the filler is lost, and this is because the function is not preferable. Generally, the porosity is determined by the ratio of the added organic solvent to the total monomer. The more the organic solvent is used, the higher the porosity becomes. Get smaller. However, it is possible to change the porosity by changing the monomer reaction rate or coating the particle surface with another compound after producing polymer particles with high porosity. It is not limited to this method.
  • the ratio of the polyfunctional monomer is preferably in the range of 10 mol% to 80 mol%.
  • a porous filler in the case of a porous filler, it is usually in the range of ⁇ 500 ⁇ m, preferably 5 ⁇ m to 300 ⁇ m.
  • a non-porous filler in the case of a non-porous filler, it is usually 1.5 ⁇ m to 60 ⁇ m, preferably 2 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • the particle size is too small, the pressure loss in the filled column will increase when separating and purifying proteins, etc. at high speed, and it will be necessary to use a pressure vessel, resulting in huge equipment costs. Become.
  • the particle size becomes too large it takes time until the protein in the aqueous solution reaches the particle surface, and a diffusion problem occurs in which the movement of the protein to the particle is reduced. Therefore, the above range is preferable.
  • the crosslinked polymer particles produced in this way contain impurities such as an organic solvent and a trace amount of residual monomer added for the purpose of pore control. Therefore, for example, it is common to wash the particles with a water-soluble organic solvent such as acetone or tetrahydride furan, remove the contaminants, and then introduce a substituent such as a hydrophilization reaction or ion exchange group introduction. It is.
  • a water-soluble organic solvent such as acetone or tetrahydride furan
  • filler (2) a filler characterized in that a hydrophilic group is present on the particle surface of the above-described filler (1) of the present invention [hereinafter referred to as filler (2). ] Will be described.
  • the crosslinked polymer particles used in the filler (1) of the present invention have a halogen atom, an alcoholic OH group, an amino group, a glycidyl group, or an epoxy group that serves as a reaction base point for introducing a substituent. . Therefore, hydrophilicity can be easily imparted to the crosslinked polymer particles by the action of a hydrophilizing agent.
  • the hydrophilizing agent used here is not particularly limited as long as it contains two or more active hydrogen groups.
  • water glycols having oxyethylene group repeating units of 20 or less, more preferably 10 or less, represented by ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, etc .; represented by glycerin, sorbitol, etc. Examples include polyols.
  • a hydrolyzate of a polyfunctional epoxy compound can also be used as a polyol.
  • a compound that is hydrophobic before the reaction but exhibits hydrophilicity after the reaction can be used as the hydrophilizing agent.
  • sorbitol polyglycidyl ethers sorbitan polyglycidyl ethers, pentaerythritol polyglycidyl ethers, glycerol polyglycidyl ethers, neopenes And tildaricol diglycidyl ether.
  • After reacting with the crosslinked polymer particles using such a hydrophilic agent if necessary, further comprising a compound containing a residual epoxy group and two or more active hydrogen groups as described above. You can react! Any dihydroxy compound, polyhydroxy compound, or hydrophilic compound after reaction can be used as the hydrophilizing agent.
  • the base point of the reaction is a halogen atom
  • a method of converting a halogen group into an OH group by hydrolysis in an aqueous solution under an alkali catalyst, or two or more OH group-containing compounds under an alkali catalyst and so-called William For example, a method of immobilizing using the Son reaction may be used.
  • the base point of the reaction is an alcoholic OH group
  • a method of fixing two or more OH group-containing compounds after epoxidation using epichlorohydrin in an alkaline catalyst can be mentioned.
  • the base point of the reaction is a glycidyl group or an epoxy group
  • a method of fixing two or more OH group-containing compounds in an acid or alkali catalyst can be mentioned.
  • the exclusion limit molecular weight of the filler (2) of the present invention is preferably in the range of 500,000 to 2,000,000 when pullulan is used as the standard substance and pure water is used as the eluent.
  • the filler (2) of the present invention is used as a hydrophilic base material for chromatography, for example.
  • a hydrophilic base material for chromatography intended for separation and purification of biopolymers is a target biopolymer when eluted with a neutral eluent having a salt concentration of 0.1 mol Z1. It is preferable that the filler is eluted without any interaction. That is, if the hydrophilic substrate is a porous substrate, it elutes in the order of molecular force with the largest molecular size based on the principle of size exclusion chromatography (hereinafter abbreviated as SEC). It is preferred that all molecules elute with an elution volume that is less than or equal to the total eluate volume.
  • the physical properties of the hydrophilic substrate can be substantially defined by the pore physical properties, mechanical strength, particle size distribution and shape.
  • the physical properties of the pores can be largely defined by the pore size distribution and the porosity. Appropriate pore properties depend on the separation purpose, method and molecular size of the target polymer. For example, if the target is general globular proteins and the base material is used for desalting or non-porous fillers, the pore size is preferably 5,000 or less (in terms of pullulan molecular weight) in terms of the exclusion limit molecular weight.
  • the preferred porosity is 60-95% for desalination, which is preferably as large as possible.
  • the porosity is as low as possible in order to improve the mechanical strength.
  • the exclusion limit molecular weight is preferably 5,000 to 500,000 (in terms of pullulan molecular weight).
  • the exclusion limit molecular weight is preferably 10,000 to 5,000,000 (in terms of pullulan molecular weight), and the porosity is preferably 50 to 95%. .
  • the separation performance per volume improves as the porosity increases and the particle diameter decreases. If the porosity is increased, the mechanical strength of the filler will be weakened and it will be easily deformed when the eluent is passed through. Therefore, the porosity is preferably 95% or less.
  • the base material of the packing material for high performance liquid chromatography for analytical purposes is preferably 80% or less. If the particle size is reduced, the pressure loss per column height of the packed column increases, and it becomes necessary to increase the mechanical strength.
  • the packing material in order to pass the eluent at an appropriate flow rate, the packing material must have high mechanical strength, and the porosity and particle size must be adjusted so that the pressure loss is not increased more than necessary. . If the shape of the packing material is not spherical, the packing material forms a bridge when packed in the column, creating a gap, and packing the most densely. I can't fill it. Therefore, practically, the elution peak shape is asymmetrical, the peak width is widened, and the column has low performance. Therefore, the shape of the filler is preferably spherical.
  • the chemical structure of the hydrophilic substrate requires a functional group that can be easily modified as a base point for synthesizing various fillers. It is preferable that the surface has an alcoholic hydroxyl group so that it can be fixed without interfering with the interaction inherent to the solute and the functional group. That is, it is preferable that the inside of the pores and the external surface have a large number of polar functional groups that are not alcoholic hydroxyl groups or ions. It is desirable that there is no functional group that interferes with the specific interaction of the target solute and the functional group to be introduced, and that it can be masked by simple modification. In other words, it is desirable to have as few ionic and hydrophobic groups as possible!
  • filler (3) a filler characterized in that an ion exchange group is present on the particle surface of the filler (1) or filler (2) of the present invention [hereinafter referred to as filler (3). ] Will be described.
  • the ion exchange group possessed by the filler (3) of the present invention is not particularly limited, but preferred examples include sulfonic acid groups, carboxyl groups, amino groups, and quaternary ammonium groups.
  • the method for introducing an ion exchange group into the filler (1) or the filler (2) is not particularly limited.
  • sodium sulfite in the case where the polymer particles polymerized using the (meth) atallyloyl monomer of the above formula (1) and washed with a water-soluble organic solvent have a daricidyl group or an epoxy group as a reaction starting point, sodium sulfite
  • a cation exchange resin can be obtained by opening a ring of an epoxy group and introducing a sulfonic acid group.
  • an anion exchange resin can be obtained if a primary, secondary or tertiary amino group is used in place of sodium sulfite, and an amino group is introduced by opening the epoxy group.
  • ammonia alkylamine having 1 to 4 carbon atoms, dialkylamine having 1 to 4 carbon atoms, trialkylamine having 1 to 4 carbon atoms, hydroxyalkyl (1 to 4 carbon atoms) amine, dihydroxyalkyl (1 carbon atom) ⁇ 4) amine, trihydroxyalkyl (carbon number) 1-4) Amine, N-hydroxyethylpiperazine, N-aminoethylpiperazine, morpholine, ethylenediamine, diethylenetriamine and the like.
  • an anion exchange resin can be obtained by reacting with the above amines.
  • the reaction base is an amino group, it can be used as it is as an anion exchange resin. Further, if necessary, an amino group may be further introduced through an epichlorohydrin.
  • a cation exchange resin can be obtained by reacting with bromoethyl sulfonic acid, monochloroacetic acid, 1,3-propane sultone, or the like. Further, if it is reacted with 2-chloroethyldetylamamine hydrochloride, glycidyltrimethylammonium chloride, etc., it is possible to obtain a cation-exchanged resin. Furthermore, an epoxy group can also be introduced by reacting with epino or rhohydrin.
  • the filler (3) of the present invention thus obtained is used, for example, as a chromatography filler when separating and purifying biopolymers such as proteins.
  • a packing material for ion exchange chromatography for the purpose of separating and purifying biopolymers is the same as that described in the description of the lyophilic substrate.
  • This is a filler with fixed ion exchange groups. Most of the physical properties of such fillers depend on the substrate.
  • the salt concentration of the eluent is changed by introducing an ion exchange group, the osmotic pressure changes between the inside and outside of the particle. This action causes the filler to swell at low salt concentrations and shrink at high salt concentrations.
  • protein ion-exchange chromatography a method that gradually increases the salt concentration and sequentially elutes protein forces with low interaction is frequently used.
  • the volume of the column bed changes greatly, and the packing state changes each time, and separation with good reproducibility is not achieved.
  • the magnitude of the swelling / shrinkage ratio is determined by the strength (hardness) of the base matrix (skeleton) and the ion exchange capacity. In general, the greater the ion exchange capacity, the greater the effect. Therefore, it is better that the ion exchange capacity, which makes the base matrix difficult to swell and shrink, is not larger than necessary. Specifically, an appropriate range for the ion exchange capacity is 30 to 300 meqZl.
  • the elution method of ion exchange chromatography is generally performed by gradually increasing the salt concentration as described above, or gradually elution of the eluent from the pH at which the target solute binds to the ion exchange group to the repulsive pH. There are methods of changing pH or a combination of both.
  • polyglual alcohol (suspension stabilizer) with a cane ratio of 88% and a polymerization degree of 3500 was charged with 1.5 g and 1 liter of water in a reactor equipped with a stirrer, and stirred well to dissolve the polyvinyl alcohol in water. . Thereafter, this aqueous solution was adjusted to 60 ° C., and this was used as an adjusted aqueous solution.
  • a conditioned liquid mixture consisting of 45 g of glycidyl metatalylate, 15 g of ethylene glycol dimetatalylate, 65 g of chlorobenzene, and 0.3 g of azobisisobutyrate-tolyl was prepared.
  • the solution was added dropwise while stirring.
  • the suspension was subsequently polymerized at 60 ° C. for 6 hours with stirring. Thereafter, the reactor was cooled to room temperature, the product was filtered, washed several times with warm water, and then washed with dioxane to obtain a granular gel (crosslinked polymer particles).
  • the obtained granular gel was further thoroughly washed with water, and then 20 g of this polymer was mixed well with 200 ml of 0.5N aqueous sulfuric acid solution, and this was heated to 90 ° C. on a water bath and reacted for 5 hours. Epoxy group was hydrolyzed. Thereafter, it was thoroughly washed with water and classified in a water bath to obtain a granular gel having a particle size of 40 ⁇ to 90 / ⁇ m. This gel is designated as a hydrophilic base 1.
  • the moisture content of the hydrophilized substrate 1 was determined by the weight loss of the hydrophilized substrate 1 after heating at 120 ° C. for 15 minutes with a ket type moisture meter. As a result, the water content was 57.2%.
  • the hydrochloric acid concentration in the approximately 0.2 M hydrochloric acid Z dioxane solution was determined by titration with a 0.1 M NaOH solution. Furthermore, about 2 g of hydrophilized base material 1 was put into a conical flask with a capacity of 200 ml, weighed, weighed 75 ml of ethyl alcohol, stirred for about 30 minutes at room temperature, and phenolphthalein solution as an indicator. The acid value in the measurement gel was determined by titration with 0.1 M NaOH solution.
  • the amount of epoxy per lg of dried gel was determined from the amount of residual hydrochloric acid, the acid value and the water content of the gel thus obtained.
  • the amount of epoxy in the hydrophilic substrate was 0.3 mmol or less per lg of dry gel.
  • hydrophilic column 1 was packed in a stainless steel column having an inner diameter of 10.7 mm and a length of 150 mm so as to be packed most closely.
  • the column was attached to HLC-803D (manufactured by Tosoh Corporation) equipped with a RI-8000 detector (manufactured by Tosoh Corporation).
  • dextran with a molecular weight of 40 million and pullulan with each molecular weight were used as standard substances
  • standard substances with various molecular weights were injected at a flow rate of 0.5 ml / min, and the exclusion limit molecular weight was determined from the elution volume.
  • the elution volume of dextran and ethylene glycol and the volume capacity of the column were also determined for porosity.
  • the exclusion limit molecular weight of one particle of the hydrophilized substrate was 1 million, and the porosity was 62%.
  • hydrophilized substrate 1 was washed with pure water and filtered with suction, and then 50 ml of hydrophilized substrate 1 was transferred to a 300 ml separable flask, and 20 ml of pure water and 20 ml of 35% aqueous sodium hydroxide solution were added and stirred. Mixed. Next, while maintaining the reaction temperature at 35 to 40 ° C., 33 g of epichlorohydrin and 39 g of jetylaminoethanol were added dropwise over 4 hours, and then the reaction was further continued at 40 ° C. for 5 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was subjected to suction filtration, and washed thoroughly in order of pure water, 0.5N hydrochloric acid, and pure water again. The filler obtained by this reaction is designated as aminated filler 1. [0074] Production Example 2
  • This adjusted mixed solution was prepared in the same manner as in Production Example 1, except that a prepared mixed solution consisting of 49 g of glycidyl metatalylate, llg of ethylene glycol dimetatalylate, 65 g of chlorobenzene, and 0.3 g of azobisisobutyrate-tolyl was used.
  • a prepared mixed solution consisting of 49 g of glycidyl metatalylate, llg of ethylene glycol dimetatalylate, 65 g of chlorobenzene, and 0.3 g of azobisisobutyrate-tolyl was used.
  • the suspension was polymerized at 60 ° C. for 6 hours with stirring. Thereafter, the reactor was cooled to room temperature, the product was filtered, washed several times with warm water, and then washed with dioxane to obtain a granular gel (crosslinked polymer particles).
  • the physical properties of the hydrophilized substrate 2 were measured. As a result, the moisture content was 55.9%, the residual epoxy amount was 0.3 mmol or less per lg of dry substrate, the exclusion limit molecular weight was 1.1 million, and the porosity was 63.2%.
  • aminated filler 2 Furthermore, according to the method described in Production Example 1, amino groups were introduced into the hydrophilized substrate 2. The filler obtained by this reaction is designated aminated filler 2.
  • this adjusted mixed solution was heated to 60 ° in the same manner as in Production Example 1.
  • the solution was added dropwise to the adjusted aqueous solution adjusted to C while stirring.
  • the suspension was subsequently polymerized at 60 ° C. for 6 hours with stirring. Thereafter, the reactor was cooled to room temperature, the product was filtered, washed several times with warm water, and then washed with dioxane to obtain a granular gel (crosslinked polymer particles).
  • aminated filler 3 amino groups were introduced into the hydrophilized substrate 3.
  • the filler obtained by this reaction is designated as aminated filler 3.
  • the physical properties of the hydrophilized substrate 4 were measured. As a result, the moisture content was 68.5%, the residual epoxy amount was 0.3 mmol or less per lg of dry substrate, the exclusion limit molecular weight was 1.1 million, and the porosity was 74%.
  • aminated filler 4 amino groups were introduced into the hydrophilized substrate 4.
  • the filler obtained by this reaction is referred to as aminated filler 4.
  • the physical properties of the hydrophilized substrate 5 were measured.
  • the water content was 70.5%
  • the residual epoxy amount was 0.3 mmol or less per lg of dry substrate
  • the exclusion limit molecular weight was 900,000
  • the porosity was 72%.
  • aminated filler 5 amino groups were introduced into the hydrophilized substrate 5.
  • the filler obtained by this reaction is designated as aminated filler 5.
  • n-hexane phase was extracted and removed in the order of pure water, 0.1M phosphoric acid aqueous solution, 0.1M sodium carbonate aqueous solution and pure water, unreacted 1,3 adamantanediol, salts, pyridine and methacrylic acid. did. Finally, the n-hexane phase was extracted with methanol, and the methanol solution was distilled off under reduced pressure at 35 ° C or lower.
  • the mixture was polymerized by heating to 60 ° C for 6 hours. Thereafter, the reaction product is cooled to room temperature, and the resulting granular gel polymer is filtered through a glass filter, washed several times with warm water, and then washed with 1,4-dioxane to form a granular gel (crosslinking polymer). Combined particles) were obtained.
  • the physical properties of the hydrophilized substrate 6 were measured. As a result, the water content was 67%, the residual epoxy amount was 0.3 mmol or less per lg of dry substrate, the exclusion limit molecular weight was 600,000, and the porosity was 70%.
  • aminated filler 6 amino groups were introduced into the hydrophilized substrate 6.
  • 1,4-Cyclohexanedimethanol monoatarylate (Nihon Kasei Co., Ltd.) 64g, 4-Hydroxybutyl attalylate (Nihon Kasei Co., Ltd.) 6g, Ethylene glycol dimetatalylate 18g, Chlorbenzene 240g, and t-butyl Peroxybivalate 1.
  • a mixture of Og was suspended in a solution of 15 g of polybulal alcohol (suspension stabilizer) having a saponification rate of 88% and a polymerization degree of 3500 in 1 liter of water. The mixture was polymerized by heating to 60 ° C for 6 hours with stirring.
  • reaction solution is cooled to room temperature, and the resulting granular gel polymer is filtered through a glass filter, washed several times with warm water, washed well with acetone, and then washed with water to form a granular gel (cross-linked). Polymer particles) were obtained.
  • the physical properties of the hydrophilized substrate 7 were measured. As a result, the water content was 78%, the residual epoxy amount was 0.3 mmol or less per lg of dry substrate, the exclusion limit molecular weight was 1.5 million, and the porosity was 75%.
  • aminated filler 7 The filler obtained by this reaction is referred to as an aminated filler 7.
  • a polyburpyrrolidone (suspension stabilizer) with a molecular weight of 360,000 (suspension stabilizer) and 1 liter of water were charged into a reactor equipped with a stirrer and stirred well to dissolve the polybulurpyrrolidone in water. Thereafter, the aqueous solution was adjusted to 60 ° C. Next, a mixed solution consisting of 200 g of glycidyl metatalylate, 50 g of ethylene gallic dimetatalylate and 1.Og of azobisisobutyronitrile was prepared, and this mixed solution was stirred in the above aqueous solution at 60 ° C. It was dripped. The suspension was polymerized for 8 hours at 60 ° C.
  • aminated filler 8 amino groups were introduced into the hydrophilic substrate 8.
  • a polyburpyrrolidone (suspension stabilizer) having a molecular weight of 360,000 (suspension stabilizer) and 1 liter of water were charged into a reactor equipped with a stirrer and stirred well to dissolve polybulurpyrrolidone in water. Thereafter, the aqueous solution was adjusted to 60 ° C. Next, 3, 4-epoxycyclohexylmethyl A mixed solution consisting of 276 g of metatalylate, 50 g of ethylene glycol dimetatalylate and 1.Og of azobisisobutyronitrile was prepared, and this mixed solution was added dropwise to the above aqueous solution at 60 ° C. with stirring. The suspension was polymerized at 60 ° C.
  • aminated filler 9 amino groups were introduced into the hydrophilized substrate 9.
  • the filler obtained by this reaction is referred to as an aminated filler 9.
  • reaction solution is cooled to room temperature, and the resulting granular gel polymer is filtered through a glass filter, washed several times with warm water, and then washed with 1,4-dioxane to form a granular gel (crosslinked polymer particles). Obtained.
  • reaction solution is cooled to room temperature, the resulting granular gel polymer is filtered through a glass filter, and the polymer is washed several times with warm water to remove the suspension stabilizer adhering to the surface. 4 Washed with dioxane to obtain a granular gel (crosslinked polymer particles).
  • the physical properties of the hydrophilized substrate 11 were measured.
  • the water content was 70.5%
  • the residual epoxy amount was 0.3 mmol or less per lg of dry substrate
  • the exclusion limit molecular weight was 800,000
  • the porosity was 72%.
  • 1,4 Cyclohexanedimethanol monoatarylate (Nippon Kasei Co., Ltd.) 32g, 6-aminohexylmethacrylamide 32g, ethylene glycol dimetatalylate 18g, isoamyl alcohol 100g, black mouth benzene 100g, and t-butylperoxy
  • a mixture of 1.5 g of pivalate was suspended in a solution of 25 g of polyburpyrrolidone (suspension stabilizer) having a molecular weight of 360,000 and 1 ml of ethanolamine in 1 liter of water. The mixture was polymerized by heating to 60 ° C for 6 hours with stirring.
  • reaction solution is cooled to room temperature, and the resulting granular gel polymer is filtered through a glass filter, washed several times with warm water, then thoroughly washed with acetone, and then washed with water to form a granular gel (crosslinked polymer). Particles).
  • polyglycerin polyglycidyl ether (trade name: Denacol EX (512, manufactured by Nagase Kasei Kogyo Co., Ltd.) 25 g and 80 ml of pure water were mixed well, 30 ml of 5N sodium hydroxide solution was added dropwise at 45 ° C, and the mixture was stirred for 3 hours. Next, the reaction product was cooled to room temperature, thoroughly washed with 0.1 N hydrochloric acid and water, and subjected to sieving to obtain a granular gel having a particle size of 40 to 90 m. This gel is used as a hydrophilic substrate 12.
  • aminated filler 12 amino groups were introduced into the hydrophilized substrate 12.
  • the filler obtained by this reaction is referred to as an aminated filler 12.
  • the hydrophilized base material 4 obtained in Production Example 4 was washed with pure water, filtered with suction, and then 5 Oml of the hydrophilized base material 4 was transferred to a 300 ml separable flask. 30 ml of pure water and 1,3-propane sultone 20 g To this and mixed with stirring. While maintaining the reaction temperature at 35 to 45 ° C, 15 g of 48% aqueous sodium hydroxide solution was added dropwise thereto, and after the addition, the reaction was further continued at 40 ° C for 3 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was suction filtered and washed thoroughly with pure water. The filler obtained by this reaction is referred to as sulfonated filler 13.
  • sulfone groups were introduced into the hydrophilized substrate 2 obtained in Production Example 2.
  • the filler obtained by this reaction is referred to as sulfonated filler 16.
  • quaternary ammonium groups were introduced into the hydrophilized substrate 2 obtained in Production Example 2.
  • the filler obtained by this reaction is designated as quaternary ammoniumized filler 18.
  • EX512 polyglycerin polyglycidyl ether (trade name: Denacol EX—51 2, manufactured by Nagase Chemical Industries)
  • hydrophilicity and alkali resistance of the hydrophilized substrate 4 obtained in Production Example 4 were evaluated in a room adjusted to 25 ° C and 2 ° C.
  • the hydrophilicity was evaluated by injecting the protein solution into a packed column and an empty column, collecting a fixed amount of eluate, and measuring the recovery rate by measuring and comparing the 280 nm ultraviolet absorbance of the eluate.
  • the proteins include ovalbumin (egg white), a-chymotrypsinogen A (usi), myoglobin (uma) and lysozyme (egg) (sold by Sigma Aldrich Japan), cytochrome. Mu C (Uma) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • a packed column having a hydrophilized base material of 4 forces was packed in a stainless steel column having an inner diameter of 10.7 mm and a length of 150 mm by a slurry packing method.
  • 0.1M phosphorus Using a solution containing acid buffer ( ⁇ 6.8) and 0.2M sodium sulfate 1.
  • Pour at a flow rate of OmlZmin and inject 0.1ml of the above protein dissolved at a concentration of OmgZml into the same eluate. From the 4th minute, 20 ml of eluate was collected.
  • the alkali resistance was evaluated by comparing the amount of carboxyl groups produced by immersion in a sodium hydroxide aqueous solution. That is, after thoroughly washing with pure water, the hydrophilized substrate 4 was measured 10 ml at a time using a chromatograph tube with an inner diameter of 20 mm with a bottom glass filter, and transferred to two 80 ml lid sample bottles. Add 60 ml of 5N sodium hydroxide aqueous solution to one sample bottle and 60 ml of pure water to the other bottle, seal tightly, mix each slurry, and let stand at 25 ° C for 4 weeks. Stored.
  • the amount of carboxyl groups produced by the hydrophilized substrate 4 was 8.3 milliequivalents per liter of the substrate.
  • the hydrophilicity and alkali resistance of the hydrophilized substrate 5 obtained in Production Example 5 were evaluated. That is, the hydrophilicity was evaluated according to the method described in Example 1. As a result, the recovery rate of the protein was 95%, and it was confirmed that the hydrophilized substrate 5 was highly hydrophilic.Alkaline resistance was evaluated according to the method described in Example 1. The substrate 5 was immersed in an alkaline aqueous solution for 4 weeks. When the alkali resistance of the substrate after immersion was evaluated by the method described in Example 1, the amount of carboxyl groups generated in the hydrophilized substrate 5 was It was 10.5 mm equivalent per liter of material.
  • hydrophilicity and alkali resistance of the hydrophilized substrate 6 obtained in Production Example 6 were evaluated according to the method described in Example 1.
  • the protein recovery rate was 95%, and it was confirmed that the hydrophilized substrate 6 was highly hydrophilic.
  • the amount of carboxyl groups generated in the hydrophilized base material 6 was 12.4 milliequivalents per liter of the base material.
  • hydrophilicity and alkali resistance of the hydrophilized substrate 7 obtained in Production Example 7 were evaluated according to the method described in Example 1.
  • the protein recovery rate was 95%, and it was confirmed that the hydrophilized substrate 6 was highly hydrophilic.
  • the amount of carboxyl groups generated in the hydrophilized base material 7 was 10.6 milliequivalents per liter of the base material.
  • the ion exchange capacity of the aminated filler 4 obtained in Production Example 4 was measured by the following method. That is, in the manner described in Example 1, 10 ml of the aminated filler 4 was printed, and this was washed well in the order of 1N sodium hydroxide aqueous solution and pure water, and measured by titration with 0.1N hydrochloric acid. . As a result, the ion exchange capacity of the aminated filler 4 was 45 milliequivalents per liter of filler.
  • the alkali resistance of the aminated filler 4 was evaluated by the following method. That is, the binding amount of bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA) to the aminated filler with and without sodium hydroxide aqueous solution immersion, and the elution capacity of acidic protein under constant elution conditions were measured.
  • BSA bovine serum albumin
  • the conditions for the aqueous sodium hydroxide solution soaking were the same as the alkali resistance evaluation of the hydrophilized substrate in Example 1 except that the soaking period was 12 weeks.
  • the absorbance of this residual BSA solution at 280 nm was measured with an ultraviolet spectrophotometer.
  • the amount of residual BSA was determined from a correlation diagram in which the relationship between a BSA solution having a known concentration and the absorbance at 280 nm was determined in advance. The difference between the amount of 200 mg BSA added and the amount of residual BSA was defined as the amount of BSA binding.
  • the BSA binding amount of the aminated filler 4 soaked in pure water was 29.5 mgZml
  • the BSA binding amount of the aminated filler 4 soaked in sodium hydroxide for 12 weeks was 26.5 mgZml. Atsuta. It was confirmed that the difference between them, that is, the decrease in the amount of BSA binding by alkali, was very small, 3. OmgZml.
  • Amination Pack 4 is packed in a stainless steel column with an inner diameter of 7.5 mm and a length of 75 mm, using 50 mM trisaminomethane buffer (pH 8.5) as the initial buffer, and a protein-containing sample at a concentration of 1 mg / ml. 0.05 ml was injected to adsorb the protein onto the column. After that, the final buffer solution is a 50 mM trisaminomethane buffer (pH 8.5), and further a linear gradient with a flow rate of 1. Oml / min for 60 minutes so that it becomes a solution containing 0.5M sodium chloride. Elution was performed. The eluted protein was detected using 25 ⁇ 2 ° C.
  • OVA ovalbumin
  • STI soybean trypsin inhibitor
  • the elution volume of OVA of aminated filler 4 immersed in pure water was 16.2 ml, and the elution volume of STI was 28. Oml.
  • the elution volume of OVA of aminated filler 4 immersed in sodium hydroxide solution for 12 weeks was 15.3 ml, and the elution volume of STI was 27. Oml. That is, it was found that the elution volume of 0.9 ml with OVA and 1. Oml with STI was reduced by alkali.
  • aminated filler 4 volume average particle size: 74 m, standard deviation: 13.4 m obtained by sieving was used to measure the inner diameter of 10.7 mm and length of 150 mm.
  • a stainless steel column was packed by a slurry packing method. Using a constant flow pump (maximum flow rate lOmlZmin), pure water was passed at 0 to lOmlZmin, and a Bourdon tube pressure gauge capable of measuring up to 400 kPa was used to measure the pressure loss at each flow rate. Next, this aminated packing 4 was extracted from the column, and the pressure loss at the same flow rate of the empty column and the liquid feeding system was measured, and the net pressure loss of the packing bed was calculated.
  • the ion exchange capacity of the aminated filler 5 obtained in Production Example 5 was measured according to the method described in Example 5. As a result, the ion exchange capacity of the aminated filler 5 was 85 milliequivalents per liter of filler. Moreover, the alkali resistance and hardness of the aminated filler 5 were evaluated according to the method described in Example 5. The results were as follows.
  • the amount of BSA bound in aminated filler 5 soaked in pure water was 37.4 mgZml, and the amount of BSA bound in aminated filler soaked in sodium hydroxide for 12 weeks was 35.9 mgZml.
  • the elution volume of OVA of aminated filler 5 soaked in pure water was 17.2 ml, and the elution volume of STI was 25.2 ml.
  • the elution volume of OVA of aminated filler 5 immersed in sodium hydroxide for 12 weeks was 16.8 ml, and the elution volume of STI was 24.8 ml.
  • the elution volume of OVA was 0.4 ml with OVA and 0.4 ml with STI.
  • aminated filler 5 (volume average particle size: 72 m, standard deviation: 14.1 m) obtained by sieving was used to measure the inner diameter of 10.7 mm and length of 150 mm.
  • a stainless steel column was packed by a slurry packing method. The subsequent operation was exactly the same as the method described in Example 5, and the relationship between the flow velocity and the pressure loss was determined.
  • the flow rate and pressure loss showed a linear relationship up to a maximum flow rate of 1 Oml / min (linear flow rate of 667 cmZhr), and the pressure loss at the maximum flow rate was 80 kPa.
  • the ion exchange capacity of the aminated filler 6 obtained in Production Example 6 was measured according to the method described in Example 5. As a result, the ion exchange capacity of the aminated filler 6 was 70 milliequivalents per liter of filler. In addition, the alkali resistance and hardness of the aminated filler 6 were evaluated according to the method described in Example 5. The results were as follows.
  • the BSA binding amount of the aminated filler 6 immersed in pure water was 26. lmg / mU for 12 weeks.
  • the BSA binding amount of the aminated filler 6 immersed in sodium hydroxide was 24.7 mgZml.
  • the difference, that is, the decrease in protein binding due to alkali, was confirmed to be very small at 1.4 mgZml.
  • the elution volume of OVA of aminated packing 6 immersed in pure water was 17.9 ml, and the elution volume of STI was 26.3 ml.
  • the elution volume of OVA of aminated filler 6 immersed in a sodium hydroxide solution for 12 weeks was 17. Oml, and the elution volume of STI was 24.9 ml. It was found that the aminated filler 6 soaked in sodium hydroxide solution for 12 weeks reduced the dissolution volume by 0.9 ml with OVA and 1.4 ml with STI. In other words, it was confirmed that the holding power hardly changed even when the aminated filler 6 was immersed in an alkaline aqueous solution.
  • the aminated filler 6 (volume average particle size: 76 m, standard deviation: 13.1 m) obtained by sieving was used for the inner diameter of 10.7 mm and length of 150 mm.
  • a stainless steel column was packed by a slurry packing method. The subsequent operation was exactly the same as the method described in Example 5, and the relationship between the flow velocity and the pressure loss was determined.
  • the maximum flow rate 1 The flow rate and pressure loss showed a linear relationship up to Oml / min (linear flow rate 667 cmZhr), and the pressure loss at the maximum flow rate was 75 kPa.
  • the ion exchange capacity of the aminated filler 7 obtained in Production Example 7 was measured according to the method described in Example 5. As a result, the ion exchange capacity of the aminated filler 7 was 125 milliequivalents per liter of filler. In addition, the alkali resistance and hardness of the aminated filler 7 were evaluated according to the method described in Example 5. The results were as follows.
  • the amount of BSA bound in aminated filler 7 immersed in pure water was 26.2 mg / mU.
  • the amount of BSA bound in aminated filler 7 immersed in sodium hydroxide for 12 weeks was 25.2 mgZml.
  • the difference, that is, the decrease in protein binding due to alkali, was confirmed to be as small as 1. OmgZml.
  • the elution volume of OVA of aminated packing 7 immersed in pure water was 17.6 ml, and the elution volume of STI was 28.2 ml.
  • the elution volume of OVA of aminated filler 7 immersed in sodium hydroxide solution for 12 weeks was 16.8 ml, and the elution volume of STI was 27.4 ml. It was found that the aminated filler 7 soaked in sodium hydroxide solution for 12 weeks had a reduced dissolution capacity of 0.8 ml with OVA and 0.8 ml with STI. That is, it was confirmed that the retention force hardly changed even when the aminated filler 7 was immersed in an alkaline aqueous solution.
  • aminated filler 7 (volume average particle size: 74 m, standard deviation: 13.1 m) obtained by sieving was used to measure the inner diameter of 10.7 mm and length of 150 mm.
  • a stainless steel column was packed by a slurry packing method. The subsequent operation was exactly the same as the method described in Example 5, and the relationship between the flow velocity and the pressure loss was determined.
  • the flow rate and pressure loss showed a linear relationship up to a maximum flow rate of 1 Oml / min (linear flow rate of 667 cmZhr), and the pressure loss at the maximum flow rate was 77 kPa.
  • Amination Pack 9 is packed in a stainless steel column with an inner diameter of 4.6 mm and a length of 35 mm, the initial buffer is 50 mM Trisaminomethane buffer (pH 8.5), and the protein-containing sample is at a concentration of 1 mg / ml. Was injected to adsorb protein to the column. After that, the final buffer solution is a 50 mM trisaminomethane buffer (pH 8.5), and a linear gradient of 30 minutes at a flow rate of 1. Oml / min so that the solution contains 0.5M sodium chloride. Elution was performed. The eluted protein was detected using 25 ⁇ 2 ° C.
  • UV absorption detector UV8020 manufactured by Tosohichi Co., Ltd., detection wavelength 280 nm. OVA and STI were used as samples. Then, the elution amount of the eluate from the start of the linear gradient to the elution of the peak top of various proteins was measured, and this was taken as the elution volume.
  • the elution volume of OVA of aminated filler 9 washed with pure water was 6.5 ml, and the elution volume of STI was 13.5 ml.
  • the aminated filler 9 soaked in sodium hydroxide solution for 12 weeks was thoroughly washed with pure water. After the washing, the elution volume of OVA of the aminated filler was 6.3 ml, and the elution volume of STI was 13 2ml.
  • Aminated filler 9 soaked in sodium hydroxide solution had a reduced elution volume of 0.2 ml with OVA and 0.3 ml with STI. This change was the result that the elution capacity hardly changed even when the aminated filler 9 close to the error range was immersed in the alkaline aqueous solution.
  • the alkali resistance of the hydrophilized substrate 1 obtained in Production Example 1 was evaluated according to the method described in Example 1.
  • the amount of carboxyl group produced by hydrophilized substrate 1 was 125 milliequivalents per liter of substrate.
  • the ion exchange capacity of the aminated filler 1 obtained in Production Example 1 was measured according to the method described in Example 5. As a result, the ion exchange capacity of aminated filler 1 was 128 milliequivalents per liter of filler. Further, the alkali resistance of the aminated filler 1 was evaluated according to the method described in Example 5. The results were as follows.
  • the amount of BSA bound in the aminated filler 1 immersed in pure water was 35.6 mgZml, and the amount of BSA bound in the aminated filler 1 immersed in sodium hydroxide solution for 12 weeks was 0.6 mgZml. 1 It was confirmed that the amount of aminated filler 1 adsorbed as much as 35. OmgZml by immersion in sodium hydroxide solution for 2 weeks.
  • the elution volume of OVA of aminated filler 1 immersed in pure water was 17.8 ml, and the elution volume of STI was 25.9 ml.
  • the elution volume of OVA of aminated filler 1 immersed in sodium hydroxide solution for 12 weeks was 4.6 ml, and the elution volume of STI was 7.8 ml. It was found that the amination filler 1 soaked in sodium hydroxide solution for 12 weeks was minus 13.2 ml with OVA and minus 18.1 ml with STI, and the elution volume was significantly reduced. In other words, it was confirmed that when the aminated filler 1 was immersed in an alkaline aqueous solution, the holding power was greatly reduced.
  • the ion exchange capacity of the aminated filler 2 obtained in Production Example 2 was measured according to the method described in Example 5. As a result, the ion exchange capacity of aminated filler 2 was 119 milliequivalents per liter of filler. Further, the alkali resistance of the aminated filler 2 was evaluated according to the method described in Example 5. The results were as follows.
  • the amount of BSA bound in aminated filler 2 immersed in pure water was 33.9 mgZml, and the amount of BSA bound in aminated filler 2 immersed in sodium hydroxide for 12 weeks was 1. OmgZml. It was confirmed that the amount of aminated filler 2 adsorbed significantly decreased as much as minus 32.9 mgZml by soaking in sodium hydroxide solution for 12 weeks.
  • the ion exchange capacity of the aminated filler 3 obtained in Production Example 3 was measured according to the method described in Example 5. As a result, the ion exchange capacity of aminated filler 3 was 106 milliequivalents per liter of filler. Further, the alkali resistance and hardness of the aminated filler were evaluated according to the method described in Example 5. The results were as follows.
  • the amount of BSA bonded to the aminated filler 3 immersed in pure water was 30.7 mg / mU.
  • the amount of BSA bonded to the aminated filler 3 immersed in sodium hydroxide solution for 12 weeks was 0.7 mgZml. 1 It was confirmed that the adsorbed amount of the aminated filler 3 immersed in sodium hydroxide / sodium hydroxide solution for 2 weeks was significantly reduced by minus 30. OmgZml.
  • the aminated filler 3 (volume average particle size: 76 m, standard deviation: 12.1 m) obtained by sieving was used. A stainless column was packed by a slurry packing method. Subsequent operations were the same as those described in Example 5, and the relationship between flow velocity and pressure loss was determined. As a result, when the flow velocity exceeded 6mlZ min (linear flow velocity 400cmZhr), the relationship between the flow velocity and the pressure loss began to deviate linearly, and the pressure increased rapidly. And at the flow rate of lOmlZmin, the effect of pressure loss was not large.
  • the alkali resistance of the aminated filler 8 obtained in Production Example 8 was evaluated according to the acidic protein elution volume measurement method described in Example 9. The results were as follows: [0155] ⁇ Elution volume of acidic protein>
  • the elution volume of OVA of aminated packing 8 washed with pure water was 7.5 ml, and the elution volume of STI was 15.8 ml.
  • the elution volume of OVA of aminated filler 8 immersed in sodium hydroxide solution for 12 weeks was 2.5 ml, and the elution volume of STI was 4.4 ml. It was found that the aminated filler 8 soaked in the sodium hydroxide solution was minus 5. Oml with OVA and minus 11.4 ml with STI.
  • the hydrophilicity and alkali resistance of the hydrophilized substrate 10 obtained in Production Example 10 were evaluated according to the method described in Example 1. As a result, the protein recovery rate was 95% or more, and it was confirmed that the hydrophilized substrate 10 was highly hydrophilic. In addition, the amount of carboxyl groups generated in the hydrophilized substrate 10 was 25.5 milliequivalents per liter of substrate.
  • the hydrophilicity and alkali resistance of the hydrophilized substrate 11 obtained in Production Example 11 were evaluated according to the method described in Example 1. As a result, the protein recovery rate was 95% or more, and it was confirmed that the hydrophilized substrate 11 was highly hydrophilic. In addition, the amount of carboxyl groups generated in the hydrophilized substrate 11 was 28.0 milliequivalents per liter of substrate.
  • the ion exchange capacity of the aminated filler 12 obtained in Production Example 12 was measured according to the method described in Example 5. As a result, the ion exchange capacity of the aminated filler 12 was 75 milliequivalents per liter of filler. Further, the alkali resistance of the aminated filler was evaluated according to the method described in Example 5. The results were as follows.
  • the amount of BSA bound in the aminated filler 12 immersed in pure water was 34.8 mgZml, and the amount of BSA bound in the aminated filler 12 immersed in sodium hydroxide for 12 weeks was 29. OmgZml. It was confirmed that the difference, that is, the decrease in protein binding due to alkali was as small as 5.8 mgZml.
  • Elution volume of OVA of aminated filler 12 soaked in pure water is 18.2 ml, elution volume of STI The amount was 27.2 ml.
  • the elution volume of the aminated filler 12 immersed in sodium hydroxide for 12 weeks was 16.4 ml, and the elution volume of STI was 24.8 ml.
  • the elution volume decreased by 1.8 ml with OVA and 2.6 ml with STI. That is, it was confirmed that even when the aminated filler 12 was immersed in an alkaline aqueous solution, the change in holding force was small.
  • the ion exchange capacity of the quaternary ammonia-containing filler 15 obtained in Production Example 15 was measured according to the method described in Example 5. As a result, the ion exchange capacity of the quaternary ammomized filler 15 was 95 milliequivalents per liter of filler. In addition, the alkali resistance of the quaternary amorphous filler 15 was evaluated according to the method described in Example 5. The results were as follows.
  • the amount of BSA bound in quaternary ammomized filler 15 soaked in pure water is 43.5 mg / mU.
  • the amount of BSA bound in quaternary ammomized filler 15 soaked in sodium hydroxide for 12 weeks is 37. It was 4mgZml. The difference, that is, the decrease in protein binding due to alkali was confirmed to be as small as 6. lmgZml.
  • the elution volume of quaternary ammomized packing 15 immersed in pure water was 20.4 ml, and the elution volume of STI was 31. Oml.
  • the elution volume of OVA of quaternary ammonia-filled filler 15 immersed in sodium hydroxide for 12 weeks was 18.4 ml, and the elution volume of STI was 28.1 ml. That is, it was found that the elution volume decreased by 1.8 ml with OVA and 2.6 ml with STI. In other words, it was confirmed that even when the quaternary ammonia-containing filler 15 was immersed in an alkaline aqueous solution, the change in holding force was small.
  • the ion exchange capacity of the sulfonated filler 13 obtained in Production Example 13 was measured by the following method. That is, in the manner described in Example 1, 10 ml of the sulfone soot filler 13 was weighed, washed thoroughly in order of 1N hydrochloric acid and pure water, and measured by titration with a 0.1N sodium hydroxide aqueous solution. . As a result, the ion exchange capacity of sulfone soot filler 13 is It was 90.0 milliequivalents per liter (pH 7.0).
  • the alkali resistance of the sulfone filler 13 was evaluated by the following method.
  • the ion exchange capacity of the sulfonated filler 13 with and without sodium hydroxide aqueous solution was measured at PH 3.5 and 8.5, respectively, and the ion exchange capacity between pH 3.5 and pH 8.5.
  • Alkali resistance was evaluated by the difference.
  • the (meth) chloro monomer polymer is strong and the sulfonic acid group is almost ionized at a pH of 3.5 or less, but the carboxylic acid group is not ionized unless the pH is 3.5 or higher, and at a pH of 3.5 or higher. Start ionization and ionize almost completely by 8.5.
  • the variability of the ion exchange capacity difference between pH 3.5 and 8.5 can also be measured by the amount of carboxylic acid produced by ester hydrolysis.
  • the amount of sulfonic acid group released can be measured by changing the ion exchange capacity at pH 3.5.
  • the conditions for immersion in the aqueous solution of sodium hydroxide and sodium hydroxide were the same as those for the alkali resistance evaluation method for the hydrophilized substrate of Example 1 except that the immersion period was 12 weeks.
  • the ion exchange capacity per liter of the sulfonated filler 13 immersed in pure water at pH 3.5 and 8.5 was 86.2 mm equivalent and 90.5 mm equivalent, respectively. Amount.
  • the ion exchange capacity per liter of filler at pH 3.5 and 8.5 was 85.8 milliequivalent and 90. It was 8 mm equivalent. Therefore, it was confirmed that the amount of sulfonic acid group released and the amount of carboxylic acid produced were very small, 0.4 milliequivalent and 5.0 milliequivalent, respectively, and the sulfonic filler 13 was stable.
  • the ion exchange capacity of the carboxymethyl candy filler 14 obtained in Production Example 14 was measured according to the method described in Example 14. As a result, the ion exchange capacity of the carboxymethyl chloride filler 14 was 64.5 milliequivalents (pH 8.5) per liter of filler.
  • the ion exchange capacity of the quaternary ammonia-containing filler 18 obtained in Production Example 18 was measured according to the method described in Example 5. As a result, the ion exchange capacity of the quaternary ammomized filler 18 was 129 milliequivalents per liter of filler. Further, the alkali resistance of the quaternary ammonia-forming filler 18 was evaluated according to the method described in Example 5. The results were as follows.
  • BSA binding amount of quaternary ammomized filler 18 soaked in pure water is 38.8 mg / mU
  • BSA binding amount of quaternary ammomized filler 18 soaked in sodium hydroxide for 12 weeks is 1. It was 4 mgZml. It was confirmed that the adsorption amount of the quaternary ammonia filler 18 soaked in sodium hydroxide solution for 12 weeks showed a significant decrease of minus 37.4 mgZml.
  • the elution volume of quaternary ammomized packing 18 immersed in pure water was 21.8 ml and the elution volume of STI was 33.2 ml.
  • the elution volume of OVA of quaternary ammonia-filled material 18 soaked in sodium hydroxide for 12 weeks was 5.6 ml, and the elution volume of STI was 10.2 ml.
  • the elution volume was significantly reduced to minus 16.2 ml for OVA and minus 23.
  • Om 1 for STI with alkali In other words, it was confirmed that when the quaternary ammomized filler 18 was immersed in an alkaline aqueous solution, the holding power was greatly reduced.
  • the ion exchange capacity of the sulfone filler 16 obtained in Production Example 16 was measured according to the method described in Example 14. As a result, the ion exchange capacity of sulfone filler 16 is 95.4 milliequivalents (liter 7.0) per liter of filler.
  • the alkali resistance of the sulfonated filler 16 was evaluated.
  • the ion exchange capacity per liter of the sulfonated filler 16 immersed in pure water at pH 3.5 and 8.5 was 91.2 and 96.4 milliequivalents, respectively. there were.
  • the ion exchange capacity per liter of filler at pH 3.5 and 8.5 was 58.6 milliequivalent and 102.8 millimolar respectively. It was equivalent.
  • the amount of sulfonic acid group released and the amount of carboxylic acid produced were 32.6 milliequivalents and 44.2 milliequivalents, respectively, and many ester hydrolysis occurred and alcohol containing sulfonic acid groups was released. Was confirmed.
  • the ion exchange capacity of the carboxymethyl candy filler 17 obtained in Production Example 17 was measured according to the method described in Example 14. As a result, the ion exchange capacity of the carboxymethyl chloride filler 17 was 68.8 milliequivalents (pH 8.5) per liter of filler.
  • the alkali resistance of the carboxymethyl candy filler 17 was evaluated according to the method described in Example 15.
  • the conditions for the aqueous sodium hydroxide solution soaking were the same as the method for evaluating the alkali resistance of the hydrophilized substrate in Example 1, except that the soaking period was 12 weeks.
  • the ion exchange capacity per liter of the filler at pH 8.5 of the carboxymethyl candy filler 17 immersed in pure water was 68.8 milliequivalents.
  • the ion exchange capacity per liter of the filler at pH 8.5 was 96.4 milliequivalents.
  • the ion exchange capacity increased by 27.6 mm equivalent. This increase is due to the fact that carboxylic acid was newly generated by hydrolysis of the ester group containing no carboxymethyl group, indicating that hydrolysis of the ester group has progressed.

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Description

親水性に優れた新規充填剤、及びその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は水溶液に溶解した物質 (特にタンパク質)との吸着'脱着作用を示し、 目 的物質の捕集や液体クロマトグラフィー法により分離、精製する為に好適な有機化合 物からなる充填剤に関する。より具体的には、高濃度のアルカリ水溶液に対して化学 的安定性が高ぐ親水性に優れ、タンパク質の分離、精製に用いることができる新規 充填剤に関する。
背景技術
[0002] タンパク質の吸着、分離、精製に使用されるクロマトグラフィー用充填剤としては、シ リカ化合物等に代表される無機系充填剤と、有機ポリマーよりなる有機系充填剤があ る。有機系充填剤はスチレン、（メタ)アクリル酸エステル、（メタ)アクリルアミド系に代 表される合成化合物を用いる合成系充填剤とァガロース、デキストラン、マンナン等 に代表される天然の多糖類を用いる天然系充填剤に大別される。
[0003] 合成系充填剤は、例えば、特許文献 1乃至 3に開示されているように、グリシジルメ タクリレートとエチレングリコールジメタタリレートのような単官能性モノマーと多官能性 モノマーの混合液を用いて、懸濁重合法等により製造され、その後、水溶性の多価 アルコール等で親水化を行って基材を製造するのが一般的である。近年の合成系 充填剤における親水化技術の進歩により、親水性の点では天然系と遜色無い合成 系充填剤を製造する方法が見出されている。また一般には、単官能性モノマーと多 官能性モノマーを用いて、懸濁重合で粒子を製造する方法のため、多官能性モノマ 一の添加量の調整で硬 、充填剤力 柔らか 、充填剤まで自由に設計できる利点を 有している。ただ、硬ぐかつ、脆さの無い充填剤を製造したいとの観点から、合成系 充填剤の場合、容易に高分子量の重合物が得られる (メタ）アクリルエステル系又は（ メタ)アクリルアミド系モノマーを用いて充填剤を製造するのが一般的に行われている 。し力も、粒子化後、タンパク質と相互作用するリガンドを取り付け易いとの点で、反 応の基点となるグリシジル基を有した、所謂、グリシジルメタタリレート（GMA)モノマ 一を用いた充填剤が多く提案されて 、る。
[0004] 前述のように、これら充填剤の主要用途は、液体クロマトグラフィー法によるタンパク 質の分離精製である。精製されたタンパク質の主要用途として医薬品（注射用タンパ ク質製剤）があり、この分野では汚染物質のコンタミによる副作用のリスクを徹底的に 排除することが要求されて 、る。
[0005] 混入する可能性汚染物質としては、
(1)目的タンパク質生産工程由来の、例えば、培養液や血清等に含有する異種タン パク質、核酸、エンドトキシン、ウィルス、
(2)生産や保存に必要な添加物等の成分と精製工程で使用する器具、充填剤、分 離膜、溶液等からの汚染成分、
(3)前回の精製で充填剤に吸着して溶出しな力つた成分、
等が考えられる。
[0006] 充填剤はカラムに充填され、精製工程で用いられるが、初回の使用前、及び再使 用前に検証された洗浄方法で必ず洗浄される。最も一般的な精製工程の装置内部 の洗浄方法は、 1N水酸ィ匕ナトリウムによる洗浄である。これは、タンパク質、エンドト キシン等を分解洗浄できるためである。この洗浄方法は米国食品医薬品局力もの指 針 (ガイドライン)として推奨されており、初回及び再使用時にも有効な方法である。 すなわち、使用バッチ毎にカラム装置内部を洗浄することが医薬用タンパク質精製を 行う GMP施設では一般に行われている。またバッチ間隔が有る場合には、 0. 01N 力ら 0. 1Nに希釈された水酸化ナトリウム水溶液を封入して装置を止めておく場合も ある。更にプリオン等の異常タンパク質の除去を行うためには、より高濃度 (例えば、 2 Nの濃度）の水酸ィ匕ナトリウム水溶液で洗浄することも必要である。
[0007] ところが、 GMAモノマーは高!、親水性を示すエステル部位を有して 、るため、アル カリ性薬品との長時間の接触により、エステルの加水分解が進行し、アルコール化合 物が放出されカルボン酸が生成する。放出されたアルコールィ匕合物を洗浄により完 全に除去できれば問題ないが、除去できなければ、それが汚染物質になる可能性が ある。またカルボン酸の生成により、本来の充填剤性能が変化し、分離精製の再現 性が失われるため純度不良が発生する。すなわち、アルカリ耐性が弱い充填剤では 、単に性能劣化によって使用可能な期間が短いだけでなぐ未知溶出物の発生リス クと精製操作時の溶出による汚染のリスク及び性能劣化による純度不良の発生等の 課題を抱えている。
[0008] 以上のように合成系充填剤は、硬い (機械強度が高い)ため、高速'高分離に適し ているとの利点を有し、親水性が高いという利点を有する一方で、更にアルカリ耐性 を有した合成系充填剤の開発が期待されているのが現状である。
[0009] 特許文献 1 :特公昭 58— 058026号公報
特許文献 2 :特開昭 53— 090991号公報
特許文献 3：特開平 05— 009233号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、高速'高分離に適 し、親水性に富み、なおかつ高濃度のアルカリ水溶液に耐性のある充填剤を提供す ることである。より詳しくは、高速'高分離に適用可能な機械強度を有し、かつタンパ ク質に対して非特異的吸着を引き起こさないために十分な親水性を有し、更に、高 濃度のアルカリ水溶液に浸漬してもタンパク質の吸着量、保持力等の変化の小さ ヽ 新規充填剤を提供することである。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、重合性を示す（ メタ)アタリロイル化合物の内、特定の構造を有したィ匕合物をモノマーとして用 ヽた充 填剤はアルカリ耐性を有していることを見出した。本発明は、これらの知見に基づい て完成されたものである。
[0012] すなわち、本発明は、以下に示すとおりの、親水性に優れた新規充填剤、その製 造方法、及びそれを用いたタンパク質の分離方法である。
[1]下記式（1)
[0013] [化 1]
Figure imgf000006_0001
[式（1)中、 R2は水素原子又は炭素数 1〜4のアルキル基を表す。 R1は—NR3—R4 ー 又はー0—1^4ー を表す。 R3は水素原子又は炭素数 1〜4のアルキル基を表 す。 R4は脂肪族環を含む炭素数 6〜 15のアルキレン基、又は炭素数 4〜8の直鎖ァ ルキレン基を表す。 R5は、ハロゲン原子、アルコール性 OH基、アミノ基、グリシジル 基又はエポキシ基を表す。ここで、 がエポキシ基の場合、当該エポキシ基は、 R4中 に含有される脂肪族環の一部に直接エポキシ基が導入されていても、脂肪族環にぺ ンダント型に付カ卩していてもよい。また、 R5がグリシジル基の場合は、グリシジルエー テルの形で R4に結合する。 ]で示される (メタ)アタリロイル系モノマーから誘導される 繰り返し単位を 20〜95mol%含有する架橋重合体粒子力もなることを特徴とする充 填剤。
[0014] [2]上記式（1)で示される (メタ)アタリロイル系モノマーから誘導される繰り返し単位 を 20〜95mol%と、多官能性モノマー力も誘導される繰り返し単位を 80〜5mol%と 、を含有する架橋重合体粒子力 なる上記 [1]に記載の充填剤。
[0015] [3]充填剤が、上記式（1)で示される (メタ)アタリロイル系モノマーと多官能性モノ マーとを重合して得られる架橋重合体粒子からなる上記 [1]又は [2]に記載の充填 剤。
[0016] [4]下記式（2)
[0017] [化 2] R
C H C ( 2 )
C =〇
R
[式（2)中、 R2は水素原子又は炭素数 1〜4のアルキル基を表す。 R1は— NR3—R4 ー 又はー0—1^4ー を表す。 R3は水素原子又は炭素数 1〜4のアルキル基を表 す。 R4は脂肪族環を含む炭素数 6〜 15のアルキレン基、又は炭素数 4〜8の直鎖ァ ルキレン基を表す。 R5は、ハロゲン原子、アルコール性 OH基、アミノ基、グリシジル 基又はエポキシ基を表す。ここで、 R5がエポキシ基の場合、当該エポキシ基は、 R4中 に含有される脂肪族環の一部に直接エポキシ基が導入されていても、脂肪族環にぺ ンダント型に付カ卩していてもよい。また、 R5がグリシジル基の場合は、グリシジルエー テルの形で R4に結合する。 ]で示される繰り返し単位を 20〜95mol%と、
下記式（3)
[化 3]
R 5
I
- C H , - C -
R ( 3 )
C H - C -
R
(式（3)中、 R6、 R7は各々独立して水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R8はァリール基、ォキシカルボ-ル基又は力ルバモイル基を有する 2官能性の有機 基を表す。）で示される繰り返し単位を 80〜5mol%と、を含有する架橋重合体粒子 からなることを特徴とする充填剤。
[0019] [5]架橋重合体粒子が、平均粒子径が 5〜300 μ mの多孔性粒子である上記 [1] 乃至 [4]の 、ずれか〖こ記載の充填剤。
[0020] [6]上記式（1)で示される（メタ）アタリロイル系モノマー 20〜95mol%と架橋剤とを 含有するモノマー混合物、及び懸濁安定剤を水相に懸濁させ、重合する上記 [1]乃 至 [5]の 、ずれかに記載の充填剤の製造方法。
[0021] [7]上記式（1)で示される (メタ）アタリロイル系モノマー 20〜95mol%と多官能性 モノマー 80〜5mol%とを含有するモノマー混合物、及び懸濁安定剤を水相に懸濁 させ、重合する [1]乃至 [5]の 、ずれかに記載の充填剤の製造方法。
[0022] [8]上記式（1)で示される（メタ）アタリロイル系モノマー力 3, 4 エポキシシクロへ キシノレメチノレメタタリレート、 1, 3 ヒドロキシァダマンタン 1 メタタリレート、 1, 4 シクロへキサンジメタノールモノアタリレート、 1, 4ーヒドロキシブチルアタリレート、 4 ヒドロキシブチルアタリレートグリシジルエーテル、 4 ブロモブチルメタタリレート、及 び 6 ァミノへキシルメタクリルアミドからなる群より選ばれる 1種又は 2種以上である 上記 [6]又は [7]に記載の充填剤の製造方法。
[0023] [9]多官能性モノマーが、エチレングリコールジメタタリレート、 1 , 3 ァダマンタン ジメタタリレート、ジビュルベンゼン、及びトリメチロールプロパントリアタリレートからな る群より選ばれる 1種又は 2種以上である上記 [7]に記載の充填剤の製造方法。
[0024] [10]その粒子表面に親水性基を有する上記 [1]乃至 [5]のいずれかに記載の充填 剤。
[0025] [11]上記 [1]乃至 [5]のいずれかに記載の充填剤に親水化剤を作用させて得られ る [10]に記載の充填剤。
[0026] [12]標準物質としてプルラン、溶離液として純水を使用した場合の排除限界分子 量力 50万〜 200万である上記 [10]又は [11]に記載の充填剤。
[0027] [13]その粒子表面にイオン交換基を有することを特徴とする上記 [1]乃至 [5]、 [10] 乃至 [12]のいずれかに記載の充填剤。
[0028] [14]上記 [1]乃至 [5]のいずれかに記載の充填剤を形成する架橋重合体粒子に含 まれるエポキシ基を開環させてイオン交換基が導入された [13]に記載の充填剤。
[0029] [15]上記 [10]乃至 [12]のいずれかに記載の充填剤を形成する架橋重合体粒子を エポキシィ匕した後、該エポキシ基を開環させてイオン交換基が導入された上記 [13] に記載の充填剤。
[0030] [16]イオン交換基が、スルフォン酸基、カルボキシル基、第 1級ァミノ基、第 2級アミ ノ基、第 3級ァミノ基、及び 4級アンモ-ゥム基力 なる群より選ばれる少なくとも 1種で ある上記 [13]乃至 [15]のいずれかに記載の充填剤。
[0031] [17]上記 [13]乃至 [16]に記載の充填剤をクロマトグラフィー用充填剤として用 、る タンパク質の分離方法。
発明の効果
[0032] 本発明の充填剤は、硬ぐ機械強度が高いために高速での使用が可能であり、高 濃度のアルカリ水溶液に対する化学的安定性が高い。
また、本発明の充填剤の反応の基点に置換基を導入することで、親水性に優れた 充填剤や、イオン交換基を有する充填剤を容易に調製することができ、タンパク質の 分離'精製に好適である。
発明を実施するための最良の形態
[0033] まず、本発明の、上記式（1)で示される (メタ)アタリロイル系モノマーから誘導される 繰り返し単位を 20〜95mol%含有する架橋重合体粒子力もなることを特徴とする充 填剤 [以下、充填剤（1)と称する。]について説明する。
[0034] 本発明において、充填剤（1)としては、特に限定するものでないが、例えば、上記 式（1)で示される (メタ)アタリロイル系モノマー力も誘導される繰り返し単位を 20〜95 mol%と、多官能性モノマーから誘導される繰り返し単位を 80〜5mol%を含有する 架橋重合体粒子からなる充填剤が好適なものとして挙げられる。より具体的には、上 記式（2)で示される繰り返し単位を 20〜95mol%と、上記式（3)で示される繰り返し 単位を 80〜5mol%を含有する架橋重合体粒子カゝらなる充填剤が好適なものとして 挙げられる。
[0035] 本発明において、充填剤（1)の製造方法としては、特に限定するものではない。た とえば、上記式（1)で示される (メタ）アタリロイル系モノマー 20〜95mol%と架橋剤と を含有するモノマー混合物、及び懸濁安定剤を水相に懸濁させ、重合することにより 、製造することができる。より具体的には、上記式（1)で示される (メタ)アタリロイル系 モノマー 20〜95mol%と架橋剤として使用される多官能性モノマー 80〜5mol%と を含有するモノマー混合物、及び懸濁安定剤を水相に懸濁させ、重合することにより 製造することができる。
[0036] 上記式（1)で示される (メタ)アタリロイル系モノマーを用いた充填剤（1)の一般的な 製法を以下に説明するが、製法はこれに限定されるものではない。まず予め、連続 相として、例えば、蒸留水に所定の界面活性剤、更に必要に応じて無機の塩を添カロ し、良く攪拌して溶解させ、水溶液とする。その後、該水溶液を所定の温度まで昇温 する。次に、本発明の (メタ)アタリロイル系モノマー、架橋剤として使用する多官能性 モノマー、重合開始剤、更に必要があれば他のモノマー及び細孔調節の目的で添 加する有機溶媒等をそれぞれ所定量取り、調整混合液を作る。そして、攪拌されて いる界面活性剤入り水溶液中に該調整混合液を滴下して液滴化を行うと同時に、所 定の温度で重合を行い、重合体粒子を製造する。この時の重合温度について、重合 開始剤が分解され、ラジカルが発生する温度であれば特に制限はない。一般に、 20 °C〜80°C、より好ましくは 40°C〜70°Cの範囲内で重合を行うとよい。
[0037] 本発明の充填剤（1)に用いられる (メタ)アタリロイル系モノマーは、上記式（1)に該 当し、架橋重合体粒子化後に置換基を導入するための反応の基点を有した (メタ)ァ クリロイル系モノマーであれば、特に限定されるものではない。例えば、 4ーヒドロキシ ブチル (メタ）アタリレートグリシジルエーテル、 6—クロ口へキシル (メタ）アタリレート、 4 ブロモブチル (メタ）アタリレート、 4ーヒドロキシブチル (メタ）アタリレート、ヒドロキシ ペンチル (メタ）アタリレート、 6—ァミノへキシル (メタ）アクリルアミド、 3, 4—エポキシ シクロへキシルメチル (メタ）アタリレート、 3, 4ージヒドロキシシクロへキシルメチル (メ タ）アタリレート及びそれらのジヒドロキシ基の一部又は全てがグリシジル基で置換さ れた化合物； 3, 4—エポキシシクロへキシルェチル (メタ）アタリレート、 3, 4ージヒドロ キシシクロへキシルェチル (メタ）アタリレート及びそのジヒドロキシ基の一部又は全て がグリシジル基で置換された化合物；3, 4—エポキシシクロへキシルプロピル (メタ） アタリレート、 3, 4ージヒドロキシシクロへキシルプロピル (メタ）アタリレート及びそのジ ヒドロキシ基の一部又は全てがグリシジル基で置換されたィ匕合物； 2, 5—ビス（ァミノ メチル)ビシクロ〔2, 2, 1〕ヘプタンの片一方のァミノ基と (メタ)アクリルハライドとの反 応物； 2, 5—ビス（ヒドロキシメチル）ビシクロ〔2, 2, 1〕ヘプタンの片一方のヒドロキシ 基と (メタ）アクリルノヽライドとの反応物； 2, 6—ビス (アミノメチル)ビシクロ〔2, 2, 1〕へ ブタンの片一方のァミノ基と (メタ)アクリルハライドとの反応物； 2, 6—ビス (ヒドロキシ メチル)ビシクロ〔2, 2, 1〕ヘプタンの片一方のヒドロキシ基と (メタ）アクリルノヽライドと の反応物；1, 3—ジヒドロキシァダマンタンの片一方のヒドロキ基と (メタ)アクリルハラ イドとの反応物；1, 3—ジアミノアダマンタンの片一方のァミノ基と (メタ)アクリルノヽライ ドとの反応物等が挙げられる。また、上記 (メタ)アタリロイル系モノマーを単独で使用 しても、混合して使用してもよい。
[0038] 本発明の充填剤（1)において、上記式（1)で示される (メタ)アタリロイル系モノマー の割合は、全モノマー中において、通常 20mol%以上 95mol%以下の範囲、好まし くは 30mol%以上 93mol%以下の範囲である。この割合が好ましい理由としては、（ メタ）アタリロイル系モノマーが 20mol%未満だと、次のような問題点があることによる 。 （a)アルカリに対する安定性が低くなる、（b)生成粒子中の置換基を導入するため の反応の基点が少なくなり、親水化剤で親水性を付与してもタンパク質等の分離に 必要な親水性が得られない、（c) 95mol%より割合が大きいと架橋剤として共重合す る多官能性モノマーの割合が小さ過ぎ、充填剤が柔らかくなる、などである。
[0039] 本発明の充填剤（1)に用いられる多官能性モノマーとしては、特に限定するもので はない。例えば、ジビュルベンゼン；炭素数が 1〜4のアルキレングリコールの繰返し ユニットが 1〜5であるアルキレングリコール—ジ (メタ）アタリレート類；アルキレン (炭 素数 1〜： L 1)ビス (メタ)アタリレート類;アルキレン (炭素数 1〜： L 1)ビス (メタ)アクリル アミド類等が挙げられる。上記式（1)で示される (メタ)アタリロイル系モノマーと共重合 できるなら多官能性モノマーはこれらに限定されるものではない。更に、本発明の (メ タ）アタリロイル系モノマーを合成するとき、副生してくる 2官能性化合物を架橋剤とし て共重合する多官能性モノマーとして用いてもよ 、。多官能性モノマーとして具体的 な化合物を例示すると、ジビュルベンゼン、ジビュルトルエン、ジビュルキシレン、 1, 3—ァダマンタンジメタタリレート、エチレングリコールジ (メタ）アタリレート、ジエチレン グリコールジ (メタ）アタリレート、トリエチレングリコールジ (メタ）アタリレート、ポリェチ レングリコールジ（メタ）アタリレート、グリセロールジ（メタ）アタリレート、トリメチロール プロパントリ（メタ）アタリレート、エチレンビスアクリルアミド等が挙げられる。
[0040] 本発明の充填剤（1)において、多官能性モノマーの割合は特に限定されるもので はないが、全モノマー中において、通常 5mol%以上 80mol%以下の範囲、好ましく は 7mol%以上 70mol%以下の範囲である。この割合が好ましい理由としては、多官 能性モノマーが 5mol%未満だと充填剤に十分な硬さが得られず、高い圧力では充 填剤が潰れてしまう可能性がある。また架橋剤が 80mol%以上になると、生成粒子 中の置換基を導入するための反応の基点が少なくなり、親水化剤で親水性を付与し てもタンパク質等の分離に必要な親水性が得られない。更にアルカリに対する安定 性が低くなることに加え、充填剤が脆くなる場合があり、カラムへの充填作業や攪拌 中等に微粒子が発生するなどの問題が起こる。
[0041] 本発明の充填剤（1)においては、上記式（1)で示される (メタ)アタリロイル系モノマ 一、上記した多官能性モノマーに加え、本発明の趣旨を逸脱しなない範囲で、それ ら以外の他のモノマーを使用することもできる。このような他のポリマーとしては、例え ば、ヒドロキシェチル (メタ）アタリレート、ヒドロキシプロピル (メタ）アタリレート、グリシジ ル (メタ）アタリレート、炭素数 1〜3からなる直鎖状又は分岐状アルキル (メタ)アタリレ ート類等の (メタ)アタリレートイ匕合物；ヒドロキシェチル (メタ)アクリルアミド、ヒドロキシ プロピル (メタ）アクリルアミド、ヒドロキシブチル (メタ）アクリルアミド、炭素数 1〜3から なる直鎖状又は分岐状アルキル (メタ）アクリルアミド類等の重合性 (メタ)アクリルアミ ド化合物；ァリールァミン、ァリールクロライド、ァリールグリシジルエーテル等の重合 性ァリール化合物；ハロアルキル（炭素数 1〜4)ビュルエーテル、ヒドロキシアルキル (炭素数 1〜4)ビュルエーテル、ビニルアセテート等の重合性ビニルイ匕合物等が挙 げられる。併用される他のモノマーは本発明の機能を満足するなら、特に限定される ものではない。また、併用される他のモノマーは単独使用でも、混合使用でも可能で ある。
[0042] 本発明の充填剤（1)の製造時に用いられる重合開始剤としては、例えば、通常の 懸濁重合で使用される有機過酸化物やァゾ系化合物等が挙げられる。上記有機過 酸化物として、ブチルパーオキサイド系では、 t ブチルパーォキシネオデカノエート
、 t ブチルパーォキシ 2—ェチルへキサノエート、 t ブチルパーォキシイソブチレ ート、 2, 5ジメチルー 2, 5ジ（ベンゾィルパーォキシ）へキサン、 t ブチルパーォキ シアセテート、 t ブチルパーォキシベンゾエート等が挙げられる。ァミルパーォキサ イド系では、 tーァミルパーォキシ 2—ェチルへキサノエート、 tーァミルパーォキシ n ォクトエート、 tーァミルパーォキシアセテート、 tーァミルパーォキシベンゾエート等 が挙げられる。パーォキシカーボネート系では、 t ブチルパーォキシイソプロピル力 ーボネート、 t ブチルパーォキシ 2—ェチルへキシルカーボネート、 tーァミルパー ォキシ 2—ェチノレへキシノレカーボネート、ジ（2—ェチノレへキシノレ）パーォキシジカー ボネート、ジ（sec ブチル）パーォキシジカーボネート等が挙げられる。ジアルキル パーオキサイド系では、ジクミルパーオキサイド、 2, 5ジメチル 2, 5ジ（tーブチルバ ーォキシ）へキサン、ジー t ブチルパーオキサイド、ジー tーァミルパーオキサイド等 が挙げられる。また、パーォキシケタール系では、 1, 1ージ (t—ブチルパーォキシ） シクロへキサン、 2, 2 ジ（t—ブチルパーォキシ）ブタン、ェチルー 3, 3 ジ（tーブ チルバ一才キシ）ブチレート、 1, 1ージ (tーァミルパーォキシ）シクロへキサン等が例 示できる。
一方、ァゾ系化合物として、ァゾ-トリル系では、 2, 2'ーァゾビス（4ーメトキシ 2, 4 ジメチルバレ口-トリル）、 2, 2'—ァゾビス（2, 4 ジメチルバレ口-トリル）、 2, 2 ，—ァゾビス（2—メチルプロピオ-トリル）、 2, 2，—ァゾビス（2—メチルブチ口-トリル ) , 1, 1，—ァゾビス（シクロへキサン— 1—カルボ-トリル)等が挙げられる。ァゾアミド 系では、 2, 2，ーァゾビス [N—（2—プロべ-ル） 2—メチルプロピオンアミド]、 2, 2 ，一ァゾビス [N ブチル 2—メチルプロピオンアミド]、 2, 2'—ァゾビス [N シクロ へキシルー 2—メチルプロピオンアミド]等が挙げられる。さらに、他のァゾ系化合物 では、 2, 2'—ァゾビス（2—メチルプロピオンアミドォキシム）、ジメチル 2, 2'—ァゾ ビス（2 メチルプロピオネート）、 4, 4，ーァゾビス（4 シァノバレリック酸）、 2, 2，一 ァゾビス（2, 4, 4 トリメチルペンタン）等が例示できる。ただ、（メタ）アタリロイル系モ ノマーを重合させられる重合開始剤であれば使用可能であり、特に上記の化合物に 限定されるものではない。このような重合開始剤の添加量は、少な過ぎると重合率が 低下し、モノマーが多く残存する事がある。多過ぎると、重合開始剤が重合体粒子中 に残存し、タンパク質等の吸着分離に悪影響を与えることがある。したがって、通常 は全モノマーに対して、 0. 05重量％〜20重量％の範囲で使用され、より好ましくは 0. 2重量％〜 10重量％の範囲で使用される。
[0044] 本発明において、懸濁重合に用いられる懸濁安定剤としては、連続相に溶解する 界面活性剤であればよぐ特に限定するものではない。例えば、ァニオン界面活性剤 、カチオン界面活性剤、ノ-オン界面活性剤等が挙げられ、何れも使用可能である。 また、懸濁安定剤の分子量についても、特に限定されず、低分子化合物でも高分子 化合物でも使用することができる。具体例としては、ァ-オン界面活性剤としては、脂 肪酸塩、高級アルコールの硫酸エステル塩、脂肪アルコールのリン酸エステル塩、ァ ルキルァリルスルフォン酸塩、ホルマリン縮合ナフタレンスルフォン酸塩等が挙げられ る。カチオン界面活性剤としては、アルキル 1級ァミン塩、アルキル 2級ァミン塩、同 3 級ァミン塩、同 4級アンモ-ゥム塩、ピリジ-ゥム塩等が挙げられる。ノ-オン界面活 性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキル フエ-ルエーテル類、ポリオキシエチレンアルキルエステル類、ソルビタンアルキルェ ステル類、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル類等が挙げられる。一方、 高分子界面活性剤としては、部分ケン化ポリビニルアルコール、澱粉、メチルセル口 ース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシェチルセルロース、部分ケン化ポリメタ クリル酸塩等が例示される。本発明においては、これらの界面活性剤にカ卩え、必要に 応じて、無機の塩、例えば、硫酸バリウム、硫酸カルシウム、硫酸アルミニウム、炭酸 カルシウム、タルク等を更に添加してもよい。上記懸濁安定剤の添加量は、特に限定 するものではないが、連続相に対して通常 0. 01重量％〜30重量％の範囲、好まし くは 0. 1重量％〜15重量％の範囲である。
[0045] ところで、クロマトグラフィー用の充填剤には、吸着負荷量が比較的多い多孔性充 填剤と、細孔内での溶質分子の拡散による分離帯の広力 ^を抑制して高分離能を発 現する目的で使用される非多孔性充填剤が知られている。
本発明の充填剤は、特に限定されることなぐ製造方法により多孔性、非多孔性の どちらの充填剤としても製造可能である。 [0046] 多孔性充填剤の場合は、細孔径の調節が必要である。以下にその調節の一例を 示すが、本発明は当該方法に限定されるものではない。ここで、細孔調節の目的で 添加する有機溶媒は、用いる本発明の (メタ）アタリロイル系モノマーの量や種類、多 官能性モノマーや他のモノマーとの量比、多官能性モノマーの種類や量、重合開始 剤の種類や量、重合温度等の影響を受ける為に一概には決められない。一般的に、 生成重合体粒子に対し膨潤性の高 、有機溶媒を用いると細孔径が小さな重合体粒 子を、モノマーは溶解するがポリマーは溶解しないような貧溶媒を用いると細孔径が 大きな重合体粒子を製造することができる。
[0047] 細孔調節の目的で添加する有機溶媒の例として、トルエン、キシレン、ジェチルべ ンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類；へキサン、ヘプタン、デカン等の 飽和炭化水素類;イソアミルアルコール、へキシルアルコール、ォクチルアルコール 等のアルコール類等が挙げられる。なかでも、水に不溶性で、用いたモノマー及び重 合開始剤を溶解する有機溶媒であれば、特にこれらに限定されるものではない。そ の細孔調節の目的で添加する有機溶媒の添加量は充填剤の空孔率 (充填剤粒子の 全容積に対する細孔容積の割合を示す)に影響を与える。空孔率は充填剤の使用 目的によって異なるので、一概には決められない。一般的には、空孔率は 40%〜90 %、より好ましくは、 55%〜80%程度の充填剤が用いられる。空孔率カこの範囲を 外れると、タンパク質等水溶性の化合物を充填剤により多く吸着させたいとの目的か ら外れるため、機能上好ましくないとの理由による。空孔率の調節は一般的には、添 加する有機溶媒の全モノマーに対する割合で決まり、有機溶媒を多く使用すれば空 孔率は大きくなり、使用する有機溶媒が少なければ、空孔率は小さくなる。ただ、モノ マーの反応率を変えたり、高い空孔率の重合体粒子を製造後、粒子表面を別の化 合物でコーティングしたりする事で、空孔率を変える事もできるので、上記の方法に 限定されるものではない。
[0048] 一方、非多孔性充填剤を製造する場合は、細孔調節である有機溶媒は添加せず、 調整混合液として (メタ）アタリロイル系モノマー、多官能性モノマー及び重合開始剤 を用いて製造される。し力も細孔容積が少なくかつ細孔径を小さくさせる為、多官能 性モノマーの比率は、 10mol%以上 80mol%以下の範囲が好適となる。 [0049] 本発明の充填剤（1)の平均粒子径は、使用目的やタンパク質の精製量によって設 定される為、一概には決められない。例えば、多孔性充填剤の場合は、通常 〜500 μ m、好ましくは 5 μ m〜300 μ mの範囲であればよい。一方、非多孔性充填 剤の場合は、通常 1. 5 μ m〜60 μ m、好ましくは 2 μ m〜30 μ mの範囲であればよ い。粒径が小さすぎると、高速でタンパク質等を分離'精製する際に、充填剤入りカラ ム内の圧力損失が大きくなり、耐圧容器を使用する必要が生じ、設備に莫大な費用 がかかることになる。また、粒径が大きくなり過ぎると水溶液中のタンパク質が粒子表 面に到達するまでに時間が力かることになり、タンパク質の粒子への移動が低下する 拡散問題が発生する。そのために上記の範囲が好適である。
[0050] このようにして製造された架橋重合体粒子は細孔調節の目的で添加する有機溶媒 や微量の残存モノマー等の夾雑物を含有している。そこで、例えば、アセトン、テトラ ハイド口フラン等の水溶性の有機溶媒で粒子を洗浄し、該夾雑物を除去後、親水化 反応やイオン交換基導入等の置換基の導入を行うのが一般的である。
[0051] 次に、本発明の上記した充填剤（1)の粒子表面に親水性基が存在することを特徴 とする充填剤 [以下、充填剤 (2)と称する。 ]について説明する。
本発明の充填剤（1)に用いられる架橋重合体粒子は、置換基を導入するための反 応の基点となる、ハロゲン原子、アルコール性 OH基、アミノ基、グリシジル基又はェ ポキシ基を有する。そのため、親水化剤を作用させることで容易に架橋重合体粒子 に親水性を付与することが可能となる。ここで用いられる親水化剤は活性水素基を 2 つ以上含有していればよぐ特に限定されない。例えば、水；エチレングリコール、ジ エチレングリコール、トリエチレングリコール等に代表される、ォキシエチレン基の繰 返しユニットが 20以下、より好ましくは 10以下のグリコール類等；グリセリン、ソルビト ール等に代表されるポリオール類等が挙げられる。その他に、多官能エポキシィ匕合 物の加水分解物等もポリオールとして利用できる。
[0052] 更に、親水化剤として用いる化合物において、反応前は疎水性でも、反応後に親 水性を示すような化合物を親水化剤として使用することも可能である。例えば、ソルビ トールポリグリシジルエーテル類、ソルビタンボリグリシジルエーテル類、ペンタエリス リトールポリグリシジルエーテル類、グリセロールポリグリシジルエーテル類、ネオペン チルダリコールジグリシジルエーテル等が挙げられる。このような親水ィ匕剤を用いて、 架橋重合体粒子と反応を行なった後、必要があれば、残存エポキシ基と上記した活 性水素基を 2個以上含有して 、る化合物とで更に反応を行ってもよ!、。このように水 溶性を示すジヒドロキシィ匕合物、ポリヒドロキシィ匕合物又は反応後親水性を示すィ匕合 物であれば、全て親水化剤として使用できる。
[0053] 本発明において、上記式（1)で示される (メタ)アタリロイル系モノマーを用いて重合 を行ない、水溶性有機溶媒で洗浄した架橋重合体粒子中には、上記したとおり、反 応の基点としてハロゲン原子、アルコール性 OH基、アミノ基、グリシジル基及びェポ キシ基等を含有している。そこで、次にそれぞれの反応の基点について、親水化方 法を示す。
[0054] 反応の基点がハロゲン原子の場合は、水溶液中でアルカリ触媒下、ハロゲン基を 加水分解により OH基に変換する方法、又はアルカリ触媒下、 2個以上の OH基含有 化合物と、所謂ウィリアムソン反応を利用して固定ィ匕する方法等が挙げられる。
[0055] 反応の基点がアルコール性 OH基の場合は、アルカリ触媒下、例えば上記のェポ キシ化合物との反応、更に必要があれば、残存エポキシ基と多価アルコールとの反 応を行う方法が挙げられる。又はアルカリ触媒下、ェピクロルヒドリンを用いてェポキ シ化した後、 2個以上の OH基含有ィ匕合物を固定ィ匕する方法が挙げられる。
[0056] 反応の基点がァミノ基の場合は、上記のエポキシィ匕合物との反応、更に必要があ れば、残存エポキシ基と多価アルコールとの反応を行う方法、又はェピクロルヒドリン を用いてエポキシ化後、 2個以上の OH基含有ィ匕合物を固定ィ匕する方法が挙げられ る。
[0057] 反応の基点がグリシジル基又はエポキシ基の場合は、酸又はアルカリ触媒下、 2個 以上の OH基含有ィ匕合物を固定ィ匕する方法が挙げられる。
このようにして得られた本発明の充填剤（2)の排除限界分子量は、標準物質として プルラン、溶離液として純水を使用した場合、 50万〜 200万の範囲であることが好ま しい。
本発明の充填剤（2)は、例えば、クロマトグラフィー用の親水性基材として使用され る。 [0058] 一般的に生体高分子の分離精製を目的とするクロマトグラフィー用親水性基材で は、塩濃度 0. 1モル Z1位の中性溶離液で溶出したとき、対象となる生体高分子と充 填剤が何の相互作用もなぐ溶出することが好ましい。すなわち、親水性基材が多孔 性基材であれば、サイズ排除クロマトグラフィー（size exclusion chromatograph y:以下、 SECと略す。）の原理に基づき、分子サイズの大きい分子力 順に溶出し、 カラム中の全溶離液量以下の溶出容量で全ての分子が溶出することが好ましい。
[0059] 本発明にお 、て、このような親水化基材の物性及びィ匕学構造は以下のような要件 を満たすことが好ましい。
親水性基材の物性は、細孔物性、機械的強度及び粒子径分布と形状でほぼ規定 できる。細孔物性は細孔径分布と空孔率で大部分が規定できる。適切な細孔物性は 分離目的、方法と対象高分子の分子サイズに依存する。例えば、対象が一般的な球 状タンパク質 (globular proteins)で、脱塩用や非多孔性充填剤用基材であれば、 細孔径は排除限界分子量で 5千 (プルラン分子量換算)以下が好ましぐ空孔率は脱 塩用では、出来るだけ大きい方が好ましぐ 60〜95%が適切である。一方、非多孔 性充填剤用基材では、空孔率は逆に出来るだけ小さいことが機械的強度を向上する ため好ましぐ 20%以下が適切である。タンパク質の SEC分離用では、排除限界分 子量で 5千〜 50万 (プルラン分子量換算）が好ましい。また、イオン交換基、疎水性 基又はァフィユティー用リガンドを基材に固定ィ匕するためには、排除限界分子量は 1 万〜 500万 (プルラン分子量換算）、空孔率は 50〜95%が好ましい。多孔性充填剤 用基材の場合は、分離方法に拘わらず、空孔率は大きいほど、粒子径は逆に小さい ほど、体積当りの分離性能は向上する。空孔率を大きくすれば充填剤は機械的強度 が弱くなり、溶離液を通液するとき変形し易くなるため、空孔率は 95%以下が好まし い。特に分析目的の高性能液体クロマトグラフィー用充填剤の基材としては、 80%以 下が好ましい。粒子径を小さくすれば充填カラムのカラム高さ当りの圧力損失は増加 し、ますます機械的強度を高める必要が生ずる。したがって溶離液を適切な流速で 通液するには、充填剤は機械的強度が高い必要があり、圧力損失を必要以上に高 めないように、空孔率と粒子径を調節しなければならない。また充填剤の形状が球状 でないと、カラムに充填する際に、充填剤がブリッジを形成し、隙間を生じ、最密に充 填できない。そのために実用的には溶出ピーク形状が非対称になり、ピーク幅が拡 大して性能の低いカラムになる。したがって、充填剤の形状は球形が好ましい。
[0060] また親水性基材の化学構造としては、各種充填剤を合成するための基点として修 飾し易い官能基が必要である。溶質と官能基固有の相互作用を妨害すること無く固 定ィ匕できるように表面にアルコール性水酸基があることが好ましい。すなわち細孔内 部及び外部表面には、アルコール性水酸基やイオンィ匕しな 、極性官能基が多 、こと が好ましい。目的の溶質と導入する官能基固有の相互作用を妨害するような官能基 はないこと、また、簡単な修飾でマスキングできる範囲であることが望ましい。すなわ ちイオン性基や疎水性基は出来るだけ少な!/、ことが望ま 、。
[0061] 次に、本発明の充填剤（1)又は充填剤 (2)の粒子表面にイオン交換基が存在する ことを特徴とする充填剤 [以下、充填剤 (3)と称する。]について説明する。
本発明の充填剤（3)が有するイオン交換基としては、特に限定するものではないが 、スルフォン酸基、カルボキシル基、アミノ基、 4級アンモ-ゥム基が好適なものとして 挙げられる。
[0062] 本発明にお ヽて、充填剤 (1)又は充填剤 (2)へのイオン交換基の導入方法として は、特に限定するものではない。例えば、上記式（1)の（メタ）アタリロイルモノマーを 用いて重合し、水溶性有機溶媒で洗浄した重合体粒子中に、反応の基点となるダリ シジル基又はエポキシ基を有する場合、亜硫酸ソーダ又は酸性亜硫酸ソーダを用い 、エポキシ基を開環させてスルフォン酸基を導入することで、カチオン交換榭脂とす ることができる。また、亜硫酸ソーダ類の替わりに 1級、 2級又は 3級アミノ基を用い、 エポキシ基を開環させてアミノ基を導入すれば、ァニオン交換榭脂とすることができる
[0063] この他に、充填剤 (2)として用いられる親水化した架橋重合体粒子を使用し、ェピ クロルヒドリンにより、エポキシィ匕後亜硫酸ソーダ類又はアミン類を導入することにより 、本発明の充填剤（3)が調製される。ここで用いられるアミン類としては、特に限定す るものではない。例えば、アンモニア、炭素数 1〜4のアルキルァミン、炭素数 1〜4の ジアルキルァミン、炭素数 1〜4のトリアルキルァミン、ヒドロキシアルキル（炭素数 1〜 4)ァミン、ジヒドロキシアルキル (炭素数 1〜4)アミン、トリヒドロキシアルキル (炭素数 1〜4)アミン、 N—ヒドロキシェチルピペラジン、 N—アミノエチルピペラジン、モルホリ ン、エチレンジァミン、ジエチレントリァミン等が挙げられる。
[0064] 反応の基点がハロゲン原子の場合、上記したアミン類を用いて反応させれば、ァニ オン交換榭脂とすることができる。また、反応の基点がァミノ基の場合、そのまま、ァ 二オン交換榭脂として使用することができる。更に必要があれば、ェピクロルヒドリンを 介在させて、更にアミノ基を導入してもよい。
[0065] 反応の基点がアルコール性 OH基の場合、ブロモェチルスルホン酸、モノクロ口酢 酸、 1, 3—プロパンスルトン等を用いて反応させれば、カチオン交換榭脂とすること ができる。また、 2—クロロェチルジェチルァミン塩酸塩、グリシジルトリメチルアンモ- ゥムクロライド等を用いて反応させれば、ァ-オン交換榭脂とすることができる。さらに 、ェピノ、ロヒドリンを用いて反応させれば、エポキシ基も導入することができる。
このようにして得られた本発明の充填剤（3)は、例えば、クロマトグラフィー用充填 剤として、タンパク質等の生体高分子を分離精製する際に使用される。
[0066] 生体高分子の分離精製を目的とするイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、親 水化基材の説明にお 、て記載したような基材に、同種のカチオン交換基又はァ-ォ ン交換基を固定ィ匕した充填剤である。このような充填剤の物性の大部分は、基材に 依存する。ただし、イオン交換基を導入することにより、溶離液の塩濃度を変化させた とき、粒子の内外間で浸透圧が変化する。この作用により充填剤は、低塩濃度では 膨潤し、高塩濃度で収縮する。タンパク質のイオン交換クロマトグラフィーでは、塩濃 度を徐々に増やして相互作用の低いタンパク質力も順に溶出する方法を多用する。 このとき膨潤収縮比の大きい充填剤では、カラムベッド容積が大きく変化し、充填状 態が毎回変化し、再現性の良い分離にならない。膨潤収縮比の大きさは、基材マトリ ックス (骨格)の強さ (硬さ）とイオン交換容量により決定する。一般にイオン交換容量 が大きいほど影響が大きい。したがって、基材マトリックスが膨潤収縮し難ぐイオン交 換容量も必要以上に大きくない方がよい。具体的には、イオン交換容量は 30〜300 meqZlが適切な範囲である。またその他の生体高分子、例えば、核酸 (DNA, RN A)では、 200meqZl以下力 ぺプタイドやオリゴ糖などでは、 50〜500meqZlが好 ましい。 [0067] イオン交換クロマトグラフィーの溶出方法は、一般に上述した塩濃度を徐々に増や して溶出する方法、目的の溶質がイオン交換基と結合する pHから反撥する pHへ徐 々に溶離液の pHを変化させる方法又は両方の組合せなどがある。
その他にも再生、洗浄などではアルカリ溶液も使用するので、基材マトリックスが膨 潤収縮し難 ヽ充填剤が好まし ヽ。
実施例
[0068] 以下、実施例により、本発明の充填剤及びその製造方法を詳細に説明するが、本 発明はこれらに限定されるものではない。
製造例 1
まず、ケンィ匕率 88%、重合度 3500のポリビュルアルコール (懸濁安定剤） 1. 5gと 1 リットルの水を攪拌機付き反応器に仕込み、良く攪拌を行い、ポリビニルアルコール を水に溶解させた。その後、この水溶液が 60°Cになるよう調節し、これを調整水溶液 とした。
次に、グリシジルメタタリレート 45g、エチレングリコールジメタタリレート 15g、クロル ベンゼン 65g及びァゾビスイソブチ口-トリル 0. 3gからなる調整混合液を作り、この調 整混合液を 60°Cの上記調整水溶液中に攪拌を行いながら滴下した。引き続き、攪 拌しながらこの懸濁物を 6時間、 60°Cで重合させた。その後、反応器を室温に冷却し 、生成物を濾過し、数回温水で洗浄した後、ジォキサンで洗浄して粒状ゲル (架橋重 合体粒子)を得た。
[0069] <親水化基材の調製 >
得られた粒状ゲルを更に水で良く洗浄した後、この重合体 20gを 0. 5N硫酸水溶 液 200mlとよく混合し、これを水浴上で 90°Cに加熱して、 5時間反応を行い、ェポキ シ基の加水分解を行った。その後、水でよく洗浄して水浴中で篩分級を行い、 40 μ πι〜90 /ζ mの粒子径の粒状ゲルを取得した。このゲルを親水化基材 1とする。
[0070] <含水率の測定 >
親水化基材 1の含水率を、ケット式水分計で 120°C、 15分間加熱した後の親水化 基材 1の重量減により求めた。その結果、含水率は 57. 2%であった。
[0071] <エポキシ基の定量 > 約 2gの親水化基材 1を容量 200mlの共栓付三角フラスコに投入した後、秤量した 。次に、このフラスコ内に、正確に 25mlの約 0. 2M—塩酸 Zジォキサン溶液をカロえ 、攪拌子を入れて、室温で 3時間穏やかに攪拌した。次いで、このフラスコ内に、 50 mlのエチルアルコールと lmlのフエ一ノルフタレイン溶液をカ卩え、 0. 1M— NaOH溶 液で滴定して、残存塩酸量を求めた。また同時に、この約 0. 2M—塩酸 Zジォキサ ン溶液中の塩酸濃度を 0. 1M— NaOH溶液で滴定して求めた。更に、約 2gの親水 化基材 1を容量 200mlの共栓付三角フラスコに投入、秤量し、 75mlのェチルアルコ ールをカ卩え、室温で約 30分間攪拌し、フエノールフタレイン溶液を指示薬として 0. 1 M— NaOH溶液で滴定して、測定ゲル中の酸価を求めた。
このようにして得られた残存塩酸量、酸価及びゲルの含水率から乾燥ゲル lg当り のエポキシ量を求めた。該親水化基材のエポキシ量は乾燥ゲル lg当り 0. 3mmol以 下であった。
[0072] <排除限界分子量及び空孔率の測定 >
親水化基材 1のゲルスラリー水溶液を用いて内径 10. 7mm,長さ 150mmのステン レス製カラムに親水化基材 1を最密充填になるように充填した。次に、 RI— 8000検 出器 (東ソ一社製)を装備した HLC— 803D (東ソ一社製)に該カラムを装着した。引 き続き、標準物質に分子量 4000万のデキストラン及び各分子量のプルランを用い、 0. 5ml/min.の流速で種々の分子量の標準物質を注入し、その溶出容量から排 除限界分子量を求めた。また、デキストランとエチレングリコールの溶出容量及びカラ ム容積力も空孔率を求めた。親水化基材 1粒子の排除限界分子量は 100万、空孔 率は 62%であった。
[0073] <ァミノ化充填剤の調製 >
得られた親水化基材 1を純水で洗浄し、吸引ろ過後、親水化基材 1の 50mlを 300 mlセパラブルフラスコに移し、純水 20ml、 35%水酸化ナトリウム水溶液 20mlを加え 、攪拌混合した。次に、反応温度を 35〜40°Cに保ちながら、ェピクロルヒドリン 33g 及びジェチルァミノエタノール 39gを 4時間で滴下し、その後、更に 40°Cで 5時間反 応を継続した。反応終了後、反応液を吸引ろ過し、純水、 0. 5N塩酸、再び純水の 順によく洗浄した。この反応で得られた充填剤をァミノ化充填剤 1とする。 [0074] 製造例 2
グリシジルメタタリレート 49g、エチレングリコールジメタタリレート llg、クロルべンゼ ン 65g及びァゾビスイソブチ口-トリル 0. 3gからなる調整混合液を用いる以外は、製 造例 1と同様の方法で、この調整混合液を 60°Cに調節した調整水溶液中に攪拌を 行いながら滴下した。引き続き、攪拌しながらこの懸濁物を 6時間、 60°Cで重合させ た。その後、反応器を室温に冷却し、生成物を濾過し、数回温水で洗浄した後、ジォ キサンで洗浄して、粒状ゲル (架橋重合体粒子)を得た。
[0075] この粒状ゲル 25g、ポリエチレングリコール（平均分子量 200) 200g及びジォキサ ン lOOgをよく混合し、次に三フッ化ホウ素ェチルエーテル錯体 lmlを加え、攪拌しな がら、 85°Cに加熱し、 4時間加熱を続けた。次に、反応物を室温まで冷却し、水でよ く洗浄し、水浴中で篩分級を行い、粒子径 40 m〜 90 mの粒状ゲルを得た。この ゲルを親水化基材 2とする。
[0076] 製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 2の物性測定をした。その結果、含水 率は 55. 9%、残存エポキシ量は、乾燥基材 lg当り 0. 3mmol以下、排除限界分子 量は 110万、空孔率は 63. 2%であった。
更に、製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 2にアミノ基を導入した。この反 応で得られた充填剤をァミノ化充填剤 2とする。
[0077] 製造例 3
グリシジルメタタリレート 56g、エチレングリコールジメタタリレート 4g、クロルベンゼン 65g及びァゾビスイソプチ口-トリル 0. 3gからなる調整混合液を用いる以外は、製造 例 1と同様の方法で、この調整混合液を 60°Cに調節した調整水溶液中に攪拌を行 いながら滴下した。引き続き、攪拌しながらこの懸濁物を 6時間、 60°Cで重合させた。 その後、反応器を室温に冷却し、生成物を濾過し、数回温水で洗浄した後、ジォキ サンで洗浄して、粒状ゲル (架橋重合体粒子)を得た。
[0078] この粒状ゲル 25g、ポリエチレングリコール（平均分子量 200) 200g及びジォキサ ン lOOgをよく混合し、次に三フッ化ホウ素ェチルエーテル錯体 lmlを加え、攪拌しな がら， 85°Cに加熱し、 4時間加熱を続けた。次に、反応物を室温まで冷却し、水でよ く洗浄し、水浴中で篩分級を行い、粒子径 40 m〜 90 mの粒状ゲルを得た。この ゲルを親水化基材 3とする。
[0079] 製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 3の物性測定をした。その結果、含水 率は 69. 4%、残存エポキシ量は、乾燥基材 lg当り 0. 3mmol以下、排除限界分子 量は 165万、空孔率は 69. 4%であった。
更に、製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 3にアミノ基を導入した。この反 応で得られた充填剤をァミノ化充填剤 3とする。
[0080] 製造例 4
3, 4 エポキシシクロへキシルメチルメタタリレート 64g、エチレングリコールジメタク リレート 16g、酢酸ブチル 140g、クロルベンゼン 31g、及び t ブチルパーォキシビバ レート 1. 4gの混合物を、ケン化率 88%、重合度 3500のポリビュルアルコール（懸濁 安定剤） 10gを 1リットルの水に溶解した溶液中に懸濁させた。引き続き力き混ぜなが ら、この混合物を 6時間、 60°Cに加熱して重合させた。反応液を室温に冷却し、生成 した粒状のゲル状重合物をグラスフィルターでろ過した。この重合物を数回温水で洗 浄した後、 1, 4 ジォキサンで洗浄して粒状ゲル (架橋重合体粒子)を得た。
[0081] この粒状ゲノレ 50g、ポリエチレングリコーノレ（平均分子量 200) 200g及び 1, 4 ジ ォキサン 200gをよく混合し、次に三フッ化ホウ素ェチルエーテル錯体 2mlを加え、攪 拌しながら、 85°Cに加熱し 4時間加熱を続けた。次に反応物を室温に冷却し、水でよ く洗浄し、篩分級を行い、粒子径 40〜90 mの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化 基材 4とする。
[0082] 製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 4の物性測定をした。その結果、含水 率は 68. 5%、残存エポキシ量は、乾燥基材 lg当り 0. 3mmol以下、排除限界分子 量は 110万、空孔率は 74%であった。
更に、製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 4にアミノ基を導入した。この反 応で得られた充填剤をァミノ化充填剤 4とする。
[0083] 製造例 5
3, 4 エポキシシクロへキシルメチルメタタリレート 58g、グリシジノレメタタリレート 6g 、エチレングリコールジメタタリレート 16g、クロルベンゼン 200g、及びァゾビスイソブ チル-卜リル 0. 6gの混合物を、ケンィ匕率 88%、重合度 2400のポリビュルアルコー ル (懸濁安定剤） 15gを 1リットルの水に溶解した溶液中に懸濁させた。引き続きかき 混ぜながら、この混合物を 6時間、 60°Cに加熱して重合させた。反応液を室温に冷 却し、生成した粒状のゲル状重合物をグラスフィルターでろ過した。重合物の表面に 付着した懸濁安定剤を除去する為に重合物を数回温水で洗浄した後、 1, 4ージォ キサンで洗浄して粒状ゲル (架橋重合体粒子)を得た。
[0084] この粒状ゲル 50g、ジエチレングリコール 50g、ポリグリセリンポリグリシジルエーテ ル（商品名：デナコール EX— 521、ナガセ化成工業社製） 50g、及び 1, 4 ジォキ サン 200gをよく混合し、次に三フッ化ホウ素ェチルエーテル錯体 2mlを加え、攪拌し ながら、 85°Cに加熱し 4時間加熱を続けた。次に反応物を室温に冷却し、水でよく洗 浄し、篩分級を行い、粒子径 40〜90 mの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化基 材 5とする。
[0085] 製造例 1記載の方法に従って、親水化基材 5の物性測定をした。その結果、含水率 は 70. 5%、残存エポキシ量は、乾燥基材 lg当り 0. 3mmol以下、排除限界分子量 は 90万、空孔率は 72%であった。
更に、製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 5にアミノ基を導入した。この反 応で得られた充填剤をァミノ化充填剤 5とする。
[0086] 製造例 6
3 ァダマンタンジオール 168gとピリジン 80gをテトラヒドロフラン 400gに溶解した。 この溶液を攪拌しながら反応温度を 40°Cに保ちつつ、メタクリル酸クロライド 84gをこ の溶液中に滴下し、 2時間反応した。得られた反応液から、テトラヒドロフランを 35°C 以下で減圧留去し、残留物を n—へキサンで抽出した。次に、 n—へキサン相を純水 、 0. 1Mりん酸水溶液、 0. 1M炭酸ナトリウム水溶液、純水の順で未反応 1, 3 ァダ マンタンジオール、塩類、ピリジン、メタクリル酸を抽出除去した。最後に n—へキサン 相をメタノールで抽出し、メタノール溶液を 35°C以下で減圧留去した。
[0087] 得られた生成物を、ガスクロマトグラフ分析したところ、この生成物は、 3 ヒドロキシ ァダマンタン 1 メタタリレート 120g、 1, 3 ァダマンタンジメタタリレート 4gの組成 であった。次に、この生成物 60g、ジビュルベンゼン 2g、トリメチロールプロパントリア タリレート 10g、酢酸ブチル 50g、クロルベンゼン 100g、及びァゾビスイソブチル-トリ ル 0. 6gの混合物を、ケン化率 88%、重合度 2400のポリビュルアルコール（懸濁安 定剤） 10gを 1リットルの水に溶解した溶液中に懸濁させ、カゝき混ぜながらこの混合物 を 6時間、 60°Cに加熱して重合させた。その後、反応物を室温に冷却し、生成した粒 状のゲル状重合物をグラスフィルターでろ過し、数回温水で洗浄した後、 1, 4—ジォ キサンで洗浄して粒状ゲル (架橋重合体粒子)を得た。
[0088] この粒状ゲル 50g、エチレングリコール 20g、グリシドール 30g、及び 1, 4—ジォキ サン 150gをよく混合し、次に三フッ化ホウ素ェチルエーテル錯体 2mlをカ卩え、攪拌し ながら、 85°Cに加熱し 4時間加熱を続けた。次に反応物を室温に冷却し、次に反応 物を室温に冷却し、水でよく洗浄し、篩分級を行い、粒子径 40〜90 mの粒状ゲル を得た。このゲルを親水化基材 6とする。
[0089] 製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 6の物性測定をした。その結果、含水 率は 67%、残存エポキシ量は、乾燥基材 lg当り 0. 3mmol以下、排除限界分子量 は 60万、空孔率は 70%であった。
更に製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 6にアミノ基を導入した。この反 応により得られた充填剤をァミノ化充填剤 6とする。
[0090] 製造例 7
1, 4—シクロへキサンジメタノールモノアタリレート（日本化成社製） 64g、 4—ヒドロ キシブチルアタリレート（日本化成社製） 6g、エチレングリコールジメタタリレート 18g、 クロルベンゼン 240g、及び t—ブチルパーォキシビバレート 1. Ogの混合物を、ケン 化率 88%、重合度 3500のポリビュルアルコール（懸濁安定剤） 15gを 1リットルの水 に溶解した溶液中に懸濁させた。カゝき混ぜながらこの混合物を 6時間、 60°Cに加熱 して重合させた。次いで、反応液を室温に冷却し、生成した粒状のゲル状重合物を グラスフィルターでろ過し、数回温水で洗浄した後、アセトンでよく洗浄し、次に水で 洗浄して粒状ゲル (架橋重合体粒子)を得た。
[0091] この粒状ゲル 50g、ポリグリセリンポリグリシジルエーテル（商品名：デナコール EX — 512、ナガセ化成工業社製） 25g、及び純水 80mlをよく混合し、これに 5N水酸ィ匕 ナトリウム溶液 30mlを 45°Cにて滴下し、 3時間攪拌混合した。次に反応物を室温に 冷却し、 0. 1N塩酸及び水でよく洗浄し、篩分級を行い、粒子径 40〜90 /z mの粒状 ゲルを得た。このゲルを親水化基材 7とする。
[0092] 製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 7の物性測定をした。その結果、含水 率は 78%、残存エポキシ量は、乾燥基材 lg当り 0. 3mmol以下、排除限界分子量 は 150万、空孔率は 75%であった。
更に製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 7にアミノ基を導入した。この反 応により得られた充填剤をァミノ化充填剤 7とする。
[0093] 製造例 8
分子量 36万のポリビュルピロリドン (懸濁安定剤） 50gと 1リットルの水を攪拌機付き 反応器に仕込み、良く攪拌を行い、ポリビュルピロリドンを水に溶解させた。その後、 水溶液が 60°Cになるよう調節した。次に、グリシジルメタタリレート 200g、エチレンダリ コールジメタタリレート 50g及びァゾビスイソブチロニトリル 1. Ogからなる混合溶液を 調製し、この混合溶液を 60°Cの上記水溶液中に攪拌を行いながら滴下した。上記水 溶液中に窒素を lOmlZminの流速で流しながら、引き続き激しく攪拌して、この懸 濁物を 8時間、 60°Cで重合させた。反応液を室温に冷却し、生成したゲル状重合物 を濾過し、数回温水で洗浄した後、ジォキサンで洗浄して粒状ゲル (架橋重合体粒 子)を得た。
[0094] この粒状ゲル（ジォキサン含有） 200gを 300mlのジォキサンに分散し、これに 150 gのエチレングリコールと 5gの固形水酸化ナトリウムを添カ卩し、これを水浴上で 70°C に加熱し、 16時間反応を行って、エポキシ基へのエチレングリコールの開環付加反 応を行った。次いで、生成物を水、次にアセトンでよく洗浄した。その後、アセトンスラ リー溶液を用いて、デカンテーシヨン分級を行い、粒子径 3〜5 /ζ πιの粒状ゲルを取 得した。これを親水化基材 8とする。
更に製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 8にアミノ基を導入した。この反 応により得られた充填剤をァミノ化充填剤 8とする。
[0095] 製造例 9
分子量 36万のポリビュルピロリドン (懸濁安定剤） 50gと 1リットルの水を攪拌機付き 反応器に仕込み、良く攪拌を行って、ポリビュルピロリドンを水に溶解させた。その後 、この水溶液が 60°Cになるよう調節した。次に、 3, 4—エポキシシクロへキシルメチル メタタリレート 276g、エチレングリコールジメタタリレート 50g及びァゾビスイソブチロニ トリル 1. Ogからなる混合溶液を調製し、この混合溶液を 60°Cの上記水溶液中に攪 拌を行いながら滴下した。上記水溶液に窒素を lOmlZminの流速で流しながら、引 き続き激しく攪拌して、この懸濁物を 8時間、 60°Cで重合させた。次いで、反応液を 室温に冷却し、生成したゲル状重合物を濾過し、数回温水で洗浄した後、ジォキサ ンで洗浄して粒状ゲル (架橋重合体粒子)を得た。
[0096] この粒状ゲル（ジォキサン含有） 200gを 300mlのジォキサンに分散し、これに 150 gのエチレングリコールと 1. 5mlの三弗化ホウ素エーテル錯体を室温で添カ卩し、これ を水浴上で 70°Cに加熱し、 4時間反応を行い、エポキシ基へのエチレングリコールの 開環付加反応を行った。その後、水、次にアセトンでよく洗浄してアセトンに懸濁し、 デカンテーシヨン分級を行い、粒子径 3〜 5 mの粒状ゲルを取得した。これを親水 化基材 9とする。
更に製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 9にアミノ基を導入した。この反 応により得られた充填剤をァミノ化充填剤 9とする。
[0097] 製造例 10
4—ヒドロキシブチルアタリレートグリシジルエーテル（日本化成社製） 48g、 3, 4— エポキシシクロへキシルメチルメタタリレート 16g、エチレングリコールジメタタリレート 1 6g、クロルベンゼン 220g、及びァゾビスイソブチル二トリル 1. 4gの混合物を、ケン化 率 88%、重合度 2400のポリビュルアルコール（懸濁安定剤） 10gを 1リットルの水に 溶解した溶液中に懸濁させた。カゝき混ぜながらこの混合物を 6時間、 65°Cに加熱し て重合させた。反応液を室温に冷却し、生成した粒状のゲル状重合物をグラスフィル ターでろ過し、数回温水で洗浄した後、 1, 4—ジォキサンで洗浄して粒状ゲル (架橋 重合体粒子)を得た。
[0098] この粒状ゲル 50g、エチレングリコール 100g、及び 1, 4—ジォキサン 200gをよく混 合し、これに三フッ化ホウ素ェチルエーテル錯体 2mlをカ卩え、攪拌しながら、 85°Cに 加熱し 4時間加熱を続けた。次に反応物を室温に冷却し、水でよく洗浄し、篩分級を 行い、粒子径 40〜 90 mの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化基材 10とする。 製造例 1記載の方法に従って、親水化基材 10の物性測定をした。その結果、含水 率は 72. 5%、残存エポキシ量は、乾燥基材 lg当り 0. 3mmol以下、排除限界分子 量は 100万、空孔率は 76%であった。
[0099] 製造例 11
4 ブロモブチルメタタリレート 64g、エチレングリコールジメタタリレート 16g、 1, 2- ジクロロプロパン 100g、クロ口ベンゼン 100g、及びァゾビスイソブチル二トリル 1. 2g の混合物を、ケン化率 88%、重合度 2400のポリビュルアルコール（懸濁安定剤） 15 gを 1リットルの水に溶解した溶液中に懸濁させた。力き混ぜながらこの混合物を 6時 間、 65°Cに加熱して重合させた。反応液を室温に冷却し、生成した粒状のゲル状重 合物をグラスフィルターでろ過し、表面に付着した懸濁安定剤を除去する為に重合 物を数回温水で洗浄した後、 1, 4 ジォキサンで洗浄して粒状ゲル (架橋重合体粒 子)を得た。
[0100] この粒状ゲル 50g、エチレングリコール 100g、及び 1, 4 ジォキサン 200gをよく混 合し、これに水酸ィ匕ナトリウム 25gを加え、攪拌しながら、 75°Cに加熱し 10時間加熱 を続けた。次に反応物を室温に冷却し、水でよく洗浄し、篩分級を行い、粒子径 40 〜 90 mの粒状ゲルを得た。このゲルを親水化基材 11とする。
製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 11の物性測定をした。その結果、含 水率は 70. 5%、残存エポキシ量は、乾燥基材 lg当り 0. 3mmol以下、排除限界分 子量は 80万、空孔率は 72%であった。
[0101] 製造例 12
1, 4 シクロへキサンジメタノールモノアタリレート（日本化成社製） 32g、 6 ァミノ へキシルメタクリルアミド 32g、エチレングリコールジメタタリレート 18g、イソアミルアル コール 100g、クロ口ベンゼン 100g、及び t ブチルパーォキシピバレート 1. 5gの混 合物を、分子量 36万のポリビュルピロリドン (懸濁安定剤） 25g及びエタノールァミン lmlを 1リットルの水に溶解した溶液中に懸濁させた。カゝき混ぜながらこの混合物を 6 時間、 60°Cに加熱して重合させた。反応液を室温に冷却し、生成した粒状のゲル状 重合物をグラスフィルターでろ過し、数回温水で洗浄した後、アセトンでよく洗浄し、 次に水で洗浄して粒状ゲル (架橋重合体粒子)を得た。
[0102] この粒状ゲル 50g、ポリグリセリンポリグリシジルエーテル（商品名：デナコール EX — 512、ナガセ化成工業社製） 25gと純水 80mlをよく混合し、 5N水酸ィ匕ナトリウム溶 液 30mlを 45°Cにて滴下し、 3時間攪拌混合した。次に反応物を室温に冷却し、 0. 1 N塩酸及び水でよく洗浄し、篩分級を行い、粒子径 40〜90 mの粒状ゲルを得た。 このゲルを親水化基材 12とする。
[0103] 製造例 1記載の方法に従って、該親水化基材の物性測定をした。その結果、含水 率は 78%、排除限界分子量は 120万、空孔率は 74%であった。
更に製造例 1に記載の方法に従って、親水化基材 12にアミノ基を導入した。この反 応により得られた充填剤をァミノ化充填剤 12とする。
[0104] 製造例 13
製造例 4で得られた親水化基材 4を純水で洗浄し、吸引ろ過後、親水化基材 4の 5 Omlを 300mlセパラブルフラスコに移し、純水 30ml、 1, 3—プロパンスルトン 20gを これに加え、攪拌混合した。反応温度を 35〜45°Cに保ちながら、 48%水酸化ナトリ ゥム水溶液 15gをこれに滴下し、滴下後更に 40°Cで 3時間反応を継続した。反応終 了後、反応液を吸引ろ過し、純水でよく洗浄した。この反応で得られた充填剤をスル フォン化充填剤 13とする。
[0105] 製造例 14
製造例 4で得られた親水化基材 4を純水で洗浄し、吸引ろ過後、 50mlを 300mlセ パラブルフラスコに移し、純水 25ml、モノクロ口酢酸ナトリウム 25gをこれに加え、攪 拌混合した。反応温度を 45〜55°Cに保ちながら、 48%水酸ィ匕ナトリウム水溶液 60g をこれに滴下し、滴下後更に 50°Cで 4時間反応を継続した。反応終了後、反応液を 吸引ろ過し、純水でよく洗浄した。この反応で得られた充填剤をカルボキシメチルイ匕 充填剤 14とする。
[0106] 製造例 15
製造例 4で得られた親水化基材 4を純水で洗浄し、吸引ろ過後、 50mlを 300mlセ パラブルフラスコに移し、純水 25ml、 70%グリシジルトリメチルアンモ -ゥムクロライド 水溶液 40gを加え、攪拌混合した。反応温度を 30〜35°Cに保ちながら、 48%水酸 化ナトリウム水溶液 2gをこれに投入し、滴下後更に 35°Cで 24時間反応を継続した。 反応終了後、反応液を吸引ろ過し、純水、 0. 5N塩酸、再び純水の順によく洗浄した 。この反応で得られた充填剤を 4級アンモニゥム化充填剤 15とする。
[0107] 製造例 16
製造例 13に記載の方法に従って、製造例 2で得られた親水化基材 2にスルフォン 基を導入した。この反応で得られた充填剤をスルフォン化充填剤 16とする。
[0108] 製造例 17
製造例 14に記載の方法に従って、製造例 2で得られた親水化基材 2にカルボキシ メチル基を導入した。この反応で得られた充填剤をカルボキシメチルイ匕充填剤 17と する。
[0109] 製造例 18
製造例 15に記載の方法に従って、製造例 2で得られた親水化基材 2に 4級アンモ 二ゥム基を導入した。この反応で得られた充填剤を 4級アンモニゥム化充填剤 18とす る。
[0110] 以上の製造例で調製した、粒状ゲル (架橋重合体粒子)、親水化基材、充填剤をそ れぞれ表 1〜表 3に併せて示す。
[0111] [表 1]
表 1
Figure imgf000032_0001
1 ) GMA グリシジルメタクリレート
2) EHMA 3, 4一エポキシシクロへキシルメチルメタクリレート
3) HAM A 1， 3—ヒドロキシァダマンタン一 1一メタクリレート
4) CHMA 1 , 4—シクロへキサンジメタノールモノアクリレート
5) HBA 1， 4ーヒドロキシブチルァクリレート
6) BAGE 4ーヒドロキシブチルァクリレ一トグリシジルェ一テル
7) ブロモブチル MA 4一ブロモブチルメタクリレート
8)ァミノへキシルアミド 6—ァミノへキシルメタクリルアミド
9) EGDMA エチレングリコールジメタクリレート
1 0) ADMA 1 , 3—ァダマンタンジメタクリレート
1 1 ) DVB ジビニルベンゼン
1 2) MPTA トリメチロールプロパントリァクリレート 2]
表 2
0113
Figure imgf000033_0001
1 ) PEG200 ポリエチレングリコール（平均分子量 200)
2) DEG ジエチレングリコール
3 ) EX521 ポリグリセリンポリグリシジルェ一テル (商品名：デナコール EX— 521、ナガセ化成工業社製)
4) EG エチレングリコール
5) Glyc グリシドール
6) EX512 ポリグリセリンポリグリシジルエーテル (商品名：デナコール EX— 51 2、ナガセ化成工業社製)
表 3
Figure imgf000034_0001
1 ) DEAE ：ジェチルアミノエタノーレ
2) 1 ,3-PS : 1 , 3—プロ/《ンスノレ卜ン
3) CAC ：モノクロ口酢酸ナトリウム
4) GTA ：グリシジルトリメチルアンモニゥムクロライド
[0114] 実施例 1
製造例 4で得られた親水化基材 4の親水性と耐アルカリ性を 25°C士 2°Cに調節した 部屋で評価した。
親水性評価は、タンパク質溶液を充填カラム及び空カラムに注入し、一定量の溶出 液を採取し、溶出液の 280nm紫外吸光度を測定比較する方法で回収率を測定する 方法で行なった。つまり、基材が疎水性を有していれば、タンパク質は基材に疎水吸 着されて回収率が低下し、逆に、基材の親水性が高ければ、回収率が高くなることを 利用する方法で各々のカラムについて機能を比較した。なお、本実施例においてタ ンパク質としては、オボアルブミン (卵白）、 a -キモトリプシノーゲン A (ゥシ）、ミオグロ ビン (ゥマ)及びリゾチーム (卵）（以上、シグマアルドリッチジャパン社製）、チトクロー ム C (ゥマ）（和光純薬工業社製)を用いた。
[0115] 具体的には、親水化基材 4力 なる充填剤を内径 10. 7mm、長さ 150mmのステ ンレスカラムにスラリー充填法で充填して充填カラムとした。溶離液として、 0. 1Mりん 酸緩衝液 (ρΗ6. 8)と 0. 2M硫酸ナトリウムの含有溶液を用い 1. OmlZminの流速 で流し、同溶離液に 2. OmgZmlの濃度で溶解した上記タンパク質を 0. 1ml注入し 、注入後 4分目力ゝら溶出液 20mlを採取した。一方、空カラムとしては、タンパク質溶 液の分散を防ぐ目的で、内径 10. 7mm長さ 75mmのステンレスカラムを用い、上記 と同様にして注入後 2分力も溶出液 20mlを採取した。空カラム力も採取されたタンパ ク質の吸光度を 100%とする相対比較で各々のタンパク質の回収率を求めた。 その結果、いずれのタンパク質も 95%以上の回収率を示し、親水化基材 4は親水 性が高い事を確認した。
[0116] 次に、耐アルカリ性の評価は、水酸ィ匕ナトリウム水溶液浸漬によるカルボキシル基 生成量の比較により行った。すなわち、純水でよく洗浄した後、親水化基材 4を、内 径 20mmの底部グラスフィルター付きのクロマトグラフ管を用いて 10mlずつ測り取り 、 80ml蓋付きサンプルビン 2個にそれぞれ移した。一方のサンプルビンには、 5N水 酸ィ匕ナトリウム水溶液 60mlを、他方には純水 60mlをそれぞれ加え、密栓し、それぞ れのスラリー液を混合した後、 25°Cにて 4週間静置保管した。保管後のそれぞれの 親水化基材 4の全量を 0. 5Nの HC1溶液で良く洗浄し、引き続き、純水で良く洗浄し た後、カルボキシル基量を 0. 1N水酸ィ匕ナトリウム溶液による滴定により測定した。こ れら親水化基材のカルボキシル基量の差より、 5N水酸ィ匕ナトリウム溶液浸漬による 加水分解で生成したカルボキシル基量を算出した。
その結果、親水化基材 4のカルボキシル基生成量は、基材 1リットル当たり 8. 3ミリ 等量であった。
[0117] 実施例 2
製造例 5で得られた親水化基材 5の親水性と耐アルカリ性を評価した。 すなわち、親水性の評価は、実施例 1に記載の方法に従って行った。その結果、タ ンパク質の回収率は何れも 95%であり、親水化基材 5は親水性が高い事を確認した また、耐アルカリ性の評価は、実施例 1に記載の方法に従い、親水化基材 5を 4週 間アルカリ水溶液に浸漬することにより行なった。浸漬後の基材の耐アルカリ性を実 施例 1に記載の方法で評価したところ、親水化基材 5のカルボキシル基生成量は、基 材 1リットル当たり 10. 5ミリ等量であった。
[0118] 実施例 3
製造例 6で得られた親水化基材 6の親水性と耐アルカリ性を実施例 1に記載の方法 に従って評価した。
その結果、タンパク質の回収率は何れも 95%であり、親水化基材 6は親水性が高 い事を確認した。また、親水化基材 6のカルボキシル基生成量は、基材 1リットル当た り 12. 4ミリ等量であった。
[0119] 実施例 4
製造例 7で得られた親水化基材 7の親水性と耐アルカリ性を実施例 1に記載の方法 に従って評価した。
その結果、タンパク質の回収率は何れも 95%であり、親水化基材 6は親水性が高 い事を確認した。また、親水化基材 7のカルボキシル基生成量は、基材 1リットル当た り 10. 6ミリ等量であった。
[0120] 実施例 5
製造例 4で得られたアミノ化充填剤 4のイオン交換容量を以下に示す方法で測定し た。すなわち、実施例 1に記載した要領で、アミノ化充填剤 4を 10m刷り取り、これを 1N水酸ィ匕ナトリウム水溶液、純水の順でよく洗浄し、 0. 1N塩酸による滴定により、 測定した。その結果、アミノ化充填剤 4のイオン交換容量は、充填剤 1リットル当たり 4 5ミリ等量であった。
[0121] 次に、アミノ化充填剤 4の耐アルカリ性を以下に示す方法で評価した。すなわち、水 酸化ナトリウム水溶液浸漬有りと無しの当該アミノ化充填剤に対する牛血清アルブミ ン（以下、 BSAと略す。）の結合量、及び酸性タンパク質の一定溶出条件での溶出容 量を測定した。ここで、水酸ィ匕ナトリウム水溶液浸潰の条件は、浸漬期間を 12週間と する以外は、実施例 1における親水化基材の耐アルカリ性評価と同じ条件で行った。
[0122] < BSA結合量の測定 >
純水でよく洗浄後、アミノ化充填剤 4を内径 10mmの底部グラスフィルター付きのク 口マトグラフ管を用いて正確に 3ml測り取った。その後、アミノ化充填剤 4の 10倍容量 の、 50mMトリスァミノメタン緩衝液 (pH8. 5)を用い、該ァミノ化充填剤を 3回洗浄し た後、 50mlメスフラスコに移した。 BSAの含有濃度が 20mgZmlの上記トリスァミノメ タン緩衝液 10mlを加え、 10分間混合して BSAを吸着させた。その後、この懸濁液を 濾紙でろ過して、アミノ化充填剤 4を除き、残存 BSA溶液を得た。
[0123] 引き続き、紫外分光光度計でこの残存 BSA溶液の 280nmにおける吸光度を測定 した。予め、紫外分光光度計を用いて、既知濃度の BSA溶液と 280nmでの吸光度 の関係を求めた相関図により、残存 BSA量を求めた。そして、添カ卩した 200mgの BS A量と残存 BSA量との差を BSA結合量とした。
[0124] その結果、純水に浸漬したアミノ化充填剤 4の BSA結合量は 29. 5mgZml、 12週 間水酸ィ匕ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤 4の BSA結合量は 26. 5mgZmlであ つた。それらの差、すなわちアルカリによる BSA結合量の低下は 3. OmgZmlと非常 に小さい事を確認した。
[0125] <酸性タンパク質の溶出容量の測定 >
アミノ化充填剤 4を内径 7. 5mm,長さ 75mmのステンレスカラムに充填し、初期緩 衝液に、 50mMトリスァミノメタン緩衝液 (pH8. 5)を用い、 lmg/ml濃度のタンパク 質含有試料を 0. 05ml注入して、カラムにタンパク質を吸着させた。その後、最終緩 衝液が、 50mMトリスァミノメタン緩衝液（pH8. 5)であり、さらには 0. 5M塩化ナトリ ゥム含有溶液になるよう、流速 1. Oml/minで 60分間のリニアグラジェント溶出を行 つた。溶出タンパク質の検出は、 25± 2°C、紫外線吸収検出器 UV8020 (東ソー (株 )製、検出波長は 280nm)を用いて行った。試料としては、卵白アルブミン (以下、 O VAと略す。）及び大豆トリプシンインヒビター（以下、 STIと略す。）を用いた。そして、 リニアグラジェント開始力も種々のタンパク質のピークトップが溶出するまでの溶離液 の溶出量を測定し、これを溶出容量とした。
[0126] その結果、純水に浸漬したアミノ化充填剤 4の OVAの溶出容量は 16. 2ml, STI の溶出容量は 28. Omlであった。一方、 12週間水酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬したアミ ノ化充填剤 4の OVAの溶出容量は 15. 3ml、 STIの溶出容量は 27. Omlであった。 すなわち、アルカリによって OVAで 0. 9ml、 STIで 1. Oml溶出容量が少なくなる事 が判った。つまり、該ァミノ化充填剤をアルカリ水溶液に浸漬しても溶出容量の変化 は小さい事、換言すれば、タンパク質の保持力はほとんど変化しない事を確認した。 [0127] <ァミノ化充填剤の硬さの評価 >
アミノ化充填剤 4の流通特性を測定する為に、篩分級で得たアミノ化充填剤 4 (体積 平均粒子径： 74 m、標準偏差： 13. 4 m)を内径 10. 7mm、長さ 150mmのステ ンレスカラムにスラリー充填法で充填した。定流量ポンプ (最大流速 lOmlZmin)で 0 カゝら lOmlZminで純水を通液し、最大 400kPaまで測定可能なブルドン管式圧力計 を用い、各流速での圧力損失を測定した。次に、このアミノ化充填剤 4をカラムより抜 出し、空カラム及び送液システムの同一流速での圧力損失を測定し、充填剤ベッドの 正味の圧力損失を算出した。
その結果、最大流速 lOmlZmin (線流速 667cmZhr)まで流速と圧力損失とは直 線関係を示し、最大流速の圧力損失は 78kPaであった。
[0128] 実施例 6
製造例 5で得られたアミノ化充填剤 5のイオン交換容量を、実施例 5に記載の方法 に従い測定した。その結果、アミノ化充填剤 5のイオン交換容量は、充填剤 1リットル 当たり 85ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤 5の耐アルカリ性及び硬さの評価を 、実施例 5に記載の方法に従い実施した。それらの結果は、以下の通りであった。
[0129] < 3八結合量>
純水に浸漬したアミノ化充填剤 5の BSA結合量は 37. 4mgZml、 12週間水酸ィ匕 ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤の BSA結合量は 35. 9mgZmlであった。その 差、すなわちアルカリによるタンパク質結合量の低下は 1. 5mgZmlと非常に小さい 事を確認した。
[0130] <酸性タンパク質の溶出容量 >
純水に浸漬したアミノ化充填剤 5の OVAの溶出容量は 17. 2ml、 STIの溶出容量 は 25. 2mlであった。一方、 12週間水酸ィ匕ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤 5の O VAの溶出容量は 16. 8ml、 STIの溶出容量は 24. 8mlであった。すなわちアルカリ によって OVAで 0. 4ml、 STIで 0. 4ml溶出容量が少なくなる事が判った。つまり、ァ ミノ化充填剤 5をアルカリ水溶液に浸漬しても保持力はほとんど変化しな ヽ事を確認 した。
[0131] <ァミノ化充填剤の硬さ > アミノ化充填剤 5の流通特性を測定する為に、篩分級で得たアミノ化充填剤 5 (体積 平均粒子径： 72 m、標準偏差： 14. 1 m)を内径 10. 7mm、長さ 150mmのステ ンレスカラムにスラリー充填法で充填した。これ以降の操作は実施例 5に記載の方法 と全く同様の操作を行って、流速と圧力損失の関係を求めた。その結果、最大流速 1 Oml/min (線流速 667cmZhr)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、最大流 速の圧力損失は 80kPaであった。
[0132] 実施例 7
製造例 6で得られたアミノ化充填剤 6のイオン交換容量を、実施例 5に記載の方法 に従い測定した。その結果、アミノ化充填剤 6のイオン交換容量は、充填剤 1リットル 当たり 70ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤 6の耐アルカリ性、及び硬さの評価 を、実施例 5に記載の方法に従い実施した。それらの結果は、以下の通りであった。
[0133] < 3八結合量>
純水に浸漬したアミノ化充填剤 6の BSA結合量は 26. lmg/mU 12週間水酸ィ匕 ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤 6の BSA結合量は 24. 7mgZmlであった。その 差、すなわちアルカリによるタンパク質結合量の低下は 1. 4mgZmlと非常に小さい 事を確認した。
[0134] <酸性タンパク質の溶出容量 >
純水に浸漬したアミノ化充填剤 6の OVAの溶出容量は 17. 9ml、 STIの溶出容量 は 26. 3mlであった。一方、 12週間水酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤 6の OVAの溶出容量は 17. Oml、 STIの溶出容量は 24. 9mlであった。 12週間水 酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤 6は OVAで 0. 9ml、 STIで 1. 4ml溶 出容量が減少することが判った。つまり、アミノ化充填剤 6をアルカリ水溶液に浸漬し ても保持力はほとんど変化しな 、事を確認した。
[0135] <ァミノ化充填剤の硬さ >
アミノ化充填剤 6の流通特性を測定する為に、篩分級で得たアミノ化充填剤 6 (体積 平均粒子径： 76 m、標準偏差： 13. 1 m)を内径 10. 7mm、長さ 150mmのステ ンレスカラムにスラリー充填法で充填した。これ以降の操作は実施例 5に記載の方法 と全く同様の操作を行って、流速と圧力損失の関係を求めた。その結果、最大流速 1 Oml/min (線流速 667cmZhr)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、最大流 速の圧力損失は 75kPaであった。
[0136] 実施例 8
製造例 7で得られたアミノ化充填剤 7のイオン交換容量を、実施例 5に記載の方法 に従い測定した。その結果、アミノ化充填剤 7のイオン交換容量は、充填剤 1リットル 当たり 125ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤 7の耐アルカリ性、及び硬さの評価 を、実施例 5に記載の方法に従い実施した。それらの結果は、以下の通りであった。
[0137] < BSA結合量 >
純水に浸漬したアミノ化充填剤 7の BSA結合量は 26. 2mg/mU 12週間水酸ィ匕 ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤 7の BSA結合量は 25. 2mgZmlであった。その 差、すなわちアルカリによるタンパク質結合量の低下は 1. OmgZmlと非常に小さい 事を確認した。
[0138] <酸性タンパク質の溶出容量 >
純水に浸漬したアミノ化充填剤 7の OVAの溶出容量は 17. 6ml、 STIの溶出容量 は 28. 2mlであった。一方、 12週間水酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤 7の OVAの溶出容量は 16. 8ml、 STIの溶出容量は 27. 4mlであった。 12週間水 酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤 7は OVAで 0. 8ml、 STIで 0. 8ml溶 出容量が少なくなる事が判った。つまり、アミノ化充填剤 7をアルカリ水溶液に浸漬し ても保持力はほとんど変化しな 、事を確認した。
[0139] <ァミノ化充填剤の硬さ >
アミノ化充填剤 7の流通特性を測定する為に、篩分級で得たアミノ化充填剤 7 (体積 平均粒子径： 74 m、標準偏差： 13. 1 m)を内径 10. 7mm、長さ 150mmのステ ンレスカラムにスラリー充填法で充填した。これ以降の操作は実施例 5に記載の方法 と全く同様の操作を行って、流速と圧力損失の関係を求めた。その結果、最大流速 1 Oml/min (線流速 667cmZhr)まで流速と圧力損失とは直線関係を示し、最大流 速の圧力損失は 77kPaであった。
[0140] 実施例 9
製造例 9で得られたアミノ化充填剤 9の耐アルカリ性の評価を、水酸ィ匕ナトリウム水 溶液浸漬有りと無しの当該アミノ化充填剤に対する、酸性タンパク質の一定溶出条 件での溶出容量測定によって行った。水酸ィ匕ナトリウム水溶液浸漬の条件は、実施 例 5と同じ条件で行なった。
[0141] <酸性タンパク質の溶出容量の測定 >
アミノ化充填剤 9を内径 4. 6mm,長さ 35mmのステンレスカラムに充填し、初期緩 衝液に、 50mMトリスァミノメタン緩衝液 (pH8. 5)を用い、 lmg/ml濃度のタンパク 質含有試料を 0. 02ml注入して、カラムにタンパク質を吸着させた。その後、最終緩 衝液が、 50mMトリスァミノメタン緩衝液（pH8. 5)であり、さらには 0. 5M塩化ナトリ ゥム含有溶液になるよう、流速 1. Oml/minで 30分間のリニアグラジェント溶出を行 つた。溶出タンパク質の検出は、 25± 2°C、紫外線吸収検出器 UV8020 (東ソ一社 製、検出波長は 280nm)を用いて行った。試料としては OVA及び STIを用いた。そ して、リニアグラジェント開始から種々のタンパク質のピークトップが溶出するまでの 溶離液の溶出量を測定し、これを溶出容量とした。
[0142] その結果、純水で洗浄したアミノ化充填剤 9の OVAの溶出容量は 6. 5ml、 STIの 溶出容量は 13. 5mlであった。一方、水酸ィ匕ナトリウム溶液に 12週間浸漬したアミノ 化充填剤 9を純水で良く洗浄した、洗浄後の当該アミノ化充填剤の OVAの溶出容量 は 6. 3ml、 STIの溶出容量は 13. 2mlであった。水酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬したァ ミノ化充填剤 9は、 OVAで 0. 2ml、 STIで 0. 3ml溶出容量が減少した。この変化量 は、誤差の範囲に近ぐアミノ化充填剤 9をアルカリ水溶液に浸漬しても溶出容量は ほとんど変化しな 、結果であった。
[0143] 比較例 1
製造例 1で得られた親水化基材 1の耐アルカリ性を、実施例 1に記載の方法に従つ て評価した。親水化基材 1のカルボキシル基生成量は、基材 1リットル当たり 125ミリ 等量であった。
[0144] 比較例 2
製造例 2で得られた親水化基材 2の耐アルカリ性を、実施例 1に記載の方法に従つ て評価した。親水化基材 2のカルボキシル基生成量は、充填剤 1リットル当たり 137ミ リ等量であった。 [0145] 比較例 3
製造例 1で得られたアミノ化充填剤 1のイオン交換容量を、実施例 5に記載の方法 に従って測定した。その結果、アミノ化充填剤 1のイオン交換容量は、充填剤 1リット ル当たり 128ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤 1の耐アルカリ性を、実施例 5に 記載の方法に従って評価した。その結果は以下の通りであった。
[0146] < BSA結合量 >
純水に浸漬したアミノ化充填剤 1の BSA結合量は 35. 6mgZml、 12週間水酸ィ匕 ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤 1の BSA結合量は 0. 6mgZmlであった。 1 2週間水酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬することにより、アミノ化充填剤 1の吸着量がマイ ナス 35. OmgZmlもの大幅な低下を来たした事を確認した。
[0147] <酸性タンパク質の溶出容量 >
純水に浸漬したアミノ化充填剤 1の OVAの溶出容量は 17. 8ml、 STIの溶出容量 は 25. 9mlであった。一方、 12週間水酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤 1の OVAの溶出容量は 4. 6ml、 STIの溶出容量は 7. 8mlであった。 12週間水酸化 ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤 1は OVAでマイナス 13. 2ml、 STIでマイナ ス 18. 1mlと大幅に溶出容量が少なくなる事が判った。つまり、アミノ化充填剤 1をァ ルカリ水溶液に浸漬すると保持力は大幅に低下する事を確認した。
[0148] 比較例 4
製造例 2で得られたアミノ化充填剤 2のイオン交換容量を、実施例 5に記載の方法 に従って測定した。その結果、アミノ化充填剤 2のイオン交換容量は、充填剤 1リット ル当たり 119ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤 2の耐アルカリ性を、実施例 5に 記載の方法に従って評価した。その結果は以下の通りであった。
[0149] < BSA結合量 >
純水に浸漬したアミノ化充填剤 2の BSA結合量は 33. 9mgZml、 12週間水酸ィ匕 ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤 2の BSA結合量は 1. OmgZmlであった。 12週 間水酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬することにより、アミノ化充填剤 2の吸着量がマイナス 3 2. 9mgZmlもの大幅な低下を来たした事を確認した。
[0150] <酸性タンパク質の溶出容量 > 純水に浸漬したアミノ化充填剤 2の OVAの溶出容量は 16. 6ml、 STIの溶出容量 は 22. 3mlであった。一方、 12週間水酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤 2の OVAの溶出容量は 4. 9ml、 STIの溶出容量は 8. 4mlであった。 12週間水酸化 ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤 2は OVAでマイナス 11. 7ml、 STIでマイナ ス 13. 9mlと大幅に溶出容量が少なくなる事が判った。つまり、アミノ化充填剤 2をァ ルカリ水溶液に浸漬すると保持力は大幅に低下する事を確認した。
[0151] 比較例 5
製造例 3で得られたアミノ化充填剤 3のイオン交換容量を、実施例 5に記載の方法 に従って測定した。その結果、アミノ化充填剤 3のイオン交換容量は、充填剤 1リット ル当たり 106ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤の耐アルカリ性、及び硬さを、実 施例 5に記載の方法に従って評価した。その結果は以下の通りであった。
[0152] < 3八結合量>
純水に浸漬したアミノ化充填剤 3の BSA結合量は 30. 7mg/mU 12週間水酸ィ匕 ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤 3の BSA結合量は 0. 7mgZmlであった。 1 2週間水酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬したアミノ化充填剤 3の吸着量がマイナス 30. Om gZmlもの大幅な低下を来たした事を確認した。
[0153] <ァミノ化充填剤の硬さ >
アミノ化充填剤 3の流通特性を測定する為に、篩分級で得たアミノ化充填剤 3 (体積 平均粒子径： 76 m、標準偏差： 12. 1 m)を内径 10. 7mm長さ 150mmのステン レスカラムにスラリー充填法で充填した。これ以降の操作は実施例 5に記載の方法と 全く同様の操作を行って、流速と圧力損失の関係を求めた。その結果流速が 6mlZ min (線流速 400cmZhr)を越えると流速と圧力損失の関係は直線力もずれ始め、 圧力の上昇が激しくなつた。そして、 lOmlZminの流速では圧力損失の影響が大き ぐ流せない状態であった。
[0154] 比較例 6
製造例 8で得られたアミノ化充填剤 8の耐アルカリ性の評価を、実施例 9に記載の 酸性タンパク質の溶出容量測定法に従って行った。その結果は以下の通りであった [0155] <酸性タンパク質の溶出容量 >
純水で洗浄したアミノ化充填剤 8の OVAの溶出容量は 7. 5ml、 STIの溶出容量は 15. 8mlであった。一方、水酸ィ匕ナトリウム溶液に 12週間浸漬したアミノ化充填剤 8 の OVAの溶出容量は 2. 5ml、 STIの溶出容量は 4. 4mlであった。水酸化ナトリウム 溶液に浸漬したアミノ化充填剤 8は OVAでマイナス 5. Oml、 STIでマイナス 11. 4ml 溶出容量が少なくなり、殆ど保持されなくなる事が判った。
[0156] 実施例 10
製造例 10で得られた親水化基材 10の親水性と耐アルカリ性を、実施例 1に記載の 方法に従って評価した。その結果、タンパク質の回収率は何れも 95%以上であり、 親水化基材 10は親水性が高い事を確認した。また、親水化基材 10のカルボキシル 基生成量は、基材 1リットル当たり 25. 5ミリ等量であった。
[0157] 実施例 11
製造例 11で得られた親水化基材 11の親水性と耐アルカリ性を、実施例 1に記載の 方法に従って評価した。その結果、タンパク質の回収率は何れも 95%以上であり、 親水化基材 11は親水性が高い事を確認した。また、親水化基材 11のカルボキシル 基生成量は、基材 1リットル当たり 28. 0ミリ等量であった。
[0158] 実施例 12
製造例 12で得られたアミノ化充填剤 12のイオン交換容量を、実施例 5に記載の方 法に従って測定した。その結果、アミノ化充填剤 12のイオン交換容量は、充填剤 1リ ットル当たり 75ミリ等量であった。また、アミノ化充填剤の耐アルカリ性を実施例 5に記 載の方法に従って評価した。その結果は以下の通りであった。
[0159] < 3八結合量>
純水に浸漬したアミノ化充填剤 12の BSA結合量は 34. 8mgZml、 12週間水酸化 ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤 12の BSA結合量は 29. OmgZmlであった。そ の差、すなわちアルカリによるタンパク質結合量の低下は 5. 8mgZmlと小さい事を 確認した。
[0160] <酸性タンパク質の溶出容量 >
純水に浸漬したアミノ化充填剤 12の OVAの溶出容量は 18. 2ml、 STIの溶出容 量は 27. 2mlであった。一方、 12週間水酸ィ匕ナトリウムに浸漬したアミノ化充填剤 12 の OVAの溶出容量は 16. 4ml、 STIの溶出容量は 24. 8mlであった。すなわちアル カリによって OVAで 1. 8ml、 STIで 2. 6ml溶出容量が減少することが判った。つまり 、アミノ化充填剤 12をアルカリ水溶液に浸漬しても保持力変化は少な ヽ事を確認し た。
[0161] 実施例 13
製造例 15で得られた 4級アンモ-ゥム化充填剤 15のイオン交換容量を、実施例 5 に記載の方法に従って測定した。その結果、 4級アンモ-ゥム化充填剤 15のイオン 交換容量は、充填剤 1リットル当たり 95ミリ等量であった。また、 4級アンモ-ゥム化充 填剤 15の耐アルカリ性を実施例 5に記載の方法に従って評価した。その結果は以下 の通りであった。
[0162] < 3八結合量>
純水に浸漬した 4級アンモ-ゥム化充填剤 15の BSA結合量は 43. 5mg/mU 12 週間水酸ィ匕ナトリウムに浸漬した 4級アンモ-ゥム化充填剤 15の BSA結合量は 37. 4mgZmlであった。その差、すなわち、アルカリによるタンパク質結合量の低下は 6. lmgZmlと小さ ヽ事を確認した。
[0163] <酸性タンパク質の溶出容量 >
純水に浸漬した 4級アンモ-ゥム化充填剤 15の OVAの溶出容量は 20. 4ml、 STI の溶出容量は 31. Omlであった。一方、 12週間水酸ィ匕ナトリウムに浸漬した 4級アン モ-ゥム化充填剤 15の OVAの溶出容量は 18. 4ml、 STIの溶出容量は 28. 1mlで あった。すなわち、アルカリによって OVAで 1. 8ml、 STIで 2. 6ml溶出容量が減少 することが判った。つまり、 4級アンモ-ゥム化充填剤 15をアルカリ水溶液に浸漬して も保持力変化は少な ヽ事を確認した。
[0164] 実施例 14
製造例 13で得られたスルフォン化充填剤 13のイオン交換容量を以下に示す方法 で測定した。すなわち、実施例 1に記載した要領で、スルフォンィ匕充填剤 13を 10ml 測り取り、これを 1N塩酸、純水の順によく洗浄し、 0. 1N水酸ィ匕ナトリウム水溶液によ る滴定で測定した。その結果、スルフォンィ匕充填剤 13のイオン交換容量は、充填剤 1 リットル当たり 90. 0ミリ等量 (pH7. 0)であった。
[0165] 次に、スルフォンィ匕充填剤 13の耐アルカリ性を以下に示す方法で評価した。すな わち、水酸化ナトリウム水溶液浸漬有りと無しのスルフォン化充填剤 13のイオン交換 容量を、 PH3. 5及び 8. 5においてそれぞれ測定し、 pH3. 5と pH8. 5間のイオン交 換容量差により、耐アルカリ性を評価した。つまり、（メタ)クロィル系モノマー重合体 力 なる充填剤では、スルフォン酸基は pH3. 5以下でほぼイオン化するが、カルボ ン酸基は PH3. 5以上でないとイオン化せず、 pH3. 5以上でイオン化を始め 8. 5ま でにほぼ完全にイオンィ匕する。したがって、 pH3. 5と 8. 5間のイオン交換容量差の 変化力もエステル加水分解で生じるカルボン酸量が測定できる。また、 pH3. 5のィ オン交換容量変化でスルフォン酸基の放出量が測定できる。なお、水酸ィ匕ナトリウム 水溶液浸漬の条件は、浸漬期間は 12週間とする以外は、実施例 1の親水化基材に おける耐アルカリ性の評価方法と同じ条件とした。
[0166] その結果、純水に浸漬したスルフォン化充填剤 13の、 pH3. 5及び 8. 5における充 填剤 1リットル当たりのイオン交換容量はそれぞれ 86. 2ミリ等量と 90. 5ミリ等量であ つた。一方、 12週間水酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬したスルフォンィ匕充填剤 13では、 p H3. 5及び 8. 5における充填剤 1リットル当たりのイオン交換容量はそれぞれ 85. 8ミ リ等量と 90. 8ミリ等量であった。したがって、スルフォン酸基の放出量及びカルボン 酸生成量はそれぞれ 0. 4ミリ等量と 5. 0ミリ等量と非常に少なぐスルフォンィ匕充填剤 13が安定である事が確認された。
[0167] 実施例 15
製造例 14で得られたカルボキシメチルイ匕充填剤 14のイオン交換容量を、実施例 1 4に記載の方法に従って測定した。その結果、カルボキシメチルイ匕充填剤 14のィォ ン交換容量は、充填剤 1リットル当たり 64. 5ミリ等量 (pH8. 5)であった。
[0168] 次に、該カルボキシメチルイ匕充填剤の耐アルカリ性を以下に示す方法で評価した。
すなわち、水酸ィ匕ナトリウム水溶液浸漬有りと無しのカルボキシメチルイ匕充填剤の pH 8. 5におけるイオン交換容量の変化で測定した。但し、この方法では、カルボキシメ チル基を含有するエステル基の加水分解によりカルボン酸が生成するため、充填剤 のアルカリ耐性を正確には測定できないと考えられる力 他に適当な方法がないため 、この方法で評価することとする。なお、水酸ィ匕ナトリウム水溶液浸漬の条件は、浸漬 期間を 12週間とする以外は、実施例 1の親水化基材における耐アルカリ性評価と同 じ条件とした。
[0169] その結果、純水に浸漬したカルボキシメチルイ匕充填剤 14の pH8. 5における充填 剤 1リットル当たりのイオン交換容量は 64. 5ミリ等量であった。一方、 12週間水酸ィ匕 ナトリウム溶液に浸漬したカルボキシメチルイ匕充填剤 14では、 64. 5ミリ等量であった 。すなわち、イオン交換容量には全く変化が無力つた。
[0170] 比較例 7
製造例 18で得られた 4級アンモ-ゥム化充填剤 18のイオン交換容量を、実施例 5 に記載の方法に従って測定した。その結果、 4級アンモ-ゥム化充填剤 18のイオン 交換容量は、充填剤 1リットル当たり 129ミリ等量であった。また、 4級アンモ-ゥム化 充填剤 18の耐アルカリ性を実施例 5に記載の方法に従って評価した。その結果は以 下の通りであった。
[0171] < BSA結合量 >
純水に浸漬した 4級アンモ-ゥム化充填剤 18の BSA結合量は 38. 8mg/mU 12 週間水酸ィ匕ナトリウムに浸漬した 4級アンモ-ゥム化充填剤 18の BSA結合量は 1. 4 mgZmlであった。 12週間水酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬した 4級アンモ-ゥム化充填 剤 18の吸着量は、マイナス 37. 4mgZmlもの大幅な低下を来たした事を確認した。
[0172] <酸性タンパク質の溶出容量 >
純水に浸漬した 4級アンモ-ゥム化充填剤 18の OVAの溶出容量は 21. 8ml、 STI の溶出容量は 33. 2mlであった。一方、 12週間水酸ィ匕ナトリウムに浸漬した 4級アン モ-ゥム化充填剤 18の OVAの溶出容量は 5. 6ml、 STIの溶出容量は 10. 2mlで あった。すなわちアルカリによって OVAでマイナス 16. 2ml、 STIでマイナス 23. Om 1と大幅に溶出容量が少なくなる事が判った。つまり、 4級アンモ-ゥム化充填剤 18を アルカリ水溶液に浸漬すると保持力は大幅に低下する事を確認した。
[0173] 比較例 8
製造例 16で得られたスルフォンィ匕充填剤 16のイオン交換容量を、実施例 14に記 載の方法に従って測定した。その結果、スルフォンィ匕充填剤 16のイオン交換容量は 、充填剤 1リットル当たり 95. 4ミリ等量 (pH7. 0)であった。
[0174] 次に、実施例 14に記載の方法に従ってスルフォン化充填剤 16の耐アルカリ性を評 価した。その結果、純水に浸漬したスルフォン化充填剤 16の、 pH3. 5及び 8. 5にお ける充填剤 1リットル当たりのイオン交換容量はそれぞれ 91. 2ミリ等量と 96. 4ミリ等 量であった。一方、 12週間水酸ィ匕ナトリウム溶液に浸漬したスルフォン化充填剤 16 では、 pH3. 5及び 8. 5における充填剤 1リットル当たりのイオン交換容量はそれぞれ 58. 6ミリ等量と 102. 8ミリ等量であった。したがって、スルフォン酸基の放出量及び カルボン酸生成量はそれぞれ 32. 6ミリ等量と 44. 2ミリ等量であり、多くのエステル 加水分解が起こりスルフォン酸基を含有するアルコールが放出された事が確認され た。
[0175] 比較例 9
製造例 17で得られたカルボキシメチルイ匕充填剤 17のイオン交換容量を、実施例 1 4に記載の方法に従って測定した。その結果、カルボキシメチルイ匕充填剤 17のィォ ン交換容量は、充填剤 1リットル当たり 68. 8ミリ等量 (pH8. 5)であった。
[0176] 次に、カルボキシメチルイ匕充填剤 17の耐アルカリ性を実施例 15に記載の方法に従 つて評価した。なお、水酸ィ匕ナトリウム水溶液浸潰の条件は、浸漬期間を 12週間とす る以外は、実施例 1における親水化基材の耐アルカリ性の評価方法と同じ条件とした
[0177] その結果、純水に浸漬したカルボキシメチルイ匕充填剤 17の pH8. 5における充填 剤 1リットル当たりのイオン交換容量は 68. 8ミリ等量であった。一方、 12週間水酸ィ匕 ナトリウム溶液に浸漬したカルボキシメチルイ匕充填剤 17では、 pH8. 5における充填 剤 1リットル当たりのイオン交換容量は 96. 4ミリ等量であった。すなわち、イオン交換 容量は 27. 6ミリ等量増加していた。この増加はカルボキシメチル基を含有しないェ ステル基の加水分解で新たにカルボン酸が生成したためであり、エステル基の加水 分解が進行して 、る事を示して 、る。
[0178] 以上の実施例、比較例の結果をそれぞれ表 4〜表 7に併せて示す。
[0179] [表 4] 表 4
Figure imgf000049_0001
5]
sffi0181 表 5
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
[表 7]
表 7
Figure imgf000051_0002
産業上の利用可能性 高速，高分離に適用可能な機械強度を有し、かつタンパク質に対して非特異的吸 着を引き起こさないために十分な親水性を有し、更に、高濃度のアルカリ水溶液に浸 潰してもタンパク質の吸着量、保持力等の変化の小さい新規充填剤が提供される。こ れらは水溶液に溶解した物質 (特にタンパク質)との吸着'脱着作用を示し、目的物 質の捕集や液体クロマトグラフィー法に利用できる。 なお、 2005年 6月 9日に出願された日本特許出願 2005— 169111号の明細書、 特許請求の範囲、及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示とし て、取り入れるものである。

Claims

請求の範囲 [1] 下記式（1) [化 1] RIC II 2 = C ( 1 ) C一 R 1 (
[式（1)中、 R2は水素原子又は炭素数 1〜4のアルキル基を表す。 R1は—NR3—R4 ー 又はー0—1^4ー を表す。 R3は水素原子又は炭素数 1〜4のアルキル基を表 す。 R4は脂肪族環を含む炭素数 6〜 15のアルキレン基、又は炭素数 4〜8の直鎖ァ ルキレン基を表す。 R5は、ハロゲン原子、アルコール性 OH基、アミノ基、グリシジル 基又はエポキシ基を表す。ここで、 R5がエポキシ基の場合、当該エポキシ基は、 R4中 に含有される脂肪族環の一部に直接エポキシ基が導入されていても、脂肪族環にぺ ンダント型に付カ卩していてもよい。また、 R5がグリシジル基の場合は、グリシジルエー テルの形で R4に結合する。 ]で示される (メタ)アタリロイル系モノマーから誘導される 繰り返し単位を 20〜95mol%含有する架橋重合体粒子力もなることを特徴とする充 填剤。
[2] 上記式（1)で示される (メタ)アタリロイル系モノマーから誘導される繰り返し単位を 2
O〜95mol%と、多官能性モノマー力 誘導される繰り返し単位を 80〜5mol%と、を 含有する架橋重合体粒子力 なる請求項 1に記載の充填剤。
[3] 上記式（1)で示される (メタ)アタリロイル系モノマーと多官能性モノマーとを重合し て得られる架橋重合体粒子力 なる請求項 1又は 2に記載の充填剤。
[4] 下記式 (2)
[化 2] R 2
I
一 C H 2 _ C - ( 2 )
C = O
I
R 1
[式（2)中、 R2は水素原子又は炭素数 1〜4のアルキル基を表す。 R1は— NR3—R4 一 R5又は一 O— R4— R5を表す。 R3は水素原子又は炭素数 1〜4のアルキル基を表 す。 R4は脂肪族環を含む炭素数 6〜； 15のアルキレン基、又は炭素数 4〜8の直鎖ァ ルキレン基を表す。 R5は、ハロゲン原子、アルコール性 OH基、アミノ基、グリシジル 基又はエポキシ基を表す。ここで、 R5がエポキシ基の場合、当該エポキシ基は、 R4中 に含有される脂肪族環の一部に直接エポキシ基が導入されていても、脂肪族環にぺ ンダント型に付カ卩していてもよレ、。また、 R5がグリシジル基の場合は、グリシジルエー テルの形で R4に結合する。 ]で示される繰り返し単位を 20〜95mol%と、 下記式（3)
[化 3]
R 5
— C H 2— C -
I
R 8 ( 3 )
I
- C H 2 - C -
I
R 7
[式（3)中、 R6、 R7は各々独立して水素原子又は炭素数 1〜3のアルキル基を表し、 R8はァリール基、ォキシカルボ-ル基又は力ルバモイル基を有する 2官能性の有機 基を表す。 ]で示される繰り返し単位を 80〜5mol%と、を含有する架橋重合体粒子 からなることを特徴とする充填剤。
[5] 架橋重合体粒子が、平均粒子径が 5〜300 μ mの多孔性粒子である請求項 1乃至 4の 、ずれかに記載の充填剤。
[6] 上記式（1)で示される (メタ)アタリロイル系モノマー 20〜95mol%と架橋剤とを含 有するモノマー混合物、及び懸濁安定剤を水相に懸濁させ、重合する請求項 1乃至 5の 、ずれかに記載の充填剤の製造方法。
[7] 上記式（1)で示される (メタ）アタリロイル系モノマー 20〜95mol%と多官能性モノ マー 80〜5mol%とを含有するモノマー混合物、及び懸濁安定剤を水相に懸濁させ 、重合する請求項 1乃至 5のいずれかに記載の充填剤の製造方法。
[8] 上記式（1)で示される（メタ）アタリロイル系モノマー力 3, 4 エポキシシクロへキ シノレメチノレメタタリレート、 1, 3 ヒドロキシァダマンタン 1 メタタリレート、 1, 4ーシ クロへキサンジメタノールモノアタリレート、 1, 4ーヒドロキシブチルアタリレート、 4ーヒ ドロキシブチルアタリレートグリシジルエーテル、 4 ブロモブチルメタタリレート、及び 6 ァミノへキシルメタクリルアミドからなる群より選ばれる 1種又は 2種以上である請 求項 6又は 7に記載の充填剤の製造方法。
[9] 多官能性モノマーが、エチレングリコールジメタタリレート、 1, 3 ァダマンタンジメ タクリレート、ジビュルベンゼン、及びトリメチロールプロパントリアタリレートからなる群 より選ばれる 1種又は 2種以上である請求項 7に記載の充填剤の製造方法。
[10] その粒子表面に親水性基を有する請求項 1乃至 5のいずれかに記載の充填剤。
[11] 請求項 1乃至 5のいずれかに記載の充填剤に親水化剤を作用させて得られる請求 項 10に記載の充填剤。
[12] 標準物質としてプルラン、溶離液として純水を使用した場合の排除限界分子量が、
50万〜 200万である請求項 10又は 11に記載の充填剤。
[13] その粒子表面にイオン交換基を有する請求項 1乃至 5、 10乃至 12のいずれかに記 載の充填剤。
[14] 請求項 1乃至 5の ヽずれかに記載の充填剤を形成する架橋重合体粒子に含まれる エポキシ基を開環させてイオン交換基が導入された請求項 13に記載の充填剤。
[15] 請求項 10乃至 12のいずれかに記載の充填剤を形成する架橋重合体粒子をェポ キシィ匕した後、該エポキシ基を開環させてイオン交換基が導入された請求項 13に記 載の充填剤。
[16] イオン交換基が、スルフォン酸基、カルボキシル基、第 1級ァミノ基、第 2級ァミノ基 、第 3級ァミノ基、及び 4級アンモ-ゥム基力 なる群より選ばれる少なくとも 1種である 請求項 13乃至 15のいずれかに記載の充填剤。
[17] 請求項 13乃至 16に記載の充填剤をクロマトグラフィー用充填剤として用いるタンパ ク質の分離方法。
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