KR101297282B1 - 친수성이 우수한 신규 충전제 및 그 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고속·고분리에 적합하고 또 친수성이 풍부하며, 고농도의 알칼리 수용액에 내성이 있는 충전제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 의하면, 하기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머로부터 유도되는 반복 단위를 20 내지 95 몰% 함유하는 것을 특징으로 하는 가교 중합체 입자로 이루어진 충전제가 제공된다:
[화학식 1]
Figure 112007086925225-pct00007
[화학식 1 중, R2는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고; R1은 -NR3-R4-R5 또는 -O-R4-R5를 나타내며; R3는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고; R4는 지방족 고리를 포함하는 탄소수 6 내지 15의 알킬렌기 또는 탄소수 4 내지 8의 직쇄 알킬렌기를 나타내며; R5는 할로겐 원자, 알코올성 OH기, 아미노기, 글리시딜기 또는 에폭시기를 나타낸다].
(메타)아크릴로일계 모노머, 가교 중합체, 충전제

Description

친수성이 우수한 신규 충전제 및 그 제조 방법{NOVEL PACKING MATERIAL WITH EXCELLENT HYDROPHILICITY AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}
본 발명은 수용액에 용해된 물질(특히 단백질)과의 흡착·탈착 작용을 나타내고, 목적 물질의 포집이나 액체 크로마토그래피법에 의해 분리, 정제하기 위해 바람직한 유기 화합물로 이루어진 충전제에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 고농도의 알칼리 수용액에 대하여 화학적 안정성이 높고, 친수성이 우수하며, 단백질의 분리, 정제에 이용할 수 있는 신규 충전제에 관한 것이다.
단백질의 흡착, 분리, 정제에 사용되는 크로마토그래피용 충전제로서는, 실리카 화합물 등으로 대표되는 무기계 충전제와, 유기 폴리머로 이루어진 유기계 충전제가 있다. 유기계 충전제는 스타이렌, (메타)아크릴산 에스터, (메타)아크릴아마이드계로 대표되는 합성 화합물을 이용하는 합성계 충전제와 아가로스, 덱스트란, 만난 등으로 대표되는 천연의 다당류를 이용하는 천연계 충전제로 대별된다.
합성계 충전제는, 예를 들면 특허문헌 1 내지 3에 개시되어 있는 바와 같이, 글리시딜 메타크릴레이트와 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트와 같은 단관능성 모노머와 다관능성 모노머의 혼합액을 이용해서, 현탁중합법 등에 의해 제조되고, 그 후에 수용성의 다가 알코올 등으로 친수화를 행하여 기재(基材)를 제조하는 것 이 일반적이다. 최근의 합성계 충전제에 있어서의 친수화 기술의 진보에 의해, 친수성의 점에서는 천연계와 손색없는 합성계 충전제를 제조하는 방법이 발견되어 있다. 또한, 일반적으로는, 단관능성 모노머와 다관능성 모노머를 이용하고, 현탁중합에서 입자를 제조하는 방법 때문에, 다관능성 모노머의 첨가량의 조정으로 단단한 충전제로부터 연한 충전제까지 자유롭게 설계할 수 있는 이점을 가지고 있다. 단, 단단하고, 또한, 취성이 없는 충전제를 제조하고자 하는 관점에서, 합성계 충전제의 경우, 용이하게 고분자량의 중합물을 얻을 수 있는 (메타)아크릴 에스터계 또는 (메타)아크릴아마이드계 모노머를 이용해서 충전제를 제조하는 것이 일반적으로 행해지고 있다. 게다가, 입자화 후, 단백질과 상호작용하는 리간드를 부착하기 쉽다는 점에서, 반응의 기점이 되는 글리시딜기를 가진, 소위, 글리시딜 메타크릴레이트(GMA) 모노머를 이용한 충전제가 많이 제안되어 있다.
전술한 바와 같이, 이들 충전제의 주요 용도는 액체 크로마토그래피법에 의한 단백질의 분리 정제이다. 정제된 단백질의 주요 용도로서 의약품(주사용 단백질 제제)이 있고, 이 분야에서는 오염물질의 오염에 의한 부작용의 위험을 철저하게 배제하는 것이 요구되고 있다.
혼입할 가능성이 있는 오염물질로서는,
(1) 목적 단백질 생산 공정 유래의, 예를 들면 배양액이나 혈청 등에 함유하는 이종 단백질, 핵산, 내독소, 바이러스;
(2) 생산이나 보존에 필요한 첨가물 등의 성분과 정제 공정에서 사용하는 기구, 충전제, 분리막, 용액 등으로부터의 오염 성분;
(3) 전회의 정제로 충전제에 흡착되어 용출되지 않았던 성분
등을 고려할 수 있다.
충전제는 칼럼에 충전되어, 정제 공정에서 이용될 수 있지만, 첫회의 사용전 및 재사용 전에 검증된 세정 방법으로 반드시 세정된다. 가장 일반적인 정제 공정의 장치 내부의 세정 방법은, 1N 수산화 나트륨에 의한 세정이다. 이것은 단백질, 내독소 등을 분해 세정할 수 있기 때문이다. 이 세정 방법은 미국 식품의약품국으로부터의 지침(가이드 라인)으로서 권장되고 있고, 첫회 및 재사용시에도 유효한 방법이다. 즉, 사용 배취(batch) 마다 칼럼 장치 내부를 세정하는 것이 의약용 단백질 정제를 행하는 GMP 시설에서는 일반적으로 행해지고 있다. 또, 배취 간격이 있을 경우에는, 0.01N로부터 0.1N로 희석된 수산화 나트륨 수용액을 봉입해서 장치를 멈추어 둘 경우도 있다. 더욱, 프리온 등의 이상 단백질의 제거를 행하기 위해서는, 보다 고농도(예를 들면, 2N의 농도)의 수산화 나트륨 수용액으로 세정하는 것도 필요하다.
그런데, GMA 모노머는 높은 친수성을 나타내는 에스터 부위를 갖고 있기 때문에, 알칼리성 약품과의 장시간의 접촉에 의해 에스터의 가수분해가 진행하고, 알코올 화합물이 방출되어 카복실산이 생성된다. 방출된 알코올 화합물을 세정에 의해 완전하게 제거할 수 있다면 문제없지만, 제거할 수 없다면, 그것이 오염물질로 될 가능성이 있다. 또, 카복실산의 생성에 의해, 본래의 충전제 성능이 변화되어, 분리 정제의 재현성을 잃어버릴 수 있기 때문에 순도불량이 발생한다. 즉, 알칼리 내성이 약한 충전제에서는 단지 성능 열화에 의해 사용가능한 기간이 짧을 뿐만 아 니라, 미지의 용출물의 발생 위험과 정제 조작시의 용출에 의한 오염 위험 및 성능 열화에 의한 순도불량의 발생 등의 과제를 내포하고 있다.
이상과 같이 합성계 충전제는, 단단하기(기계 강도가 높기) 때문에, 고속·고분리에 적합하다고 하는 이점을 갖고, 친수성이 높다고 하는 이점을 갖는 한편, 더욱 알칼리 내성을 가진 합성계 충전제의 개발이 기대되고 있는 것이 현상황이다.
특허문헌 1: 일본국 공고특허 소58-058026호 공보
특허문헌 2: 일본국 공개특허 소53-090991호 공보
특허문헌 3: 일본국 공개특허 평05-009233호 공보
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 기술적 과제
본 발명은 상기 과제를 감안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은 고속·고분리에 적합하고, 친수성이 풍부하고, 또한, 고농도의 알칼리 수용액에 내성이 있는 충전제를 제공하는 것이다. 보다 상세하게는, 고속·고분리에 적용가능한 기계 강도를 갖고, 또, 단백질에 대해서 비특이적 흡착을 야기하지 않으므로 충분한 친수성을 갖고, 또한, 고농도의 알칼리 수용액에 침지해도 단백질의 흡착량, 보유력 등의 변화가 작은 신규 충전제를 제공하는 것이다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, 중합성을 나타내는 (메타)아크릴로일 화합물 내, 특정한 구조를 가진 화합물을 모노머로서 이용한 충전제는 알칼리 내성을 지니고 있는 것을 발견하였다. 본 발명은 이들 지견에 의거해서 완성된 것이다.
즉, 본 발명은 이하에 나타낸 바와 같은, 친수성이 우수한 신규 충전제, 그 제조 방법 및 그것을 이용한 단백질의 분리 방법이다.
[1] 하기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머로부터 유도되는 반복 단위를 20 내지 95 몰% 함유하는 가교중합체 입자로 이루어진 것을 특징으로 하는 충전제:
Figure 112007086925225-pct00001
[화학식 1 중, R2는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고; R1은 -NR3-R4-R5 또는 -O-R4-R5를 나타내며; R3는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고; R4는 지방족 고리를 포함하는 탄소수 6 내지 15의 알킬렌기 또는 탄소수 4 내지 8의 직쇄 알킬렌기를 나타내며; R5는 할로겐 원자, 알코올성 OH기, 아미노기, 글리시딜기 또는 에폭시기를 나타내고; 여기서, R5가 에폭시기인 경우, 상기 에폭시기는 R4 중에 함유되는 지방족 고리의 일부에 직접 에폭시기가 도입되어 있어 도 되고, 지방족 고리에 펜던트(pendant)형으로 부가되어 있어도 되며, 또한 R5가 글리시딜기인 경우에는, 글리시딜 에터의 형태로 R4에 결합한다].
[2] 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머로부터 유도되는 반복 단위를 20 내지 95 몰%와, 다관능성 모노머로부터 유도되는 반복 단위를 80 내지 5 몰% 함유하는 가교중합체 입자로 이루어진 상기 [1]항에 기재된 충전제.
[3] 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머와 다관능성 모노머를 중합해서 얻어지는 가교중합체 입자로 이루어진 상기 [1]항 또는 [2]항에 기재된 충전제.
[4] 하기 화학식 2로 표시되는 반복 단위를 20 내지 95 몰%와 하기 화학식 3으로 표시되는 반복 단위를 80 내지 5 몰% 함유하는 가교중합체 입자로 이루어진 것을 특징으로 하는 충전제:
Figure 112007086925225-pct00002
[화학식 2 중, R2는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고; R1은 -NR3-R4-R5 또는 -O-R4-R5를 나타내며; R3는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고; R4는 지방족 고리를 포함하는 탄소수 6 내지 15의 알킬렌기 또는 탄소수 4 내지 8의 직쇄 알킬렌기를 나타내며; R5는 할로겐 원자, 알코올성 OH기, 아미노기, 글리시딜기 또는 에폭시기를 나타내고; 여기서, R5가 에폭시기인 경우, 상기 에폭시기는 R4 중에 함유되는 지방족 고리의 일부에 직접 에폭시기가 도입되어 있어도 되고, 지방족 고리에 펜던트형으로 부가되어 있어도 무방하며, 또한 R5가 글리시딜기인 경우에는, 글리시딜 에터의 형태로 R4에 결합한다]
Figure 112007086925225-pct00003
[화학식 3 중, R6 및 R7은 각각 독립하여 수소원자 또는 탄소수 1 내지 3의 알킬기를 나타내고, R8은 아릴기, 옥시카보닐기 또는 카바모일기를 갖는 2관능성의 유기기를 나타낸다].
[5] 가교중합체 입자는 평균 입자 직경이 5 내지 300 ㎛인 다공성 입자인 상기 [1]항 내지 [4]항 중 어느 한 항에 기재된 충전제.
[6] 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머 20 내지 95 몰%와 가교제를 함유하는 모노머 혼합물 및 현탁 안정제를 수상에 현탁시켜 중합하는, 상기 [1]항 내지 [5]항 중 어느 한 항에 기재된 충전제의 제조 방법.
[7] 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머 20 내지 95 몰%와 다관능성 모노머 80 내지 5몰%를 함유하는 모노머 혼합물 및 현탁 안정제를 수상에 현탁시켜 중합하는, 상기 [1]항 내지 [5]항 중 어느 한 항에 기재된 충전제의 제조 방법.
[8] 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머는 3,4-에폭시사이클로헥실메틸 메타크릴레이트, 1,3-하이드록시아다만탄-1-메타크릴레이트, 1,4-사이클로헥세인다이메탄올 모노아크릴레이트, 1,4-하이드록시부틸아크릴레이트, 4-하이드록시부틸아크릴레이트 글리시딜에터, 4-브로모부틸메타크릴레이트 및 6-아미노헥실메타크릴아마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상인 상기 [6]항 또는 [7]항에 기재된 충전제의 제조 방법.
[9] 다관능성 모노머는 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트, 1,3-아다만탄 다이메타크릴레이트, 다이비닐벤젠 및 트라이메틸올프로페인 트라이아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상인 상기 [7]항에 기재된 충전제의 제조 방법.
[10] 그 입자 표면에 친수성 기를 가진 상기 [1]항 내지 [5]항 중 어느 한 항에 기재된 충전제.
[11] 상기 [1]항 내지 [5]항 중 어느 한 항에 기재된 충전제에 친수화제를 작용시켜서 얻어지는 상기 [10]항에 기재된 충전제.
[12] 표준물질로서 풀루란, 용리액으로서 순수를 사용한 경우의 배제한계분자량이 50만 내지 200만인 상기 [10]항 또는 [11]항에 기재된 충전제.
[13] 그 입자 표면에 이온교환기를 갖는 상기 [1]항 내지 [5]항 및 [10]항 내지 [12]항 중 어느 한 항에 기재된 충전제.
[14] 상기 [1]항 내지 [5]항 중 어느 한 항에 기재된 충전제를 형성하는 가교중합체 입자에 포함되는 에폭시기를 개환시켜 이온교환기가 도입된 상기 [13]항에 기재된 충전제.
[15] 상기 [10]항 내지 [12]항 중 어느 한 항에 기재된 충전제를 형성하는 가교중합체 입자를 에폭시화한 후, 상기 에폭시기를 개환시켜 이온교환기를 도입한 상기 [13]항에 기재된 충전제.
[16] 상기 이온교환기는 설폰산기, 카복실기, 제 1급 아미노기, 제 2급 아미노기, 제 3급 아미노기 및 4급 암모늄기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인 상기 [13]항 내지 [15]항 중 어느 한 항에 기재된 충전제.
[17] 상기 [13]항 내지 [16]항 중 어느 한 항에 기재된 충전제를 크로마토그래피용 충전제로서 이용하는 단백질의 분리 방법.
발명의 효과
본 발명의 충전제는 단단하고, 기계강도가 높기 때문에 고속에서의 사용이 가능해서, 고농도의 알칼리 수용액에 대한 화학적 안정성이 높다.
또한, 본 발명의 충전제의 반응의 기점에 치환기를 도입함으로써 친수성이 우수한 충전제나, 이온교환기를 갖는 충전제를 용이하게 조제할 수 있고, 단백질의 분리·정제에 바람직하다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
우선, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머로부터 유도되는 반복 단위를 20 내지 95 몰% 함유하는 가교중합체 입자로 이루어진 것을 특징으로 하는 충전제[이하, 충전제(1)이라고 칭함]에 관하여 설명한다.
본 발명에 있어서, 충전제(1)로서는, 특히 한정되는 것이 아니지만, 예를 들어, 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머로부터 유도되는 반복 단위를 20 내지 95 몰%와, 다관능성 모노머로부터 유도되는 반복 단위를 80 내지 5 몰% 함유하는 가교중합체 입자로 이루어진 충전제를 바람직한 것으로서 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 화학식 2로 표시되는 반복 단위를 20 내지 95 몰%와, 상기 화학식 3으로 표시되는 반복 단위를 80 내지 5 몰% 함유하는 가교중합체 입자로 이루어진 충전제를 바람직한 것으로서 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 충전제(1)의 제조 방법으로서는 특히 한정되지 않고, 예를 들어, 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머 20 내지 95 몰%와 가교제를 함유하는 모노머 혼합물 및 현탁 안정제를 수상에 현탁시켜 중합함으로써 제조할 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머 20 내지 95 몰%와 가교제로서 사용되는 다관능성 모노머 80 내지 5 몰% 를 함유하는 모노머 혼합물 및 현탁 안정제를 수상에 현탁시켜 중합함으로써 제조할 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머를 이용한 충전제(1)의 일반적인 제법을 이하에 설명하지만, 제법은 이것으로 한정되는 것은 아니다. 우선, 미리 연속 상으로서 예를 들어 증류수에 소정의 계면활성제, 더욱 필요에 따라 무기염을 첨가하고, 양호하게 교반해서 용해시켜, 수용액으로 한다. 그 후, 상기 수용액을 소정의 온도까지 승온한다. 다음에, 본 발명의 (메타)아크릴로일계 모노머, 가교제로서 사용하는 다관능성 모노머, 중합개시제, 더욱 필요가 있다면 다른 모노머 및 세공조절목적으로 첨가하는 유기용매 등을 각각 소정량 취하여, 조정 혼합액을 만든다. 그리고, 교반되고 있는 계면활성제가 주입된 수용액 중에 상기 조정 혼합액을 적하해서 액적화를 행함과 동시에, 소정의 온도로 중합을 행하여, 중합체 입자를 제조한다. 이때의 중합온도에 대해서, 중합개시제가 분해되어, 라디칼이 발생하는 온도이면 특히 제한은 없다. 일반적으로, 20℃ 내지 80℃, 더욱 바람직하게는 40℃ 내지 70℃의 범위 내에서 중합을 행하면 된다.
본 발명의 충전제(1)에 이용될 수 있는 (메타)아크릴로일계 모노머는, 상기 화학식 1에 해당하고, 가교중합체 입자화 후에 치환기를 도입하기 위한 반응의 기점을 가진 (메타)아크릴로일계 모노머이면, 특히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 4-하이드록시부틸(메타)아크릴레이트 글리시딜에터, 6-클로로헥실(메타)아크릴레이트, 4-브로모부틸(메타)아크릴레이트, 4-하이드록시부틸(메타)아크릴레이트, 하이드록시펜틸(메타)아크릴레이트, 6-아미노헥실(메타)아크릴아마이드, 3,4-에폭 시사이클로헥실메틸(메타)아크릴레이트, 3,4-다이하이드록시사이클로헥실메틸(메타)아크릴레이트 및 그들의 다이하이드록시기의 일부 또는 전부가 글리시딜기로 치환된 화합물; 3,4-에폭시사이클로헥실에틸(메타)아크릴레이트, 3,4-다이하이드록시사이클로헥실에틸(메타)아크릴레이트 및 그의 다이하이드록시기의 일부 또는 전부가 글리시딜기로 치환된 화합물; 3,4-에폭시사이클로헥실프로필(메타)아크릴레이트, 3,4-다이하이드록시사이클로헥실프로필(메타)아크릴레이트 및 그의 다이하이드록시기의 일부 또는 전부가 글리시딜기로 치환된 화합물; 2,5-비스(아미노메틸)바이사이클로[2,2,1]헵테인의 한쪽의 아미노기와 (메타)아크릴할라이드와의 반응물; 2,5-비스(하이드록시메틸)바이사이클로[2,2,1]헵테인의 한쪽의 하이드록시기와 (메타)아크릴 할라이드와의 반응물; 2,6-비스(아미노메틸)바이사이클로[2,2,1]헵테인의 한쪽의 아미노기와 (메타)아크릴 할라이드와의 반응물; 2,6-비스(하이드록시메틸)바이사이클로[2,2,1]헵테인의 한쪽의 하이드록시기와 (메타)아크릴 할라이드와의 반응물; 1,3-다이하이드록시아다만탄의 한쪽의 하이드록시기와 (메타)아크릴할라이드와의 반응물; 1,3-다이아미노아다만탄의 한쪽의 아미노기와 (메타)아크릴 할라이드와의 반응물 등을 들 수 있다. 또한, 상기 (메타)아크릴로일계 모노머를 단독으로 사용해도, 혼합해서 사용해도 무방하다.
본 발명의 충전제(1)에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머의 비율은, 전체 모노머 중에 있어서, 보통 20 몰% 이상 95 몰% 이하의 범위, 바람직하게는 30 몰% 이상 93몰% 이하의 범위이다. 이 비율이 바람직한 이유로서는, (메타)아크릴로일계 모노머가 20 몰% 미만이면, 다음과 같은 문제점이 있는 것에 연유한다. (a) 알칼리에 대한 안정성이 낮아지고, (b) 생성 입자 중의 치환기를 도입하기 위한 반응의 기점이 적어지고, 친수화제로 친수성을 부여해도 단백질 등의 분리에 필요한 친수성을 얻을 수 없으며, (c) 95 몰%보다 비율이 크다면 가교제로서 공중합하는 다관능성 모노머의 비율이 지나치게 작아, 충전제가 유연해지는 등이다.
본 발명의 충전제(1)에 이용할 수 있는 다관능성 모노머로서는, 특히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어, 다이비닐벤젠; 탄소수가 1 내지 4인 알킬렌글라이콜의 반복 유닛이 1 내지 5인 알킬렌글라이콜 다이(메타)아크릴레이트류; 알킬렌(탄소수 1 내지 11) 비스(메타)아크릴레이트류; 알킬렌(탄소수 1 내지 11) 비스(메타)아크릴아마이드류 등을 들 수 있다. 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머와 공중합될 수 있으면 다관능성 모노머는 이들로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 (메타)아크릴로일계 모노머를 합성할 때, 부생하고 있는 2관능성 화합물을 가교제로서 공중합하는 다관능성 모노머로서 사용해도 된다. 다관능성 모노머로서 구체적인 화합물을 예시하면, 다이비닐벤젠, 다이비닐톨루엔, 다이비닐자일렌, 1,3-아다만탄 다이메타크릴레이트, 에틸렌글라이콜 다이(메타)아크릴레이트, 다이에틸렌글라이콜 다이(메타)아크릴레이트, 트라이에틸렌글라이콜 다이(메타)아크릴레이트, 폴리에틸렌글라이콜 다이(메타)아크릴레이트, 글리세롤 다이(메타)아크릴레이트, 트라이메틸올 트라이(메타)아크릴레이트, 에틸렌비스아크릴아마이드 등을 들 수 있다.
본 발명의 충전제(1)에 있어서, 다관능성 모노머의 비율은 특히 한정되는 것 은 아니지만, 전체 모노머 중에 있어서, 통상 5몰% 이상 80 몰% 이하의 범위, 바람직하게는 7몰% 이상 70 몰% 이하의 범위이다. 이 비율이 바람직한 이유로서는, 다관능성 모노머가 5몰% 미만이면 충전제에 충분한 경도를 얻을 수 없고, 높은 압력에서는 충전제가 찌부러져 버릴 가능성이 있다. 또, 가교제가 80 몰% 이상으로 되면, 생성 입자 중의 치환기를 도입하기 위한 반응의 기점이 적어지고, 친수화제로 친수성을 부여해도 단백질 등의 분리에 필요한 친수성을 얻을 수 없다. 더욱, 알칼리에 대한 안정성이 낮아지는 것에 부가해서, 충전제가 무르게 될 경우가 있어, 칼럼에의 충전 작업이나 교반중 등에 미립자가 발생하는 등의 문제가 일어난다.
본 발명의 충전제(1)에 있어서는, 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머, 전술한 다관능성 모노머에 부가해서, 본 발명의 취지를 일탈하지 않는 범위에서, 그들 이외의 다른 모노머를 사용할 수도 있다. 이와 같은 다른 폴리머로서는, 예를 들어, 하이드록시에틸(메타)아크릴레이트, 하이드록시프로필(메타)아크릴레이트, 글리시딜(메타)아크릴레이트, 탄소수 1 내지 3으로 이루어진 직쇄형상 또는 분기형상 알킬(메타)아크릴레이트류 등의 (메타)아크릴레이트 화합물; 하이드록시에틸(메타)아크릴아마이드, 하이드록시프로필(메타)아크릴아마이드, 하이드록시부틸(메타)아크릴아마이드, 탄소수 1 내지 3으로 이루어진 직쇄형상 또는 분기형상 알킬(메타)아크릴아마이드류 등의 중합성 (메타)아크릴아마이드 화합물; 아릴아민, 아릴클로라이드, 아릴글리시딜에터 등의 중합성 아릴 화합물; 할로알킬(탄소수 1 내지 4)비닐에터, 하이드록시알킬(탄소수 1 내지 4)비닐에터, 아세트산 비닐 등의 중합성 비닐 화합물 등을 들 수 있다. 병용되는 다른 모노머는 본 발명의 기능을 만족시킨다면, 특히 한정되는 것은 아니다. 또한, 병용되는 다른 모노머는 단독 사용으로도, 혼합 사용으로도 가능하다.
본 발명의 충전제(1)의 제조시 이용할 수 있는 중합개시제로서는, 예를 들어 통상의 현탁중합에서 사용되는 유기 과산화물이나 아조계 화합물 등을 들 수 있다. 상기 유기 과산화물로서, 부틸퍼옥사이드계로는, t-부틸퍼옥시네오데카노에이트, t-부틸퍼옥시2-에틸헥사노에이트, t-부틸퍼옥시아이소부티레이트, 2,5-다이메틸-2,5-다이(벤조일퍼옥시)헥세인, t-부틸퍼옥시아세테이트, t-부틸퍼옥시벤조에이트 등을 들 수 있다. 아밀퍼옥사이드계에서는, t-아밀퍼옥시2-에틸헥사노에이트, t-아밀퍼옥시n-옥토에이트, t-아밀퍼옥시아세테이트, t-아밀퍼옥시벤조에이트 등을 들 수 있다. 퍼옥시카보네이트계에서는, t-부틸퍼옥시아이소프로필카보네이트, t-부틸퍼옥시2-에틸헥실카보네이트, t-아밀퍼옥시2-에틸헥실카보네이트, 다이(2-에틸헥실)퍼옥시다이카보네이트, 다이(sec-부틸)퍼옥시다이카보네이트 등을 들 수 있다. 다이알킬퍼옥사이드계에서는, 다이큐밀퍼옥사이드, 2,5-다이메틸2,5-다이(t-부틸퍼옥시)헥세인, 다이-t-부틸퍼옥사이드, 다이-t-아밀퍼옥사이드 등을 들 수 있다. 또한, 퍼옥시케탈계에서는, 1,1-다이(t-부틸퍼옥시)사이클로헥세인, 2,2-다이(t-부틸퍼옥시)부테인, 에틸-3,3-다이(t-부틸퍼옥시)부틸레이트, 1,1-다이(t-아밀퍼옥시)사이클로헥세인 등을 예시할 수 있다.
한편, 아조계 화합물로서, 아조나이트릴계에서는, 2,2'-아조비스(4-메톡시-2,4-다이메틸발레로나이트릴), 2,2'-아조비스(2,4-다이메틸발레로나이릴), 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오나이트릴), 2,2'-아조비스(2-메틸부티로나이트릴), 1,1'-아 조비스(사이클로헥세인-1-카보나이트릴) 등을 들 수 있다. 아조아마이드계로는, 2,2'-아조비스[N-(2-프로페닐)-2-메틸프로피온아마이드], 2,2'-아조비스[N-부틸-2-메틸프로피온아마이드], 2,2'-아조비스[N-시클로헥실-2-메틸프로피온아마이드] 등을 들 수 있다. 또한, 다른 아조계 화합물에서는, 2,2'-아조비스(2-메틸프로피온아마이드옥심), 다이메틸2,2'-아조비스(2-메틸프로피오네이트), 4,4'-아조비스(4-사이아노발레르산), 2,2'-아조비스(2,4,4-트라이메틸펜테인) 등을 예시할 수 있다. 단, (메타)아크릴로일계 모노머를 중합시킬 수 있는 중합개시제이면 사용가능하며, 특히 상기 화합물로 한정되는 것은 아니다. 이러한 중합개시제의 첨가량은, 지나치게 적으면 중합률이 저하하고, 모노머가 다수 잔존하는 일이 있다. 지나치게 많으면, 중합개시제가 중합체 입자 속에 잔존하고, 단백질 등의 흡착 분리에 악영향을 주는 일이 있다. 따라서, 통상은 전체 모노머에 대하여, 0.05중량% 내지 20중량%의 범위에서 사용되며, 더욱 바람직하게는 0.2중량% 내지 10중량%의 범위에서 사용된다.
본 발명에 있어서, 현탁중합에 이용할 수 있는 현탁 안정제로서는, 연속 상에 용해되는 계면활성제이면 되고, 특히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 음이온 계면활성제, 양이온 계면활성제, 비이온 계면활성제 등을 들 수 있고, 어느 쪽도 사용가능하다. 또한, 현탁 안정제의 분자량에 관해서도, 특히 한정되지 않고, 저분자 화합물로도 고분자 화합물로도 사용할 수 있다. 구체적인 예로서는, 음이온 계면활성제로서는, 지방산염, 고급 알코올의 황산 에스터염, 지방 알코올의 인산 에스터염, 알킬아릴 설폰산염, 포르말린 축합 나프탈렌 설폰산염 등을 들 수 있 다. 양이온 계면활성제로서는, 알킬 1급 아민염, 알킬 2급 아민염, 알킬 3급 아민염, 알킬 4급 암모늄염, 피리디늄염 등을 들 수 있다. 비이온 계면활성제로서는, 폴리옥시에틸렌 알킬에터류, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에터류, 폴리옥시에틸렌 알킬에스터류, 솔비탄 알킬에스터류, 폴리옥시에틸렌 솔비탄알킬에스터류 등을 들 수 있다. 한편, 고분자 계면활성제로서는, 부분 비누화 폴리비닐알코올, 전분, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 부분 비누화 폴리메타크릴산염 등이 예시된다. 본 발명에 있어서는, 이들 계면활성제에 가해서, 필요에 따라, 무기염, 예를 들면 황산바륨, 황산칼슘, 황산알루미늄, 탄산칼슘, 탤크 등을 더욱 첨가해도 무방하다. 상기 현탁 안정제의 첨가량은, 특히 한정되는 것은 아니지만, 연속 상에 대하여 통상 0.01 중량% 내지 30 중량%의 범위, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 15 중량%의 범위이다.
그런데, 크로마토그래피용의 충전제에는, 흡착 부하량이 비교적 많은 다공성 충전제와, 세공 내에서의 용질 분자의 확산에 의한 분리대의 확대를 억제해서 고분리 능력을 발현할 목적으로 사용되는 비다공성 충전제가 알려져 있다.
본 발명의 충전제는, 특히 한정되지 않고, 제조 방법에 의해 다공성, 비다공성의 어느 쪽의 충전제로서도 제조가능하다.
다공성 충전제의 경우에는, 세공 직경의 조절이 필요하다. 이하에, 그 조절의 일례를 나타내지만, 본 발명은 상기 방법으로 한정되는 것은 아니다. 여기서, 세공조절 목적으로 첨가하는 유기용매는, 이용하는 본 발명의 (메타)아크릴로일계 모노머의 양이나 종류, 다관능성 모노머나 다른 모노머와의 양비, 다관능성 모노머 의 종류나 양, 중합개시제의 종류나 양, 중합온도 등의 영향을 받기 때문에 일률적으로는 결정할 수 없다. 일반적으로, 생성 중합체 입자에 대하여 팽윤성이 높은 유기용매를 이용하면 세공 직경이 작은 중합체 입자를, 모노머는 용해시키지만 폴리머는 용해시키지 않는 것 같은 빈용매를 이용하면 세공 직경이 큰 중합체 입자를 제조할 수 있다.
세공조절 목적으로 첨가하는 유기용매의 예로서, 톨루엔, 자일렌, 다이에틸벤젠, 도데실벤젠 등의 방향족 탄화수소류; 헥세인, 헵테인, 데케인 등의 포화 탄화수소류; 아이소아밀 알코올, 헥실 알코올, 옥틸 알코올 등의 알코올류 등을 들 수 있다. 그중에서도, 물에 불용성이고, 이용된 모노머 및 중합개시제를 용해시키는 유기용매이면, 특히 이들로 한정되는 것은 아니다. 그 세공조절 목적으로 첨가하는 유기용매의 첨가량은 충전제의 공공률(空孔率)(충전제 입자의 전체 용적에 대한 세공용적의 비율을 나타냄)에 영향을 준다. 공공률은 충전제의 사용 목적에 따라 다르므로, 일률적으로는 결정할 수 없다. 일반적으로는, 공공률은 40% 내지 90%, 더 바람직하게는, 55% 내지 80% 정도인 충전제를 이용할 수 있다. 공공률이 이 범위를 벗어나면, 단백질 등 수용성의 화합물을 충전제에 의해 많이 흡착시키고자 하는 목적으로부터 벗어나므로, 기능상 바람직하지 못하다라는 이유에 연유한다. 공공률의 조절은 일반적으로는, 첨가하는 유기용매의 전체 모노머에 대한 비율로 결정, 유기용매를 많이 사용하면 공공률은 커지고, 사용하는 유기용매가 적으면, 공공률은 작아진다. 다만, 모노머의 반응률을 변화시키거나, 높은 공공률의 중합체 입자를 제조 후, 입자 표면을 다른 화합물로 코팅하거나 함으로써, 공공률 을 변화시킬 수도 있으므로, 상기 방법으로 한정되는 것은 아니다.
한편, 비다공성 충전제를 제조하는 경우, 세공조절 목적인 유기용매는 첨가하지 않고, 조정 혼합액으로서 (메타)아크릴로일계 모노머, 다관능성 모노머 및 중합개시제를 이용해서 제조된다. 또한, 세공용적이 적고 또 세공 직경을 작게 하기 위해서, 다관능성 모노머의 비율은 10 몰% 이상 80 몰% 이하의 범위가 적합하다.
본 발명의 충전제(1)의 평균 입자 직경은, 사용 목적이나 단백질의 정제량에 의해 설정되므로, 일률적으로는 결정할 수 없다. 예를 들어, 다공성 충전제의 경우에는, 통상 3㎛ 내지 500㎛, 바람직하게는 5㎛ 내지 300㎛의 범위이면 된다. 한편, 비다공성 충전제의 경우에는, 통상 1.5㎛ 내지 60㎛, 바람직하게는 2㎛ 내지 30㎛의 범위이면 된다. 입자 직경이 지나치게 작으면, 고속으로 단백질 등을 분리·정제할 때에, 충전제 주입 칼럼 내의 압력 손실이 커져서, 내압용기를 사용할 필요가 생겨, 설비에 막대한 비용이 들게 된다. 또한, 입자 직경이 지나치게 커지면 수용액 중의 단백질이 입자 표면에 도달하기까지 시간이 걸리게 되어, 단백질의 입자에의 이동이 저하하는 확산 문제가 발생한다. 그 때문에, 상기 범위가 바람직하다.
이와 같이 해서 제조된 가교 중합체 입자는 세공조절 목적으로 첨가하는 유기용매나 미량의 잔존 모노머 등의 협잡물을 함유하고 있다. 그래서, 예를 들어, 아세톤, 테트라하이드로퓨란 등의 수용성 유기용매로 입자를 세정하고, 상기 협잡물을 제거 후, 친수화 반응이나 이온교환기 도입 등의 치환기의 도입을 행하는 것이 일반적이다.
다음에, 본 발명의 전술한 충전제(1)의 입자 표면에 친수성 기가 존재하는 것을 특징으로 하는 충전제[이하, "충전제(2)"라 칭함]에 대하여 설명한다.
본 발명의 충전제(1)에 이용할 수 있는 가교중합체 입자는, 치환기를 도입하기 위한 반응의 기점이 되는 할로겐 원자, 알코올성 OH기, 아미노기, 글리시딜기 또는 에폭시기를 갖는다. 그 때문에, 친수화제를 작용시킴으로써 용이하게 가교중합체 입자에 친수성을 부여하는 것이 가능해진다. 여기서 이용할 수 있는 친수화제는 활성수소기를 2개 이상 함유하고 있으면 되고, 특히 한정되지 않고, 예를 들어, 물; 에틸렌글라이콜, 다이에틸렌글라이콜, 트라이에틸렌글라이콜 등으로 대표되는 옥시에틸렌기의 반복 유닛이 20 이하, 더 바람직하게는 10 이하의 글라이콜류 등; 글리세린, 솔비톨 등으로 대표되는 폴리올류 등을 들 수 있다. 그 밖에, 다관능성 에폭시 화합물의 가수분해물 등도 폴리올로서 이용할 수 있다.
또한, 친수화제로서 이용하는 화합물에 있어서, 반응 전에는 소수성이어도, 반응 후에 친수성을 나타내는 바와 같은 화합물을 친수화제로서 사용하는 것도 가능하다. 예를 들어, 솔비톨 폴리글리시딜에터류, 솔비탄 폴리글리시딜에터류, 펜타에리트리톨 폴리글리시딜에터류, 글리세롤 폴리글리시딜에터류, 네오펜틸글라이콜 다이글리시딜에터 등을 들 수 있다. 이러한 친수화제를 이용해서, 가교중합체 입자와 반응을 행한 후, 필요하다면, 잔존 에폭시기와 전술한 활성수소기를 2개 이상 함유하고 있는 화합물에 의해서 더욱 반응을 행해도 된다. 이와 같이 수용성을 나타내는 다이하이드록시 화합물, 폴리하이드록시화합물 또는 반응후 친수성을 나타내는 화합물이면, 모두 친수화제로서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머를 이용해서 중합을 행하고, 수용성 유기용매로 세정한 가교중합체 입자 중에는, 상기한 바와 마찬가지로, 반응의 기점으로서 할로겐 원자, 알코올성 OH기, 아미노기, 글리시딜기 및 에폭시기 등을 함유하고 있다. 그리고, 다음에 각각의 반응의 기점에 대해서 친수화 방법을 나타낸다.
반응의 기점이 할로겐 원자인 경우에는, 수용액 중에서 알칼리 촉매하, 할로겐기를 가수분해에 의해 OH기로 변환하는 방법, 또는 알칼리 촉매하, 2개 이상의 OH기 함유 화합물과, 소위 윌리암슨(Williamson) 반응을 이용해서 고정화하는 방법 등을 들 수 있다.
반응의 기점이 알코올성 OH기인 경우에는, 알칼리 촉매하, 예를 들면 상기의 에폭시 화합물과의 반응, 더욱 필요가 있으면, 잔존 에폭시기와 다가 알코올과의 반응을 행하는 방법을 들 수 있다. 또는 알칼리 촉매하, 에피클로로히드린을 이용해서 에폭시화한 후, 2개 이상의 OH기 함유 화합물을 고정화하는 방법을 들 수 있다.
반응의 기점이 아미노기인 경우에는, 상기 에폭시 화합물과의 반응, 더욱 필요가 있으면, 잔존 에폭시기와 다가 알코올과의 반응을 행하는 방법, 또는 에피클로로히드린을 이용해서 에폭시화 후, 2개 이상의 OH기 함유 화합물을 고정화하는 방법을 들 수 있다.
반응의 기점이 글리시딜기 또는 에폭시기인 경우에는, 산 또는 알칼리 촉매 하, 2개 이상의 OH기 함유 화합물을 고정화하는 방법을 들 수 있다.
이와 같이 해서 얻어진 본 발명의 충전제(2)의 배제한계분자량은, 표준물질로서 풀루란, 용리액으로서 순수를 사용했을 경우, 50만 내지 200만의 범위인 것이 바람직하다.
본 발명의 충전제(2)는, 예를 들어 크로마토그래피용의 친수성 기재로서 사용된다.
일반적으로 생체 고분자의 분리 정제를 목적으로 하는 크로마토그래피용 친수성 기재에서는, 염농도 0.1몰/1단위의 중성 용리액으로 용출했을 때, 대상으로 되는 생체 고분자와 충전제가 아무런 상호작용도 없이, 용출되는 것이 바람직하다. 즉, 친수성 기재가 다공성 기재이면, 사이즈배제크로마토그래피(size exclusion chromatography: 이하, "SEC"라 약칭함)의 원리에 근거하여, 분자사이즈가 큰 분자로부터 순차적으로 용출되어, 칼럼 중의 전체 용리액량 이하의 용출용량으로 모든 분자가 용출되는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 이러한 친수화 기재의 물성 및 화학구조는 이하와 같은 요건을 충족시키는 것이 바람직하다.
친수성 기재의 물성은 세공 물성, 기계적 강도 및 입자 직경분포와 형상으로 거의 규정할 수 있다. 세공 물성은 세공 직경 분포와 공공률로 대부분을 규정할 수 있다. 적절한 세공 물성은 분리 목적, 방법과 대상 고분자의 분자사이즈에 의존한다. 예를 들어, 대상이 일반적인 구상 단백질(globular proteins)로, 탈염용이나 비다공성 충전제용 기재이면, 세공 직경은 배제한계분자량으로 5,000(풀루란 분자량 환산) 이하가 바람직하며, 공공률은 탈염용에서는 될 수 있는한 큰 쪽이 바 람직하며, 60 내지 95%가 적절하다. 한편, 비다공성 충전제용 기재에서는, 공공률은 반대로 될 수 있는 한 작은 것이 기계적 강도를 향상하기 위해서 바람직하며, 20% 이하가 적절하다. 단백질의 SEC 분리용에서는, 배제한계분자량에서 5,000 내지 50만(풀루란 분자량 환산)이 바람직하다. 또한, 이온교환기, 소수성 기 또는 친화도용 리간드를 기재에 고정화하기 위해서는, 배제한계분자량은 1만 내지 500만(풀루란 분자량 환산), 공공률은 50 내지 95%가 바람직하다. 다공성 충전제용 기재의 경우에는, 분리 방법에 관계없이, 공공률은 클수록, 입자 직경은 반대로 작을수록, 체적 당의 분리 성능은 향상한다. 공공률을 크게 하면 충전제는 기계적 강도가 약해지고, 용리액을 통액할 때 변형되기 쉬워지므로, 공공률은 95% 이하가 바람직하다. 특히 분석 목적의 고성능 액체 크로마토그래피용 충전제의 기재로서는, 80% 이하가 바람직하다. 입자 직경을 작게 하면 충전 칼럼의 칼럼 높이당의 압력손실은 증가하여, 점점 기계적 강도를 높일 필요가 생긴다. 따라서, 용리액을 적절한 유속으로 통액하기 위해서는, 충전제는 기계적 강도가 높을 필요가 있어, 압력손실을 필요 이상으로 높이지 않도록, 공공률과 입자 직경을 조절하지 않으면 안된다. 또, 충전제의 형상이 구상이 아니면, 칼럼에 충전할 때에, 충전제가 브리지(bridge)를 형성하여, 간극이 생겨, 가장 조밀하게 충전될 수 없다. 그 때문에 실용적으로는 용출 피크 형상이 비대칭으로 되고, 피크 폭이 확대해서 성능이 낮은 칼럼이 된다. 따라서, 충전제의 형상은 구형이 바람직하다.
또, 친수성 기재의 화학구조로서는, 각종 충전제를 합성하기 위한 기점으로서 수식하기 쉬운 관능기가 필요하다. 용질과 관능기 고유의 상호작용을 방해하는 일 없이 고정화할 수 있도록 표면에 알코올성 수산기가 있는 것이 바람직하다. 즉, 세공 내부 및 외부 표면에는, 알코올성 수산기나 이온화하지 않은 극성 관능기가 많은 것이 바람직하다. 목적의 용질과 도입하는 관능기 고유의 상호작용을 방해하는 것 같은 관능기는 없는 것, 또한 간단한 수식으로 마스킹할 수 있는 범위인 것이 바람직하다. 즉, 이온성 기나 소수성 기는 될 수 있는 한 적은 것이 바람직하다.
다음에, 본 발명의 충전제(1) 또는 충전제(2)의 입자 표면에 이온교환기가 존재하는 것을 특징으로 하는 충전제[이하, "충전제(3)"이라 칭함]에 대하여 설명한다.
본 발명의 충전제(3)이 가진 이온교환기로서는, 특히 한정되는 것은 아니지만, 설폰산기, 카복실기, 아미노기, 4급 암모늄기를 바람직한 것으로서 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 충전제(1) 또는 충전제(2)에의 이온교환기의 도입 방법으로서는, 특히 한정하는 것이 아니다. 예를 들어, 상기 화학식 1의 (메타)아크릴로일 모노머를 이용해서 중합하고, 수용성 유기용매로 세정한 중합체 입자 중에, 반응의 기점이 되는 글리시딜기 또는 에폭시기를 가진 경우, 아황산 소다 또는 산성 아황산 소다를 이용하여, 에폭시기를 개환시켜 설폰산기를 도입함으로써 양이온 교환수지로 할 수 있다. 또한, 아황산 소다류 대신에 1급, 2급 또는 3급 아미노기를 이용하여, 에폭시기를 개환시켜 아미노기를 도입하면, 음이온 교환수지로 할 수 있다.
그 외에, 충전제(2)로서 이용할 수 있는 친수화한 가교중합체 입자를 사용하여, 에피클로로히드린에 의해, 에폭시화후 아황산 소다류 또는 아민류를 도입함으로써, 본 발명의 충전제(3)이 조제된다. 여기서 이용할 수 있는 아민류로서는, 특히 한정되는 것이 아니고, 예를 들어, 암모니아, 탄소수 1 내지 4의 알킬아민, 탄소수 1 내지 4의 다이알킬아민, 탄소수 1 내지 4의 트라이알킬아민, 하이드록시알킬(탄소수 1 내지 4)아민, 다이하이드록시알킬(탄소수 1 내지 4)아민, 트라이하이드록시알킬(탄소수 1 내지 4)아민, N-하이드록시에틸피페라진, N-아미노에틸피페라진, 몰폴린(morpholine), 에틸렌 다이아민, 다이에틸렌 트라이아민 등을 들 수 있다.
반응의 기점이 할로겐 원자인 경우, 전술한 아민류를 이용해서 반응시키면, 음이온 교환수지로 할 수 있다. 또한, 반응의 기점이 아미노기인 경우, 그대로, 음이온 교환수지로서 사용할 수 있다. 더욱 필요가 있으면, 에피클로로히드린을 개재시켜서, 더욱 아미노기를 도입해도 무방하다.
반응의 기점이 알코올성 OH기인 경우, 브로모에틸설폰산, 모노클로로아세트산, 1,3-프로페인설폰 등을 이용해서 반응시키면, 양이온 교환수지로 할 수 있다. 또한, 2-클로로에틸다이에틸아민 염산염, 글리시딜 트라이메틸암모늄 클로라이드 등을 이용해서 반응시키면, 음이온 교환수지로 할 수 있다. 한층 더, 에피할로히드린을 이용해서 반응시키면, 에폭시기도 도입할 수 있다.
이와 같이 해서 얻어진 본 발명의 충전제(3)은 예를 들어 크로마토그래피용 충전제로서 단백질 등의 생체 고분자를 분리 정제할 때에 사용된다.
생체 고분자의 분리 정제를 목적으로 하는 이온교환크로마토그래피용 충전제는, 친수화 기재의 설명에 있어서 기재한 것과 같은 기재에, 동종의 양이온 교환기 또는 음이온교환기를 고정화한 충전제이다. 이러한 충전제의 물성의 대부분은 기재에 의존한다. 단, 이온교환기를 도입함으로써, 용리액의 염농도를 변화시켰을 때, 입자의 내외간에서 침투압이 변화된다. 이 작용에 의해 충전제는, 저염농도에서는 팽윤하고, 고염농도로 수축한다. 단백질의 이온교환크로마토그래피에서는, 염농도를 서서히 증가시켜서 상호작용이 낮은 단백질로부터 순차적으로 용출시키는 방법을 많이 이용한다. 이때 팽윤 수축비가 큰 충전제에서는, 칼럼 베드 용적이 크게 변화하여, 충전 상태가 매회 변화하고, 재현성이 양호한 분리로 되지 않는다. 팽윤 수축비의 크기는, 기재 매트릭스(골격)의 강도(경도)와 이온교환용량에 의해 결정한다. 일반적으로 이온교환용량이 클수록 영향이 크다. 따라서, 기재 매트릭스가 팽윤 수축하기 어렵고, 이온교환용량도 필요 이상으로 크지 않은 쪽이 좋다. 구체적으로는, 이온교환용량은 30 내지 300 meq/ℓ가 적절한 범위이다. 또한, 그 밖의 생체 고분자, 예를 들어 핵산(DNA, RNA)에서는 200 meq/ℓ 이하가 바람직하고, 펩타이드나 올리고당 등에서는 50 내지 500 meq/ℓ가 바람직하다.
이온교환크로마토그래피의 용출방법은, 일반적으로 전술한 염농도를 서서히 증가시켜 용출하는 방법, 목적의 용질이 이온교환기와 결합하는 pH로부터 반발하는 pH로 서서히 용리액의 pH를 변화시키는 방법 또는 양쪽의 조합 등이 있다.
그 밖에도 재생, 세정 등에서는 알칼리 용액도 사용하므로, 기재 매트릭스가 팽윤 수축하기 어려운 충전제가 바람직하다.
이하, 실시예에 의해, 본 발명의 충전제 및 그 제조 방법을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.
제조예 1
우선, 비누화율 88%, 중합도 3500인 폴리비닐알코올(현탁 안정제) 1.5g과 1ℓ의 물을 교반기 부착 반응기에 주입하고, 잘 교반을 행하여, 폴리비닐알코올을 물에 용해시켰다. 그 후, 이 수용액이 60℃가 되도록 조절하고, 이것을 조정 수용액으로 하였다.
다음에, 글리시딜 메타크릴레이트 45g, 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트 15g, 클로로벤젠 65g 및 아조비스아이소부티로나이트릴 0.3g으로 이루어진 조정 혼합액을 만들고, 이 조정 혼합액을 60℃의 상기 조정 수용액 중에 교반을 행하면서 적하하였다. 계속해서, 교반하면서 이 현탁물을 6시간, 60℃에서 중합시켰다. 그 후, 반응기를 실온으로 냉각하고, 생성물을 여과하고, 몇 차례 온수로 세정한 후, 다이옥세인으로 세정해서 입상 겔(가교중합체 입자)을 얻었다.
<친수화 기재의 조제>
얻어진 입상 겔을 더욱 물로 잘 세정한 후, 이 중합체 20g을 0.5N 황산수용액 200㎖와 잘 혼합하고, 이것을 수욕 상에서 90℃로 가열하고, 5시간 반응을 행하여, 에폭시기의 가수분해를 행하였다. 그 후, 물로 잘 세정해서 수욕 상에서 체분급을 행하여, 40㎛ 내지 90㎛의 입자 직경의 입상 겔을 취득하였다. 이 겔을 친수화 기재 1이라 칭한다.
<함수율의 측정>
친수화 기재 1의 함수율을, 블랭킷식 수분계에서 120℃, 15분간 가열한 후의 친수화 기재 1의 중량감소에 따라 구하였다. 그 결과, 함수율은 57.2%였다.
<에폭시기의 정량>
약 2g의 친수화 기재 1을 용량 200㎖의 유리제 마개(共栓) 부착 삼각 플라스크에 투입한 후, 칭량하였다. 다음에, 이 플라스크 내에, 정확하게 25㎖의 약 0.2M-염산/다이옥세인 용액을 첨가하고, 교반자를 넣어서, 실온에서 3시간 온화하게 교반하였다. 이어서, 이 플라스크 내에, 50㎖의 에틸알코올과 1㎖의 페놀프탈레인 용액을 첨가하고, 0.1M-NaOH 용액으로 적정하여, 잔존 염산량을 구하였다. 또한 동시에, 이 약 0.2M-염산/다이옥세인 용액 중의 염산농도를 0.1M-NaOH 용액으로 적정해서 구하였다. 또, 약 2g의 친수화 기재 1을 용량 200㎖의 유리제 마개 부착 삼각 플라스크에 투입하여, 칭량하고, 75㎖의 에틸알코올을 가해서, 실온에서 약 30분간 교반하고, 페놀프탈레인 용액을 지시약으로 해서 0.1M-NaOH 용액으로 적정하고, 측정 겔 중의 산가를 구하였다.
이와 같이 해서 얻어진 잔존 염산량, 산가 및 겔의 함수율로부터 건조 겔 1g 당의 에폭시량을 구하였다. 상기 친수화 기재의 에폭시량은 건조 겔 1g 당 0.3 mmol 이하였다.
<배제한계분자량 및 공공률의 측정>
친수화 기재 1의 겔 슬러리 수용액을 이용해서 내경 10.7㎜, 길이 150㎜의 스테인레스제 칼럼에 친수화 기재 1을 가장 조밀한 충전이 되도록 충전하였다. 다 음에, RI-8000 검출기(토소사 제품)를 장비한 HLC-803D(토소사 제품)에 상기 칼럼을 장착하였다. 계속해서, 표준물질에 분자량 4000만의 덱스트란 및 각 분자량의 풀루란을 이용하여, 0.5㎖/min의 유속으로 여러 가지 분자량의 표준물질을 주입하고, 그 용출용량으로부터 배제한계분자량을 구하였다. 또한, 덱스트란과 에틸렌글라이콜의 용출용량 및 칼럼 용적으로부터 공공률을 구하였다. 친수화 기재 1 입자의 배제한계분자량은 100만, 공공률은 62%였다.
<아미노화 충전제의 조제>
얻어진 친수화 기재 1을 순수로 세정하고, 흡인 여과 후, 친수화 기재 1의 50㎖를 300㎖ 분리형 플라스크에 옮기고, 순수 20 ㎖, 35% 수산화 나트륨 수용액 20㎖를 가하여, 교반 혼합하였다. 다음에, 반응온도를 35 내지 40℃로 유지하면서, 에피클로로히드린 33g 및 다이에틸아미노에탄올 39g을 4시간으로 적하하고, 그 후, 더욱 40℃에서 5시간 반응을 계속하였다. 반응 종료 후, 반응액을 흡인 여과하고, 순수, 0.5N 염산, 재차 순수의 순서로 잘 세정하였다. 이 반응에서 얻어진 충전제를 아미노화 충전제 1이라 칭한다.
제조예 2
글리시딜 메타크릴레이트 49g, 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트 11g, 클로로벤젠 65g 및 아조비스아이소부티로나이트릴 0.3g으로 이루어진 조정 혼합액을 이용한 이외에는, 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 이 조정 혼합액을 60℃로 조절한 조정 수용액 중에 교반을 행하면서 적하하였다. 계속해서, 교반하면서 이 현탁물을 6시간, 60℃에서 중합시켰다. 그 후에 반응기를 실온으로 냉각하고, 생성물을 여과하고, 몇 차례 온수로 세정한 후, 다이옥세인으로 세정하여 입상 겔(가교중합체 입자)을 얻었다.
이 입상 겔 25g, 폴리에틸렌글라이콜(평균 분자량 200) 200g 및 다이옥세인 100g을 잘 혼합하고, 다음에 삼불화 붕소 에틸에터 착물 1㎖를 가하여, 교반하면서, 85℃로 가열하고, 4시간 가열을 계속하였다. 다음에, 반응물을 실온까지 냉각하고, 물로 잘 세정하고, 수욕 상에서 체 분급을 행하여, 입자 직경 40㎛ 내지 90㎛의 입상 겔을 얻었다. 이 겔을 친수화 기재 2라고 칭한다.
제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 2의 물성측정을 하였다. 그 결과, 함수율은 55.9%, 잔존 에폭시량은 건조 기재 1g당 0.3mmol 이하, 배제한계분자량은 110만, 공공률은 63.2%였다.
또한, 제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 2에 아미노기를 도입하였다. 이 반응에서 얻어진 충전제를 아미노화 충전제 2라고 칭한다.
제조예 3
글리시딜 메타크릴레이트 56g, 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트 4g, 클로로벤젠 65g 및 아조비스아이소부티로나이트릴 0.3g으로 이루어진 조정 혼합액을 이용한 이외에는, 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 이 조정 혼합액을 60℃로 조절한 조정 수용액 중에 교반을 행하면서 적하하였다. 계속해서, 교반하면서 이 현탁물을 6시간, 60℃에서 중합시켰다. 그 후에 반응기를 실온으로 냉각하고, 생성물을 여과하고, 몇 차례 온수로 세정한 후, 다이옥세인으로 세정하여 입상 겔(가교중합체 입자)을 얻었다.
이 입상 겔 25g, 폴리에틸렌글라이콜(평균 분자량 200) 200g 및 다이옥세인 100g을 잘 혼합하고, 다음에 삼불화 붕소 에틸에터 착물 1㎖를 가하고, 교반하면서, 85℃로 가열하고, 4시간 가열을 계속하였다. 다음에, 반응물을 실온까지 냉각하고, 물로 잘 세정하고, 수욕 상에서 체 분급을 행하여, 입자 직경 40㎛ 내지 90㎛의 입상 겔을 얻었다. 이 겔을 친수화 기재 3이라 칭한다.
제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 3의 물성측정을 하였다. 그 결과, 함수율은 69.4%, 잔존 에폭시량은 건조 기재 1g당 0.3mmol 이하, 배제한계분자량은 165만, 공공률은 69.4%였다.
또한, 제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 3에 아미노기를 도입하였다. 이 반응에서 얻어진 충전제를 아미노화 충전제 3이라 칭한다.
제조예 4
3,4-에폭시사이클로헥실메틸 메타크릴레이트 64g, 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트 16g, 아세트산 부틸 140g, 클로로벤젠 31g 및 t-부틸퍼옥시피발레이트 1.4g의 혼합물을, 비누화율 88%, 중합도 3500인 폴리비닐알코올(현탁 안정제) 10g을 1ℓ의 물에 용해한 용액 중에 현탁시켰다. 계속해서 혼합하면서, 이 혼합물을 6시간, 60℃로 가열해서 중합시켰다. 반응액을 실온으로 냉각하고, 생성된 입상의 겔 형상 중합물을 유리 필터로 여과하였다. 이 중합물을 몇 차례 온수로 세정한 후, 1,4-다이옥세인으로 세정해서 입상 겔(가교중합체 입자)을 얻었다.
이 입상 겔 50g, 폴리에틸렌글라이콜(평균 분자량 200) 200g 및 1,4-다이옥세인 200g을 잘 혼합하고, 다음에 삼불화 붕소 에틸에터 착물 2㎖를 가하여, 교반 하면서, 85℃로 가열하고 4시간 가열을 계속하였다. 다음에 반응물을 실온으로 냉각하고, 물로 잘 세정하고, 체 분급을 행하여, 입자 직경 40 내지 90㎛의 입상 겔을 얻었다. 이 겔을 친수화 기재 4라 칭한다.
제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 4의 물성측정을 하였다. 그 결과, 함수율은 68.5%, 잔존 에폭시량은 건조 기재 1g당 0.3mmol 이하, 배제한계분자량은 110만, 공공률은 74%였다.
또한, 제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 4에 아미노기를 도입하였다. 이 반응에서 얻어진 충전제를 아미노화 충전제 4라 칭한다.
제조예 5
3,4-에폭시사이클로헥실메틸 메타크릴레이트 58g, 글리시딜 메타크릴레이트 6g, 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트 16g, 클로로벤젠 200g 및 아조비스아이소부틸나이트릴 0.6g의 혼합물을, 비누화율 88%, 중합도 2400인 폴리비닐알코올(현탁 안정제) 15g을 1ℓ의 물에 용해한 용액 중에 현탁시켰다. 계속해서 혼합하면서, 이 혼합물을 6시간, 60℃로 가열해서 중합시켰다. 반응액을 실온으로 냉각하고, 생성된 입상의 겔 형상 중합물을 유리 필터로 여과하였다. 중합물의 표면에 부착된 현탁 안정제를 제거하기 위하여 중합물을 몇 차례 온수로 세정한 후, 1,4-다이옥세인으로 세정해서 입상 겔(가교중합체 입자)을 얻었다.
이 입상 겔 50g, 다이에틸렌글라이콜 50g, 폴리글리세린 폴리글리시딜에터(상품명: 데나콜 EX-521, 나가세 카세이코교사 제품) 50g 및 1,4-다이옥세인 200g을 잘 혼합하고, 다음에 삼불화 붕소 에틸에터 착물 2㎖를 가하여, 교반하면서, 85 ℃로 가열해서 4시간 가열을 계속하였다. 다음에 반응물을 실온으로 냉각하고, 물로 잘 세정하고, 체 분급을 행하여, 입자 직경 40 내지 90㎛의 입상 겔을 얻었다. 이 겔을 친수화 기재 5라고 칭한다.
제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 5의 물성측정을 하였다. 그 결과, 함수율은 70.5%, 잔존 에폭시량은 건조 기재 1g당 0.3mmol 이하, 배제한계분자량은 90만, 공공률은 72%였다.
또한, 제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 5에 아미노기를 도입하였다. 이 반응에서 얻어진 충전제를 아미노화 충전제 5라 칭한다.
제조예 6
3-아다만탄 다이올 168g과 피리딘 80g을 테트라하이드로퓨란 400g에 용해시켰다. 이 용액을 교반하면서 반응온도를 40℃로 유지하면서, 메타크릴산 클로라이드 84g을 이 용액 중에 적하하고, 2시간 반응하였다. 얻어진 반응액으로부터, 테트라하이드로퓨란을 35℃ 이하로 감압 증류 제거하고, 잔류물을 n-헥세인으로 추출하였다. 다음에 n-헥세인 상을 순수, 0.1M 인산수용액, 0.1M 탄산나트륨 수용액, 순수의 순서로 미반응 1,3-아다만탄 다이올, 염류, 피리딘, 메타크릴산을 추출 제거하였다. 최후로, n-헥세인 상을 메탄올에 의해서 추출하고, 메탄올 용액을 35℃ 이하로 감압 증류 제거하였다.
얻어진 생성물을, 가스크로마토그래피 분석한 바, 이 생성물은 3-하이드록시아다만탄-1-메타크릴레이트 120g, 1,3-아다만탄 다이메타크릴레이트 4g의 조성이었다. 다음에, 이 생성물 60g, 다이비닐벤젠 2g, 트라이메틸올프로페인 트라이아크 릴레이트 10g, 아세트산 부틸 50g, 클로로벤젠 100g 및 아조비스아이소부틸나이트릴 0.6g의 혼합물을, 비누화율 88%, 중합도 2400인 폴리비닐알코올(현탁 안정제) 10g을 1ℓ의 물에 용해한 용액 중에 현탁시켜, 혼합하면서 이 혼합물을 6시간, 60℃로 가열해서 중합시켰다. 그 후에 반응물을 실온으로 냉각하고, 생성된 입상의 겔 형상 중합물을 유리 필터로 여과하고, 몇 차례 온수로 세정한 후, 1,4-다이옥세인으로 세정해서 입상 겔(가교중합체 입자)을 얻었다.
이 입상 겔 50g, 에틸렌글라이콜 20g, 글리시돌 30g 및 1,4-다이옥세인 150g을 잘 혼합하고, 다음에 삼불화 붕소 에틸에터 착물 2㎖를 가하고, 교반하면서, 85℃로 가열하고, 4시간 가열을 계속하였다. 다음에 반응물을 실온으로 냉각하고, 다음에 반응물을 실온으로 냉각하고, 물로 잘 세정하고, 체 분급을 행하여, 입자 직경 40 내지 90㎛의 입상 겔을 얻었다. 이 겔을 친수화 기재 6이라 칭한다.
제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 6의 물성측정을 하였다. 그 결과, 함수율은 67%, 잔존 에폭시량은 건조 기재 1g당 0.3mmol 이하, 배제한계분자량은 60만, 공공률은 70%였다.
또한, 제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 6에 아미노기를 도입하였다. 이 반응에 의해 얻어진 충전제를 아미노화 충전제 6이라 칭한다.
제조예 7
1,4-사이클로헥세인다이메탄올 모노아크릴레이트(니혼카세이사 제품) 64g, 4-하이드록시부틸아크릴레이트(니혼카세이사 제품) 6g, 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트 18g, 클로로벤젠 240g 및 t-부틸퍼옥시피발레이트 1.0g의 혼합물을, 비누 화율 88%, 중합도 3500인 폴리비닐알코올(현탁 안정제) 15g을 1ℓ의 물에 용해한 용액 중에 현탁시켰다. 뒤섞으면서 이 혼합물을 6시간, 60℃로 가열하여 중합시켰다. 이어서, 반응액을 실온으로 냉각하고, 생성된 입상의 겔 형상 중합물을 유리 필터로 여과하고, 몇 차례 온수로 세정한 후, 아세톤으로 잘 세정하고, 다음에 물로 세정해서 입상 겔(가교중합체 입자)을 얻었다.
이 입상 겔 50g, 폴리글리세린 폴리글리시딜에터(상품명: 데나콜 EX-512, 나가세 카세이코교사 제품) 25g 및 순수 80㎖를 잘 혼합하고, 이것에 5N 수산화 나트륨 용액 30㎖를 45℃에서 적하하고, 3시간 교반 혼합하였다. 다음에 반응물을 실온으로 냉각하고, 0.1N 염산 및 물로 잘 세정하고, 체 분급을 행하여, 입자 직경 40 내지 90㎛의 입상 겔을 얻었다. 이 겔을 친수화 기재 7이라 칭한다.
제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 7의 물성측정을 하였다. 그 결과, 함수율은 78%, 잔존 에폭시량은 건조 기재 1g당 0.3mmol 이하, 배제한계분자량은 150만, 공공률은 75%였다.
또한, 제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 7에 아미노기를 도입하였다. 이 반응에 의해 얻어진 충전제를 아미노화 충전제 7이라 칭한다.
제조예 8
분자량 36만인 폴리비닐피롤리돈(현탁 안정제) 50g과 1ℓ의 물을 교반기 부착 반응기에 주입하고, 잘 교반을 행하여, 폴리비닐피롤리돈을 물에 용해시켰다. 그 후에 수용액이 60℃가 되도록 조절하였다. 다음에, 글리시딜 메타크릴레이트 200g, 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트 50g 및 아조비스아이소부티로나이트릴 1.0g으로 이루어진 혼합 용액을 조제하고, 이 혼합 용액을 60℃의 상기 수용액 중에 교반을 행하면서 적하하였다. 상기 수용액 중에 질소를 10 ㎖/min의 유속으로 흘려보내면서, 계속해서 격렬하게 교반하여, 이 현탁물을 8시간, 60℃에서 중합시켰다. 반응액을 실온으로 냉각하고, 생성한 겔 형상 중합물을 여과하고, 몇 차례 온수로 세정한 후, 다이옥세인으로 세정해서 입상 겔(가교중합체 입자)을 얻었다.
이 입상 겔(다이옥세인 함유) 200g을 300㎖의 다이옥세인에 분산시키고, 이것에 150g의 에틸렌글라이콜과 5g의 고형 수산화 나트륨을 첨가하고, 이것을 수욕 상에서 70℃로 가열하여, 16시간 반응을 행하고, 에폭시기에의 에틸렌글라이콜의 개환부가반응을 행하였다. 이어서, 생성물을 물, 다음에 아세톤으로 잘 세정하였다. 그 후에 아세톤 슬러리 용액을 이용해서, 데칸테이션 분급을 행하여, 입자 직경 3 내지 5㎛의 입상 겔을 취득하였다. 이것을 친수화 기재 8이라 칭한다.
또한, 제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 8에 아미노기를 도입하였다. 이 반응에 의해 얻어진 충전제를 아미노화 충전제 8이라 칭한다.
제조예 9
분자량 36만인 폴리비닐피롤리돈(현탁 안정제) 50g과 1ℓ의 물을 교반기 부착 반응기에 주입하고, 잘 교반을 행하여, 폴리비닐피롤리돈을 물에 용해시켰다. 그 후에 이 수용액이 60℃가 되도록 조절하였다. 다음에, 3,4-에폭시사이클로헥실메틸 메타크릴레이트 276g, 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트 50g 및 아조비스아이소부티로나이트릴 1.0g으로 이루어진 혼합 용액을 조제하고, 이 혼합 용액을 60℃의 상기 수용액 중에 교반을 행하면서 적하하였다. 상기 수용액에 질소를 10㎖ /min의 유속으로 흘려보내면서, 계속해서 격렬하게 교반하여, 이 현탁물을 8시간, 60℃에서 중합시켰다. 이어서, 반응액을 실온으로 냉각하고, 생성한 겔 형상 중합물을 여과하고, 몇 차례 온수로 세정한 후, 다이옥세인으로 세정해서 입상 겔(가교중합체 입자)을 얻었다.
이 입상 겔(다이옥세인 함유) 200g을 300㎖의 다이옥세인에 분산시키고, 이것에 150g의 에틸렌글라이콜과 1.5㎖의 삼불화 붕소 에터 착물을 실온에서 첨가하고, 이것을 수욕 상에서 70℃로 가열하여, 4시간 반응을 행하고, 에폭시기에의 에틸렌글라이콜의 개환부가반응을 행하였다. 그 후에, 물, 다음에 아세톤으로 잘 세정해서 아세톤에 현탁하고, 데칸테이션 분급을 행하여, 입자 직경 3 내지 5㎛의 입상 겔을 취득하였다. 이것을 친수화 기재 9라 칭한다.
또한, 제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 9에 아미노기를 도입하였다. 이 반응에 의해 얻어진 충전제를 아미노화 충전제 9라 칭한다.
제조예 10
4-하이드록시부틸아크릴레이트 글리시딜에터(니혼카세이사 제품) 48g, 3,4-에폭시사이클로헥실메틸 메타크릴레이트 16g, 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트 16g, 클로로벤젠 220g 및 아조비스아이소부틸나이트릴 1.4g의 혼합물을, 비누화율 88%, 중합도 2400인 폴리비닐알코올(현탁 안정제) 10g을 1ℓ의 물에 용해한 용액 중에 현탁시켰다. 뒤섞으면서 이 혼합물을 6시간, 65℃로 가열해서 중합시켰다. 반응액을 실온으로 냉각하고, 생성된 입상의 겔 형상 중합물을 유리 필터로 여과하고, 몇 차례 온수로 세정한 후, 1,4-다이옥세인으로 세정해서 입상 겔(가교중합체 입자)을 얻었다.
이 입상 겔 50g, 에틸렌글라이콜 100g 및 1,4-다이옥세인 200g을 잘 혼합하고, 이것에 삼불화 붕소 에틸에터 착물 2㎖를 첨가하고, 교반하면서, 85℃로 가열해서 4시간 가열을 계속하였다. 다음에, 반응물을 실온으로 냉각하고, 물로 잘 세정하고, 체 분급을 행하여, 입자 직경 40 내지 90㎛의 입상 겔을 얻었다. 이 겔을 친수화 기재 10이라 칭한다.
제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 10의 물성측정을 하였다. 그 결과, 함수율은 72.5%, 잔존 에폭시량은 건조 기재 1g당 0.3mmol 이하, 배제한계분자량은 100만, 공공률은 76%였다.
제조예 11
4-브로모부틸메타크릴레이트 64g, 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트 16g, 1,2-다이클로로프로페인 100g, 클로로벤젠 100g 및 아조비스아이소부틸나이트릴 1.2g의 혼합물을, 비누화율 88%, 중합도 2400의 폴리비닐알코올(현탁 안정제) 15g을 1ℓ의 물에 용해한 용액 중에 현탁시켰다. 뒤섞으면서 이 혼합물을 6시간, 65℃로 가열해서 중합시켰다. 반응액을 실온으로 냉각하고, 생성된 입상의 겔 형상 중합물을 유리 필터로 여과하고, 표면에 부착된 현탁 안정제를 제거하기 위하여 중합물을 몇 차례 온수로 세정한 후, 1,4-다이옥세인으로 세정해서 입상 겔(가교중합체 입자)을 얻었다.
이 입상 겔 50g, 에틸렌글라이콜 100g 및 1,4-다이옥세인 200g을 잘 혼합하고, 이것에 수산화 나트륨 25g을 가하여, 교반하면서, 75℃로 가열해서 10시간 가 열을 계속하였다. 다음에 반응물을 실온으로 냉각하고, 물로 잘 세정하고, 체 분급을 행하여, 입자 직경 40 내지 90㎛의 입상 겔을 얻었다. 이 겔을 친수화 기재 11이라 칭한다.
제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 11의 물성측정을 하였다. 그 결과, 함수율은 70.5%, 잔존 에폭시량은 건조 기재 1g당 0.3mmol 이하, 배제한계분자량은 80만, 공공률은 72%였다.
제조예 12
1,4-사이클로헥세인다이메탄올 모노아크릴레이트(니혼카세이사 제품) 32g, 6-아미노헥실메타크릴아마이드 32g, 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트 18g, 아이소아밀 알코올 100g, 클로로벤젠 100g 및 t-부틸퍼옥시피발레이트 1.5g의 혼합물을, 분자량 36만인 폴리비닐피롤리돈(현탁 안정제) 25g 및 에탄올 아민 1㎖를 1ℓ의 물에 용해한 용액 중에 현탁시켰다. 뒤섞으면서 이 혼합물을 6시간, 60℃로 가열해서 중합시켰다. 반응액을 실온으로 냉각하고, 생성된 입상의 겔 형상 중합물을 유리 필터로 여과하고, 몇 차례 온수로 세정한 후, 아세톤으로 잘 세정하고, 다음에 물로 세정해서 입상 겔(가교중합체 입자)을 얻었다.
이 입상 겔 50g, 폴리글리세린 폴리글리시딜에터(상품명: 데나콜 EX-512, 나가세카세이코교사 제품) 25g과 순수 80㎖를 잘 혼합하고, 5N 수산화 나트륨 용액 30㎖를 45℃에서 적하하고, 3시간 교반 혼합하였다. 다음에 반응물을 실온으로 냉각하고, 0.1N 염산 및 물로 잘 세정하고, 체 분급을 행하여, 입자 직경 40 내지 90㎛의 입상 겔을 얻었다. 이 겔을 친수화 기재 12라 칭한다.
제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 상기 친수화 기재의 물성측정을 하였다. 그 결과, 함수율은 78%, 배제한계분자량은 120만, 공공률은 74%였다.
또한, 제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 친수화 기재 12에 아미노기를 도입하였다. 이 반응에 의해 얻어진 충전제를 아미노화 충전제 12라 칭한다.
제조예 13
제조예 4에서 얻어진 친수화 기재 4를 순수로 세정하고, 흡인 여과후, 친수화 기재 4의 50㎖를 300㎖ 분리형 플라스크에 옮기고, 이것에 순수 30㎖, 1,3-프로페인설폰 20g을 가하여, 교반 혼합하였다. 반응온도를 35 내지 45℃로 유지하면서, 이것에 48% 수산화 나트륨 수용액 15g을 적하하고, 적하 후, 더욱 40℃에서 3시간 반응을 계속하였다. 반응 종료 후, 반응액을 흡인 여과하고, 순수로 잘 세정하였다. 이 반응에서 얻어진 충전제를 설폰화 충전제 13이라 칭한다.
제조예 14
제조예 4에서 얻어진 친수화 기재 4를 순수로 세정하고, 흡인 여과 후, 50㎖를 300㎖ 분리형 플라스크에 옮기고, 이것에 순수 25㎖, 모노클로로아세트산 나트륨 25g을 가하고, 교반 혼합하였다. 반응온도를 45 내지 55℃로 유지하면서, 48% 수산화 나트륨 수용액 60g을 이것에 적하하고, 적하 후 더욱 50℃에서 4시간 반응을 계속하였다. 반응 종료 후, 반응액을 흡인 여과하고, 순수로 잘 세정하였다. 이 반응에서 얻어진 충전제를 카복시메틸화 충전제 14라 칭한다.
제조예 15
제조예 4에서 얻어진 친수화 기재 4를 순수로 세정하고, 흡인 여과후, 50㎖ 를 300㎖ 분리형 플라스크에 옮기고, 순수 25㎖, 70% 글리시딜 트라이메틸암모늄 클로라이드 수용액 40g을 가하고, 교반 혼합하였다. 반응온도를 30 내지 35℃로 유지하면서, 이것에 48% 수산화 나트륨 수용액 2g을 투입하고, 적하 후 더욱 35℃에서 24시간 반응을 계속하였다. 반응 종료 후, 반응액을 흡인 여과하고, 순수, 0.5N 염산, 다시 순수의 순서로 잘 세정하였다. 이 반응에서 얻어진 충전제를 4급 암모늄화 충전제 15라 칭한다.
제조예 16
제조예 13에 기재된 방법에 따라서, 제조예 2에서 얻어진 친수화 기재 2에 설폰기를 도입하였다. 이 반응에서 얻어진 충전제를 설폰화 충전제 16이라 칭한다.
제조예 17
제조예 14에 기재된 방법에 따라서, 제조예 2에서 얻어진 친수화 기재 2에 카복시메틸기를 도입하였다. 이 반응에서 얻어진 충전제를 카복시메틸화 충전제 17이라 칭한다.
제조예 18
제조예 15에 기재된 방법에 따라서, 제조예 2에서 얻어진 친수화 기재 2에 4급 암모늄기를 도입하였다. 이 반응에서 얻어진 충전제를 4급 암모늄화 충전제 18이라 칭한다.
이상의 제조예에 의해서 조제한 입상 겔(가교중합체 입자), 친수화 기재, 충 전제를 각각 표 1 내지 표 3에 함께 나타낸다.
제조예
번호		 가교중합체 입자
모노머 가교제, 함유율
1 GMA1 ) EGDMA9 ), 15 중량%
2 GMA1 ) EGDMA9 ), 18.3 중량%
3 GMA1 ) EGDMA9 ), 6.7 중량%
4 EHMA2 ) EGDMA9 ), 22.9 중량%
5 EHMA2 )/GMA1 ) EGDMA9 ), 20 중량%
6 HAMA3 ) ADMA10 ), DVB11 ), MPTA12 ), 18.9 중량%
7 CHMA4 ), HBA5 ) EGDMA9 ), 20.5 중량%
8 GMA1 ) EGDMA9 ), 20 중량%
9 EHMA2 ) EGDMA9 ), 15.3 중량%
10 BAGE6 ) EGDMA9 ), 20 중량%
11 브로모부틸MA7 ) EGDMA9 ), 20 중량%
12 아미노헥실아마이드8 ) + CHMA4 ) EGDMA9 ), 22 중량%
1) GMA : 글리시딜 메타크릴레이트
2) EHMA : 3,4-에폭시사이클로헥실메틸 메타크릴레이트
3) HAMA : 1,3-하이드록시아다만탄-1-메타크릴레이트
4) CHMA : 1,4-사이클로헥세인다이메탄올 모노아크릴레이트
5) HBA : 1,4-하이드록시부틸아크릴레이트
6) BAGE : 4-하이드록시부틸아크릴레이트 글리시딜에터
7) 브로모부틸MA : 4-브로모부틸메타크릴레이트
8) 아미노헥실아마이드 : 6-아미노헥실메타크릴아마이드
9) EGDMA : 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트
10) ADMA : 1,3-아다만탄 다이메타크릴레이트
11) DVB : 다이비닐벤젠
12) MPTA : 트라이메틸올프로페인 트라이아크릴레이트
제조예
번호		 친수화
기재
번호		 친수화제 촉매 물성측정
입자
직경		 함수율 잔존에폭시량 배제한계
분자량		 공공률
1 1 H2O 황산 40~90㎛ 57.2% ≤0.3mmol/건조겔1g 100만 62%
2 2 PEG2001 ) BF3 40~90㎛ 55.9% ≤0.3mmol/건조겔1g 110만 63.2%
3 3 PEG2001 ) BF3 40~90㎛ 69.4% ≤0.3mmol/건조겔1g 165만 69.4%
4 4 PEG2001 ) BF3 40~90㎛ 68.5% ≤0.3mmol/건조겔1g 110만 74%
5 5 DEG2 ), EX5213 ) BF3 40~90㎛ 70.5% ≤0.3mmol/건조겔1g 90만 72%
6 6 EG4 ), Glyc5 ) BF3 40~90㎛ 67% ≤0.3mmol/건조겔1g 60만 70%
7 7 EX5126 ) NaOH 40~90㎛ 78% ≤0.3mmol/건조겔1g 150만 75%
8 8 EG4 ) NaOH 3~5㎛ - - - -
9 9 EG4 ) BF3 3~5㎛ - - - -
10 10 DEG2 ) BF3 40~90㎛ 72.5% ≤0.3mmol/건조겔1g 100만 76%
11 11 PEG2001 ) NaOH 40~90㎛ 70.5% ≤0.3mmol/건조겔1g 65만 72%
12 12 EX5125 ) NaOH 40~90㎛ 74% ≤0.3mmol/건조겔1g 66만 74%
1) PEG200 : 폴리에틸렌글라이콜(평균분자량 200)
2) DEG : 다이에틸렌글라이콜
3) EX521 : 폴리글리세린 폴리글리시딜에터(상품명: 데나콜 EX-521, 나가세카세이코교사 제품)
4) EG : 에틸렌글라이콜
5) Glyc : 글리시돌
6) EX512 : 폴리글리세린 폴리글리시딜에터(상품명: 데나콜 EX-512, 나가세카세이코교사 제품)
제조예 번호 충전제 번호 원료 기재 번호 관능기 시약
1 아미노화 충전제 1 친수화 기재 1 아미노기 DEAE1 )
2 아미노화 충전제 2 친수화 기재 2 아미노기 DEAE1 )
3 아미노화 충전제 3 친수화 기재 3 아미노기 DEAE1 )
4 아미노화 충전제 4 친수화 기재 4 아미노기 DEAE1 )
5 아미노화 충전제 5 친수화 기재 5 아미노기 DEAE1 )
6 아미노화 충전제 6 친수화 기재 6 아미노기 DEAE1 )
7 아미노화 충전제 7 친수화 기재 7 아미노기 DEAE1 )
8 아미노화 충전제 8 친수화 기재 8 아미노기 DEAE1 )
9 아미노화 충전제 9 친수화 기재 9 아미노기 DEAE1 )
12 아미노화 충전제 12 친수화 기재 12 아미노기 DEAE1 )
13 설폰화 충전제 13 친수화 기재 4 설폰기 1,3-PS2 )
14 카복시메틸화 충전제 14 친수화 기재 4 카복실기 CAC3 )
15 4급 암모늄화 충전제 15 친수화 기재 4 4급 암모늄기 GTA4 )
16 설폰화 충전제 16 친수화 기재 2 설폰기 1.3-PS2 )
17 카복시메틸화 충전제 17 친수화 기재 2 카복실기 CAC3 )
18 4급 암모늄화 충전제 18 친수화 기재 2 4급 암모늄기 GTA4 )
1) DEAE : 다이에틸아미노에탄올
2) 1,3-PS : 1,3-프로페인설폰
3) CAC : 모노클로로아세트산나트륨
4) GTA : 글리시딜트라이메틸암모늄클로라이드
실시예 1
제조예 4에서 얻어진 친수화 기재 4의 친수성과 내알칼리성을 25℃±2℃로 조절한 챔버에서 평가하였다.
친수성 평가는, 단백질 용액을 충전 칼럼 및 빈 칼럼에 주입하고, 일정량의 용출액을 채취하여, 용출액의 280㎚ 자외흡광도를 측정 비교하는 방법으로 회수율을 측정하는 방법으로 행하였다. 즉, 기재가 소수성을 지니고 있으면, 단백질은 기재에 소수흡착되어서 회수율이 저하하고, 반대로, 기재의 친수성이 높으면, 회수율이 높아지게 되는 것을 이용하는 방법으로 각각의 칼럼에 대해서 기능을 비교하였다. 또한, 본 실시예에 있어서 단백질로서는, 오브알부민(난백), α-키모트립시노겐 A(소), 미오글로빈(말) 및 리소자임(알)(이상, 시그마알드리치 재팬사 제품), 시토크롬 C(말)(와코쥰야쿠코교사 제품)를 이용하였다.
구체적으로는, 친수화 기재 4로 이루어진 충전제를 내경 10.7㎜, 길이 150㎜의 스테인레스 칼럼에 슬러리 충전법으로 충전해서 충전 칼럼으로 하였다. 용리액으로서, 0.1M 인산 완충액(pH 6.8)과 0.2M 황산나트륨의 함유 용액을 이용하여 1.0㎖/min의 유속으로 흐르게 하고, 상기 용리액에 2.0㎎/㎖의 농도로 용해한 상기 단백질을 0.1㎖ 주입하고, 주입후 4분째로부터 용출액 20㎖를 채취하였다. 한편, 빈 칼럼으로서는, 단백질 용액의 분산을 방지할 목적으로, 내경 10.7㎜, 길이 75㎜의 스테인레스 칼럼을 이용하여, 상기와 같은 방법으로 주입 후 2분부터 용출액 20㎖를 채취하였다. 빈 칼럼으로부터 채취된 단백질의 흡광도를 100%로 하는 상대비교에 의해 각각의 단백질의 회수율을 구하였다. 그 결과, 어느 쪽의 단백질도 95% 이상의 회수율을 나타내고, 친수화 기재 4는 친수성이 높은 것을 확인하였다.
다음에, 내알칼리성의 평가는 수산화 나트륨 수용액 침지에 의한 카복실기 생성량의 비교에 의해 행하였다. 즉, 순수로 잘 세정한 후, 친수화 기재 4를, 내경 20㎜의 바닥부에 유리필터를 부착한 크로마토그래프관을 이용해서 10㎖씩 취하여, 80㎖ 마개 부착 샘플 병 2개에 각각 옮겼다. 한쪽의 샘플 병에는, 5N 수산화 나트륨 수용액 60㎖를, 다른 쪽에는 순수 60㎖를 각각 가하고, 마개를 덮고, 각각의 슬러리 액을 혼합한 후, 25℃에서 4주간 정치 보관하였다. 보관 후의 각각의 친수화 기재 4의 전체 량을 0.5N의 HCI용액으로 잘 세정하고, 계속해서, 순수로 잘 세정한 후, 카복실기량을 0.1N 수산화 나트륨 용액에 의한 적정에 의해 측정하였다. 이들 친수화 기재의 카복실기량의 차이로부터, 5N 수산화 나트륨 용액 침지에 의한 가수분해에 의해 생성한 카복실기량을 산출하였다.
그 결과, 친수화 기재 4의 카복실기 생성량은 기재 1ℓ당 8.3밀리등량이었다.
실시예 2
제조예 5에서 얻어진 친수화 기재 5의 친수성과 내알칼리성을 평가하였다.
즉, 친수성의 평가는 실시예 1에 기재된 방법에 따라 행하였다. 그 결과, 단백질의 회수율은 어느 쪽도 95%이며, 친수화 기재 5는 친수성이 높은 것을 확인하였다.
또한, 내알칼리성의 평가는 실시예 1에 기재된 방법에 따라, 친수화 기재 5를 4주간 알칼리 수용액에 침지시킴으로써 행하였다. 침지 후의 기재의 내알칼리성을 실시예 1에 기재된 방법으로 평가한 바, 친수화 기재 5의 카복실기 생성량은 기재 1ℓ당 10.5밀리등량이었다.
실시예 3
제조예 6에서 얻어진 친수화 기재 6의 친수성과 내알칼리성을 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 평가하였다.
그 결과, 단백질의 회수율은 어느 쪽도 95%이며, 친수화 기재 6은 친수성이 높은 것을 확인하였다. 또한, 친수화 기재 6의 카복실기 생성량은 기재 1ℓ당 12.4밀리등량이었다.
실시예 4
제조예 7에서 얻어진 친수화 기재 7의 친수성과 내알칼리성을 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 평가하였다.
그 결과, 단백질의 회수율은 어느 쪽도 95%이며, 친수화 기재 6은 친수성이 높은 것을 확인하였다. 또한, 친수화 기재 7의 카복실기 생성량은 기재 1ℓ당 10.6밀리등량이었다.
실시예 5
제조예 4에서 얻어진 아미노화 충전제 4의 이온교환용량을 이하에 나타내는 방법으로 측정하였다. 즉, 실시예 1에 기재한 요령으로, 아미노화 충전제 4를 10㎖ 취하여, 이것을 1N 수산화 나트륨 수용액, 순수의 순서로 잘 세정하고, 0.1N 염산에 의한 적정에 의해 측정하였다. 그 결과, 아미노화 충전제 4의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 45밀리등량이었다.
다음에 아미노화 충전제 4의 내알칼리성을 이하에 나타낸 방법으로 평가하였다. 즉, 수산화 나트륨 수용액 침지 유무의 상기 아미노화 충전제에 대한 소혈청 알부민(이하, "BSA"라 약칭함)의 결합량 및 산성 단백질의 일정 용출조건에서의 용출용량을 측정하였다. 여기서, 수산화 나트륨 수용액 침지 조건은 침지 기간을 12주간으로 한 이외에는, 실시예 1에 있어서의 친수화 기재의 내알칼리성 평가와 같은 조건으로 행하였다.
<BSA 결합량의 측정>
순수로 잘 세정 후, 아미노화 충전제 4를 내경 10㎜의 바닥부에 유리 필터를 부착한 크로마토그래프관을 이용해서 정확하게 3㎖를 취하였다. 그 후에 아미노화 충전제 4의 10배 용량의, 50mM 트리스아미노메테인 완충액(pH 8.5)을 이용하여, 상기 아미노화 충전제를 3회 세정한 후, 50㎖ 메스플라스크에 옮겼다. BSA의 함유 농도가 20㎎/㎖인 상기 트리스아미노메테인 완충액 10㎖를 가하고, 10분간 혼합해서 BSA를 흡착시켰다. 그 후에 이 현탁액을 여과지에서 여과하여, 아미노화 충전제 4를 제거해서, 잔존 BSA 용액을 얻었다.
계속해서, 자외분광광도계에서 이 잔존 BSA 용액의 280㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 미리, 자외분광광도계를 이용하여, 기지 농도의 BSA 용액과 280㎚에서의 흡광도의 관계를 구한 상관도로부터, 잔존 BSA량을 구하였다. 그리고, 첨가한 200㎎의 BSA량과 잔존 BSA량과의 차를 BSA 결합량이라 하였다.
그 결과, 순수에 침지한 아미노화 충전제 4의 BSA 결합량은 29.5㎎/㎖, 12주간 수산화 나트륨에 침지한 아미노화 충전제 4의 BSA 결합량은 26.5㎎/㎖였다. 그들의 차이, 즉, 알칼리에 의한 BSA 결합량의 저하는 3.0㎎/㎖로 매우 작은 것을 확인하였다.
<산성 단백질의 용출용량의 측정>
아미노화 충전제 4를 내경 7.5㎜, 길이 75㎜의 스테인레스 칼럼에 충전하고, 초기 완충액에, 50mM 트리스아미노메테인 완충액(pH 8.5)을 이용하여, 1㎎/㎖ 농도의 단백질함유 시료를 0.05㎖ 주입하고, 칼럼에 단백질을 흡착시켰다. 그 후, 최종 완충액이 50mM 트리스아미노메테인 완충액(pH 8.5)이며, 그 위에 0.5M 염화나트륨 함유 용액이 되도록, 유속 1.0㎖/min에서 60분간의 선형 구배용출을 행하였다. 용출 단백질의 검출은 25±2℃, 자외선 흡수 검출기 UV8020(토소(주) 제품, 검출 파장은 280㎚)을 이용해서 행하였다. 시료로서는, 난백 알부민(이하, "OVA"라 약칭함)을, 대두 트립신 저해제(이하, "STI"라 약칭함)를 이용하였다. 그리고, 선형 구배 시작으로부터 각종 단백질의 피크 정상이 용출될 때까지의 용리액의 용출량을 측정하고, 이것을 용출 용량으로 하였다.
그 결과, 순수에 침지한 아미노화 충전제 4의 OVA의 용출용량은 16.2㎖, STI의 용출용량은 28.0㎖였다. 한편, 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 4의 OVA의 용출용량은 15.3㎖, STI의 용출용량은 27.0㎖였다. 즉, 알칼리에 의해 OVA에서 0.9㎖, STI에서 1.0㎖ 용출용량이 적어지는 것을 알 수 있었다. 즉, 상기 아미노화 충전제를 알칼리 수용액에 침지해도 용출용량의 변화는 작은 것, 바꾸어 말하면, 단백질의 보유력은 거의 변화되지 않은 것을 확인하였다.
<아미노화 충전제의 경도의 평가>
아미노화 충전제 4의 유통 특성을 측정하기 위해서, 체 분급에 의해서 얻어진 아미노화 충전제 4(체적평균 입자 직경: 74㎛, 표준편차: 13.4㎛)를 내경 10.7㎜, 길이 150㎜의 스테인레스 칼럼에 슬러리 충전법으로 충전하였다. 정류량 펌프(최대유속 10㎖/min)로 0으로부터 10㎖/min에서 순수를 통액하고, 최대 400㎪까지 측정가능한 부르동관식 압력계를 이용하여, 각 유속에서의 압력손실을 측정하였다. 다음에, 이 아미노화 충전제 4를 칼럼으로부터 빼내고, 빈 칼럼 및 송액 시스템의 동일 유속에서의 압력손실을 측정하고, 충전제 베드의 정미의 압력손실을 산출하였다.
그 결과, 최대유속 10㎖/min(선유속 667㎝/hr)까지 유속과 압력손실과는 직선관계를 나타내고, 최대유속의 압력손실은 78㎪이었다.
실시예 6
제조예 5에서 얻어진 아미노화 충전제 5의 이온교환용량을 실시예 5에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 그 결과, 아미노화 충전제 5의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 85밀리등량이었다. 또한, 아미노화 충전제 5의 내알칼리성 및 경도의 평가를 실시예 5에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 그들의 결과는 다음과 같았다.
<BSA 결합량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 5의 BSA 결합량은 37.4㎎/㎖, 12주간 수산화 나트륨에 침지한 아미노화 충전제의 BSA 결합량은 35.9㎎/㎖였다. 그 차이, 즉, 알칼리에 의한 단백질 결합량의 저하는 1.5㎎/㎖로 매우 작은 것을 확인하였다.
<산성 단백질의 용출용량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 5의 OVA의 용출용량은 17.2㎖, STI의 용출용량은 25.2㎖였다. 한편, 12주간 수산화 나트륨에 침지한 아미노화 충전제 5의 OVA의 용출용량은 16.8㎖, STI의 용출용량은 24.8㎖였다. 즉, 알칼리에 의해 OVA에서 0.4㎖, STI에서 0.4㎖ 용출용량이 적어지는 것으로 판명되었다. 즉, 아미노화 충전제 5를 알칼리 수용액에 침지해도 보유력은 거의 변화되지 않은 것을 확인하였다.
<아미노화 충전제의 경도>
아미노화 충전제 5의 유통 특성을 측정하기 위해서, 체 분급에 의해서 얻어진 아미노화 충전제 5(체적평균 입자 직경: 72㎛, 표준편차: 14.1㎛)를 내경 10.7㎜, 길이 150㎜의 스테인레스 칼럼에 슬러리 충전법으로 충전하였다. 이것 이후의 조작은 실시예 5에 기재된 방법과 완전히 마찬가지 조작을 행하여, 유속과 압력손실의 관계를 구하였다. 그 결과, 최대유속 10㎖/min(선유속 667㎝/hr)까지 유속과 압력손실과는 직선관계를 나타내고, 최대유속의 압력손실은 80㎪이었다.
실시예 7
제조예 6에서 얻어진 아미노화 충전제 6의 이온교환용량을 실시예 5에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 그 결과, 아미노화 충전제 6의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 70밀리등량이었다. 또한, 아미노화 충전제 6의 내알칼리성 및 경도의 평가를 실시예 5에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 그들의 결과는 다음과 같았다.
<BSA 결합량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 6의 BSA 결합량은 26.1㎎/㎖, 12주간 수산화 나트륨에 침지한 아미노화 충전제 6의 BSA 결합량은 24.7㎎/㎖였다. 그 차이, 즉, 알칼리에 의한 단백질 결합량의 저하는 1.4㎎/㎖로 매우 작은 것을 확인하였다.
<산성 단백질의 용출용량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 6의 OVA의 용출용량은 17.9㎖, STI의 용출용량은 26.3㎖였다. 한편, 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 6의 OVA의 용출용량은 17.0㎖, STI의 용출용량은 24.9㎖였다. 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 6은 OVA에서 0.9㎖, STI에서 1.4㎖ 용출용량이 감소한 것으로 판명되었다. 즉, 아미노화 충전제 6을 알칼리 수용액에 침지해도 보유력은 거의 변화되지 않은 것을 확인하였다.
<아미노화 충전제의 경도>
아미노화 충전제 6의 유통 특성을 측정하기 위해서, 체 분급에 의해 얻어진 아미노화 충전제 6(체적평균 입자 직경: 76㎛, 표준편차: 13.1㎛)을 내경 10.7㎜, 길이 150㎜의 스테인레스 칼럼에 슬러리 충전법으로 충전하였다. 이것 이후의 조작은 실시예 5에 기재된 방법과 완전히 마찬가지 조작을 행하여, 유속과 압력손실의 관계를 구하였다. 그 결과, 최대유속 10 ㎖/min(선유속 667㎝/hr)까지 유속과 압력손실과는 직선관계를 나타내고, 최대유속의 압력손실은 75㎪이었다.
실시예 8
제조예 7에서 얻어진 아미노화 충전제 7의 이온교환용량을 실시예 5에 기재된 방법에 따라 측정하였다. 그 결과, 아미노화 충전제 7의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 125밀리등량이었다. 또한, 아미노화 충전제 7의 내알칼리성 및 경도의 평가를 실시예 5에 기재된 방법에 따라 실시하였다. 그들의 결과는 다음과 같았다.
<BSA 결합량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 7의 BSA 결합량은 26.2㎎/㎖, 12주간 수산화 나트륨에 침지한 아미노화 충전제 7의 BSA 결합량은 25.2㎎/㎖였다. 그 차이, 즉, 알칼리에 의한 단백질 결합량의 저하는 1.0㎎/㎖로 매우 작은 것을 확인하였다.
<산성 단백질의 용출용량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 7의 OVA의 용출용량은 17.6㎖, STI의 용출용량은 28.2㎖였다. 한편, 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 7의 OVA의 용출용량은 16.8㎖, STI의 용출용량은 27.4㎖였다. 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 7은 OVA에서 0.8㎖, STI에서 0.8㎖ 용출용량이 적어지는 것으로 판명되었다. 즉, 아미노화 충전제 7을 알칼리 수용액에 침지해도 보유력은 거의 변화되지 않은 것을 확인하였다.
<아미노화 충전제의 경도>
아미노화 충전제 7의 유통 특성을 측정하기 위해서, 체 분급에 의해 얻어진 아미노화 충전제 7(체적평균 입자 직경: 74㎛, 표준편차: 13.1㎛)을 내경 10.7㎜, 길이 150㎜의 스테인레스 칼럼에 슬러리 충전법으로 충전하였다. 이것 이후의 조작은 실시예 5에 기재된 방법과 완전히 마찬가지 조작을 행하여, 유속과 압력손실의 관계를 구하였다. 그 결과, 최대유속 10㎖/min(선유속 667㎝/hr)까지 유속과 압력손실과는 직선관계를 나타내고, 최대유속의 압력손실은 77㎪이었다.
실시예 9
제조예 9에서 얻어진 아미노화 충전제 9의 내알칼리성의 평가를 수산화 나트륨 수용액 침지 유무의 상기 아미노화 충전제에 대한 산성 단백질의 일정 용출조건에서의 용출용량측정에 의해서 행하였다. 수산화 나트륨 수용액 침지 조건은 실시예 5와 마찬가지 조건으로 행하였다.
<산성 단백질의 용출용량의 측정>
아미노화 충전제 9를 내경 4.6㎜, 길이 35㎜의 스테인레스 칼럼에 충전하고, 초기 완충액에, 50mM 트리스아미노메테인 완충액(pH 8.5)을 이용하고, 1㎎/㎖ 농도의 단백질 함유 시료를 0.02㎖ 주입하고, 칼럼에 단백질을 흡착시켰다. 그 후, 최종 완충액이 50mM 트리스아미노메테인 완충액(pH 8.5)이며, 게다가 0.5M 염화나트륨 함유 용액이 되도록, 유속 1.0㎖/min에서 30분간의 선형 구배 용출을 행하였다. 용출 단백질의 검출은 25±2℃, 자외선 흡수 검출기 UV8020(토소사 제품, 검출 파장은 280㎚)을 이용해서 행하였다. 시료로서는 OVA 및 STI를 이용하였다. 그리고, 선형 구배 시작으로부터 각종 단백질의 피크 정상이 용출될 때까지의 용리액의 용출량을 측정하고, 이것을 용출용량으로 하였다.
그 결과, 순수로 세정한 아미노화 충전제 9의 OVA의 용출용량은 6.5㎖, STI의 용출용량은 13.5㎖였다. 한편, 수산화 나트륨 용액에 12주간 침지한 아미노화 충전제 9를 순수로 잘 세정한, 세정후의 상기 아미노화 충전제의 OVA의 용출용량은 6.3㎖, STI의 용출용량은 13.2㎖였다. 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 9는 OVA에서 0.2㎖, STI에서 0.3㎖ 용출용량이 감소하였다. 이 변화량은, 오차의 범위에 가깝고, 아미노화 충전제 9를 알칼리 수용액에 침지해도 용출용량은 거의 변화되지 않은 결과였다.
비교예 1
제조예 1에서 얻어진 친수화 기재 1의 내알칼리성을 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 평가하였다. 친수화 기재 1의 카복실기 생성량은 기재 1ℓ당 125밀리등량이었다.
비교예 2
제조예 2에서 얻어진 친수화 기재 2의 내알칼리성을 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 평가하였다. 친수화 기재 2의 카복실기 생성량은 충전제 1ℓ당 137밀리등량이었다.
비교예 3
제조예 1에서 얻어진 아미노화 충전제 1의 이온교환용량을 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 측정하였다. 그 결과, 아미노화 충전제 1의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 128밀리등량이었다. 또한, 아미노화 충전제 1의 내알칼리성을 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 평가하였다. 그 결과는 다음과 같았다.
<BSA 결합량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 1의 BSA 결합량은 35.6㎎/㎖, 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 1의 BSA 결합량은 0.6㎎/㎖였다. 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지시킴으로써, 아미노화 충전제 1의 흡착량이 마이너스 35.0㎎/㎖의 대폭적인 저하를 가져온 것을 확인하였다.
<산성 단백질의 용출용량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 1의 OVA의 용출용량은 17.8㎖, STI의 용출용량은 25.9㎖였다. 한편, 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 1의 OVA의 용출용량은 4.6㎖, STI의 용출용량은 7.8㎖였다. 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 1은 OVA에서 마이너스 13.2㎖, STI에서 마이너스 18.1㎖로 대폭 용출 용량이 적어지는 것으로 판정되었다. 즉, 아미노화 충전제 1을 알칼리 수용액에 침지하면 보유력은 대폭 저하하는 것을 확인하였다.
비교예 4
제조예 2에서 얻어진 아미노화 충전제 2의 이온교환용량을 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 측정하였다. 그 결과, 아미노화 충전제 2의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 119밀리등량이었다. 또한, 아미노화 충전제 2의 내알칼리성을 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 평가하였다. 그 결과는 다음과 같았다.
<BSA 결합량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 2의 BSA 결합량은 33.9㎎/㎖, 12주간 수산화 나트륨에 침지한 아미노화 충전제 2의 BSA 결합량은 1.0㎎/㎖였다. 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지시킴으로써, 아미노화 충전제 2의 흡착량이 마이너스 32.9㎎/㎖의 대폭적인 저하를 가져온 것을 확인하였다.
<산성 단백질의 용출용량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 2의 OVA의 용출용량은 16.6㎖, STI의 용출용량은 22.3㎖였다. 한편, 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 2의 OVA의 용출용량은 4.9㎖, STI의 용출용량은 8.4㎖였다. 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 2는 OVA에서 마이너스 11.7㎖, STI에서 마이너스 13.9㎖로 대폭 용출용량이 적어지는 것으로 판정되었다. 즉, 아미노화 충전제 2를 알칼리 수용액에 침지하면 보유력은 대폭 저하하는 것을 확인하였다.
비교예 5
제조예 3에서 얻어진 아미노화 충전제 3의 이온교환용량을 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 측정하였다. 그 결과, 아미노화 충전제 3의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 106밀리등량이었다. 또한, 아미노화 충전제의 내알칼리성 및 경도를 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 평가하였다. 그 결과는 다음과 같았다.
<BSA 결합량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 3의 BSA 결합량은 30.7㎎/㎖, 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 3의 BSA 결합량은 0.7㎎/㎖였다. 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 3의 흡착량이 마이너스 30.0㎎/㎖의 대폭적인 저하를 가져온 것을 확인하였다.
<아미노화 충전제의 경도>
아미노화 충전제 3의 유통 특성을 측정하기 위해서, 체 분급에 의해 얻어진 아미노화 충전제 3(체적평균 입자 직경: 76㎛, 표준편차: 12.1㎛)을 내경 10.7㎜, 길이 150㎜의 스테인레스 칼럼에 슬러리 충전법으로 충전하였다. 이것 이후의 조작은 실시예 5에 기재된 방법과 완전히 마찬가지 조작을 행하여, 유속과 압력손실의 관계를 구하였다. 그 결과 유속이 6㎖/min(선유속 400㎝/hr)을 넘으면 유속과 압력손실의 관계는 직선으로부터 어긋나기 시작하고, 압력의 상승이 심하게 되었다. 그리고, 10㎖/min의 유속으로는 압력손실의 영향이 커서, 흐를 수 없는 상태였다.
비교예 6
제조예 8에서 얻어진 아미노화 충전제 8의 내알칼리성의 평가를 실시예 9에 기재된 산성 단백질의 용출용량측정법에 따라 행하였다. 그 결과는 다음과 같았다.
<산성 단백질의 용출용량>
순수로 세정한 아미노화 충전제 8의 OVA의 용출용량은 7.5㎖, STI의 용출용량은 15.8㎖였다. 한편, 수산화 나트륨 용액에 12주간 침지한 아미노화 충전제 8의 OVA의 용출용량은 2.5㎖, STI의 용출용량은 4.4㎖였다. 수산화 나트륨 용액에 침지한 아미노화 충전제 8은 OVA에서 마이너스 5.0㎖, STI에서 마이너스 11.4㎖ 용출용량이 적어져, 거의 유지되지 않게 되는 것으로 판명되었다.
실시예 10
제조예 10에서 얻어진 친수화 기재 10의 친수성과 내알칼리성을 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 평가하였다. 그 결과, 단백질의 회수율은 어느 쪽도 95% 이상이며, 친수화 기재 10은 친수성이 높은 것을 확인하였다. 또한, 친수화 기재 10의 카복실기 생성량은 기재 1ℓ당 25.5밀리등량이었다.
실시예 11
제조예 11에서 얻어진 친수화 기재 11의 친수성과 내알칼리성을 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 평가하였다. 그 결과, 단백질의 회수율은 어느 쪽도 95% 이상이며, 친수화 기재 11은 친수성이 높은 것을 확인하였다. 또한, 친수화 기재 11의 카복실기 생성량은 기재 1ℓ당 28.0밀리등량이었다.
실시예 12
제조예 12에서 얻어진 아미노화 충전제 12의 이온교환용량을 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 측정하였다. 그 결과, 아미노화 충전제 12의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 75밀리등량이었다. 또한, 아미노화 충전제의 내알칼리성을 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 평가하였다. 그 결과는 다음과 같았다.
<BSA 결합량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 12의 BSA 결합량은 34.8㎎/㎖, 12주간 수산화 나트륨에 침지한 아미노화 충전제 12의 BSA 결합량은 29.0㎎/㎖였다. 그 차이, 즉, 알칼리에 의한 단백질 결합량의 저하는 5.8㎎/㎖로 작은 것을 확인하였다.
<산성 단백질의 용출용량>
순수에 침지한 아미노화 충전제 12의 OVA의 용출용량은 18.2㎖, STI의 용출 용량은 27.2㎖였다. 한편, 12주간 수산화 나트륨에 침지한 아미노화 충전제 12의 OVA의 용출용량은 16.4㎖, STI의 용출용량은 24.8㎖였다. 즉, 알칼리에 의해 OVA에서 1.8㎖, STI에서 2.6㎖ 용출용량이 감소하는 것으로 판명되었다. 즉, 아미노화 충전제 12를 알칼리 수용액에 침지해도 보유력 변화는 적은 것을 확인하였다.
실시예 13
제조예 15에서 얻어진 4급 암모늄화 충전제 15의 이온교환용량을 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 측정하였다. 그 결과, 4급 암모늄화 충전제 15의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 95밀리등량이었다. 또한, 4급 암모늄화 충전제 15의 내알칼리성을 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 평가하였다. 그 결과는 다음과 같았다.
<BSA 결합량>
순수에 침지한 4급 암모늄화 충전제 15의 BSA 결합량은 43.5㎎/㎖, 12주간 수산화 나트륨에 침지한 4급 암모늄화 충전제 15의 BSA 결합량은 37.4㎎/㎖였다. 그 차이, 즉, 알칼리에 의한 단백질 결합량의 저하는 6.1㎎/㎖로 작은 것을 확인하였다.
<산성 단백질의 용출용량>
순수에 침지한 4급 암모늄화 충전제 15의 OVA의 용출용량은 20.4㎖, STI의 용출용량은 31.0㎖였다. 한편, 12주간 수산화 나트륨에 침지한 4급 암모늄화 충전제 15의 OVA의 용출용량은 18.4㎖, STI의 용출용량은 28.1㎖였다. 즉, 알칼리에 의해 OVA에서 1.8㎖, STI에서 2.6㎖ 용출용량이 감소하는 것으로 판명되었다. 즉, 4급 암모늄화 충전제 15를 알칼리 수용액에 침지해도 보유력 변화는 적은 것을 확인하였다.
실시예 14
제조예 13에서 얻어진 설폰화 충전제 13의 이온교환용량을 이하에 나타내는 방법으로 측정하였다. 즉, 실시예 1에 기재한 요령으로, 설폰화 충전제 13을 10㎖ 취하여, 이것을 1N 염산, 순수의 순서로 잘 세정하고, 0.1N 수산화 나트륨 수용액에 의한 적정에서 측정하였다. 그 결과, 설폰화 충전제 13의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 90.0밀리등량(pH 7.0)이었다.
다음에 설폰화 충전제 13의 내알칼리성을 이하에 나타낸 방법으로 평가하였다. 즉, 수산화 나트륨 수용액 침지 유무의 설폰화 충전제 13의 이온교환용량을 pH 3.5 및 8.5에 있어서 각각 측정하고, pH 3.5과 pH 8.5 사이의 이온교환용량차이에 의해 내알칼리성을 평가하였다. 즉, (메타)크로일계 모노머 중합체로 이루어진 충전제에서는, 설폰산기는 pH 3.5 이하로 거의 이온화하지만, 카복실산기는 pH 3.5 이상이 아니면 이온화하지 않고, pH 3.5 이상에서 이온화를 시작하여 8.5까지 거의 완전하게 이온화한다. 따라서, pH 3.5과 8.5 사이의 이온교환용량차이의 변화로부터 에스터 가수분해로 생기는 카복실산량을 측정할 수 있다. 또한, pH 3.5의 이온교환용량 변화로 설폰산기의 방출량을 측정할 수 있다. 또한, 수산화 나트륨 수용액 침지 조건은, 침지 기간은 12주간으로 하는 이외에는 실시예 1의 친수화 기재에 있어서의 내알칼리성의 평가 방법과 같은 조건으로 하였다.
그 결과, 순수에 침지한 설폰화 충전제 13의, pH 3.5 및 8.5에 있어서의 충전제 1ℓ당의 이온교환용량은 각각 86.2밀리등량과 90.5밀리등량이었다. 한편, 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 설폰화 충전제 13에서는, pH 3.5 및 8.5에 있어서의 충전제 1ℓ당의 이온교환용량은 각각 85.8밀리등량과 90.8밀리등량이었다. 따라서, 설폰산기의 방출량 및 카복실산 생성량은 각각 0.4밀리등량과 5.0밀리등량으로 매우 적어, 설폰화 충전제 13이 안정적인 것이 확인되었다.
실시예 15
제조예 14에서 얻어진 카복시메틸화 충전제 14의 이온교환용량을 실시예 14에 기재된 방법에 따라서 측정하였다. 그 결과, 카복시메틸화 충전제 14의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 64.5밀리등량(pH 8.5)이었다.
다음에, 상기 카복시메틸화 충전제의 내알칼리성을 이하에 나타낸 방법으로 평가하였다. 즉, 수산화 나트륨 수용액 침지 유무의 카복시메틸화 충전제의 pH 8.5에 있어서의 이온교환용량의 변화로 측정하였다. 단, 이 방법에서는, 카복시메틸기를 함유하는 에스터기의 가수분해에 의해 카복실산이 생성되므로, 충전제의 알칼리 내성을 정확하게는 측정할 수 없는 것으로 생각되지만, 이외에 적당한 방법이 없기 때문에, 이 방법으로 평가하는 것으로 한다. 또한, 수산화 나트륨 수용액 침지 조건은, 침지 기간을 12주간으로 하는 이외에는 실시예 1의 친수화 기재에 있어서의 내알칼리성 평가와 같은 조건으로 하였다.
그 결과, 순수에 침지한 카복시메틸화 충전제 14의 pH 8.5에 있어서의 충전제 1ℓ당의 이온교환용량은 64.5밀리등량이었다. 한편, 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 카복시메틸화 충전제 14에서는 64.5밀리등량이었다. 즉, 이온교환용량에는 전혀 변화가 없었다.
비교예 7
제조예 18에서 얻어진 4급 암모늄화 충전제 18의 이온교환용량을 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 측정하였다. 그 결과, 4급 암모늄화 충전제 18의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 129밀리등량이었다. 또한, 4급 암모늄화 충전제 18의 내알칼리성을 실시예 5에 기재된 방법에 따라서 평가하였다. 그 결과는 다음과 같았다.
<BSA 결합량>
순수에 침지한 4급 암모늄화 충전제 18의 BSA 결합량은 38.8㎎/㎖, 12주간 수산화 나트륨에 침지한 4급 암모늄화 충전제 18의 BSA 결합량은 1.4㎎/㎖였다. 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 4급 암모늄화 충전제 18의 흡착량은 마이너스 37.4㎎/㎖의 대폭적인 저하를 가져온 것을 확인하였다.
<산성 단백질의 용출용량>
순수에 침지한 4급 암모늄화 충전제 18의 OVA의 용출용량은 21.8㎖, STI의 용출용량은 33.2㎖였다. 한편, 12주간 수산화 나트륨에 침지한 4급 암모늄화 충전제 18의 OVA의 용출용량은 5.6㎖, STI의 용출용량은 10.2㎖였다. 즉, 알칼리에 의해 OVA에서 마이너스 16.2㎖, STI에서 마이너스 23.0㎖로 대폭 용출용량이 적어지는 것으로 판명되었다. 즉, 4급 암모늄화 충전제 18을 알칼리 수용액에 침지하면 보유력은 대폭 저하하는 것을 확인하였다.
비교예 8
제조예 16에서 얻어진 설폰화 충전제 16의 이온교환용량을 실시예 14에 기재된 방법에 따라서 측정하였다. 그 결과, 설폰화 충전제 16의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 95.4밀리등량(pH 7.0)이었다.
다음에, 실시예 14에 기재된 방법에 따라서 설폰화 충전제 16의 내알칼리성을 평가하였다. 그 결과, 순수에 침지한 설폰화 충전제 16의, pH 3.5 및 8.5에 있어서의 충전제 1ℓ당의 이온교환용량은 각각 91.2밀리등량과 96.4밀리등량이었다. 한편, 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 설폰화 충전제 16에서는, pH 3.5 및 8.5에 있어서의 충전제 1ℓ당의 이온교환용량은 각각 58.6밀리등량과 102.8밀리등량이었다. 따라서, 설폰산기의 방출량 및 카복실산 생성량은 각각 32.6밀리등량과 44.2밀리등량이며, 많은 에스터 가수분해가 일어나 설폰산기를 함유하는 알코올이 방출된 것이 확인되었다.
비교예 9
제조예 17에서 얻어진 카복시메틸화 충전제 17의 이온교환용량을 실시예 14에 기재된 방법에 따라서 측정하였다. 그 결과, 카복시메틸화 충전제 17의 이온교환용량은 충전제 1ℓ당 68.8밀리등량(pH 8.5)이었다.
다음에, 카복시메틸화 충전제 17의 내알칼리성을 실시예 15에 기재된 방법에 따라서 평가하였다. 또한, 수산화 나트륨 수용액 침지 조건은, 침지 기간을 12주간으로 한 이외에는, 실시예 1에 있어서의 친수화 기재의 내알칼리성 평가 방법과 같은 조건으로 하였다.
그 결과, 순수에 침지한 카복시메틸화 충전제 17의 pH 8.5에 있어서의 충전제 1ℓ당의 이온교환용량은 68.8밀리등량이었다. 한편, 12주간 수산화 나트륨 용액에 침지한 카복시메틸화 충전제 17에서는, pH 8.5에 있어서의 충전제 1ℓ당의 이온교환용량은 96.4밀리등량이었다. 즉, 이온교환용량은 27.6밀리등량 증가하고 있었다. 이 증가는 카복시메틸기를 함유하지 않은 에스터기의 가수분해로 새롭게 카복실산이 생성되었기 때문이며, 에스터기의 가수분해가 진행하고 있는 것을 나타내고 있다.
이상의 실시예 및 비교예의 결과를 각각 표 4 내지 표 7에 함께 나타낸다.
번호 친수화 기재 번호 평가
친수성 내알칼리성
실시예 1 친수화 기재 4 ≥ 95% 8.3 meq/ℓ
실시예 2 친수화 기재 5 95% 10.5 meq/ℓ
실시예 3 친수화 기재 6 95% 12.4 meq/ℓ
실시예 4 친수화 기재 7 95% 10.6 meq/ℓ
실시예 10 친수화 기재 10 ≥ 95% 25.5 meq/ℓ
실시예 11 친수화 기재 11 ≥ 95% 28.0 meq/ℓ
비교예 1 친수화 기재 1 - 125 meq/ℓ
비교예 2 친수화 기재 2 - 137 meq/ℓ


충전제
번호		 평가

이온교환
용량		 내알칼리성 경도
BSA 결합량 OVA용출량의 감소량 STI결합량의 감소량
초기치 감소량 감소율
실시예 5 아미노화 충전제 4 45 meq/ℓ 29.5㎎/㎖ 3.0㎎/㎖ 10.2% 0.9㎖ 1.0㎖ 78㎪
실시예 6 아미노화 충전제 5 85 meq/ℓ 37.4㎎/㎖ 1.5㎎/㎖ 4.0% 0.4㎖ 0.4㎖ 80㎪
실시예 7 아미노화 충전제 6 70 meq/ℓ 26.1㎎/㎖ 1.4㎎/㎖ 5.4% 0.9㎖ 1.4㎖ 75㎪
실시예 8 아미노화 충전제 7 125 meq/ℓ 26.2㎎/㎖ 1.0㎎/㎖ 3.8% 0.8㎖ 0.8㎖ 77㎪
실시예 9 아미노화 충전제 9 - - - - 0.2㎖ 0.3㎖ -
실시예 12 아미노화 충전제 12 75 meq/ℓ 34.8㎎/㎖ 5.8㎎/㎖ 16.7% 1.8㎖ 2.6㎖ -
실시예 13 4급 암모늄화 충전제15 95 meq/ℓ 43.5㎎/㎖ 6.1㎎/㎖ 14.0% 1.8㎖ 2.6㎖ -
비교예 3 아미노화 충전제 1 128 meq/ℓ 35.6㎎/㎖ 35.0㎎/㎖ 98.4% 13.2㎖ 18.1㎖ -
비교예 4 아미노화 충전제 2 119 meq/ℓ 33.9㎎/㎖ 32.9㎎/㎖ 97.1% 11.7㎖ 13.9㎖ -
비교예 5 아미노화 충전제 3 106 meq/ℓ 30.7㎎/㎖ 30.0㎎/㎖ 97.7% - - 측정
불능
비교예 6 아미노화 충전제 8 - - - - 5.0㎖ 11.4㎖ -
비교예 7 4급 암모늄화 충전제18 129 meq/ℓ 38.8㎎/㎖ 37.4㎎/㎖ 96.4% 16.2㎖ 23.0㎖ -


충전제
번호		 평가
이온교환
용량
(pH 7.0)		 내알칼리성
이온교환용량(pH 3.5) 이온교환용량차(pH 8.5)-(pH 3.5)
초기치 설폰산기의
감소량		 초기치 카복실산의
증가량
실시예 14 설폰화
충전제 13		 90 meq/ℓ 86.2 meq/ℓ 0.4 meq/ℓ 4.3 meq/ℓ 5.0 meq/ℓ
비교예 8 설폰화
충전제 16		 95.4 meq/ℓ 91.2 meq/ℓ 32.6 meq/ℓ 5.2 meq/ℓ 44.2 meq/ℓ
번호 충전제 번호 내알칼리성
이온교환용량(pH 8.5)
초기치 처리후 변화량
실시예 15 카복시메틸화 충전제 14 64.5 meq/ℓ 64.5 meq/ℓ 0 meq/ℓ
비교예 9 카복시메틸화 충전제 17 68.8 meq/ℓ 96.4 meq/ℓ 27.6 meq/ℓ
고속·고분리에 적용가능한 기계강도를 갖고, 또 단백질에 대하여 비특이적 흡착을 야기하지 않으므로 충분한 친수성을 가지며, 또한 고농도의 알칼리 수용액에 침지해도 단백질의 흡착량, 보유력 등의 변화가 작은 신규 충전제가 제공된다. 이들은 수용액에 용해한 물질(특히 단백질)과의 흡착·탈착 작용을 나타내고, 목적물질의 포집이나 액체 크로마토그래피법에 이용할 수 있다.
또한, 2005년 6월 9일에 출원된 일본 특허출원 제2005-169111호의 명세서, 특허청구범위 및 요약서의 전체 내용을 여기에 인용하고, 본 발명의 명세서의 개시로서 받아들인다.

Claims (18)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머로부터 유도되는 반복 단위를 20 내지 95 몰% 함유하는 가교중합체 입자로 이루어진 것을 특징으로 하는 충전제:
    [화학식 1]
    Figure 112007086925225-pct00004
    [화학식 1 중, R2는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고; R1은 -NR3-R4-R5 또는 -O-R4-R5를 나타내며; R3는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고; R4는 지방족 고리를 포함하는 탄소수 6 내지 15의 알킬렌기 또는 탄소수 4 내지 8의 직쇄 알킬렌기를 나타내며; R5는 할로겐 원자, 알코올성 OH기, 아미노기, 글리시딜기 또는 에폭시기를 나타내고; 여기서, R5가 에폭시기인 경우, 상기 에폭시기는 R4 중에 함유되는 지방족 고리의 일부에 직접 에폭시기가 도입되어 있어도 되고, 지방족 고리에 펜던트(pendant)형으로 부가되어 있어도 되며, 또한 R5가 글리시딜기인 경우에는, 글리시딜 에터의 형태로 R4에 결합한다].
  2. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머로부터 유도되는 반복 단위를 20 내지 95 몰%와, 중합가능한 불포화결합을 2개 이상 가지는 다관능성 모노머로부터 유도되는 반복 단위를 80 내지 5 몰% 함유하는 가교중합체 입자로 이루어진 충전제.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머와 중합가능한 불포화결합을 2개 이상 가지는 다관능성 모노머를 중합해서 얻어지는 가교중합체 입자로 이루어진 충전제.
  4. 하기 화학식 1로 표시되는 모노머로부터 유도되는 하기 화학식 2로 표시되는 반복 단위를 20 내지 95 몰%와,
    하기 화학식 3으로 표시되는 반복 단위를 80 내지 5 몰% 함유하는 가교중합체 입자로 이루어진 것을 특징으로 하는 충전제:
    [화학식 1]
    Figure 712013002585239-pct00008
    [화학식 1 중, R2는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고; R1은 -NR3-R4-R5 또는 -O-R4-R5를 나타내며; R3는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고; R4는 지방족 고리를 포함하는 탄소수 6 내지 15의 알킬렌기 또는 탄소수 4 내지 8의 직쇄 알킬렌기를 나타내며; R5는 할로겐 원자, 알코올성 OH기, 아미노기, 글리시딜기 또는 에폭시기를 나타내고; 여기서, R5가 에폭시기인 경우, 상기 에폭시기는 R4 중에 함유되는 지방족 고리의 일부에 직접 에폭시기가 도입되어 있어도 되고, 지방족 고리에 펜던트(pendant)형으로 부가되어 있어도 되며, 또한 R5가 글리시딜기인 경우에는, 글리시딜 에터의 형태로 R4에 결합한다].
    [화학식 2]
    Figure 712013002585239-pct00005
    [화학식 2 중, R2는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고; R1은 -NR3-R4-R5 또는 -O-R4-R5를 나타내며; R3는 수소원자 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타내고; R4는 지방족 고리를 포함하는 탄소수 6 내지 15의 알킬렌기 또는 탄소수 4 내지 8의 직쇄 알킬렌기를 나타내며; R5는 할로겐 원자, 알코올성 OH기, 아미노기, 글리시딜기 또는 에폭시기를 나타내고; 여기서, R5가 에폭시기인 경우, 상기 에폭시기는 R4 중에 함유되는 지방족 고리의 일부에 직접 에폭시기가 도입되어 있어도 되고, 지방족 고리에 펜던트형으로 부가되어 있어도 무방하며, 또한 R5가 글리시딜기인 경우에는, 글리시딜 에터의 형태로 R4에 결합한다]
    [화학식 3]
    Figure 712013002585239-pct00006
    [화학식 3 중, R6 및 R7은 각각 독립하여 수소원자 또는 탄소수 1 내지 3의 알킬기를 나타내고, R8은 아릴기, 옥시카보닐기 또는 카바모일기를 갖는 2관능성의 유기기를 나타낸다].
  5. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 가교중합체 입자는 평균 입자 직경이 5 내지 300 ㎛인 다공성 입자인 충전제.
  6. 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머 20 내지 95 몰%와 중합가능한 불포화결합을 2개 이상 가지는 다관능성 모노머를 함유하는 모노머 혼합물 및 현탁 안정제를 수상에 현탁시켜 중합하는, 제 1항 또는 제 4항에 기재된 충전제의 제조 방법.
  7. 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머 20 내지 95 몰%와 중합가능한 불포화결합을 2개 이상 가지는 다관능성 모노머 80 내지 5몰%를 함유하는 모노머 혼합물 및 현탁 안정제를 수상에 현탁시켜 중합하는, 제 1항 또는 제 4항에 기재된 충전제의 제조 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 (메타)아크릴로일계 모노머는 3,4-에폭시사이클로헥실메틸 메타크릴레이트, 1,3-하이드록시아다만탄-1-메타크릴레이트, 1,4-사이클로헥세인다이메탄올 모노아크릴레이트, 1,4-하이드록시부틸아크릴레이트, 4-하이드록시부틸아크릴레이트 글리시딜에터, 4-브로모부틸메타크릴레이트 및 6-아미노헥실메타크릴아마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상인 충전제의 제조 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 중합가능한 불포화결합을 2개 이상 가지는 다관능성 모노머는 에틸렌글라이콜 다이메타크릴레이트, 1,3-아다만탄 다이메타크릴레이트, 다이비닐벤젠 및 트라이메틸올프로페인 트라이아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상인 충전제의 제조 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 입자 표면에 친수성 기를 가진 충전제.
  11. 제 10항에 있어서, 제 1항에 기재된 충전제에 친수화제를 작용시켜서 얻어지는 충전제.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 표준물질로서 풀루란, 용리액으로서 순수를 사용한 경우의 배제한계분자량이 50만 내지 200만인 충전제.
  13. 제 1항 또는 제 10항에 있어서, 입자 표면에 이온교환기를 갖는 충전제.
  14. 제 13항에 있어서, 제 1항 또는 제 10항에 기재된 충전제를 형성하는 가교중합체 입자에 에폭시기가 함유되는 경우, 상기 함유되는 에폭시기를 개환시켜 이온교환기가 도입된 충전제.
  15. 제 10항에 있어서, 입자 표면에 친수성기를 가지는 가교중합체 입자를 에폭시화한 후, 상기 에폭시기를 개환시켜 이온교환기를 도입한 충전제.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 이온교환기는 설폰산기, 카복실기, 제 1급 아미노기, 제 2급 아미노기, 제 3급 아미노기 및 4급 암모늄기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인 충전제.
  17. 제 13항에 기재된 충전제를 이온교환 크로마토그래피용 충전제로서 이용하는 단백질의 분리 방법.
  18. 제 10항에 기재된 충전제를 크기배제 크로마토그래피용 충전제로서 이용하는 단백질의 분리 방법.
KR1020077028207A 2005-06-09 2006-06-08 친수성이 우수한 신규 충전제 및 그 제조 방법 KR101297282B1 (ko)

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