WO2023048115A1 - 血球分離剤、およびそれを用いた血球分離方法 - Google Patents

血球分離剤、およびそれを用いた血球分離方法 Download PDF

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WO2023048115A1
WO2023048115A1 PCT/JP2022/034900 JP2022034900W WO2023048115A1 WO 2023048115 A1 WO2023048115 A1 WO 2023048115A1 JP 2022034900 W JP2022034900 W JP 2022034900W WO 2023048115 A1 WO2023048115 A1 WO 2023048115A1
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WO
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polymer
blood cell
cell separation
inorganic carrier
agent
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/034900
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
亜美子 桝谷
晃司 渡邉
友也 照内
洋子 照内
実 竹内
Original Assignee
日東紡績株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the present invention relates to a blood cell separation agent and a blood cell separation method using the same, and more specifically to a blood cell separation agent in which a specific polymer is supported on an inorganic carrier and a blood cell separation method using the same.
  • Blood is a sample used for various biochemical or immunological tests, but it is usually separated into plasma or serum and blood cells and subjected to various analyses.
  • centrifugation is commonly used to separate plasma or serum from blood cells, but simpler and faster blood cell separation methods that do not require centrifugation are being investigated.
  • Simpler and faster blood cell separation methods that do not require centrifugation include, for example, a solution containing a cholic acid-based surfactant and an acid (Patent Document 1) or a specific quaternary amine sulfone polymer (Patent Document 2).
  • Patent Document 1 a solution containing a cholic acid-based surfactant and an acid
  • Patent Document 2 a specific quaternary amine sulfone polymer
  • a simple test device which includes a test pad containing a reagent that reacts with the target soluble component and a filter pad for separating the soluble component and blood cells (Patent Document 3). It consists of a carrier matrix impregnated with thrombin and lectin. In this device blood is introduced to a filter pad and plasma or serum separated from blood cells is introduced to a test pad for analysis. For this reason, this device has the advantage that the separated plasma or serum can be used for analysis as it is. No particular consideration is given to this point.
  • a blood filter in which a glass nonwoven fabric is impregnated or attached with a blood coagulant has been proposed (Patent Document 4), and poly(diallyldimethylammonium chloride) is used as the blood coagulant.
  • the blood coagulant may be dissociated from the glass nonwoven fabric and mixed with the separated plasma or serum, but no particular consideration is given to this point.
  • JP 2018-059791 A Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-26062 JP-A-4-212060 JP 2020-085887 A
  • the present invention provides a blood cell separation agent and a blood cell separation method using the same that can exhibit excellent blood cell separation performance without contamination of samples with polymers constituting the blood cell separation agent. for the purpose.
  • the present inventors treated blood with a blood cell separation agent in which various polymers having hemagglutination ability were attached to an inorganic carrier, and evaluated the blood cell separation ability.
  • a blood cell separation agent in which various polymers having hemagglutination ability were attached to an inorganic carrier, and evaluated the blood cell separation ability.
  • pH fluctuation was the main cause.
  • This problem is that the polymer is mixed in the separated sample and can be a factor affecting the analysis system.
  • a blood cell separating agent comprising an inorganic carrier and a polymer having a constitutional unit having an amino group, at least some of the amino groups are primary, secondary, or tertiary amino groups;
  • the present invention relates to a blood cell separating agent, wherein at least part of the polymer is supported on the inorganic carrier, and the polymer supported on the inorganic carrier is linked to the other polymer by cross-linking.
  • [2] to [19] below are all preferable aspects or embodiments of the present invention.
  • the polymer is (a1) allylamine (co)polymer, (a2) diallylamine (co)polymer, or (a3) polyethyleneimine. agent.
  • a blood cell separation agent comprising the step of contacting a sample containing blood cells with the blood cell separation agent according to any one of [1] to [10].
  • a blood cell comprising a step of supporting a polymer having a structural unit having an amino group on an inorganic carrier, and reacting the polymer with a cross-linking agent before or after carrying the polymer on the inorganic carrier to link the polymers by cross-linking.
  • the polymer is (a2) diallylamine (co)polymer or (a3) polyethyleneimine.
  • the polymer supported by the inorganic carrier does not detach, there is no contamination of the separated sample with the polymer, making it possible to perform accurate measurements in various analytical systems. Furthermore, even if the sample introduced into the analysis system is required to have a pH suitable for analysis, it is possible to separate blood cells under pH conditions suitable for analysis, and the sample obtained after separation treatment can be used for analysis as it is.
  • the blood cell separation agents (carriers are silica beads) of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 and 2 were tested for their blood cell separation ability and detachment of polymer from the carrier due to pH change. Red blood cells are seen in red, and in Examples 1 to 4, it can be seen that red blood cells are retained in the upper part of the reservoir. Moreover, in Comparative Example 2, it was confirmed that red blood cells moved downward from the top of the reservoir. On the other hand, in Comparative Example 1, red blood cells reached the bottom of the reservoir and flowed out of the reservoir. Further, in Examples 1 to 4, no substance that was dyed with Ponceau S was found in the pH 5.0 buffer solution.
  • Examples 14 and 15 show the results of tests on the blood cell separation agents (carriers are silica beads) of Examples 14 and 15 on blood cell separation ability and detachment of polymers from the carrier due to pH change. Erythrocytes appear red, and in Examples 14 and 15, it can be seen that erythrocytes are retained in the upper part of the reservoir. Moreover, in Examples 14 and 15, no substances stained with Ponceau S were observed in the pH 5.0 buffer solution, and it is understood that the polymer did not detach from the carrier.
  • the blood cell separating agent of the present invention is a blood cell separating agent comprising an inorganic carrier and a polymer having a structural unit having an amino group, at least some of the amino groups are primary, secondary, or tertiary amino groups; At least part of the polymer is supported on the inorganic carrier, and the polymer supported on the inorganic carrier is linked to the other polymer by cross-linking. That is, the blood cell separating agent of the present invention is a polymer (hereinafter also referred to as "specific polymer") having at least a portion of structural units having primary, secondary, or tertiary amino groups. It has The blood cell separation agent of the present invention can achieve excellent technical effects such as excellent blood cell separation performance by including the specific polymer.
  • the blood cell separating agent of the present invention may contain only one type of specific polymer, or may contain a combination of two or more types.
  • the specific polymer contains at least a structural unit (hereinafter also referred to as a "specific structural unit") having a primary, secondary, or tertiary amino group in its molecule. Any (co)polymer having one species is acceptable, and is not subject to any other restrictions.
  • “(co)polymer” is a concept that includes both homopolymers and copolymers. Therefore, the specific polymer may be a homopolymer consisting only of specific structural units. It may be a copolymer having a structural unit of
  • the specific polymer it preferably has a plurality of specific structural units. More specifically, the ratio of the specific structural unit to the total structural units of the specific polymer is preferably 1 mol% or more, more preferably 10 to 100 mol%, and 50 to 100 mol%. is particularly preferred.
  • the specific polymer may have only one type of specific structural unit in its molecule, or may have two or more types of specific structural units. When the polymer has two or more specific structural units, the ratio of the above specific structural units to all structural units of the specific polymer is calculated based on the total number of moles of the two or more specific structural units.
  • At least part of the specific structural unit may have a primary, secondary, or tertiary amino group, and is not subject to any other restrictions.
  • the specific polymers can be crosslinked relatively easily. Support on the carrier can be made more stable.
  • at least part of the amino groups in the specific structural unit be secondary amino groups or tertiary amino groups.
  • the amino group in the specific structural unit may be a free amino group or a cationic amino group having an addition salt or the like.
  • (a1) allylamine (co)polymer, (a2) diallylamine (co)polymer, and (a3) polyethylene Imines can preferably be used. Only one of (a1) allylamine (co)polymer, (a2) diallylamine (co)polymer, and (a3) polyethyleneimine may be used, or two or more thereof may be used in combination. Furthermore, from the viewpoint of realizing good blood cell separation performance, it is particularly preferable to use (a2) diallylamine (co)polymer and/or (a3) polyethyleneimine as the specific polymer.
  • the (a1) allylamine (co)polymer preferably used as the specific polymer in the present invention has a structural unit derived from (A1) a monoallylamine-based monomer. Since the monoallylamine-based monomer has an amino group, in the (a1) allylamine (co)polymer, the structural unit derived from the (A1) monoallylamine-based monomer corresponds to the specific structural unit described above.
  • the amino group in the structural unit derived from the monoallylamine-based monomer may be primary, secondary, or tertiary; From the viewpoint of, it is preferably a secondary amino group or a tertiary amino group.
  • the structural unit derived from the monoallylamine-based monomer preferably has a structure represented by the following formula (I) or a structure that is an addition salt thereof.
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom or a monovalent organic group, more preferably R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom having 1 to 12 carbon atoms. or a cycloalkyl group having 5 to 6 carbon atoms.
  • Alkyl groups having 1 to 12 carbon atoms preferred as R 1 and R 2 may be linear or branched, and may be aralkyl groups.
  • Examples include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, hexyl group, octyl group, decyl group and dodecyl group. , benzyl group and the like.
  • Preferred examples of cycloalkyl groups having 5 to 6 carbon atoms as R 1 and R 2 include, but are not limited to, cyclopentyl and cyclohexyl groups.
  • HX represents an inorganic acid or an organic acid
  • H is a hydrogen atom
  • X is not particularly limited as long as it is a group capable of forming an inorganic acid or an organic acid together with hydrogen.
  • the type of addition salt is not particularly limited, but from the viewpoint of availability and ease of reaction control, for example, hydrochloride, sulfate, phosphate, nitrate, sulfite, phosphite, nitrite, Hydrobromides, acetates, amide sulfates, methanesulfonates, trifluoroacetates, p-toluenesulfonates, and the like can be used.
  • hydrochlorides, sulfates, phosphates and amidosulfates are preferred, and hydrochlorides, sulfates, phosphates and amidosulfates having a structure derived from monoallylamine are particularly preferred.
  • the (a1) allylamine (co)polymer may consist entirely of structural units derived from the (A1) monoallylamine-based monomer (that is, even if it is a homopolymer of a monoallylamine-based monomer, well), or (A1) may have a structural unit other than the structural unit derived from the monoallylamine-based monomer (that is, a copolymer of a monoallylamine-based monomer and other monomers may be.).
  • the ratio of the structural unit (A1) to the total structural units of the (a1) allylamine (co)polymer is preferably 5 to 100 mol%, particularly preferably 10 to 100 mol%.
  • the ratio of the structural unit (A1) can be appropriately adjusted by adjusting the ratio of the monoallylamine-based monomer used in the production of the (a1) allylamine (co)polymer and other polymerization conditions. can be done.
  • (a1) allylamine (co)polymer there are no particular restrictions on the structural units other than the structural units derived from the (A1) monoallylamine-based monomer, and monomers copolymerizable with the monoallylamine-based monomer are appropriately selected. Such constitutional units can be derived by using and copolymerizing.
  • copolymerizable monomers include diallylamines such as diallylamine and diallylmethylamine, or addition salts thereof; anionic monomers such as dicarboxylic acids, acrylamide, dimethylacrylamide, acryloylmorpholine, N-[3-(dimethylamino) Acrylamides such as propyl] (meth)acrylamide, (3-acrylamidopropyl)trimethylammonium chloride, (3-methacrylamidopropyl)trimethylammonium chloride; allyl alcohols, allyl ethers such as ethylene glycol monoallyl ether; (meth) Allylsulfonic acids such as allylsulfonic acid (sodium) or addition salts thereof; vinylsulfonic acids such as vinylsulfonic acid (sodium) or addition salts thereof; sodium isoprenesulfonate; but not limited to these.
  • anionic monomers such as dicarboxylic acids, acrylamide, dimethylacrylamide,
  • diallylamines anionic monomers such as dicarboxylic acids, acrylamide, and the like can be preferably used. From the viewpoint of realizing good blood cell separation performance, it is particularly preferable to copolymerize diallylamines having a secondary amino group. Other monomers copolymerizable with the monoallylamine-based monomer may be used alone or in combination of two or more. Details of the diallylamines will be described later in relation to (a2) the diallylamine (co)polymer.
  • An anionic structural unit can be introduced into the allylamine (co)polymer (a1) by copolymerizing an anionic monomer such as an anionic structural unit dicarboxylic acid.
  • an anionic structural unit By having an anionic structural unit, the (a1) allylamine (co)polymer becomes a so-called amphoteric polymer, and advantageous effects such as miscibility with blood cells and hydrophilicity can be realized.
  • the anionic structural unit in the embodiment of the present invention may be a structural unit that can have a negative charge by dissociation, and is not subject to any other restrictions, but preferably has a structure derived from a divalent carboxylic acid, It is particularly preferred to have a structure represented by structural formula (1), (2), or (3) below.
  • R 3 is hydrogen or a methyl group
  • Y is independently hydrogen, Na, K, NH4 , 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, or 1/3Fe.
  • the anionic structural unit may have a structure that does not correspond to any of the above structural formulas (1), (2), and (3) as long as it has an anionic group such as a carboxyl group.
  • each anionic structural unit has a mutually different structure within the range represented by the same general structural formula (1), (2), or (3). or have different structures represented by different general structural formulas.
  • general structural formula (1) for example, although represented by general structural formula (1), a plurality of types of anionic constitutional units having different structures due to the different elements of Y may be used.
  • one anionic structural unit having a structure represented by structural formula (1) and another anionic structural unit having a structure represented by structural formula (2) may be used. .
  • At least part of the anionic structural units is preferably derived from maleic acid, and in this case, the anionic structural units have the structure represented by the above formula (2), and Y is either becomes hydrogen.
  • At least part of the anionic constitutional units may be derived from an unsaturated monocarboxylic acid.
  • the ratio of structural units derived from (A1) monoallylamine-based monomers/anionic structural units is 1/1 to 100/1. Preferably, it is particularly preferably between 1/1 and 10/1. Furthermore, the ratio of the sum of structural units derived from (A1) monoallylamine-based monomers and anionic structural units to all structural units (when no anionic structural units are present, (A1) monoallylamine-based monomer The ratio of the structural units derived from the polymer to the total structural units) is preferably 80 mol % or more, particularly preferably 90 mol % or more. (A1) The ratio of the sum of the structural units derived from the monoallylamine-based monomer and the anionic structural units to the total structural units is 80 mol% or more, so that favorable properties such as improvement in blood cell separation ability are obtained. can be realized.
  • the molecular weight of the allylamine (co)polymer is not particularly limited, and a (co)polymer having a suitably suitable molecular weight may be obtained or polymerized depending on the type of use in the blood cell separation agent, other components, etc. .
  • the weight average molecular weight (Mw) is preferably from 500 to 10,000,000 from the viewpoints of ease of carrying on an inorganic carrier and polymerization in a practically acceptable time and cost. More preferably, the weight average molecular weight (Mw) is from 1,000 to 1,000,000. It is particularly preferred that the weight average molecular weight (Mw) is from 2,000 to 500,000.
  • the molecular weight is preferably high within the above range, for example, the weight average molecular weight (Mw) is preferably 8,000 or more.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the allylamine (co)polymer can be measured, for example, by gel permeation chromatography (GPC method) using a liquid chromatograph. More specifically, it can be measured, for example, by the method described in the Examples of the present application.
  • the molecular weight of the allylamine (co)polymer is appropriately adjusted by adjusting the presence/absence, type and composition of comonomers, the temperature, time and pressure in the polymerization process, the type and amount of the radical initiator used in the polymerization process, and the like. can do.
  • the rotational viscosity [ ⁇ ] of the allylamine (co)polymer is not particularly limited, and can be appropriately set in consideration of the ease of supporting it on the inorganic carrier, the production cost, etc. (25° C.) is preferable, and 10 to 60 mPa ⁇ s (25° C.) is particularly preferable.
  • the rotational viscosity [ ⁇ ] can be measured by a method commonly used in the industry, and can be measured, for example, with a digital Brookfield viscometer DV-3T manufactured by AMETEK Brookfield. In the measurement, a ULA adapter is used, and the liquid volume is typically 16 mL, and the liquid temperature can be measured at 25°C.
  • Rotational viscosity [ ⁇ ] is also adjusted appropriately by adjusting the dilution concentration during polymerization, the presence or absence, type and composition of comonomers, the temperature, time and pressure in the polymerization process, the type and amount of radical initiator used in the polymerization process, etc. can do.
  • the (a2) diallylamine (co)polymer preferably used as the specific polymer in the present invention is a (co)polymer having a structural unit derived from the (A2) diallylamine-based monomer. be. Since the diallylamine-based monomer has an amino group, in the (a2) diallylamine (co)polymer, the structural unit derived from the (A2) diallylamine-based monomer corresponds to the specific structural unit described above.
  • the term "(co)polymer” as used herein is a concept that includes both homopolymers and copolymers.
  • (A2) may be a homopolymer consisting of only the structural units described above, or may be a copolymer having structural units derived from (A2) the diallylamine-based monomer and other structural units.
  • the (a2) diallylamine (co)polymer has structural units derived from the (A2) diallylamine-based monomer. More specifically, (A2) the structural unit derived from the diallylamine-based monomer is a structure represented by the following structural formula (IIa) or (IIb), or an inorganic acid salt or an organic acid salt thereof or a structure represented by Structural Formula (IIIa) or (IIIb) below.
  • R 4 represents a hydrogen atom or a monovalent organic group, preferably a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms.
  • R 5 and R 6 each independently represent a hydrogen atom or a monovalent organic group (provided that at least one of R 5 and R 6 is a hydrogen atom ), preferably a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms, and X 1 ⁇ is a counter ion.
  • R 4 is more preferably a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, or a benzyl group, and particularly preferably a hydrogen atom or a methyl group.
  • R 5 and R 6 are a hydrogen atom
  • a hydrogen atom, or a methyl group is particularly preferred.
  • the diallylamine (co)polymer is a structural unit of the structure represented by the above structural formula (IIa) or (IIb) as a structural unit derived from the (A2) diallylamine-based monomer, that is, a free structure but is an inorganic acid salt or an organic acid salt of the structure represented by the above structural formula (IIa) or (IIb), i.e., a structure having an addition salt, or It may have a structural unit of the structure represented by the above structural formula (IIIa) or (IIIb), that is, a structure having a counter ion.
  • diallylamine (co)polymer In the production of the diallylamine (co)polymer, it is preferable to use a diallylamine monomer having an addition salt or a counterion from the viewpoint of production cost. The process of removing addition salts such as HCl and counter ions from the polymer is complicated and causes an increase in cost.
  • Using the (a2) diallylamine (co)polymer of type (a2) is a preferred embodiment from the viewpoint of cost and the like.
  • the inorganic acid salt or organic acid salt having the structure represented by the above structural formula (IIa) or (IIb) is hydrochloride, carboxylate, or sulfonate. , or an alkyl sulfate salt, particularly preferably a hydrochloride.
  • the counter ion X ⁇ is not particularly limited, but is preferably chloride ion, carboxylate ion, sulfonate ion, or alkyl sulfate ion from the viewpoint of availability, controllability of reaction, etc., and is preferably chloride ion or ethyl sulfate ion. is particularly preferred.
  • each diallylamine-based structural unit has the same general structural formula (IIa), (IIb), (IIIa), or (IIIb ), or may have different structures represented by different general structural formulas.
  • a structural unit derived from a plurality of types of diallylamine-based monomers (A2) represented by the general structural formula (IIa) and having different structures due to the different structures of R 4 may In the latter case, for example, using one structural unit (A2) having a structure represented by structural formula (IIa) and another structural unit (A2) having a structure represented by structural formula (IIIa) good too.
  • the content of the structural unit derived from the (A2) diallylamine-based monomer in the (a2) diallylamine (co)polymer is not particularly limited, but 1 mol of the total structural units of the (a2) diallylamine (co)polymer % or more, more preferably 5 to 100 mol %.
  • (A2) The ratio of structural units derived from diallylamine-based monomers adjusts the ratio of diallylamine-based monomers used in the production of (a2) diallylamine (co)polymer and other polymerization conditions. By doing so, it is possible to make appropriate adjustments.
  • the structural units other than the structural units derived from the (A2) diallylamine-based monomer are not particularly limited, and monomers copolymerizable with the diallylamine-based monomer are appropriately used.
  • Such a structural unit can be derived by copolymerizing with Preferred examples of copolymerizable monomers include monoallylamines or addition salts thereof; anionic monomers such as dicarboxylic acids, sulfur dioxide, acrylamide, dimethylacrylamide, acryloylmorpholine, N-[3-(dimethylamino)propyl] ( Acrylamides such as meth)acrylamide, (3-acrylamidopropyl)trimethylammonium chloride, (3-methacrylamidopropyl)trimethylammonium chloride; allyl alcohols, allyl ethers such as ethylene glycol monoallyl ether, (meth)allylsulfonic acid allylsulfonic acids such as (sodium) or addition salts thereof; vinylsulfonic acids such as vinylsulfonic acid (sodium) or addition salts thereof; sodium isoprenesulfonate; but not limited thereto.
  • anionic monomers such as dicarboxylic acids,
  • monoallylamines such as dicarboxylic acids, sulfur dioxide, acrylamide, and the like can be preferably used.
  • Monomers other than diallylamine-based monomers may be used alone or in combination of two or more. Details such as the preferred form of the structural unit derived from anionic monomers such as monoallylamines and dicarboxylic acids are the same as those described above with respect to (a1) the allylamine (co)polymer.
  • the sulfur dioxide structural unit can impart advantageous properties such as polymerizability and blood cell separation ability to the specific polymer.
  • the sulfur dioxide structural unit in the copolymer of this embodiment is derived from sulfur dioxide having a structure represented by the following structural formula (4).
  • the ratio of the sulfur dioxide structural units to the total structural units of the copolymer of the present embodiment is preferably 1 mol % or more.
  • the proportion of structural units derived from sulfur dioxide is 1 mol% or more, the copolymer of the present embodiment is improved in polymerizability and hydrophobicity, and has separation performance from an anion component (for example, blood cells). Beneficial properties such as enhancement can be imparted more effectively.
  • the proportion of sulfur dioxide structural units is more preferably 1 to 50 mol %, particularly preferably 10 to 50 mol %.
  • the ratio of the structural unit derived from (A2) the diallylamine-based monomer and the sulfur dioxide structural unit there is no particular limitation on the ratio of the structural unit derived from (A2) the diallylamine-based monomer and the sulfur dioxide structural unit, and the ratio can be any ratio as long as copolymerization is possible. From the viewpoint of increasing the molecular weight of the copolymer, it is preferable that the proportions of both structural units are not greatly different.
  • (A2) a structural unit derived from a diallylamine-based monomer and a structural unit derived from sulfur dioxide. is preferably from 99:1 to 50:50, particularly preferably from 90:10 to 50:50.
  • the molecular weight of the diallylamine (co)polymer is not particularly limited, and a (co)polymer having a suitably suitable molecular weight may be obtained or polymerized depending on the type of use in the blood cell separation agent and the relationship with other components.
  • the weight average molecular weight (Mw) is preferably from 500 to 10,000,000 from the viewpoints of ease of carrying on an inorganic carrier and polymerization in a practically acceptable time and cost. More preferably, the weight average molecular weight (Mw) is from 1,000 to 1,000,000. It is particularly preferred that the weight average molecular weight (Mw) is from 2,000 to 500,000.
  • the molecular weight is preferably high within the above range, for example, the weight average molecular weight (Mw) is preferably 15,000 or more.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the diallylamine (co)polymer can be measured, for example, by gel permeation chromatography (GPC method) using a liquid chromatograph. More specifically, it can be measured, for example, by the method described in the Examples of the present application.
  • the molecular weight of the diallylamine (co)polymer is appropriately adjusted by adjusting the presence/absence, type and composition of comonomers, the temperature, time and pressure in the polymerization process, the type and amount of the radical initiator used in the polymerization process, and the like. can do.
  • the rotational viscosity [ ⁇ ] of the diallylamine (co)polymer is also not particularly limited, and can be appropriately set in relation to the ease of supporting on the inorganic carrier, the production cost, etc., but it is 10 to 1,500 mPa. ⁇ s (25°C) is preferable, and 10 to 500 mPa ⁇ s (25°C) is particularly preferable.
  • the rotational viscosity [ ⁇ ] can be measured by a method commonly used in the industry, and can be measured, for example, with a digital Brookfield viscometer DV-3T manufactured by AMETEK Brookfield. In the measurement, a ULA adapter is used, and the liquid volume is typically 16 mL, and the liquid temperature can be measured at 25°C.
  • the rotational viscosity [ ⁇ ] can also be appropriately adjusted by adjusting the presence/absence, type and composition of comonomers, the temperature, time and pressure in the polymerization process, the type and amount of the radical initiator used in the polymerization process, and the like.
  • the (a3) polyethyleneimine preferably used as the specific polymer in the present invention is a polymer having a structural unit derived from ethyleneimine, more specifically represented by the following formula (IVa) It has structural units.
  • (a3) Polyethyleneimine has an amino group by having a structural unit having the structure represented by the above formula (IVa), and therefore corresponds to a polymer (specific polymer) having a structural unit having an amino group used in the present invention. do. Further, since the above amino group is a secondary amino group, it also corresponds to a (co)polymer having a constituent unit having a secondary amino group or a tertiary amino group, which is preferable as a specific polymer.
  • Polyethyleneimine may be composed only of structural units having the structure represented by the above formula (IVa), or may have structural units having other structures. When it consists only of structural units of the structure represented by the above formula (IVa), (a3) polyethyleneimine has a linear structure. (a3) Polyethyleneimine may have a branched structure by having a tertiary amino group, and may have a structure represented by the following formula (IVb), for example. Also in the structure of the following formula (IVb), the linear part has a secondary amino group and the terminal has a primary amino group.
  • the type of the addition salt is not particularly limited, and for example, the various organic acid salts and inorganic acid salts described above in relation to (a1) allylamine (co)polymer and (a2) diallylamine (co)polymer may be appropriately used. can be used.
  • polyethyleneimine is not particularly limited. ,000 to 2,000,000.
  • Polyethyleneimine can be synthesized, for example, by subjecting ethyleneimine to ring-opening polymerization in the presence of an acid catalyst.
  • Lupasol trade name: Lupasol SK (average molecular weight about 2,000,000), Lupasol G20 (average molecular weight about 1,300), Lupasol G20 WF (average Lupasol P (average molecular weight about 750,000), Lupasol PS (average molecular weight about 750,000), Lupasol PR 8515 (2,000), Lupasol PN 40, Lupasol WF (average molecular weight about 25, 000), Lupasol SC-61B (average molecular weight of 110,000) and Lupasol FG), Epomin (model number: SP-003 (average molecular weight of about 300), SP-006 (average molecular weight of about 600) commercially available from Nippon Shokubai Co., Ltd.
  • SP-003 average molecular weight of about 300
  • SP-006 average molecular weight of about 600
  • SP-012 average molecular weight about 1,200
  • SP-018 average molecular weight about 1,800
  • SP-200 average molecular weight about 10,000
  • P-1000 average molecular weight about 70,000
  • BPEI commercially available from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • eller code 161-17831 average molecular weight about 600
  • seller code 167-17811 average molecular weight about 1,800
  • seller code 164-17821 average molecular weight about 10,000
  • the method for producing the specific polymer is not particularly limited, and can be produced by a method known in the art. Examples include monoallylamine or diallylamine monomers, or inorganic acid salts thereof, Alternatively, it can be produced by homopolymerizing an organic acid salt, or by copolymerizing with other monomers as desired.
  • the solvent for homopolymerization of monoallylamine or diallylamine, or inorganic or organic acid salts thereof, or copolymerization with other monomers is not particularly limited. , sulfoxide, amide and the like may be used, but aqueous solvents are preferred.
  • the monomer concentration depends on the type of monomer, and (co)polymerization Although it varies depending on the type of solvent used, it is usually 10 to 75% by weight in the case of an aqueous solvent.
  • This (co)polymerization reaction is usually a radical polymerization reaction and is carried out in the presence of a radical polymerization catalyst.
  • the type of radical polymerization catalyst is not particularly limited, and preferred examples thereof include peroxides such as t-butyl hydroperoxide, persulfates such as ammonium persulfate, sodium persulfate and potassium persulfate, azobis-based catalysts, Examples include water-soluble azo compounds such as diazo compounds.
  • the amount of the radical polymerization catalyst added is generally 0.1 to 20 mol%, preferably 1.0 to 10 mol%, based on the total monomers.
  • the polymerization temperature is generally 0-100° C., preferably 5-80° C.
  • the polymerization time is generally 1-150 hours, preferably 5-100 hours.
  • the atmosphere for polymerization the atmosphere does not cause any serious problem in polymerizability, but the atmosphere can be carried out in an atmosphere of an inert gas such as nitrogen.
  • the blood cell separating agent of the present invention is a blood cell separating agent comprising an inorganic carrier and a polymer (specific polymer) having a constitutional unit having an amino group, wherein at least part of the polymer is preferably an electrostatic It is a blood cell separating agent supported on the inorganic carrier in a form of interaction adsorption and/or covalent bonding. Supporting the specific polymer on an inorganic carrier is preferable from the viewpoint of handling, reuse of the blood cell separation agent, suppression of contamination of the sample separated from the blood cells with the blood cell separation agent, and the like.
  • the shape of the inorganic carrier is not particularly limited, and for example, containers, inner walls of tubes, inorganic particles, magnetic beads, glass wool, glass filter paper and the like can be used as inorganic carriers.
  • examples of materials for the inorganic carrier include glass, silica, kaolin, zeolite, bentonite, and the like, since they themselves have blood cell separation ability and can easily support the specific (co)polymer.
  • the particle diameter of the inorganic carrier is not particularly limited, but the primary particle diameter is preferably 0.05 to 500 ⁇ m, particularly preferably 0.1 to 50 ⁇ m.
  • the method for supporting the specific polymer on the inorganic carrier is not particularly limited, but it is possible to support it on the inorganic carrier in the form of being adsorbed by electrostatic interaction and/or covalently bonded. Preferably, this makes it possible to achieve stable loading.
  • the method of adsorbing the specific polymer to the inorganic carrier by electrostatic interaction is not particularly limited, but the pH of the dispersion or solution in which the specific polymer is dispersed or dissolved, or the solid content concentration, particularly the polymer concentration, is adjusted. It is preferable to perform operations such as For example, when the inorganic carrier is silica, the pH of the specific polymer is preferably 5-11, particularly preferably 7-10. Moreover, the polymer concentration of the specific polymer is preferably 1.0 to 20% by weight, particularly preferably 2.5 to 10% by weight.
  • the method of binding the specific polymer to the inorganic carrier by covalent bonding either by reacting a functional group such as an amino group in the specific polymer with a reactive group present on the surface of the inorganic carrier, or A covalent bond can be achieved using a compound that is reactive with both.
  • the inorganic carrier is silica
  • a silane coupling agent it is preferred to use a silane coupling agent.
  • the type of silane coupling agent is not particularly limited, but epoxysilane, methacrylsilane, acrylsilane, chlorosilane, and the like can be preferably used. Among them, it is particularly preferable to use epoxysilane.
  • the specific polymers are crosslinked.
  • the specific polymer tends to be easily desorbed due to pH changes. Even so, the adsorption of the crosslinked specific polymer as a whole is maintained. Therefore, in the case of adsorbing the specific polymer onto an inorganic carrier by electrostatic interaction, the technical value of cross-linking the specific polymers is particularly high. .
  • Cross-linking agents conventionally used in the art can be appropriately used for cross-linking specific polymers, and peroxide-based cross-linking agents, epoxy-based cross-linking agents, halogenated alkyl-based cross-linking agents, etc. can be used as appropriate. can be done. Among them, cross-linking is preferably performed using a cross-linking agent which is a compound having a total of at least two functional groups capable of forming covalent bonds with amino groups in the specific polymer.
  • Examples of such functional groups include halogen groups, aldehyde groups, epoxy groups, carboxyl groups, acid anhydride groups, acid halide groups, N-chloroformyl groups, chloroformate groups, imide ether groups, amidinyl groups, isocyanate groups, groups, vinyl groups, and the like.
  • cross-linking agents include ethylene glycol diacrylate, propylene glycol diacrylate, butylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, propylene glycol dimethacrylate, butylene glycol dimethacrylate, polyethylene glycol dimethacrylate, polyethylene glycol diacrylate, methylenebis Acrylamide, methylenebismethacrylamide, ethylenebisacrylamide, epichlorohydrin, toluene diisocyanate, ethylenebismethacrylamide, ethylidenebisacrylamide, divinylbenzene, bisphenol A dimethacrylate, bisphenol A diacrylate, 1,4-butanediol diglycidyl ether , 1,2-ethanediol diglycidyl ether (ethylene glycol diglycidyl ether (EGDGE)), 1,3-dichloropropane, 1,2-dichloroethane, 1,3-dibromopropane, 1,2-di
  • the cross-linking agent/specific polymer molar ratio is preferably 0.05 to 20, particularly preferably 0.4 to 15.
  • the amount of the cross-linking agent is within a suitable range according to any of the above criteria, the blood cell separation performance is improved and the adsorption of the specific polymer as a whole is maintained.
  • the blood cell separation method of the present invention is not particularly limited except for this point, and blood cells can be separated in various forms.
  • the blood cell separation agent is added to or mixed with the blood cell-containing sample in the collection container, or the blood cell separation agent in the container is used for collection.
  • a sample containing the blood cells can be added and mixed to capture the blood cells and separate them into a blood cell and liquid phase.
  • the blood cell separation agent of the present invention does not detach the specific polymer from the inorganic carrier, preventing the sample from being contaminated with the specific polymer. None. Therefore, it is possible to obtain a sample having a pH suitable for the pH conditions of the analytical system such as the pH of the mobile phase of HPLC. can.
  • the blood cells can be separated simply by putting the sample into the collection tube and, if necessary, inverting and mixing. For this reason, there is also the advantage that the sampling tube carrying the specific polymer can be used repeatedly because it is highly practical. There is no contamination of the liquid phase separated from the blood cells with the blood cell separation agent, and the specific polymer does not detach from the inorganic carrier even when the sample is obtained by the blood cell separation under the condition of being exposed to an acidic or alkaline solution, and the analysis system is improved. It is the same as the blood cell separating agent in which a specific polymer is supported on a particulate or fibrous inorganic carrier in that a sample having a pH suitable for the pH condition can be obtained.
  • a blood cell separation agent in which a specific polymer is supported on a particulate inorganic carrier is filled in a container such as a column or a sample flow path of an analyzer together with a support made of a filtering material as necessary to separate blood cells.
  • a member or a blood cell separation part can be configured.
  • a blood cell separation agent in which a specific polymer is supported on a particulate inorganic carrier and a sample containing blood cells are mixed, and the mixture is introduced into a container such as a column filled with a filtering material, and the blood cells are collected. It can also be separated into a liquid phase.
  • the sample discharged from the blood cell separation member or the blood cell separation unit can be directly subjected to various analyses, and it is required to obtain a sample with a pH suitable for the pH conditions of the analysis system such as the pH of the mobile phase of HPLC. It is possible to respond even if it is done. Therefore, it is possible to continuously perform various analyzes from blood cell separation.
  • Filtering materials constituting the support include sheet-like or particulate filter paper, sheet-like or particulate chromatography paper, particulate silica gel, particulate or fibrous alumina, particulate diatomaceous earth, particulate Or fibrous glass and combinations thereof.
  • a blood cell separation member or a blood cell separation unit may be configured by filling a container such as a column or a sample channel of an analyzer with a blood cell separation agent in which a specific polymer is supported on a sheet-like or fibrous inorganic carrier. can.
  • the blood cell separation agent and method of the present invention can be applied to any sample containing blood cells, such as blood, urine, lymph, brain fluid, body cavity fluid, cell exudate, digestive fluid, stool, and the like.
  • a typical sample applied is blood, including whole blood samples, blood samples containing anticoagulants such as heparin, with whole blood samples being the most typical sample.
  • the weight average molecular weight of each cationic polymer below is measured by the following method.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the cationic polymer (Example 11) containing the anionic structural unit (a) is determined by gel permeation chromatography (GPC method) using a Hitachi L-2000 high performance liquid chromatograph. It was measured.
  • the eluent channel pump is Hitachi L-2130 pump
  • the detector is Hitachi L-2490 RI detector
  • the column is two TOSOH TSKgel ⁇ -M (exclusion limit molecular weight 10,000,000) connected in series. was used.
  • Samples were adjusted to a concentration of 0.5 g/100 mL with an eluent, and 100 ⁇ L was used. A 0.15 mol/L sodium sulfate and 1% by weight acetic acid aqueous solution was used as an eluent.
  • the column temperature was 40° C. and the flow rate was 1.0 mL/min.
  • a calibration curve was determined using pullulan with molecular weights of 5,900, 47,300, 212,000 and 788,000 as standard substances, and the weight average molecular weight (Mw) of the cationic polymer was determined based on the calibration curve.
  • the weight average molecular weight (Mw) of other cationic polymers was measured by gel permeation chromatography (GPC method) using a Chromaster (registered trademark) 5450 high-performance liquid chromatograph manufactured by Hitachi High-Tech Science Co., Ltd.
  • the detector was an RI differential refractive index detector, and the columns were GS-220HQ (exclusion limit molecular weight: 3,000) and GS-620HQ (exclusion limit molecular weight: 2,000,000) of aqueous gel filtration type from Shodex Asahipack connected in series. used things.
  • the sample was adjusted to a concentration of 0.5 g/100 mL with the eluent and 20 ⁇ L was used.
  • a 0.4 mol/L sodium chloride aqueous solution was used as an eluent.
  • the column temperature was 30° C. and the flow rate was 1.0 mL/min.
  • a calibration curve is obtained using polyethylene glycol having a molecular weight of 106, 194, 440, 600, 1,470, 4,100, 7,100, 10,300, 12,600, 23,000, etc. Based on the curve, the weight average molecular weight (Mw) of the cationic polymer was determined.
  • diallylamine hydrochloride sulfur dioxide copolymer product name: PAS-92, manufactured by Nittobo Medical, amine grade: secondary, polymer pH: 7, weight average molecular weight: 5,000, unit molecular weight relative to amine: 197.68
  • PAS-92 diallylamine hydrochloride sulfur dioxide copolymer
  • epichlorohydrin manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.
  • 500 ⁇ L of the resulting solution was mixed with the washed silica beads and stirred at room temperature for one day to support the cationic polymer on the silica beads.
  • the cationic polymer-immobilized silica beads were washed with MES-HEPES buffer (20 mM MES, 20 mM HEPES, pH 5.0) and then with HEPES buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0). Thereafter, the cationic polymer-immobilized silica beads were suspended in 500 ⁇ L of HEPES buffer and used as a blood cell separating agent.
  • Example 2 Ethylene glycol diglycidyl ether (EGDGE, manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) was added to the polymer solution to a final concentration of 3% by volume (0.19 mmol), and 500 ⁇ L of the resulting solution (molar ratio of cross-linking agent to 1 mol of polymer was , 0.381) was mixed with the washed silica beads, and a blood cell separating agent was prepared in the same manner as in Example 1.
  • EGDGE Ethylene glycol diglycidyl ether
  • Example 3 A blood cell separating agent was prepared in the same manner as in Example 1, except that 25 mg of silica beads (manufactured by Micromod Pumbletechnoligie) having a particle size of 0.1 ⁇ m were used.
  • Example 4 A blood cell separating agent was prepared in the same manner as in Example 1, except that 25 mg of silica beads (manufactured by Micromod Pelletechnoligie) having a particle size of 0.5 ⁇ m were used.
  • Comparative example 2 500 ⁇ L of a polymer solution containing no epichlorohydrin (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) was mixed with the washed silica beads and stirred at room temperature for one day, except that the cationic polymer was supported on the silica beads.
  • a blood cell separator was prepared in the same manner.
  • allylamine polymer product name: PAA-08, manufactured by Nittobo Medical, amine class: primary, polymer pH: 7, weight average molecular weight: 8,000, unit molecular weight for amine: 57.09
  • amine class primary, polymer pH: 7, weight average molecular weight: 8,000, unit molecular weight for amine: 57.09
  • Epichlorohydrin manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.
  • Example 8 10% by weight (5.146 mmol) of diallylamine polymer (product name: PAS-21, manufactured by Nittobo Medical, amine class: secondary, polymer pH: 7, weight average molecular weight: 5,000, unit molecular weight for amine: 97.16) ) in pure water to prepare a polymer solution, and epichlorohydrin (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) is added to the polymer solution so that the final concentration is 3% by volume (1.91 mmol).
  • a blood cell separating agent was prepared in the same manner as in Example 5, except that 5 mL of the resulting solution (molar ratio of cross-linking agent to 1 mol of polymer was 0.372) was mixed with glass beads.
  • Example 9 10% by weight (3 A polymer solution was prepared by dissolving in pure water at a concentration of .742 mmol), and epichlorohydrin (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added to the polymer solution so that the final concentration was 3% by volume (1.91 mmol).
  • a blood cell separating agent was prepared in the same manner as in Example 5, except that 5 mL of the resulting solution (molar ratio of cross-linking agent to 1 mol of polymer was 0.511) was mixed with glass beads.
  • Example 10 10 weights of methyl diallylamine hydrochloride polymer (product name: PAS-M-1L, manufactured by Nittobo Medical, amine class: tertiary, polymer pH: 9, weight average molecular weight: 5,000, unit molecular weight for amine: 147.65) % (67.728 mmol) in pure water to prepare a polymer solution, and 1,3-dichloropropane (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd. ) (molar ratio of cross-linking agent to 1 mol of polymer: 0.467) was mixed with glass beads, to prepare a blood cell separating agent in the same manner as in Example 5.
  • methyl diallylamine hydrochloride polymer product name: PAS-M-1L, manufactured by Nittobo Medical, amine class: tertiary, polymer pH: 9, weight average molecular weight: 5,000, unit molecular weight for amine: 147.65) % (67.
  • Example 11 10 weights of diallylamine hydrochloride maleic acid copolymer (product name PAS-411, manufactured by Nittobo Medical, amine grade: secondary, polymer pH: 7, weight average molecular weight: 40,000, unit molecular weight for amine: 172.31) % (2.902 mmol) in pure water to prepare a polymer solution.
  • a blood cell separation agent was prepared in the same manner as in Example 5, except that 5 mL of the solution obtained by adding (molar ratio of cross-linking agent to 1 mol of polymer: 0.659) was mixed with glass beads.
  • Example 12 10 weights of diallylamine hydrochloride sulfur dioxide copolymer (product name PAS-92, manufactured by Nittobo Medical, amine class: secondary, polymer pH: 9, weight average molecular weight: 5,000, unit molecular weight for amine: 197.68) % (2.529 mmol) in pure water to prepare a polymer solution, and epichlorohydrin (manufactured by Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) was added to the polymer solution to a final concentration of 3% by volume (1.91 mmol).
  • a blood cell separating agent was prepared in the same manner as in Example 5, except that 5 mL of the resulting solution (molar ratio of cross-linking agent to 1 mol of polymer: 0.756) was mixed with glass beads.
  • diallylamine hydrochloride sulfur dioxide copolymer product name PAS-92, manufactured by Nittobo Medical, amine grade: secondary, polymer pH: 7, weight average molecular weight: 5,000, unit molecular weight for amine: 197.68
  • a polymer solution was prepared by dissolving in pure water at a concentration of 5% by weight (0.632 mmol), and epichlorohydrin (
  • a blood cell separation agent was prepared in the same manner as in Example 5, except that 5 mL of a solution (molar ratio of cross-linking agent to 1 mol of polymer was 12.606) added with Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd. was mixed with glass beads.
  • diallylamine hydrochloride sulfur dioxide copolymer product name PAS-92, manufactured by Nittobo Medical, amine class: secondary, polymer pH: 7, weight average molecular weight: 5,000, unit molecular weight for amine: 197.68
  • PAS-92 diallylamine hydrochloride sulfur dioxide copolymer
  • the synthesized cationic polymer-immobilized silica beads were washed with MES-HEPES buffer (20 mM MES, 20 mM HEPES, pH 5.0) and then with HEPES buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0). Thereafter, the cationic polymer-immobilized silica beads were suspended in 500 ⁇ L of HEPES buffer and used as a blood cell separating agent.
  • Epoxysilane: Z6040 manufactured by Dow Toray was added to an acetic acid solution adjusted to 1.0% by volume so that the final concentration was 0.1% by volume, and the mixture was stirred overnight to prepare an acetic acid solution containing a silane coupling agent.
  • a blood cell separation agent was prepared in the same manner as in Example 14, except that
  • the blood cell separation ability was visually determined according to the following criteria. ⁇ : The thickness of the blood cell layer is in the range of 1/4 or less from the top of the support, and all blood cells are captured in the column. ⁇ : The thickness of the blood cell layer is in the range of more than 1/4 from the top of the support. All blood cells captured within the column ⁇ : Blood cells leaked out of the column
  • the blood cell separation column After applying 5 ⁇ L of the whole blood sample to the blood cell separation column, the blood cell separation column was connected to a syringe pump (manufactured by Tokyo Glass Instruments) and HEPES buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7) was added at a flow rate of 0.5 mL / min. .0) was sent by 2 mL.
  • HEPES buffer 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7
  • the thickness of the blood cell layer is in the range of 1/4 or less from the top of the support, and all blood cells are captured in the column
  • ⁇ The thickness of the blood cell layer is in the range of more than 1/4 from the top of the support, All blood cells captured within the column ⁇ : Blood cells leak out of the column
  • Tables 6 to 9 and FIGS. 1 to 3 show the blood cell separation ability of the blood cell separation agents of Examples and Comparative Examples and the results of tests on detachment of the polymer from the carrier due to changes in pH.
  • the blood cell separation agents of Examples 1 to 15 all had excellent blood cell separation ability, and desorption of the polymer was not observed even under acidic conditions.
  • the blood cell separation agent of Comparative Example 2 which was not subjected to the cross-linking treatment, tended to have a lower blood cell separation ability (compared with Examples 1 and 2), and desorption of the polymer was observed under acidic conditions. Admitted. Therefore, it was demonstrated that the intermolecular and/or intramolecular cross-linking of the specific polymer improved the blood cell separation ability and prevented the polymer from falling off from the inorganic carrier even when the pH changed.

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Abstract

試料への血球分離剤を構成するポリマーの混入がなく、優れた血球分離能を発揮し得る血球分離剤及びこれを用いた血球分離方法を提供する。　無機担体と、アミノ基を有する構成単位を有するポリマーとを含む、血球分離剤あって、　前記アミノ基の少なくとも一部が、第一級、第二級、又は第三級のアミノ基であり、　前記ポリマーの少なくとも一部が、前記無機担体に担持され、前記無機担体に担持された前記ポリマーが、架橋により他の前記ポリマーに連結されている、血球分離剤。

Description

血球分離剤、およびそれを用いた血球分離方法
　本発明は、血球分離剤、およびそれを用いた血球分離方法に関し、より具体的には、無機担体に特定のポリマーが担持された血球分離剤及びこれを用いた血球分離方法に関する。
　血液は、様々な生化学または免疫学的検査に用いられる検体であるが、通常、血漿または血清と血球とに分離してそれぞれ種々の分析に供される。昨今では、検体採取から分析結果の提示までの時間をより短縮することが求められており、血球分離時間を短縮し、分離から分析までの工程を連続して行うことが多くの検査で試みられている。
　従来、血漿または血清と血球との分離には、遠心分離法が一般的に用いられているが、遠心分離を要しないより簡易で迅速な血球分離方法が検討されている。
　遠心分離を要しないより簡易で迅速な血球分離方法としては、例えば、コール酸系界面活性剤及び酸を含有する溶液（特許文献１）または特定の第４級アミンスルホンポリマー（特許文献２）を採取した血液に添加して血清と血餅に分離する方法が提案されている。しかし、これらの方法では、凝集剤の血清または血漿中への混入による影響が懸念される。
　また、目的とする可溶性成分と反応する試薬を含む試験パッドと共に、可溶性成分と血球を分離するための濾過パッドを備える、簡易試験装置が提案されており（特許文献３）、この濾過パッドは、担体マトリックスからなり、トロンビン、レクチンが含浸されている。この装置では血液が濾過パッドに導入され、血球から分離された血漿または血清が試験パッドに導入され分析される。このため、この装置では、分離された血漿または血清がそのまま分析に用いられるメリットがある一方、この濾過パッドでは、トロンビン、レクチンが分離された血漿または血清に混入する恐れがあるが、この装置ではこの点については特に配慮されていない。
　また、ガラス不織布に血液凝集剤を含浸または付着させた血液フィルターが提案されており（特許文献４）、血液凝集剤としては、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）が用いられている。しかし、この血液フィルターにおいても、血液凝集剤がガラス不織布から解離して分離された血漿または血清に混入することがあるが、この点について特に配慮されていない。
特開２０１８－０５９７９１号公報 特開昭５９－２６０６２特開 特開平４－２１２０６０号公報 特開２０２０－０８５８８７号公報
　これらの従来技術に対して、本発明は、試料への血球分離剤を構成するポリマーの混入がなく、優れた血球分離能を発揮し得る血球分離剤及びこれを用いた血球分離方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、無機担体に血球凝集能を有する様々なポリマーを付着させた血球分離剤で血液を処理して、血球分離能を評価していたところ、血球分離剤を構成するポリマーが担体から脱離する現象に遭遇し、その原因を探求したところ、ｐＨ変動が主要な原因であることを見出した。この問題は、ポリマーが分離した試料に混入し、分析系への影響を及ぼす要因と成り得ることから、本発明者らは、この問題を改善すべく検討を重ね、ｐＨの変動に曝されても、血球分離剤を構成するポリマーの脱離が無い血球分離剤とすることに成功し、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明は、
［１］
　無機担体と、アミノ基を有する構成単位を有するポリマーとを含む、血球分離剤であって、
　前記アミノ基の少なくとも一部が、第一級、第二級、又は第三級のアミノ基であり、
　前記ポリマーの少なくとも一部が前記無機担体に担持され、前記無機担体に担持された前記ポリマーが、架橋により他の前記ポリマーに連結されている、血球分離剤、に関する。
　以下、［２］から［１９］は、いずれも本発明の好ましい一態様又は一実施形態である。
［２］
　前記アミノ基の少なくとも一部が、第二級、又は第三級のアミノ基である、［１］に記載の血球分離剤。
［３］
　前記架橋が、前記アミノ基と共有結合を生成可能な官能基を合計で少なくとも２個有する化合物である架橋剤により実現される、［１］又は［２］に記載の血球分離剤。
［４］
　前記ポリマーが、（ａ１）アリルアミン（共）重合体、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体、又は（ａ３）ポリエチレンイミンである、［１］から［３］のいずれか一項に記載の血球分離剤。
［５］前記ポリマーが、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体、又は（ａ３）ポリエチレンイミンである、［４］に記載の血球分離剤。
［６］
　前記ポリマーの重量平均分子量が、３，０００から２００,０００である、［１］から［５］の何れか一項に記載の血球分離剤。
［７］
　前記無機担体が、一次粒子径が０．０５～５００μｍの無機粒子である、［１］から［６］の何れか一項に記載の血球分離剤。
［８］
　前記ポリマーの前記無機担体への担持が、静電相互作用による吸着で実現されている、［１］から［７］のいずれか一項に記載の血球分離剤。
［９］
　前記ポリマーの前記無機担体への担持が、共有結合により実現されている、［１］から［７］のいずれか一項に記載の血球分離剤。
［１０］
　前記共有結合が、シランカップリングにより形成されている、［９］に記載の血球分離剤。
［１１］
　血球を含有する検体を、［１］～［１０］のいずれか一項に記載の血球分離剤と接触させる工程を含む、血球分離方法。
［１２］
　アミノ基を有する構成単位を有するポリマーを、無機担体に担持し、前記無機担体に担持させる前または後で、前記ポリマーを架橋剤と反応させて、架橋によりポリマー間を連結させる工程を含む、血球分離剤の製造方法であって、前記アミノ基の少なくとも一部が、第一級、第二級、又は第三級のアミノ基である、上記血球分離剤の製造方法。
［１３］
　前記アミノ基の少なくとも一部が、第二級、又は第三級のアミノ基である、［１２］に記載の方法。
［１４］
　前記ポリマーが、（ａ１）アリルアミン（共）重合体、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体、又は（ａ３）ポリエチレンイミンである、［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］
　前記ポリマーが、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体、又は（ａ３）ポリエチレンイミンである、［１４］に記載の方法。
［１６］
　前記ポリマーを、前記無機担体に、静電相互作用で吸着させ、及び／又は共有結合させて、担持する、［１２］～［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］
　前記ポリマーを、シランカップリング剤により、前記無機担体に共有結合させる、［１６］に記載の方法。
［１８］
　前記ポリマーを、アルカリ溶液中で、前記無機担体と接触させて、静電相互作用により前記無機担体に吸着させる、［１６］に記載の方法。
［１９］
　前記架橋剤が、前記アミノ基と共有結合を生成可能な官能基を合計で少なくとも２個有する化合物である、［１２］から［１８］のいずれか一項に記載の方法。
　本発明の血球分離剤は、無機担体に担持されたポリマーが脱離しないため、分離した試料へのポリマーの混入は無く、各種分析系において正確な測定を行うことが可能となる。さらに、分析系に導入される試料について、分析に適合したｐＨを有することが要求される場合でも、分析に適合したｐＨ条件で血球を分離することが可能であり、分離処理後に得られた試料をそのまま分析に供することが可能となる。
実施例１～４ならびに比較例１および２の血球分離剤（担体は、シリカビーズ）について、血球分離能およびｐＨ変化によるポリマーの担体からの脱離を試験した結果を示す。赤く見えるのが赤血球であり、実施例１～４では、リザーバーの上部に赤血球が保持されていることがわかる。また、比較例２では、リザーバーの上部から下方に赤血球が移動していることが確認された。他方、比較例１では、赤血球がリザーバーの下部に達し、リザーバーの外部に流出した。また、実施例１～４では、ｐＨ５．０の緩衝液中にポンソーＳで染色される物質は確認されなかった。他方、比較例２では、ｐＨ５．０の緩衝液中にポンソーＳで染色される物質が確認され、ポリマーが担体から脱離したものと理解される。 実施例５～１３および比較例３の血球分離剤（担体は、ガラスビーズ）について、血球分離能を試験した結果を示す。赤く見えるのが赤血球であり、実施例６、７、９、１１～１３では、リザーバーの上部に赤血球が保持されていることがわかる。他方、比較例３では、赤血球がリザーバーの下部に達し、リザーバーの外部に流出した。また、実施例５、８、および１０では、リザーバーの上部から下方に少し赤血球が移動していることが確認された。 実施例１４および１５の血球分離剤（担体は、シリカビーズ）について、血球分離能およびｐＨ変化によるポリマーの担体からの脱離を試験した結果を示す。赤く見えるのが赤血球であり、実施例１４および１５では、リザーバーの上部に赤血球が保持されていることがわかる。また、実施例１４および１５では、ｐＨ５．０の緩衝液中にポンソーＳで染色される物質は確認されず、ポリマーが担体から脱離していないものと理解される。
　本発明の血球分離剤は、無機担体と、アミノ基を有する構成単位を有するポリマーとを含む、血球分離剤であって、
　前記アミノ基の少なくとも一部が、第一級、第二級、又は第三級のアミノ基であり、
　前記ポリマーの少なくとも一部が、前記無機担体に担持され、前記無機担体に担持された前記ポリマーが、架橋により他の前記ポリマーに連結されている、血球分離剤である。
　すなわち、本発明の血球分離剤は、その少なくとも一部が、第一級、第二級、又は第三級であるアミノ基を有する構成単位を有するポリマー（以下、「特定ポリマー」ともいう。）を有するものである。
　本発明の血球分離剤においては、特定ポリマーを有することで、本発明の血球分離剤は血球の分離性能に優れる等の優れた技術的効果を実現することができる。また、特定ポリマーが無機担体に安定的に担持されることで、血球を効率的かつ良好な取り扱い性で、捕捉、分離等することができる。
　本発明の血球分離剤は、特定ポリマーを１種類のみ有していてもよく、２種類以上の組み合わせを有していてもよい。
　特定ポリマー
　特定ポリマーは、その分子中にその少なくとも一部が、第一級、第二級、又は第三級であるアミノ基を有する構成単位（以下、「特定構成単位」ともいう。）を少なくとも１種を有する（共）重合体であればよく、特にそれ以外の制限を受けない。
　ここで「（共）重合体」とは、単独重合体及び共重合体の双方を包含する概念であり、したがって特定ポリマーは、特定構成単位のみからなる単独重合体であってもよく、それ以外の構成単位を有する共重合体であってもよい。
　特定ポリマーは、その分子中に特定構成単位１個のみ有するものであれば足るが、血球の分離速度の観点から、特定構成単位を複数個有することが好ましい。より具体的には、特定構成単位が特定ポリマーの全構成単位に占める割合は、１モル％以上であることが好ましく、１０～１００モル％であることがより好ましく、５０～１００モル％であることが特に好ましい。
　特定ポリマーは、その分子中に、１種のみの特定構成単位を有していてもよく、２種以上の特定構成単位を有していてもよい。２種以上の特定構成単位を有する場合、上述の特定構成単位が特定ポリマーの全構成単位に占める割合は、当該２種以上の特定構成単位のモル数の合計に基づいて計算する。
　特定構成単位は、その少なくとも一部が、第一級、第二級、又は第三級であるアミノ基を有するものであればよく、特にそれ以外の制限を受けない。特定構成単位におけるアミノ基の少なくとも一部が第一級アミノ基、第二級アミノ基、又は第三級アミノ基であることにより、特定ポリマー同士を比較的容易に架橋することができるので、無機担体への担持を一層安定的なものとすることができる。更に、良好な血球分離性能を実現する観点からは、特定構成単位におけるアミノ基の少なくとも一部が、第二級アミノ基、又は第三級アミノ基であることが好ましい。
　上記特定構成単位におけるアミノ基は、遊離のアミノ基であってもよく、付加塩等を有するカチオン性のアミノ基であってもよい。
　特定ポリマーとしては、入手の容易さ、構造の制御性、水への溶解性等の観点から、（ａ１）アリルアミン（共）重合体、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体、及び（ａ３）ポリエチレンイミンを好ましく使用することができる。
　（ａ１）アリルアミン（共）重合体、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体、及び（ａ３）ポリエチレンイミンのうち１種類のみを使用してもよく、また２種類以上を併用してもよい。
　更に、良好な血球分離性能を実現する観点からは、特定ポリマーとして（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体、及び／又は（ａ３）ポリエチレンイミンを使用することが特に好ましい。
　（ａ１）アリルアミン（共）重合体
　本発明における特定ポリマーとして好ましく用いられる（ａ１）アリルアミン（共）重合体は、（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位を有する。モノアリルアミン系単量体はアミノ基を有するので、（ａ１）アリルアミン（共）重合体においては、（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位が、上述の特定構成単位に該当する。
　（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位中のアミノ基は、第一級、第二級、及び第三級のいずれであってもよいが、良好な血球分離性能を実現する等の観点からは、第二級アミノ基、又は第三級アミノ基であることが好ましい。
　より具体的には、（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位は、下記式（Ｉ）で表される構造、又はその付加塩である構造、を有することが好ましい。
　式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子又は１価の有機基を示し、より好ましくはＲ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～１２のアルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基である。
　Ｒ１及びＲ２として好ましい炭素数１～１２のアルキル基は、直鎖状、枝分かれ状のいずれであってもよく、またアラルキル基であってもよい。その例としてはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、ベンジル基などが挙げられる。また、Ｒ１及びＲ２として好ましい炭素数５～６のシクロアルキル基としては、シクロペンチル基およびシクロヘキシル基が挙げられるが、これらには限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位が付加塩である場合の構造は、下記式（Ｉ’）により表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　式（Ｉ’）中、ＨＸは無機酸又は有機酸を表し、Ｈは水素原子であり、Ｘは水素と共に無機酸又は有機酸を形成し得る基であれば特に限定されない。
　付加塩の種類には特に制限はないが、入手性や反応の制御の容易さ等の観点から、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、亜硫酸塩、亜リン酸塩、亜硝酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、アミド硫酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等を使用することができる。
　中でも、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及びアミド硫酸塩が好ましく、モノアリルアミンから導かれる構造の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及びアミド硫酸塩が特に好ましい。
　（ａ１）アリルアミン（共）重合体は、その全てが（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位からなっていてもよく（すなわちモノアリルアミン系単量体の単独重合体であってもよく）、あるいは（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位以外の構成単位を有していてもよい（すなわちモノアリルアミン系単量体と、それ以外の単量体との共重合体であってもよい。）。
　（ａ１）アリルアミン（共）重合体の全構成単位に占める、構成単位（Ａ１）の割合は、５～１００モル％であることが好ましく、１０～１００モル％であることが特に好ましい。
　（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位の割合が５モル％以上であることで、高い血球の分離性能等の有利な特性を実現することができる。
　構成単位（Ａ１）の割合は、（ａ１）アリルアミン（共）重合体の製造の際の、モノアリルアミン系単量体の使用割合や、それ以外の重合条件を調整することで、適宜調整することができる。
　（ａ１）アリルアミン（共）重合体における、（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位以外の構成単位には特に制限は無く、モノアリルアミン系単量体と共重合可能なモノマーを適宜使用して共重合することで、その様な構成単位を導くことができる。
　共重合可能なモノマーの好ましい例としては、ジアリルアミン、ジアリルメチルアミン等のジアリルアミン類またはその付加塩；ジカルボン酸等のアニオン性モノマー、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］（メタ）アクリルアミド、（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、（３－メタクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド等のアクリルアミド類；アリルアルコール類、エチレングリコールモノアリルエーテル等のアリルエーテル類；（メタ）アリルスルホン酸（ナトリウム）等のアリルスルホン酸類またはその付加塩；ビニルスルホン酸（ナトリウム）等のビニルスルホン酸類またはその付加塩；イソプレンスルホン酸ナトリウム等を挙げることができるが、これらには限定されない。
　これらの中でも、ジアリルアミン類、ジカルボン酸等のアニオン性モノマー、アクリルアミド等を好ましく用いることができる。良好な血球分離性能を実現する等の観点からは、第二級アミノ基を有するジアリルアミン類を共重合することが特に好ましい。
　モノアリルアミン系単量体と共重合可能な他のモノマーは、１種類のみを使用することもできるし、２種類以上を組み合わせて使用することもできる。
　ジアリルアミン類の詳細については、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体に関連して、後述する。
　アニオン性構成単位
　ジカルボン酸等のアニオン性モノマーを共重合することで、（ａ１）アリルアミン（共）重合体にアニオン性構成単位を導入することができる。アニオン性構成単位を有することで、（ａ１）アリルアミン（共）重合体がいわゆる両性高分子となり、血球等との混和性、親水性等の有利な効果を実現することができる。
　本発明実施形態におけるアニオン性構成単位は、解離により負電荷を有し得る構成単位であればよく、それ以外の制限は課されないが、二価のカルボン酸から導かれる構造を有することが好ましく、下記の構造式（１）、（２）、又は（３）で示される構造を有することが特に好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　但し、上記式（１）中、Ｒ３は、水素又はメチル基であり、（１）、（２）、及び（３）中、Ｙは、結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。
　アニオン性構成単位は、カルボキシル基等のアニオン性基を有する限りにおいて、上記の構造式（１）、（２）、及び（３）のいずれにも該当しない構造を有していてもよい。
　特定ポリマーがアニオン性構成単位を有する場合には、１種類のみのアニオン性構成単位を単独で用いてもよいし、複数種類の互いに異なる構造のアニオン性構成単位を組み合わせて用いてもよい。
　複数種類の互いに異なるアニオン性構成単位を用いる場合、それぞれのアニオン性構成単位は、同一の一般構造式（１）、（２）、又は（３）で表される範囲内において互いに異なる構造を有していてもよいし、異なる一般構造式で表される互いに異なる構造を有していてもよい。前者の場合、例えば、一般構造式（１）で表されるが、Ｙの元素が互いに異なることによって構造が互いに異なる、複数種類のアニオン性構成単位を用いてもよい。後者の場合、例えば、構造式（１）で表される構造を有する１のアニオン性構成単位と、構造式（２）で表される構造を有する他のアニオン性構成単位とを用いてもよい。
　アニオン性構成単位の少なくとも一部は、マレイン酸から導かれるものであることが好ましく、このとき当該アニオン性構成単位は、上記式（２）で表される構造を有することとなり、Ｙはいずれも水素となる。
　特定ポリマーがアニオン性構成単位を有する場合のアニオン性構成単位の含有量には特に制限はないが、アニオン性構成単位が不飽和ジカルボン酸から導かれる場合には、（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位とのモル比が、（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位／アニオン性構成単位＝１／０．１～１／０．５であることが好ましく、１／０．２～１／０．５であることが特に好ましい。
　アニオン性構成単位の少なくとも一部は、不飽和モノカルボン酸から導かれるものであってもよい。アニオン性構成単位が不飽和モノカルボン酸から導かれる場合には、（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位／アニオン性構成単位の比率は１／１～１００／１であることが好ましく、１／１～１０／１であることが特に好ましい。
　更に、（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位とアニオン性構成単位との合計が全構成単位に占める割合（アニオン性構成単位が存在しない場合には、（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位が全構成単位に占める割合）が、８０モル％以上であることが好ましく、９０モル％以上であることが特に好ましい。（Ａ１）モノアリルアミン系単量体から導かれる構成単位とアニオン性構成単位との合計が全構成単位に占める割合が、８０モル％以上であることで、血球分離能の向上等の好ましい性質を実現することができる。
　（ａ１）アリルアミン（共）重合体の分子量には特に制限は無く、血球分離剤における使用形態や他の成分等との関係で適宜好適な分子量の（共）重合体を入手又は重合すればよい。
　無機担体への担持の容易さや、実用上許容可能な時間及びコストで重合を行う観点からは、重量平均分子量（Ｍｗ）が５００から１０，０００，０００であることが好ましい。重量平均分子量（Ｍｗ）は、１，０００から１，０００，０００であることがより好ましい。重量平均分子量（Ｍｗ）は、２，０００から５００，０００であることが特に好ましい。
　良好な血球分離性能を実現する等の観点からは、上記範囲内において高分子量であることが好ましく、例えば重量平均分子量（Ｍｗ）が８，０００以上であることが好ましい。
　（ａ１）アリルアミン（共）重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）は、例えば、液体クロマトグラフを使用し、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ法）によって測定することができる。より具体的には、例えば本願実施例に記載の方法によって測定することができる。
　（ａ１）アリルアミン（共）重合体の分子量は、コモノマーの有無、種類及び組成、重合工程における温度、時間及び圧力、重合工程で用いるラジカル開始剤の種類及び量等を調整することで、適宜調整することができる。
　（ａ１）アリルアミン（共）重合体の回転粘度［η］にも特に制限は無く、無機担体への担持の容易さや製造コスト等を考慮して適宜設定することができるが、１０～７００ｍＰａ・ｓ（２５℃）であることが好ましく、１０～６０ｍＰａ・ｓ（２５℃）であることが特に好ましい。
　回転粘度［η］は、当業界において慣用される方法により測定することができるが、例えば、ＡＭＥＴＥＫ　Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ製デジタルＢ型粘度計ＤＶ－３Ｔにより測定することができる。測定にあたっては、ＵＬＡアダプターを使用し、典型的には液量１６ｍＬ、液温２５℃で測定することができる。
　回転粘度［η］も、重合時の希釈濃度、コモノマーの有無、種類及び組成、重合工程における温度、時間及び圧力、重合工程で用いるラジカル開始剤の種類及び量等を調整することで、適宜調整することができる。
　（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体
　本発明における特定ポリマーとして好ましく用いられる（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体は、（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位を有する（共）重合体である。ジアリルアミン系単量体はアミノ基を有するので、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体においては、（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位が、上述の特定構成単位に該当する。
　ここで「（共）重合体」とは、単独重合体及び共重合体の双方を包含する概念であり、したがって（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体は、（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位のみからなる単独重合体であってもよく、（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位と、それ以外の構成単位とを有する共重合体であってもよい。
　（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体は、（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位を有する。
　より具体的には、（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位は、下記の構造式（ＩＩａ）、若しくは（ＩＩｂ）で示される構造、又はその無機酸塩、若しくは有機酸塩である構造、又は下記の構造式（ＩＩＩａ）、若しくは（ＩＩＩｂ）で示される構造、を有することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　上記式（ＩＩａ）、及び（ＩＩｂ）中、Ｒ４は、水素原子、又は１価の有機基を示し、好ましくは水素原子、炭素数１から１０のアルキル基、炭素数５から１０のシクロアルキル基、又は炭素数７から１０のアラルキル基である。上記式（ＩＩＩａ）、及び（ＩＩＩｂ）中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に水素原子、又は１価の有機基を示し（但し、Ｒ５及びＲ６の少なくとも一方は、水素原子である。）、好ましくは水素原子、炭素数１から１０のアルキル基、炭素数５から１０のシクロアルキル基、又は炭素数７から１０のアラルキル基であり、Ｘ－はカウンターイオンである。
　上記式（ＩＩａ）、及び（ＩＩｂ）中、Ｒ４は、水素原子、メチル基、エチル基、又はベンジル基であることがより好ましく、水素原子、又はメチル基であることが特に好ましい。
　上記式（ＩＩＩａ）、及び（ＩＩＩｂ）中、Ｒ５及びＲ６は、その少なくとも一方が水素原子である限りにおいて、それぞれ独立に水素原子、メチル基、エチル基、又はベンジル基であることが好ましく、水素原子、又はメチル基であることが特に好ましい。
　（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体は、（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位として、上記の構造式（ＩＩａ）、又は（ＩＩｂ）で示される構造の構成単位、すなわち遊離の構造の構成単位、を有していてもよいが、上記の構造式（ＩＩａ）、又は（ＩＩｂ）で示される構造の無機酸塩、若しくは有機酸塩である構造、すなわち付加塩を有する構造、又は上記の構造式（ＩＩＩａ）、若しくは（ＩＩＩｂ）で示される構造、すなわちカウンターイオンを有する構造、の構成単位を有していてもよい。
　（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体の製造にあたっては、製造コスト等の観点からは、付加塩やカウンターイオンを有するジアリルアミンモノマーを用いることが好ましい。重合体からＨＣｌ等の付加塩やカウンターイオンを除去するプロセスは煩雑であり、コスト増大の原因ともなることから、その様なプロセスを要さずして製造可能である、付加塩型やカウンターイオン型の（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体を用いることは、コスト等の観点からも好ましい実施形態である。
　入手の容易さや反応の制御性等の観点から、上記の構造式（ＩＩａ）、又は（ＩＩｂ）で示される構造の無機酸塩、又は有機酸塩は、塩酸塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩、又はアルキルサルフェート塩であることが好ましく、塩酸塩であることが特に好ましい。
　（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体が（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位として上記の構造式（ＩＩＩａ）、若しくは（ＩＩＩｂ）で示される構造を有する場合の、カウンターイオンＸ－には特に限定はないが、入手の容易さや反応の制御性等の観点から、塩素イオン、カルボン酸イオン、スルホン酸イオン、又はアルキルサルフェートイオンであることが好ましく、塩素イオン、又はエチルサルフェートイオンであることが特に好ましい。
　（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体においては、１種類のみの（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位を単独で用いてもよいし、複数種類の互いに異なる構造の（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位を組み合わせて用いてもよい。
　複数種類の互いに異なる（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位を用いる場合、それぞれのジアリルアミン系構成単位は、同一の一般構造式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩＩａ）、又は（ＩＩＩｂ）で表される範囲内において互いに異なる構造を有していてもよいし、異なる一般構造式で表される互いに異なる構造を有していてもよい。前者の場合、例えば、一般構造式（ＩＩａ）で表されるが、Ｒ４の構造が互いに異なることによって構造が互いに異なる、複数種類の（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位を用いてもよい。後者の場合、例えば、構造式（ＩＩａ）で表される構造を有する１の構成単位（Ａ２）と、構造式（ＩＩＩａ）で表される構造を有する他の構成単位（Ａ２）とを用いてもよい。
　（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体における（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位の含有量には特に制限はないが、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体の全構成単位の１モル％以上を占めることが好ましく５～１００モル％を占めることがより好ましい。
　（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位の割合は、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体の製造の際の、ジアリルアミン系単量体の使用割合や、それ以外の重合条件を調整することで、適宜調整することができる。
　（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体における、（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位以外の構成単位には特に制限は無く、ジアリルアミン系単量体と共重合可能なモノマーを適宜使用して共重合することで、その様な構成単位を導くことができる。
　共重合可能なモノマーの好ましい例としては、モノアリルアミン類またはその付加塩；ジカルボン酸等のアニオン性モノマー、二酸化硫黄、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、アクリロイルモルホリン、Ｎ－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］（メタ）アクリルアミド、（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、（３－メタクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド等のアクリルアミド類；アリルアルコール類、エチレングリコールモノアリルエーテル等のアリルエーテル類、（メタ）アリルスルホン酸（ナトリウム）等のアリルスルホン酸類またはその付加塩；ビニルスルホン酸（ナトリウム）等のビニルスルホン酸類またはその付加塩；イソプレンスルホン酸ナトリウム等を挙げることができるが、これらには限定されない。
　これらの中でも、モノアリルアミン類、ジカルボン酸等のアニオン性モノマー、二酸化硫黄、アクリルアミド等を好ましく用いることができる。
　ジアリルアミン系単量体以外のモノマーは、１種類のみを使用することもできるし、２種類以上を組み合わせて使用することもできる。
　モノアリルアミン類、ジカルボン酸等のアニオン性モノマー等から導かれる構成単位の好ましい形態等の詳細は、（ａ１）アリルアミン（共）重合体に関して上記にて説明したのと同様である。
　二酸化硫黄構成単位
　本実施形態においては、二酸化硫黄構成単位を有することで、特定ポリマーに、重合性、血球分離能の向上等の有利な特性を付与することができる。
　本実施形態の共重合体中の、二酸化硫黄構成単位は、下記構造式（４）で表される構造を有する二酸化硫黄から導かれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　二酸化硫黄構成単位が、本実施形態の共重合体の全構成単位に占める割合は、１モル％以上であることが好ましい。特に、二酸化硫黄から導かれる構成単位の割合が、１モル％以上であることによって、本実施形態の共重合体に、重合性、疎水性の向上、アニオン成分（たとえば血球）との分離性能の向上等の有利な特性を一層効果的に付与することができる。
　二酸化硫黄構成単位の割合は、１～５０モル％であることがより好ましく、１０～５０モル％であることが特に好ましい。
　本実施形態における、（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位と二酸化硫黄構成単位との割合にも特に制限はなく、共重合可能な限りにおいて、任意の割合とすることができる。共重合体の高分子量化の観点からは、両構成単位の割合が大きくは異ならないことが好ましく、例えば（Ａ２）ジアリルアミン系単量体から導かれる構成単位と、二酸化硫黄から導かれる構成単位との比が、９９：１から５０：５０であることが好ましく、９０：１０～５０：５０であることが特に好ましい。
　（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体の分子量には特に制限は無く、血球分離剤における使用形態や他の成分等との関係で適宜好適な分子量の（共）重合体を入手又は重合すればよい。
　無機担体への担持の容易さや、実用上許容可能な時間及びコストで重合を行う観点からは、重量平均分子量（Ｍｗ）が５００から１０，０００，０００であることが好ましい。重量平均分子量（Ｍｗ）は、１，０００から１，０００，０００であることがより好ましい。重量平均分子量（Ｍｗ）は、２，０００から５００，０００であることが特に好ましい。
　良好な血球分離性能を実現する等の観点からは、上記範囲内において高分子量であることが好ましく、例えば重量平均分子量（Ｍｗ）が１５，０００以上であることが好ましい。
　（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）は、例えば、液体クロマトグラフを使用し、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ法）によって測定することができる。より具体的には、例えば本願実施例に記載の方法によって測定することができる。
　（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体の分子量は、コモノマーの有無、種類及び組成、重合工程における温度、時間及び圧力、重合工程で用いるラジカル開始剤の種類及び量等を調整することで、適宜調整することができる。
　（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体の回転粘度［η］にも特に制限は無く、無機担体への担持の容易さや製造コスト等との関係で適宜設定することができるが、１０～１，５００ｍＰａ・ｓ（２５℃）であることが好ましく、１０～５００ｍＰａ・ｓ（２５℃）であることが特に好ましい。
　回転粘度［η］は、当業界において慣用される方法により測定することができるが、例えば、ＡＭＥＴＥＫ　Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ製デジタルＢ型粘度計ＤＶ－３Ｔにより測定することができる。測定にあたっては、ＵＬＡアダプターを使用し、典型的には液量１６ｍＬ、液温２５℃で測定することができる。
　回転粘度［η］も、コモノマーの有無、種類及び組成、重合工程における温度、時間及び圧力、重合工程で用いるラジカル開始剤の種類及び量等を調整することで、適宜調整することができる。
（ａ３）ポリエチレンイミン
　本発明における特定ポリマーとして好ましく用いられる（ａ３）ポリエチレンイミンは、エチレンイミンから導かれる構成単位を有する重合体であり、より具体的には、下式（ＩＶａ）で表される構造の構成単位を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　（ａ３）ポリエチレンイミンは、上式（ＩＶａ）で表される構造の構成単位を有することでアミノ基を有するので、本発明で用いられるアミノ基を有する構成単位を有するポリマー（特定ポリマー）に該当する。また上記アミノ基は、第二級アミノ基なので、特定ポリマーとして好ましい、第二級アミノ基、又は第三級アミノ基を有する構成単位を有する（共）重合体にも該当する。
　（ａ３）ポリエチレンイミンは、上記式（ＩＶａ）で表される構造の構成単位のみからなっていてもよく、それ以外の構造の構成単位を有していてもよい。
　上記式（ＩＶａ）で表される構造の構成単位のみからなる場合、（ａ３）ポリエチレンイミンは直鎖状の構造を有する。
　（ａ３）ポリエチレンイミンは、第三級アミノ基を有することで分岐状の構造を有していてもよく、例えば下式（ＩＶｂ）で表される構造を有していてもよい。下式（ＩＶｂ）の構造においても、直鎖状の部分においては第二級アミノ基が存在し、末端においては第一級アミノ基が存在するので、本発明で用いられるその少なくとも一部が、第一級、第二級、又は第三級であるアミノ基を有する構成単位を有するポリマー（特定ポリマー）に該当し、また特定ポリマーとして特に好ましい、第二級アミノ基、又は第三級アミノ基を有する構成単位を有する（共）重合体にも該当する。
　式（ＩＶａ）及び（ＩＶｂ）においてアミノ基はいずれも遊離の状態で表されているが、これらのアミノ基の一部または全部は付加塩であってもよい。付加塩の種類には特に制限は無く、例えば（ａ１）アリルアミン（共）重合体、及び（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体に関連して上記で説明した各種有機酸塩、無機酸塩を適宜使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　（ａ３）ポリエチレンイミンの分子量には特に限定はないが、好ましくはその重量平均分子量が１００～２，０００，０００の範囲内であり、より好ましくは５００～２，０００，０００、特に好ましくは１，０００～２，０００，０００の範囲内である。
　（ａ３）ポリエチレンイミンは、例えば、エチレンイミンを酸触媒の存在下、開環重合させることにより合成することができる。
　あるいは、市販のポリエチレンイミン、例えば、ＢＡＳＦ社から市販されているＬｕｐａｓｏｌ　（商品名：Ｌｕｐａｓｏｌ　ＳＫ（平均分子量約２，０００，０００）、Ｌｕｐａｓｏｌ　Ｇ２０（平均分子量約１，３００）、Ｌｕｐａｓｏｌ　Ｇ２０　ＷＦ（平均分子量約１，３００）、Ｌｕｐａｓｏｌ　Ｐ（平均分子量約　７５０，０００）、Ｌｕｐａｓｏｌ　ＰＳ（平均分子量約７５０，０００）、Ｌｕｐａｓｏｌ　ＰＲ　８５１５（２，０００）、Ｌｕｐａｓｏｌ　ＰＮ　４０、Ｌｕｐａｓｏｌ　ＷＦ（平均分子量約２５，０００）、Ｌｕｐａｓｏｌ　ＳＣ－６１Ｂ（平均分子量１１０，０００）及び　Ｌｕｐａｓｏｌ　ＦＧ）、株式会社日本触媒から市販されているエポミン（型番：ＳＰ－００３（平均分子量約３００）、ＳＰ－００６（平均分子量約６００）、ＳＰ－０１２（平均分子量約１，２００）、ＳＰ－０１８（平均分子量約１，８００）、ＳＰ－２００（平均分子量約１０，０００）及びＰ－１０００（平均分子量約７０，０００））、和光純薬株式会社から市販されているＢＰＥＩ（販売元コード１６１－１７８３１（平均分子量約６００）、販売元コード１６７－１７８１１（平均分子量約１，８００）、及び販売元コード１６４－１７８２１（平均分子量約１０，０００））、などを用いてもよい。
　特定ポリマーの製造方法
　特定ポリマー重合体の製造方法には特に制限はなく、従来当該技術分野において公知の方法で製造することができるが、例えばモノアリルアミン若しくはジアリルアミン単量体、又はその無機酸塩、若しくは有機酸塩を単独重合し、又は所望により他の単量体と共重合することにより製造することができる。
　モノアリルアミン若しくはジアリルアミン、又はその無機酸塩、若しくは有機酸塩を単独重合し、又は他の単量体と共重合する場合の溶媒は特に限定されず、水系の溶媒であっても、アルコール、エーテル、スルホキシド、アミド等の有機系の溶媒であってもよいが、水系の溶媒であることが好ましい。
　モノアリルアミン若しくはジアリルアミン、又はその無機酸塩、若しくは有機酸塩を単独重合し、又は他の単量体と共重合する場合の単量体濃度は単量体の種類により、また（共）重合を行う溶媒の種類により、異なるが、水系の溶媒の場合通常１０～７５重量％である。この（共）重合反応は、通常、ラジカル重合反応であり、ラジカル重合触媒の存在下に行なわれる。ラジカル重合触媒の種類は特に限定されるものでなく、その好ましい例として、ｔ－ブチルハイドロパーオキサイドなどの過酸化物、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムなどの過硫酸塩、アゾビス系、ジアゾ系などの水溶性アゾ化合物が挙げられる。
　ラジカル重合触媒の添加量は、一般的には全モノマーに対して０．１～２０モル％、好ましくは１．０～１０モル％である。重合温度は一般的には０～１００℃、好ましくは５～８０℃であり、重合時間は一般的には１～１５０時間、好ましくは５～１００時間である。重合雰囲気は、大気中でも重合性に大きな問題を生じないが、窒素などの不活性ガスの雰囲気で行なうこともできる。
　無機担体
　本発明の血球分離剤は、無機担体と、アミノ基を有する構成単位を有するポリマー（特定ポリマー）とを含む、血球分離剤であって、前記ポリマーの少なくとも一部が、好ましくは静電相互作用で吸着され、及び／又は共有結合で結合された形態で、前記無機担体に担持されている、血球分離剤である。
　特定ポリマーを無機担体に担持することは、取り扱い、血球分離剤の再利用、血球から分離した試料中への血球分離剤の混入抑制等の観点から、好ましい。
　無機担体の形状には特に制限は無く、例えば容器、管の内壁、無機粒子、磁気ビーズ、グラスウール、ガラス濾紙等を、無機担体として使用することができる。また、無機担体の材質としては、それ自体血球分離能を有すると共に、特定（共）重合体の担持が容易な点で、ガラス、シリカ、カオリン、ゼオライト、ベントナイト等が挙げられる。
　粒子状の無機担体を利用する場合、無機担体の粒径にも特に制限は無いが、一次粒子径が０．０５～５００μｍであることが好ましく、０．１～５０μｍであることが特に好ましい。
　本発明においては、特定ポリマーを無機担体に担持する方法には特に制限は無いが、静電相互作用で吸着され、及び／又は共有結合で結合された形態で、前記無機担体に担持することが好ましく、これにより、安定的な担持が実現できる。
　特定ポリマーを静電相互作用で無機担体に吸着する方法には特に制限は無いが、特定ポリマーを分散又は溶解した分散体又は溶液のｐＨを調整する、固形分濃度、特にポリマー濃度、を調整する等の操作を行うことが好ましい。
　例えば、無機担体がシリカである場合には、特定ポリマーのｐＨは５～１１とすることが好ましく、ｐＨ７～１０とすることが特に好ましい。
　また、特定ポリマーのポリマー濃度は、１．０～２０重量％とすることが好ましく、２．５～１０重量％とすることが特に好ましい。
　特定ポリマーを共有結合で無機担体に結合する方法にも特に制限は無く、特定ポリマー中のアミノ基等の官能基と、無機担体の表面に存在する反応性の基との間を反応させ、あるいは両者と反応性を有する化合物を使用して、共有結合を実現することができる。
　例えば、無機担体がシリカである場合には、シランカップリング剤を使用することが好ましい。シランカップリング剤の種類にも特に制限は無いが、エポキシシラン、メタクリルシラン、アクリルシラン、クロロシラン等を好ましく使用することができる。中でも、エポキシシランを使用することが特に好ましい。
　また、これらの手法により担持するにあたって、特定ポリマー同士を架橋する。特定ポリマーを静電相互作用で無機担体上に吸着する場合、ｐＨ変化で特定ポリマーが脱離し易い傾向があるが、特定ポリマー同士を架橋することで、ｐＨ変化により特定ポリマーの一部が脱離したとしても、架橋された特定ポリマー全体の吸着が維持されるので、特定ポリマーを静電相互作用で無機担体上に吸着する場合においては、特定ポリマー同士を架橋することの技術的価値が特に高い。
　特定ポリマー同士の架橋には、従来より当該技術分野で用いられる架橋剤を適宜使用することができ、過酸化物系架橋剤、エポキシ系架橋剤、ハロゲン化アルキル系架橋剤等を適宜使用することができる。なかでも、特定ポリマー中のアミノ基と共有結合を生成可能な官能基を合計で少なくとも２個有する化合物である架橋剤により架橋することが好ましい。このような官能基としては、例えば、ハロゲン基、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、酸無水物基、酸ハライド基、Ｎ－クロロホルミル基、クロロホルメート基、イミドエーテル基、アミジニル基、イソシアネート基、ビニル基等が挙げられる。
　具体的な架橋剤としては、エチレングリコールジアクリレート、プロピレングリコールジアクリレート、ブチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、プロピレングリコールジメタクリレート、ブチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、メチレンビスアクリルアミド、メチレンビスメタクリルアミド、エチレンビスアクリルアミド、エピクロロヒドリン、トルエンジイソシアネート、エチレンビスメタクリルアミド、エチリデンビスアクリルアミド、ジビニルベンゼン、ビスフェノールＡジメタクリレート、ビスフェノールＡジアクリレート、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，２－エタンジオールジグリシジルエーテル（エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ））、１，３－ジクロロプロパン、１，２－ジクロロエタン、１，３－ジブロモプロパン、１，２－ジブロモエタン、スクシニルジクロリド、ジメチルスクシネート、アクリロイルクロリド、ピロメリティックジアンヒドリド等が挙げられる。中でも、エピクロルヒドリン、１，３－ジクロロプロパン、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ）を特に好ましく使用することができる。
　特定ポリマー同士の架橋の際の架橋剤濃度は、架橋剤／特定ポリマーのモル比が、０．０５～２０であることが好ましく、０．４～１５であることが特に好ましい。
　架橋剤の量が上記いずれかの基準で好適な範囲内にあることで、血球分離性能を向上し、特定ポリマー全体の吸着が維持される。
　血球分離方法
　上述した血球分離剤を、血球を含有する検体に接触させると血球が分離し、血球と液相に分離することができる。従って、本発明の血球分離方法は、この点以外に特に制限はなく、種々の形態により血球を分離できる。
　例えば、特定ポリマーを粒子状の無機担体に担持させた血球分離剤では、採取容器中の血球を含有する試料に、血球分離剤を添加、混合して、または容器中の血球分離剤に、採取した血球を含有する検体を添加、混合して、血球を捕捉し、血球と液相に分離することができる。この方法は、臨床現場での利用が容易であり、汎用性が高いという利点がある。
　本発明の血球分離剤では、特定ポリマーが無機担体に担持されているため、血球から分離した液相への血球分離剤の混入が無い。加えて、血球分離剤が酸性溶液またはアルカリ溶液に曝される条件で試料を得る場合でも、本発明の血球分離剤では、特定ポリマーが無機担体から脱離せず、試料への特定ポリマーの混入が無い。よって、ＨＰＬＣの移動相のｐＨなどの分析系のｐＨ条件に適合したｐＨの試料を得ることができ、試料に対して所定のｐＨとすることが要求される分析でも、そのまま分析に供することができる。
　試料採取管の内壁表面に特定ポリマーを担持させた血球分離剤を用いる場合には、採取管に試料を入れ、必要に応じて転倒混和するだけで、血球を分離できる。このため、実用性が高く、特定ポリマーが担持された試料採取管を繰り返し使用できるメリットもある。血球から分離した液相への血球分離剤の混入が無く、特に酸性溶液またはアルカリ溶液に曝される条件で血球分離により試料を得る場合でも、特定ポリマーが無機担体から脱離せず、分析系のｐＨ条件に適合したｐＨの試料を得ることができる点は、特定ポリマーを粒子状または繊維状の無機担体に担持させた血球分離剤と同様である。
　特定ポリマーを粒子状の無機担体に担持させた血球分離剤では、必要に応じて濾過材料によって構成される支持体と共に、これをカラムなどの容器または分析装置の試料流路に充填して血球分離部材または血球分離部を構成することができる。また、特定ポリマーを粒子状の無機担体に担持させた血球分離剤と血球を含有する試料とを混合し、濾過材料を充填しておいたカラムなどの容器に、当該混合物を導入して血球と液相とに分離することもできる。これらの実施形態では、血球分離部材または血球分離部から流出した試料をそのまま各種分析に供することができ、ＨＰＬＣの移動相のｐＨなど分析系のｐＨ条件に適合したｐＨの試料を得ることが要求される場合でも対応可能である。従って、血球分離から各種分析を連続して行うことも可能である。支持体を構成する濾過材料としては、シート状若しくは粒子状の濾紙、シート状若しくは粒子状のクロマトグラフィー紙、粒子状のシリカゲル、粒子状若しくは繊維状のアルミナ、粒子状のケイ藻土、粒子状若しくは繊維状のガラス及びその組み合わせを挙げることができる。
　同様に、シート状、または繊維状の無機担体に特定ポリマーを担持させた血球分離剤をカラムなどの容器または分析装置の試料流路に充填して血球分離部材または血球分離部を構成することもできる。
　本発明の血球分離剤および方法は、血球を含有する試料であれば適用可能であり、例えば、血液、尿、リンパ液、脳液、体腔液、細胞浸出液、消化液、便等に適用できる。適用される典型的な試料は、血液であり、これには、全血検体、ヘパリン等の抗凝固剤入りの血液検体が含まれ、全血検体が最も典型的な試料である。
　以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（重量平均分子量の測定方法）
　なお、下記各カチオン性ポリマーの重量平均分子量は、それぞれ以下の方法で測定したものである。
　アニオン構成単位（イ）を含むカチオン性ポリマー（実施例１１）の重量平均分子量（Ｍｗ）は、日立Ｌ－２０００型高速液体クロマトグラフを使用し、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ法）によって測定した。
　溶離液流路ポンプは日立Ｌ－２１３０形ポンプ、検出器は日立Ｌ－２４９０形ＲＩ検出器、カラムはＴＯＳＯＨ　ＴＳＫｇｅｌ　α-Ｍ（排除限界分子量１０，０００，０００）２本を直列に接続したものを用いた。サンプルは溶離液で０．５ｇ／１００ｍＬの濃度に調製し、１００μＬを用いた。溶離液には、０．１５モル／Ｌの硫酸ナトリウム、１重量％酢酸水溶液を使用した。カラム温度は４０℃で、流速は１．０ｍＬ／分で実施した。標準物質として、分子量５，９００、４７，３００、２１２，０００、７８８，０００のプルランを用いて較正曲線を求め、その較正曲線を基にカチオン性ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）を求めた。
　それ以外のカチオン性ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、株式会社日立ハイテクサイエンス製Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ（登録商標）５４５０高速液体クロマトグラフを使用し、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ法）によって測定した。
　検出器はＲＩ示差屈折率検出器、カラムはショーデックスアサヒパックの水系ゲル濾過タイプのＧＳ－２２０ＨＱ（排除限界分子量３，０００）とＧＳ－６２０ＨＱ（排除限界分子量２００万）とを直列に接続したものを用いた。サンプルは溶離液で０．５ｇ／１００ｍＬの濃度に調製し、２０μＬを用いた。溶離液には、０．４モル／Ｌの塩化ナトリウム水溶液を使用した。カラム温度は３０℃で、流速は１．０ｍＬ／分で実施した。標準物質として、分子量１０６、１９４、４４０、６００、１，４７０、４，１００、７，１００、１０，３００、１２，６００、２３，０００などのポリエチレングリコールを用いて較正曲線を求め、その較正曲線を基にカチオン性ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）を求めた。
１．血球分離剤の調製
多点静電相互作用によりシリカビーズ上に固相化されたカチオン性ポリマーの調製
（実施例１）
　粒径が０．３μｍのシリカビーズ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ　Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅ製）２５ｍｇに、１規定に調整したＮａＯＨを５００μＬ添加し、３０分間攪拌した。上清を除去した後、中性になるまで、蒸留水にて洗浄を繰り返した。
　他方、ジアリルアミン塩酸塩二酸化硫黄共重合体（製品名：ＰＡＳ－９２、ニットーボーメディカル製、アミン級数：２級、ポリマーｐＨ：７、重量平均分子量：５，０００、アミンに対する単位分子量：１９７．６８）を純水に溶解して、固形分濃度１０重量％（０．２５３ｍｍｏｌ）で、４規定のＮａＯＨによりｐＨ７．０のポリマー溶液を調製した。
　次いで、ポリマー溶液中に終濃度３体積％（０．１９ｍｍｏｌ）になるようにエピクロロヒドリン（東京化成工業製）を添加し、得られた溶液５００μＬ（ポリマー１ｍｏｌに対する架橋剤のｍｏｌ比は、０．７５６）を、洗浄後のシリカビーズと混和し、１日室温で攪拌して、シリカビーズへカチオン性ポリマーを担持した。
　カチオン性ポリマーを固相化したシリカビーズは、ＭＥＳ－ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＭＥＳ，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ５．０）、ついでＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）により洗浄した。その後、５００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液にカチオン性ポリマー固相化シリカビーズを懸濁して、血球分離剤として用いた。
（実施例２）
　ポリマー溶液中に終濃度３体積％（０．１９ｍｍｏｌ）になるようにエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ、東京化成工業製）を添加し、得られた溶液５００μＬ（ポリマー１ｍｏｌに対する架橋剤のｍｏｌ比は、０．３８１）を、洗浄後のシリカビーズと混和した以外は、実施例１と同様にして血球分離剤を調製した。
（実施例３）
　粒径が０．１μｍのシリカビーズ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ　Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅ製）２５ｍｇを用いた以外は、実施例１と同様にして血球分離剤を調製した。
（実施例４）
　粒径が０．５μｍのシリカビーズ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ　Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅ製）２５ｍｇを用いた以外は、実施例１と同様にして血球分離剤を調製した。
（比較例１）
　粒径が０．３μｍのシリカビーズ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ　Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅ製）２５ｍｇを、実施例１と同様に洗浄後、カチオン性ポリマーを固相化せずに、５００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁して、血球分離剤として用いた。
（比較例２）
　エピクロロヒドリン（東京化成工業製）を含まないポリマー溶液５００μＬを、洗浄後のシリカビーズと混和し、１日室温で攪拌して、シリカビーズへカチオン性ポリマーを担持した以外は、実施例１と同様に血球分離剤を調製した。
　実施例１～４ならびに比較例１および２の血球分離剤の調製の概要を纏めて以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
多点静電相互作用によりガラスビーズ上に固相化された各種カチオン性ポリマーの調製
（実施例５）
　中心粒径５３～３８μｍのガラスビーズ（フジガラスビーズＦＧＢ－３２０、不二製作所製）５．０ｇに、１規定に調整したＮａＯＨを５ｍＬ添加し、３０分間攪拌した。上清を除去した後、中性になるまで、蒸留水にて洗浄を繰り返した。
　他方、アリルアミン重合体（製品名：ＰＡＡ－０８、ニットーボーメディカル製、アミン級数：１級、ポリマーｐＨ：７、重量平均分子量：８，０００、アミンに対する単位分子量：５７．０９）を１０重量％（０．８７６ｍｍｏｌ）の濃度で純水に溶解してポリマー溶液を調製した。
　ポリマー溶液中に終濃度３体積％（０．１９ｍｍｏｌ）になるようにエピクロロヒドリン（東京化成工業製）を添加し、得られた溶液５ｍＬ（ポリマー１ｍｏｌに対する架橋剤のｍｏｌ比は、０．２１８）を、ガラスビーズと混和し、４日間室温で攪拌することで、ガラスビーズへ各カチオン性ポリマーを固相化した。カチオン性ポリマーを固相化したガラスビーズは、ＭＥＳ－ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＭＥＳ，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ５．０）、ついでＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）により洗浄した。その後、５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液でカチオン性ポリマーを固相化したガラスビーズを懸濁し、血球分離剤として用いた。
（実施例６）
　アリルアミン塩酸塩ジアリルアミン塩酸塩共重合体（製品名ＰＡＡ－Ｄ１１－ＨＣｌ、ニットーボーメディカル製、アミン級数：１級＋２級、ポリマーｐＨ：７、重量平均分子量：１００，０００、アミンに対する単位分子量：１１３．５９）を１０重量％（４．４０２ｍｍｏｌ）の濃度で純水に溶解してポリマー溶液を調製し、ポリマー溶液中に終濃度３体積％（１．９１ｍｍｏｌ）になるようにエピクロロヒドリン（東京化成工業製）を添加して得られた溶液５ｍＬ（ポリマー１ｍｏｌに対する架橋剤のｍｏｌ比は、０．４３５）を、ガラスビーズと混和した以外は、実施例５と同様にして、血球分離剤を調製した。
（実施例７）
　アリルアミン塩酸塩ジアリルアミン塩酸塩共重合体（製品名ＰＡＡ－Ｄ１９－ＨＣｌ、ニットーボーメディカル製、アミン級数：１級＋２級、ポリマーｐＨ：７、重量平均分子量：４０，０００、アミンに対する単位分子量：１３１．６２）を１０重量％（３．７９９ｍｍｏｌ）の濃度で純水に溶解してポリマー溶液を調製し、ポリマー溶液中に終濃度３体積％（１．９１ｍｍｏｌ）になるようにエピクロロヒドリン（東京化成工業製）を添加して得られた溶液５ｍＬ（ポリマー１ｍｏｌに対する架橋剤のｍｏｌ比は、０．５０４）を、ガラスビーズと混和した以外は、実施例５と同様にして、血球分離剤を調製した。
（実施例８）
　ジアリルアミン重合体（製品名ＰＡＳ－２１、ニットーボーメディカル製、アミン級数：２級、ポリマーｐＨ：７、重量平均分子量：５，０００、アミンに対する単位分子量：９７．１６）を１０重量％（５．１４６ｍｍｏｌ）の濃度で純水に溶解してポリマー溶液を調製し、ポリマー溶液中に終濃度３体積％（１．９１ｍｍｏｌ）になるようにエピクロロヒドリン（東京化成工業製）を添加して得られた溶液５ｍＬ（ポリマー１ｍｏｌに対する架橋剤のｍｏｌ比は、０．３７２）を、ガラスビーズと混和した以外は、実施例５と同様にして、血球分離剤を調製した。
（実施例９）
　ジアリルアミン塩酸塩重合体（製品名ＰＡＳ－２１ＣＬ、ニットーボーメディカル製、アミン級数：２級、ポリマーｐＨ：７、重量平均分子量：５０，０００、アミンに対する単位分子量：１３３．６２）を１０重量％（３．７４２ｍｍｏｌ）の濃度で純水に溶解してポリマー溶液を調製し、ポリマー溶液中に終濃度３体積％（１．９１ｍｍｏｌ）になるようにエピクロロヒドリン（東京化成工業製）を添加して得られた溶液５ｍＬ（ポリマー１ｍｏｌに対する架橋剤のｍｏｌ比は、０．５１１）を、ガラスビーズと混和した以外は、実施例５と同様にして、血球分離剤を調製した。
（実施例１０）
　メチルジアリルアミン塩酸塩重合体（製品名ＰＡＳ－Ｍ－１Ｌ、ニットーボーメディカル製、アミン級数：３級、ポリマーｐＨ：９、重量平均分子量：５，０００、アミンに対する単位分子量：１４７．６５）を１０重量％（６７．７２８ｍｍｏｌ）の濃度で純水に溶解してポリマー溶液を調製し、ポリマー溶液中に終濃度３体積％（３１．６０ｍｍｏｌ）になるように１，３－ジクロロプロパン（東京化成工業製）を添加して得られた溶液５ｍＬ（ポリマー１ｍｏｌに対する架橋剤のｍｏｌ比は、０．４６７）を、ガラスビーズと混和した以外は、実施例５と同様にして、血球分離剤を調製した。
（実施例１１）
　ジアリルアミン塩酸塩マレイン酸共重合体（製品名ＰＡＳ－４１１、ニットーボーメディカル製、アミン級数：２級、ポリマーｐＨ：７、重量平均分子量：４０，０００、アミンに対する単位分子量：１７２．３１）を１０重量％（２．９０２ｍｍｏｌ）の濃度で純水に溶解してポリマー溶液を調製し、ポリマー溶液中に終濃度３体積％（１．９１ｍｍｏｌ）になるように、エピクロロヒドリン（東京化成工業製）を添加して得られた溶液５ｍＬ（ポリマー１ｍｏｌに対する架橋剤のｍｏｌ比は、０．６５９）を、ガラスビーズと混和した以外は、実施例５と同様にして、血球分離剤を調製した。
（実施例１２）
　ジアリルアミン塩酸塩二酸化硫黄共重合体（製品名ＰＡＳ－９２、ニットーボーメディカル製、アミン級数：２級、ポリマーｐＨ：９、重量平均分子量：５，０００、アミンに対する単位分子量：１９７．６８）を１０重量％（２．５２９ｍｍｏｌ）の濃度で純水に溶解してポリマー溶液を調製し、ポリマー溶液中に終濃度３体積％（１．９１ｍｍｏｌ）になるようにエピクロロヒドリン（東京化成工業製）を添加して得られた溶液５ｍＬ（ポリマー１ｍｏｌに対する架橋剤のｍｏｌ比は、０．７５６）を、ガラスビーズと混和した以外は、実施例５と同様にして、血球分離剤を調製した。
（実施例１３）
　ジアリルアミン塩酸塩二酸化硫黄共重合体（製品名ＰＡＳ－９２、ニットーボーメディカル製、アミン級数：２級、ポリマーｐＨ：７、重量平均分子量：５，０００、アミンに対する単位分子量：１９７．６８）を２．５重量％（０．６３２ｍｍｏｌ）の濃度で純水に溶解してポリマー溶液を調製し、このポリマー溶液中に、終濃度１２．５体積％（７．９７ｍｍｏｌ）になるようにエピクロロヒドリン（東京化成工業製）を添加した溶液５ｍＬ（ポリマー１ｍｏｌに対する架橋剤のｍｏｌ比は、１２．６０６）を、ガラスビーズと混和した以外は、実施例５と同様にして、血球分離剤を調製した。
（比較例３）
　中心粒径５３～３８μｍのガラスビーズ（フジガラスビーズＦＧＢ－３２０、不二製作所製）５．０ｇを、実施例５と同様に洗浄後、カチオン性ポリマーを固相化せずに、５ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁して、血球分離剤として用いた。
　実施例５～１３および比較例３の血球分離剤の調製の概要を纏めて以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
シランカップリングによりシリカビーズ上に固相化したカチオン性ポリマーの調製
（実施例１４）
　１．０体積％に調整した酢酸溶液に、終濃度０．１体積％になるようアクリルシラン：ＫＢＭ－５１０３（信越化学製）を添加し、終夜攪拌して、シランカップリング剤含有酢酸溶液を調製した。粒径が１．５μｍのシリカビーズ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ　Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅ製）２５ｍｇを、このシランカップリング剤含有酢酸溶液５００μＬに添加し、室温で１時間撹拌してシランカップリング剤を結合させた後、上清を除去し、無水エタノール５００μＬにて洗浄、ドラフト内で乾燥した。
　他方、ジアリルアミン塩酸塩二酸化硫黄共重合体（製品名ＰＡＳ－９２、ニットーボーメディカル製、アミン級数：２級、ポリマーｐＨ：７、重量平均分子量５，０００、アミンに対する単位分子量１９７．６８）を純水に溶解して、１０重量％（０．２５３ｍｍｏｌ）の濃度で、４規定のＮａＯＨによりｐＨ７．０のポリマー溶液を調製した。
　次いで、ポリマー溶液中に、終濃度が３体積％（０．１９ｍｍｏｌ）になるようにエピクロロヒドリン（東京化成工業製）を添加し、得られた溶液５００μＬ（ポリマー１ｍｏｌに対する架橋剤のｍｏｌ比は、０．７５６）に、シランカップリング剤を結合させたシリカビーズを添加し、室温で終夜攪拌して、カチオン性ポリマー固相化シリカビーズを合成した。合成したカチオン性ポリマー固相化シリカビーズは、ＭＥＳ－ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＭＥＳ，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ５．０）、ついでＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）により洗浄を行った。その後、５００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液にてカチオン性ポリマー固相化シリカビーズを懸濁し、血球分離剤として用いた。
（実施例１５）
　１．０体積％に調整した酢酸溶液に、終濃度０．１体積％になるようエポキシシラン：Ｚ６０４０（東レ・ダウ製）を添加し、終夜攪拌して、シランカップリング剤含有酢酸溶液を調製した以外は、実施例１４と同様にして血球分離剤を調製した。
　実施例１４および１５の血球分離剤の調製の概要を纏めて以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　カチオン性ポリマー固相化シリカビーズによる血球分離
　内径５．７ｍｍ、容量１ｍＬのＩｎｅｒｔＳｅｐ（登録商標）エンプティリザーバー（ジーエルサイエンス製）の下層に、保留粒子径１μｍの濾紙（桐山製作所製）を敷き、その上に、メッシュ３００以上の濾紙粉末（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）０．１ｇを充填し、血球分離用カラムを作製した。
　実施例１～４、１４および１５ならびに比較例２で調製したカチオン性ポリマー固相化シリカビーズ１００μＬに対し、全血検体５μＬをピペッティングにより添加、混合し、混合物を全量、血球分離用カラムにアプライした。次いで、血球分離用カラムをシリンジポンプ（東京硝子器械製）に接続して、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）を２ｍＬ送液した。対照として、比較例１で調製したカチオン性ポリマー未感作のシリカビーズと血液の混合物をカラムにアプライした。血球分離能は、目視により、下記の基準により判定した。
 
　〇：血球層の厚みが支持体の上から１／４以下の範囲であり、血球の全てがカラム内で捕捉
　△：血球層の厚みが支持体の上から1/4を超える範囲であり、血球の全てがカラム内で捕捉
　×：血球がカラム外へ漏出
カチオン性ポリマー固相化ガラスビーズによる血球分離
　内径５．７ｍｍ、容量１ｍＬのＩｎｅｒｔＳｅｐ（登録商標）エンプティリザーバー（ジーエルサイエンス製）の下層に、保留粒子径１μｍの濾紙（桐山製作所製）を敷き、その上に、実施例５～１３で調製したカチオン性ポリマー固相化ガラスビーズ５００μＬを充填し、血球分離用カラムを作製した。全血検体５μＬを血球分離用カラムにアプライした後、血球分離用カラムをシリンジポンプ（東京硝子器械製）に接続して、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）を２ｍＬ送液した。対照として、比較例３で調製したカチオン性ポリマー未感作のガラスビーズを充填したカラムを使用した。血球分離能は、目視により、下記の基準により判定した。
 
〇：血球層の厚みが支持体の上から１／４以下の範囲であり、血球の全てがカラム内で捕捉
△：血球層の厚みが支持体の上から１／４を超える範囲であり、血球の全てがカラム内で捕捉
×：血球がカラム外へ漏出
ｐＨ変化によるポリマーの担体からの脱離
　１．５ｍＬチューブに実施例１～１５ならびに比較例１および２の血球分離剤を５０μＬ分取し、遠心分離操作により、上清を除去した後、５０μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）にて洗浄し、上清を回収した。その後、５０μＬのＭＥＳ－ＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ　ＭＥＳ，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，ｐＨ５．０）にて再度洗浄し、同じく上清を回収した。
　回収した上清のうち１μＬをニトロセルロースメンブレンＩＡＢ０７５（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）に点着し、５０℃で３０分乾燥した後、カチオン性のアミノ基を赤色に呈色可能なポンソーＳ染色液（ビークル製）にて５分間染色した。その後、１体積％酢酸溶液にて５分間脱色した。
　各実施例および比較例の血球分離剤について血球分離能およびｐＨ変化によるポリマーの担体からの脱離を試験した結果を、表６～９並びに図１～３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　上記の試験結果から理解される通り、実施例１～１５の血球分離剤は、いずれも優れた血球分離能を有し、酸性条件下においてもポリマーの脱離は認められなかった。これに対して、架橋処理を行わなかった比較例２の血球分離剤は、血球分離能が低くなる傾向が認められ（実施例１および２との比較）、酸性条件下においてポリマーの脱離が認められた。従って、特定ポリマーを分子間及び/又は分子内で架橋したことで、血球分離能が向上し、ｐＨ変化によっても無機担体からのポリマーが脱落しないことが示された。
　また、実施例８および９の血球分離剤の試験結果から、重量平均分子量に着目すると、重量平均分子量が大きくなるにつれ血球分離能が大きくなる傾向が認められた。担体に結合可能なポリマー数が一定であると仮定すると、通常、重量平均分子量が大きいポリマーほど、血球捕捉に使用される官能基数が増えることで血球分離能が向上すると考えられる。

Claims (19)

  1. 　無機担体と、アミノ基を有する構成単位を有するポリマーとを含む、血球分離剤であって、
    　前記アミノ基の少なくとも一部が、第一級、第二級、又は第三級のアミノ基であり、
    　前記ポリマーの少なくとも一部が前記無機担体に担持され、
    　前記無機担体に担持された前記ポリマーが、架橋により他の前記ポリマーに連結されている、血球分離剤。
  2. 　前記アミノ基の少なくとも一部が、第二級、又は第三級のアミノ基である、請求項１に記載の血球分離剤。
  3. 　前記架橋が、前記アミノ基と共有結合を生成可能な官能基を合計で少なくとも２個有する化合物である架橋剤により実現される、請求項１又は２に記載の血球分離剤。
  4. 　前記ポリマーが、（ａ１）アリルアミン（共）重合体、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体、又は（ａ３）ポリエチレンイミンである、請求項１から３の何れか一項に記載の血球分離剤。
  5. 　前記ポリマーが、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体、又は（ａ３）ポリエチレンイミンである、請求項４に記載の血球分離剤。
  6. 　前記ポリマーの重量平均分子量が、３，０００から２００,０００である、請求項１から５の何れか一項に記載の血球分離剤。
  7. 　前記無機担体が、一次粒子径が０．０５～５００μｍの無機粒子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の血球分離剤。
  8. 　前記ポリマーの前記無機担体への担持が、静電相互作用による吸着で実現されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の血球分離剤。
  9. 　前記ポリマーの前記無機担体への担持が、共有結合により実現されている、請求項１から７のいずれか一項に記載の血球分離剤。
  10. 　前記共有結合が、シランカップリングにより形成されている、請求項９に記載の血球分離剤。
  11. 　血球を含有する検体を、請求項１～１０のいずれか一項に記載の血球分離剤と接触させる工程を含む、血球分離方法。
  12. 　アミノ基を有する構成単位を有するポリマーを、無機担体に担持し、
    　前記無機担体に担持させる前または後で、前記ポリマーを架橋剤と反応させて、架橋によりポリマー間を連結させる工程を含む、血球分離剤の製造方法であって、
    　前記アミノ基の少なくとも一部が、第一級、第二級、又は第三級のアミノ基である、
    　上記血球分離剤の製造方法。
  13. 　前記アミノ基の少なくとも一部が、第二級、又は第三級のアミノ基である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記ポリマーが、（ａ１）アリルアミン（共）重合体、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体、又は（ａ３）ポリエチレンイミンである、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 　前記ポリマーが、（ａ２）ジアリルアミン（共）重合体、又は（ａ３）ポリエチレンイミンである、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記ポリマーを、前記無機担体に、静電相互作用で吸着させ、及び／又は共有結合させて、担持する、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　前記ポリマーを、シランカップリング剤により、前記無機担体に共有結合させる請求項１６に記載の方法。
  18. 　前記ポリマーを、アルカリ溶液中で、前記無機担体と接触させて、静電相互作用により前記無機担体に吸着させる、請求項１６に記載の方法。
  19. 　前記架橋剤が、前記アミノ基と共有結合を生成可能な官能基を合計で少なくとも２個有する化合物である、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の方法。
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