CN118076891A

CN118076891A - 血细胞分离剂及使用其的血细胞分离方法

Info

Publication number: CN118076891A
Application number: CN202280063141.0A
Authority: CN
Inventors: 桝谷亚美子; 渡边晃司; 照内友也; 照内洋子; 竹内实
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 2021-09-21
Filing date: 2022-09-20
Publication date: 2024-05-24
Also published as: EP4407313A1; JPWO2023048115A1; WO2023048115A1

Abstract

本发明提供一种能够在避免样品被血细胞分离剂中含有的聚合物污染的情况下表现出优异的血细胞分离能力的血细胞分离剂及使用其的血细胞分离方法。该血细胞分离剂包含：无机载体和含有具有氨基的构成单元的聚合物；其中，所述氨基的至少一部分是伯氨基、仲氨基或叔氨基，所述聚合物的至少一部分负载在所述无机载体上，负载于所述无机载体上的所述聚合物通过交联与其余所述聚合物连接。

Description

血细胞分离剂及使用其的血细胞分离方法

技术领域

本发明涉及血细胞分离剂和使用其的血细胞分离方法，更具体地，涉及在无机载体上负载特定的聚合物的血细胞分离剂和使用其的血细胞分离方法。

背景技术

血液是用于各种生化检查或免疫学检查的检体，通常分离为血浆或血清和血细胞而分别用于各种分析。近来，要求进一步缩短从检体采集到分析结果提示的时间，在许多检查中尝试缩短血细胞分离时间，从而连续进行从分离到分析的步骤。

以往，在血浆或血清与血细胞的分离中，通常使用离心分离法，但正在研究不需要离心分离的更简易、迅速的血细胞分离方法。

作为不需要离心分离的更简易、迅速的血细胞分离方法，例如提出了将含有胆酸系表面活性剂和酸的溶液(专利文献1)或特定的季胺砜聚合物添加到采集的血液中而将血液分离为血清和血饼的方法(专利文献2)。然而，这些方法可能受到凝集剂混入血清或血浆中的影响。

另外，提出了一种简易试验装置，该试验装置具备包括与目标可溶性成分反应的试剂的试验垫，以及用于分离可溶性成分和血细胞的过滤垫(专利文献3)，该过滤垫包含载体基质，其浸渍有凝血酶、凝集素。在该装置中，将血液导入过滤垫，将从血细胞分离出的血浆或血清导入试验垫中进行分析。因此，该装置具有分离出的血浆或血清可直接用于分析的优点，另一方面，对于该过滤垫而言，凝血酶、凝集素有可能混入分离的血浆或血清中，但该装置没有特别考虑这一点。

另外，提出了在玻璃无纺布中浸渍或附着有血液凝集剂的血液过滤器(专利文献4)，作为血液凝集剂，使用聚(二烯丙基二甲基氯化铵)。但是，在该血液过滤器中，也有血液凝集剂混入到从玻璃无纺布中解离而分离出的血浆或血清中的情况，但对此也没有特别考虑。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2018-059791号公报

专利文献2：日本特开昭59-26062号公报

专利文献3：日本特开平4-212060号公报

专利文献4：日本特开2020-085887号公报

发明内容

发明要解决的课题

与这些现有技术相比，本发明的目的在于，提供一种能够在避免样品被血细胞分离剂中含有的聚合物污染的情况下表现出优异的血细胞分离能力的血细胞分离剂及使用其的血细胞分离方法。

解决课题的手段

本发明人用在无机载体上附着有具有血细胞凝集能力的各种聚合物而成的血细胞分离剂处理血液，评价血细胞分离能力，结果遇到了血细胞分离剂中含有的聚合物从载体中脱离的现象，探究其原因，结果发现，主要原因是pH变化。该问题可能成为分离的样品被聚合物污染而影响分析系统的主要原因，因此本发明人为了改善该问题而反复进行了研究，成功地制成即使暴露于pH的变化，血细胞分离剂中含有的聚合物也不会脱离的血细胞分离剂，从而完成了本发明。

即，本发明涉及：

[1]一种血细胞分离剂，其包含：

无机载体、和

含有具有氨基的构成单元(结构单元)的聚合物；

其中，所述氨基的至少一部分是伯氨基、仲氨基或叔氨基，

所述聚合物的至少一部分负载在所述无机载体上，

负载于所述无机载体上的所述聚合物通过交联与其余所述聚合物连接。

以下，[2]～[19]都是本发明的一优选实施方式或一实施方式。

[2]根据[1]所述的血细胞分离剂，其中，所述氨基的至少一部分是仲氨基或叔氨基。

[3]根据[1]或[2]所述的血细胞分离剂，其中，所述交联是通过交联剂实现的，所述交联剂是具有合计至少2个可与所述氨基生成共价键的官能团的化合物。

[4]根据[1]～[3]任一项所述的血细胞分离剂，其中，所述聚合物为(a1)烯丙胺(共)聚合物、(a2)二烯丙胺(共)聚合物、或(a3)聚乙烯亚胺。

[5]根据[4]所述的血细胞分离剂，其中，所述聚合物是(a2)二烯丙胺(共)聚合物、或(a3)聚乙烯亚胺。

[6]根据[1]～[5]任一项所述的血细胞分离剂，其中，所述聚合物的重均分子量为3,000～200,000。

[7]根据[1]～[6]任一项所述的血细胞分离剂，其中，所述无机载体是一次粒径为0.05～500μm的无机粒子。

[8]根据[1]～[7]任一项所述的血细胞分离剂，其中，所述聚合物在所述无机载体上的负载是通过利用静电相互作用的吸附来实现的。

[9]根据[1]～[7]任一项所述的血细胞分离剂，其中，所述聚合物在所述无机载体上的负载是通过共价键实现的。

[10]根据[9]所述的血细胞分离剂，其中，所述共价键通过硅烷偶联形成。

[11]血细胞分离方法，其包括使含有血细胞的检体与[1]～[10]任一项所述的血细胞分离剂接触的工序。

[12]一种血细胞分离剂的制造方法，将包括以下工序：将含有具有氨基的构成单元的聚合物负载在无机载体上，在负载于所述无机载体之前或之后，使所述聚合物与交联剂反应，通过交联使聚合物间连接；

其中，所述氨基的至少一部分是伯氨基、仲氨基或叔氨基。

[13]根据[12]所述的方法，其中，所述氨基的至少一部分是仲氨基或叔氨基。

[14]根据[12]或[13]所述的方法，其中，所述聚合物是(a1)烯丙胺(共)聚合物、(a2)二烯丙胺(共)聚合物、或(a3)聚乙烯亚胺。

[15]根据[14]所述的方法，其中，所述聚合物是(a2)二烯丙胺(共)聚合物、或(a3)聚乙烯亚胺。

[16]根据[12]～[15]任一项所述的方法，其中，所述聚合物通过静电相互作用吸附和/或共价键合而负载在所述无机载体上。

[17]根据[16]所述的方法，其中，所述聚合物通过硅烷偶联剂共价键合到所述无机载体上。

[18]根据[16]所述的方法，其中，使所述聚合物在碱溶液中与所述无机载体接触，通过静电相互作用而吸附在所述无机载体上。

[19]根据[12]～[18]任一项所述的方法，其中，所述交联剂是具有合计至少2个可与所述氨基生成共价键的官能团的化合物。

发明效果

本发明的血细胞分离剂由于负载在无机载体上的聚合物不脱离，因此分离的样品不被聚合物污染，能够在各种分析系统中进行正确的测定。进而，即使当要导入分析系统的样品需要具有适合于分析的pH的情况下，也能够在适合于分析的pH条件下分离血细胞，能够将分离处理后得到的样品直接供于分析。

附图说明

[图1]表示实施例1～4以及比较例1和2的血细胞分离剂(载体为二氧化硅珠)的血细胞分离能力和根据pH变化的聚合物从载体的脱离的试验结果。红色部分对应红细胞，在实施例1～4中，可知红细胞被保持在储存器的上部。另外，在比较例2中，确认红细胞从储存器的上部向下方移动。另一方面，在比较例1中，红细胞到达储存器的下部，流出到储存器的外部。另外，在实施例1～4中，在pH5.0的缓冲液中未观察到用丽春红S染色的物质。另一方面，在比较例2中，在pH5.0的缓冲液中观察到用丽春红S染色的物质，可以理解为聚合物从载体脱离。

[图2]表示实施例5～13和比较例3的血细胞分离剂(载体为玻璃珠)的血细胞分离能力的试验结果。红色部分对应红细胞，在实施例6、7、9、11～13中，可知红细胞被保持在储存器的上部。另一方面，在比较例3中，红细胞到达储存器的下部，流出到储存器的外部。另外，在实施例5、8和10中，确认红细胞从储存器的上部向下方移动了一些。

[图3]表示实施例14和15的血细胞分离剂(载体为二氧化硅珠)的血细胞分离能力和根据pH变化的聚合物从载体的脱离的试验结果。红色部分对应红细胞，在实施例14和15中，可知红细胞被保持在储存器的上部。另外，在实施例14和15中，在pH5.0的缓冲液中未观察到用丽春红S染色的物质。可以理解为聚合物没有从载体脱离。

具体实施方式

本发明的血细胞分离剂是包含无机载体和聚合物的血细胞分离剂，所述聚合物含有具有氨基的构成单元，

其中，所述氨基的至少一部分是伯氨基、仲氨基或叔氨基，

所述聚合物的至少一部分负载在所述无机载体上，负载在所述无机载体上的所述聚合物通过交联与其余所述聚合物连接。

即，本发明的血细胞分离剂包含聚合物(以下也称为“特定聚合物”)，所述聚合物包含具有氨基的构成单元，所述氨基的至少一部分是伯氨基、仲氨基或叔氨基。

在本发明的血细胞分离剂中，通过具有特定聚合物，本发明的血细胞分离剂能够实现血细胞的分离性能优异等优异的技术效果。另外，通过使特定聚合物稳定地负载在无机载体上，能够以高效且良好的操作性捕捉、分离血细胞等。

本发明的血细胞分离剂可以仅具有一种特定聚合物，也可以具有2种以上的组合。

特定聚合物

特定聚合物仅要求是具有至少1种构成单元(以下也称为“特定构成单元”)的(共)聚合物，所述构成单元在分子中具有氨基，所述氨基的至少一部分是伯氨基、仲氨基或叔氨基，不受除此以外的特别限制。

在此，“(共)聚合物”是包含均聚物和共聚物两者的概念，因此，特定聚合物既可以是仅由特定构成单元构成的均聚物，也可以是具有除此以外的构成单元的共聚物。

特定聚合物只要在其分子中仅具有1个特定构成单元即可，但从血细胞的分离速度等的观点考虑，优选具有多个特定构成单元。更具体而言，特定构成单元在特定聚合物的全部构成单元中所占的比例优选为1摩尔％以上，更优选为10～100摩尔％，特别优选为50～100摩尔％。

特定聚合物在其分子中既可以仅具有一种特定构成单元，也可以具有2种以上的特定构成单元。在具有2种以上的特定构成单元的情况下，上述特定构成单元在特定聚合物的全部构成单元中所占的比例基于该2种以上的特定构成单元的摩尔数的合计来计算。

特定构成单元只要具有氨基且氨基的至少一部分为伯氨基、仲氨基或叔氨基即可，不受除此以外的特别限制。通过使特定构成单元中的氨基的至少一部分为伯氨基、仲氨基或叔氨基，能够比较容易地使特定聚合物彼此交联，因此能够更稳定地负载在无机载体上。此外，从实现良好的血细胞分离性能的观点考虑，特定构成单元中的氨基的至少一部分优选为仲氨基或叔氨基。

上述特定构成单元中的氨基既可以是游离的氨基，也可以是具有加成盐等的阳离子性的氨基。

作为特定聚合物，从容易获得、结构的可控性、在水中的溶解性等的观点考虑，可以优选使用(a1)烯丙胺(共)聚合物、(a2)二烯丙胺(共)聚合物和(a3)聚乙烯亚胺。

可以仅使用(a1)烯丙胺(共)聚合物、(a2)二烯丙胺(共)聚合物和(a3)聚乙烯亚胺中的1种，也可以并用2种以上。

此外，从实现良好的血细胞分离性能的观点考虑，作为特定聚合物，特别优选使用(a2)二烯丙胺(共)聚合物和/或(a3)聚乙烯亚胺。

(a1)烯丙胺(共)聚合物

作为本发明的特定聚合物优选使用的(a1)烯丙胺(共)聚合物具有由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元。由于单烯丙胺系单体具有氨基，在(a1)烯丙胺(共)聚合物中，由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元相当于上述的特定构成单元。

由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元中的氨基可以是伯氨基、仲氨基和叔氨基中的任一种，从实现良好的血细胞分离性能等的观点考虑，优选为仲氨基或叔氨基。

更具体地，由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元优选具有下述式(I)表示的结构或其加成盐的结构。

式(I)中，R¹和R²各自独立地表示氢原子或1价有机基团，更优选R¹和R²各自独立地为氢原子、碳数1～12的烷基、或碳数5～6的环烷基。

作为R¹和R²优选的碳数1～12的烷基可以是直链状、支链状的任一种，还可以是芳烷基。作为其例子，可举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、癸基、十二烷基、苄基等。另外，作为R¹和R²优选的碳数5～6的环烷基，可举出：环戊基和环己基，但并不限定于此。

[化1]

由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元为加成盐时的结构由下述式(I’)表示。

[化2]

在式(I’)中，HX表示无机酸或有机酸，H是氢原子，X只要是可与氢一起形成无机酸或有机酸的基团，就没有特别限定。

加成盐的种类没有特别限制，但从获得性和反应控制的容易性等的观点考虑，例如可以使用：盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、亚硫酸盐、亚磷酸盐、亚硝酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐、酰胺硫酸盐、甲磺酸盐、三氟乙酸盐、对甲苯磺酸盐等。

其中，优选盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐和酰胺硫酸盐，特别优选由单烯丙胺衍生的结构的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐和酰胺硫酸盐。

(a1)烯丙胺(共)聚合物可以全部由由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元构成(即，可以是单烯丙胺系单体的均聚物)，或者也可以具有除了由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元以外的构成单元(即，也可以是单烯丙胺系单体与除此以外的单体的共聚物)。

构成单元(A1)在(a1)烯丙胺(共)聚合物的全部构成单元中所占的比例优选为5～100摩尔％，特别优选为10～100摩尔％。

通过使由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元的比例为5摩尔％以上，可以实现高的血细胞分离性能等有利的特性。

构成单元(A1)的比例可以通过调整制造(a1)烯丙胺(共)聚合物时的单烯丙胺系单体的使用比例和除此之外的聚合条件来适当调整。

(a1)烯丙胺(共)聚合物中的由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元以外的构成单元没有特别限制，通过适当使用可与单烯丙胺系单体共聚的单体进行共聚，可以衍生出这样的构成单元。

作为可共聚单体的优选例，可举出：二烯丙胺、二烯丙基甲胺等二烯丙胺类或其加成盐；二羧酸等阴离子性单体、丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、丙烯酰基吗啉、N-[3-(二甲氨基)丙基](甲基)丙烯酰胺、(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵、(3-甲基丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵等丙烯酰胺类；烯丙基醇类；乙二醇单烯丙基醚等烯丙基醚类；(甲基)烯丙基磺酸(钠)等烯丙基磺酸类或其加成盐；乙烯基磺酸(钠)等乙烯基磺酸类或其加成盐；异戊二烯磺酸钠等，但不限定于此。

其中，可优选使用二烯丙胺类、二羧酸等阴离子性单体、丙烯酰胺等。从实现良好的血细胞分离性能等的观点考虑，特别优选使具有仲氨基的二烯丙胺类共聚。

能够与单烯丙胺系单体共聚的其他单体可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

关于二烯丙胺类(二烯丙基胺类)的详细情况，将在后面叙述(a2)二烯丙胺(共)聚合物。

阴离子性构成单元

通过与二羧酸等阴离子性单体共聚，可以向(a1)烯丙胺(共)聚合物中引入阴离子性构成单元。通过具有阴离子性构成单元，(a1)烯丙胺(共)聚合物成为所谓的两性高分子，能够实现与血细胞等的混合性、亲水性等有利的效果。

本发明实施方式的阴离子性构成单元只要是能够通过解离而具有负电荷的构成单元，就没有除此以外的限制，但优选具有由二元羧酸衍生的结构，特别优选具有由下述结构式(1)、(2)或(3)表示的结构。

[化3]

[化4]

[化5]

其中，在上述式(1)中，R³为氢或甲基，在(1)、(2)和(3)中，相对于键合的羧基，Y各自独立地为氢、Na、K、NH₄、1/2Ca、1/2Mg、1/2Fe、1/3Al或1/3Fe。

只要阴离子性构成单元具有羧基等阴离子性基团，就还可以具有不相当于上述结构式(1)、(2)和(3)中的任一种的结构。

当特定聚合物具有阴离子性构成单元时，可以单独使用仅一种阴离子性构成单元，也可以组合使用多种结构互不相同的阴离子性构成单元。

当使用多种互不相同的阴离子性构成单元时，各个阴离子性构成单元既可以具有由同一通式(1)、(2)或(3)表示的范围内的互不相同的结构，也可以具有由不同的通式表示的互不相同的结构。在前者的情况下，例如可以使用由通式(1)表示但因Y的元素互不相同而结构互不相同的多种阴离子性构成单元。在后者的情况下，例如可以使用具有由结构式(1)表示的结构的一种阴离子性构成单元和具有由结构式(2)表示的结构的另一种阴离子性构成单元。

阴离子性构成单元的至少一部分优选衍生自马来酸，此时，该阴离子性构成单元具有由上述式(2)表示的结构，Y均为氢。

特定聚合物具有阴离子性构成单元时的阴离子性构成单元的含量没有特别限制，但在阴离子性构成单元由不饱和二羧酸衍生的情况下，其与由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元的摩尔比优选为：由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元/阴离子性构成单元＝1/0.1～1/0.5，特别优选为1/0.2～1/0.5。

阴离子性构成单元的至少一部分也可以衍生自不饱和一元羧酸。当阴离子性构成单元由不饱和单羧酸衍生时，由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元/阴离子性构成单元的比率优选为1/1～100/1，特别优选为1/1～10/1。

进而，由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元和阴离子性构成单元的合计占全部构成单元的比例(在不存在阴离子性构成单元的情况下，由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元占全部构成单元的比例)优选为80摩尔％以上，特别优选为90摩尔％以上。通过使由(A1)单烯丙胺系单体衍生的构成单元和阴离子性构成单元的合计占全部构成单元的比例为80摩尔％以上，可以实现提高血细胞分离能力等优选的性质。

(a1)烯丙胺(共)聚合物的分子量没有特别限制，只要根据血细胞分离剂的使用形态以及与其他成分等的关系来购得或通过聚合得到具有适当分子量的(共)聚合物即可。

从易于负载在无机载体上、以及以实用上允许的时间和成本进行聚合的观点考虑，重均分子量(Mw)优选为500～10,000,000。重均分子量(Mw)更优选为1,000～1,000,000。重均分子量(Mw)特别优选为2,000～500,000。

从实现良好的血细胞分离性能等的观点考虑，重均分子量(Mw)优选为上述范围内的高分子量，例如重均分子量(Mw)优选为8,000以上。

(a1)烯丙胺(共)聚合物的重均分子量(Mw)例如可以使用液相色谱，通过凝胶渗透色谱(GPC法)测定。更具体地，例如可以通过本申请实施例中记载的方法测定。

(a1)烯丙胺(共)聚合物的分子量可以通过调整共聚单体的有无、种类及组成、聚合工序的温度、时间及压力、聚合工序中使用的自由基引发剂的种类及量等来适当调整。

对(a1)烯丙胺(共)聚合物的旋转粘度[η]也没有特别限制，可以考虑对无机载体的负载的容易度和制造成本等而适当设定，但优选为10～700mPa·s(25℃)，特别优选为10～60mPa·s(25℃)。

旋转粘度[η]可以通过本领域中常用的方法测定，例如可以通过AMETEKBrookfield公司制的数字B型粘度计DV-3T来测定。在测定时，可以使用超低粘度适配器(ULA)，典型地在液量16mL、液温25℃下测定。

旋转粘度[η]可以通过调整聚合时的稀释浓度、共聚单体的有无、种类及组成、聚合工序的温度、时间及压力、聚合工序中使用的自由基引发剂的种类及量等来适当调整。

(a2)二烯丙胺(共)聚合物

作为本发明的特定聚合物所优选使用的(a2)二烯丙胺(共)聚合物是具有由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元的(共)聚合物。由于二烯丙胺系单体具有氨基，所以在(a2)二烯丙胺(共)聚合物中，由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元相当于上述的特定构成单元。

在此，“(共)聚合物”是包含均聚物和共聚物两者的概念，因此，(a2)二烯丙胺(共)聚合物既可以是仅由由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元构成的均聚物，也可以是具有由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元和除此以外的构成单元的共聚物。

(a2)二烯丙胺(共)聚合物具有由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元。

更具体地，由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元优选具有下述结构式(I Ia)或(I Ib)表示的结构、或者其无机酸盐或有机酸盐的结构、或下述结构式(I I Ia)或(I IIb)表示的结构。

[化6]

[化7]

[化8]

[化9]

在上述式(I Ia)和(I Ib)中，R⁴表示氢原子或1价有机基团，优选氢原子、碳数1～10的烷基、碳数5～10的环烷基、或碳数7～10的芳烷基。在上述式(I I Ia)和(I I Ib)中，R⁵和R⁶各自独立地表示氢原子或1价有机基团(其中，R⁵和R⁶的至少一方为氢原子)，优选氢原子、碳数1～10的烷基、碳数5～10的环烷基、或碳数7～10的芳烷基，X^-为反离子。

在上述式(I Ia)和(I Ib)中，R⁴更优选为氢原子、甲基、乙基或苄基，特别优选为氢原子或甲基。

在上述式(I I Ia)和(I I Ib)中，只要R⁵和R⁶的至少一方为氢原子，R⁵和R⁶优选各自独立地为氢原子、甲基、乙基或苄基，特别优选为氢原子或甲基。

就(a2)二烯丙胺(共)聚合物而言，作为由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元，可以具有上述的结构式(I Ia)或(I Ib)表示的结构的构成单元，即游离结构的构成单元，也可以具有如下结构的构成单元：上述的结构式(I Ia)或(I Ib)表示的结构的无机酸盐或有机酸盐的结构，即具有加成盐的结构，或上述的结构式(I I Ia)或(I I Ib)表示的结构，即具有反离子的结构。

在制造(a2)二烯丙胺(共)聚合物时，从制造成本等的观点考虑，优选使用具有加成盐或反离子的二烯丙胺系单体。从聚合物中除去HCl等加成盐和反离子的工艺复杂，也成为成本增大的原因，因此，从成本等的观点来看，使用不需要这样的工艺就可以制造的加成盐型或反离子型的(a2)二烯丙胺(共)聚合物是优选的实施方式。

从获得的容易性和反应的控制性等的观点考虑，上述结构式(IIa)或(IIb)表示的结构的无机酸盐或有机酸盐优选为盐酸盐、羧酸盐、磺酸盐或烷基硫酸盐，特别优选为盐酸盐。

(a2)二烯丙胺(共)聚合物具有上述结构式(II Ia)或(I IIb)表示的结构作为由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元时的反离子X^-没有特别限定，但从获得的容易性和反应的控制性等的观点考虑，优选氯离子、羧酸根离子、磺酸根离子或烷基硫酸根离子，特别优选氯离子或乙基硫酸根离子。

在(a2)二烯丙胺(共)聚合物中，可以单独使用仅由一种(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元，也可以组合使用由多种相互不同的结构的(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元。

当使用由多种互不相同的(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元时，各个二烯丙胺系构成单元既可以具有由同一通式(IIa)、(IIb)、(I IIa)或(I IIb)表示的范围内的互不相同的结构，也可以具有由不同的通式表示的互不相同的结构。在前者的情况下，例如可以使用由通式(IIa)表示但因R⁴的结构互不相同而结构互不相同的多种(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元。在后者的情况下，例如可以使用具有由结构式(IIa)表示的结构的一种构成单元(A2)和具有由结构式(II Ia)表示的结构的另一种构成单元(A2)。

(a2)二烯丙胺(共)聚合物中的由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元的含量没有特别限制，优选占(a2)二烯丙胺(共)聚合物的全部构成单元的1摩尔％以上，更优选占5～100摩尔％。

由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元的比例可以通过调整制造(a2)二烯丙胺(共)聚合物时的二烯丙胺系单体的使用比例、以及除此以外的聚合条件来适当调整。

(a2)二烯丙胺(共)聚合物中的由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元以外的构成单元没有特别限制，通过适当使用可与二烯丙胺系单体共聚的单体进行共聚，可以衍生出这样的构成单元。

作为可共聚单体的优选例，可举出：单烯丙胺类或其加成盐；二羧酸等阴离子性单体、二氧化硫、丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、丙烯酰基吗啉、N-[3-(二甲氨基)丙基](甲基)丙烯酰胺、(3-丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵、(3-甲基丙烯酰胺丙基)三甲基氯化铵等丙烯酰胺类；烯丙基醇类；乙二醇单烯丙基醚等烯丙基醚类；(甲基)烯丙基磺酸(钠)等烯丙基磺酸类或其加成盐；乙烯基磺酸(钠)等乙烯基磺酸类或其加成盐；异戊二烯磺酸钠等，但不限定于此。

其中，可优选使用单烯丙胺类、二羧酸等阴离子性单体、二氧化硫、丙烯酰胺等。

二烯丙胺系单体以外的单体可以仅使用1种，也可以组合使用2种以上。

由单烯丙胺类、二羧酸等阴离子性单体等衍生的构成单元的优选实施方式等的详情与上述对(a1)烯丙胺(共)聚合物所说明的相同。

二氧化硫构成单位

在本实施方式中，通过具有二氧化硫构成单元，能够向特定聚合物赋予聚合性、血细胞分离能力的提高等有利的特性。

本实施方式的共聚物中的二氧化硫构成单元由具有下述结构式(4)表示的结构的二氧化硫衍生。

[化10]

二氧化硫构成单元在本实施方式的共聚物的全部构成单元中所占的比例优选为1摩尔％以上。特别是，通过使由二氧化硫衍生的构成单元的比例为1摩尔％以上，能够向本实施方式的共聚物更有效地赋予聚合性、疏水性的提高、与阴离子成分(例如血细胞)的分离性能的提高等有利的特性。

二氧化硫构成单元的比例更优选为1～50摩尔％，特别优选为10～50摩尔％。

本实施方式的由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元与二氧化硫构成单元的比例没有特别限制，只要能够共聚，就可以设为任意的比例。从共聚物的高分子量化的观点考虑，优选两构成单元的比例大不相同，例如由(A2)二烯丙胺系单体衍生的构成单元与由二氧化硫衍生的构成单元的比优选为99∶1～50∶50，特别优选为90∶10～50∶50。

(a2)二烯丙胺(共)聚合物的分子量没有特别限制，只要根据血细胞分离剂的使用形态以及与其他成分等的关系来购得或通过聚合得到具有适当分子量的(共)聚合物即可。

从实现良好的血细胞分离性能等的观点考虑，重均分子量(Mw)优选为上述范围内的高分子量，例如重均分子量(Mw)优选为15,000以上。

(a2)二烯丙胺(共)聚合物的重均分子量(Mw)例如可以使用液相色谱，通过凝胶渗透色谱(GPC法)来测定。更具体地，例如可以通过本申请实施例中记载的方法测定。

(a2)二烯丙胺(共)聚合物的分子量可以通过调整共聚单体的有无、种类及组成、聚合工序的温度、时间及压力、聚合工序中使用的自由基引发剂的种类及量等来适当调整。

对(a2)二烯丙胺(共)聚合物的旋转粘度[η]也没有特别限制，可以根据对无机载体的负载的容易度和与制造成本等的关系而适当设定，优选为10～1,500mPa·s(25℃)，特别优选为10～500mPa·s(25℃)。

旋转粘度[η]可以通过本领域中常用的方法测定，例如可以通过AMETEKBrookfield公司制的数字B型粘度计DV-3T来测定。在测定时，可以使用超低粘度适配器(ULA)，通常在液量16mL、液温25℃下测定。

旋转粘度[η]可以通过调整共聚单体的有无、种类及组成、聚合工序的温度、时间及压力、聚合工序中使用的自由基引发剂的种类及量等来适当调整。

(a3)聚乙烯亚胺

作为本发明的特定聚合物所优选使用的(a3)聚乙烯亚胺是具有由乙烯亚胺衍生的构成单元的聚合物，更具体而言，具有由下式(IVa)表示的结构的构成单元。

[化11]

(a3)聚乙烯亚胺由于通过具有由上式(IVa)表示的结构的构成单元而具有氨基，因此相当于本发明中使用的含有具有氨基的构成单元的聚合物(特定聚合物)。另外，由于上述氨基是仲氨基，因此也相当于作为特定聚合物优选的含有具有仲氨基或叔氨基的构成单元的(共)聚合物。

(a3)聚乙烯亚胺既可以仅由由上述式(IVa)表示的结构的构成单元构成，也可以具有除此以外的结构的构成单元。

在仅由由上述式(IVa)表示的结构的构成单元构成的情况下，(a3)聚乙烯亚胺具有直链状结构。

(a3)聚乙烯亚胺可以通过具有叔氨基而具有支链状结构，例如可以具有下式(IVb)表示的结构。在下式(IVb)的结构中，由于在直链状的部分存在仲氨基、且在末端存在伯氨基，因此相当于本发明中使用的含有具有氨基(氨基的至少一部分为伯氨基、仲氨基或叔氨基)的构成单元的聚合物(特定聚合物)，也相当于作为特定聚合物特别优选的含有具有仲氨基或叔氨基的构成单元的(共)聚合物。

在式(IVa)和(IVb)中，氨基均以游离状态表示，这些氨基的一部分或全部也可以是加成盐。加成盐的种类没有特别限制，例如可以适当使用上述关于(a1)烯丙胺(共)聚合物和(a2)二烯丙胺(共)聚合物所说明的各种有机酸盐、无机酸盐。

[化12]

(a3)聚乙烯亚胺的分子量没有特别限定，优选其重均分子量在100～2,000,000的范围内，更优选在500～2,000,000的范围内，特别优选在1000～2,000,000的范围内。

(a3)聚乙烯亚胺例如可以通过在酸催化剂的存在下使乙烯亚胺开环聚合来合成。

或者可以使用：市售的聚乙烯亚胺，例如，BASF公司市售的Lupasol(商品名：Lupasol SK(平均分子量约2,000,000)、Lupasol G20(平均分子量约1,300)、Lupasol G20WF(平均分子量约1,300)、Lupasol P(平均分子量约750,000)、Lupasol PS(平均分子量约750,000)、Lupasol PR 8515(2,000)、Lupasol PN 40、Lupasol WF(平均分子量约25,000)、Lupasol SC-61B(平均分子量约110,000)、及Lupasol FG)，株式会社日本触媒市售的Epomin(型号：SP-003(平均分子量约300)、SP-006(平均分子量约600)、SP-012(平均分子量约1,200)、SP-018(平均分子量约1,800)、SP-200(平均分子量约10,000)、及P-1000(平均分子量约70,000)，和光纯药株式会社市售的BPEI(销售商代码161-17831(平均分子量约600)、销售商代码167-17811(平均分子量约1,800)、和销售商代码164-17821(平均分子量约10,000))等。

特定聚合物的制造方法

特定聚合物的制造方法没有特别限制，可以通过以往该技术领域中公知的方法制造，例如可以通过将单烯丙胺或二烯丙胺系单体或者其无机酸盐或有机酸盐均聚，或者根据需要与其他单体共聚来制造。

将单烯丙胺或二烯丙胺或者其无机酸盐或有机酸盐均聚、或者与其他单体共聚时的溶剂没有特别限定，可以是水系的溶剂，也可以是醇、醚、亚砜、酰胺等有机系的溶剂，优选为水系的溶剂。

单烯丙胺或二烯丙胺或者其无机酸盐或有机酸盐均聚或者与其他单体共聚时的单体浓度根据单体的种类或进行(共)聚合的溶剂的种类的不同而不同，但水系溶剂的情况下的单体浓度通常为10～75重量％。该(共)聚合反应通常为自由基聚合反应，在自由基聚合催化剂的存在下进行。自由基聚合催化剂的种类没有特别限定，作为其优选的例子，可举出：叔丁基过氧化氢等过氧化物、过硫酸铵、过硫酸钠、过硫酸钾等过硫酸盐，偶氮二系、重氮系等水溶性偶氮化合物。

自由基聚合催化剂的添加量通常相对于全部单体为0.1～20摩尔％，优选为1.0～10摩尔％。聚合温度一般为0～100℃，优选为5～80℃，聚合时间一般为1～150小时，优选为5～100小时。关于聚合气氛，即使在大气中聚合性也不会出现大的问题，聚合也可以在氮气等非活性气体气氛中进行。

无机载体

本发明的血细胞分离剂是包含无机载体和含有具有氨基的构成单元的聚合物(特定聚合物)的血细胞分离剂，其中，所述聚合物的至少一部分优选以通过静电相互作用来吸附和/或通过共价键来键合的方式负载在所述无机载体上。

从可操作性、血细胞分离剂的再利用、以及抑制血细胞分离剂对从血细胞分离的样品的污染等的观点考虑，优选将特定聚合物负载在无机载体上。

无机载体的形状没有特别限制，例如可以使用容器、管的内壁、无机粒子、磁珠、玻璃棉、玻璃滤纸等作为无机载体。另外，作为无机载体的材质，从本身具有血细胞分离能力并且容易负载特定(共)聚合物的方面考虑，可举出：玻璃、二氧化硅、高岭土、沸石、膨润土等。

当利用粒状无机载体时，无机载体的粒径没有特别限制，但一次粒径优选为0.05～500μm，特别优选为0.1～50μm。

在本发明中，在无机载体上负载特定聚合物的方法没有特别限制，但优选以通过静电相互作用来吸附和/或通过共价键来键合的方式负载在所述无机载体上，由此可以实现稳定的负载。

通过静电相互作用将特定聚合物吸附在无机载体上的方法没有特别限制，但优选进行以下操作：调整分散或溶解有特定聚合物的分散体或溶液的pH，调整固体成分浓度、特别是聚合物浓度等。

例如，当无机载体为二氧化硅时，特定聚合物的pH优选为5～11,特别优选为pH7～10。

另外，特定聚合物的聚合物浓度优选为1.0～20重量％，特别优选为2.5～10重量％。

通过共价键将特定聚合物与无机载体结合的方法也没有特别限制，可以通过使特定聚合物中的氨基等官能团与无机载体表面存在的反应性基团之间反应或者通过使用与两者具有反应性的化合物来实现共价键。

例如，当无机载体为二氧化硅时，优选使用硅烷偶联剂。硅烷偶联剂的种类也没有特别限制，可优选使用环氧硅烷、甲基丙烯酸硅烷、丙烯酸硅烷、氯硅烷等。其中，特别优选使用环氧硅烷。

另外，在通过这些方法进行负载时，使特定聚合物彼此交联。在通过静电相互作用将特定聚合物吸附在无机载体上时，存在特定聚合物因pH的变化而容易脱离的倾向，但通过使特定聚合物彼此交联，即使特定聚合物的一部分会因pH的变化而脱离，也能够维持被交联的特定聚合物整体的吸附，在通过静电相互作用将特定聚合物吸附在无机载体上时，使特定聚合物彼此交联的技术价值特别高。

在特定聚合物彼此的交联中，可以适当使用以往在该技术领域中使用的交联剂，可以适当使用过氧化物系交联剂、环氧系交联剂、卤代烷基系交联剂等。其中，优选通过交联剂进行交联，该交联剂是具有合计至少2个可与特定聚合物中的氨基生成共价键的官能团的化合物。作为这样的官能团，例如可举出：卤素基团、醛基、环氧基、羧基、酸酐基、酰卤基、N-氯甲酰基、氯甲酸酯基、酰亚胺醚基、脒基、异氰酸酯基、乙烯基等。

作为具体的交联剂，可举出：乙二醇二丙烯酸酯、丙二醇二丙烯酸酯、丁二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙二醇二甲基丙烯酸酯、丁二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、亚甲基双丙烯酰胺、亚甲基双甲基丙烯酰胺、乙烯双丙烯酰胺、表氯醇、甲苯二异氰酸酯、亚乙基双甲基丙烯酰胺、亚乙基双丙烯酰胺、二乙烯基苯、双酚A二甲基丙烯酸酯、双酚A二丙烯酸酯、1,4-丁烷二醇二缩水甘油醚、1,2-乙烷二醇二缩水甘油醚(乙二醇二缩水甘油醚(EGDGE))、1,3-二氯丙烷、1,2-二氯乙烷、1,3-二溴丙烷、1,2-二溴乙烷、琥珀酰二氯、琥珀酸二甲酯、丙烯酰氯、均苯四甲酸二酐等。其中，可特别优选使用表氯醇、1,3-二氯丙烷、乙二醇二缩水甘油醚(EGDGE)。

关于特定聚合物彼此交联时的交联剂浓度，交联剂/特定聚合物的摩尔比优选为0.05～20，特别优选为0.4～15。

通过使交联剂的量在上述任一基准的优选范围内，由此提高血细胞分离性能，维持特定聚合物整体的吸附。

血细胞分离方法

当上述的血细胞分离剂与含有血细胞的检体接触时，血细胞分离，可以分离为血细胞和液相。因此，本发明的血细胞分离方法除了将血细胞分离剂与血细胞接触以外没有特别限制，可以通过各种方式分离血细胞。

例如，对于将特定聚合物负载在粒状无机载体上而成的血细胞分离剂来说，可以向采集容器中的含有血细胞的样品中添加混合血细胞分离剂，或者向容器中的血细胞分离剂中添加混合采集的含有血细胞的检体，捕捉血细胞，分离成血细胞和液相。该方法具有在临床实践中使用容易、通用性高的优点。

对于本发明的血细胞分离剂而言，由于特定聚合物被负载在无机载体上，所以从血细胞分离出的液相不会被血细胞分离剂污染。另外，即使在使血细胞分离剂暴露于酸性溶液或碱性溶液的条件下得到样品，在对于本发明的血细胞分离剂而言，特定聚合物也不会从无机载体中脱离，样品不会被特定聚合物污染。因此，能够得到具有适合于HPLC的流动相的pH等分析系统的pH条件的pH的样品，即使是分析需要样品具有规定pH的情况下，也能够将样品直接供于分析。

在使用在样品采集管的内壁表面负载特定聚合物而成的血细胞分离剂的情况下，只要在采集管中装入样品，根据需要进行倒置混合，就能够分离血细胞。因此，具有实用性高、且能够反复使用负载有特定聚合物的样品采集管的优点。在从血细胞分离出的液相不被血细胞分离剂污染、特别是在暴露于酸性溶液或碱性溶液的条件下通过血细胞分离而得到样品时，从特定聚合物不从无机载体脱离、能够得到具有适合于分析系统的pH条件的pH的样品的观点考虑，可以以与获得在颗粒或纤维状的无机载体上负载特定聚合物而成的血细胞分离剂同样的方式获得。

对于在粒状无机载体上负载特定聚合物而成的血细胞分离剂而言，可以将其根据需要与由过滤材料构成的支持体一起填充到柱等容器或分析装置的样品流路中，以构成血细胞分离部件或血细胞分离部。另外，也可以将在粒状无机载体上负载特定聚合物而成的血细胞分离剂与含有血细胞的样品混合，将其混合物导入到填充有过滤材料的柱等容器中，以分离成血细胞和液相。在这些实施方式中，从血细胞分离部件或血细胞分离部流出的样品可直接供于各种分析，即使在要求得到具有适合于HPLC的流动相的pH等分析系统的pH条件的pH的样品的情况下也可以应对。因此，可以在血细胞分离之后连续进行各种分析。作为构成支持体的过滤材料，可举出：片状或粒状的滤纸、片状或粒状的色谱纸、粒状的硅胶、粒状或纤维状的氧化铝、粒状的硅藻土、粒状或纤维状的玻璃及其组合。

类似地，也可以将在片状或纤维状的无机载体上负载特定聚合物而成的血细胞分离剂填充到柱等容器或分析装置的样品流路中，以构成血细胞分离部件或血细胞分离部。

本发明的血细胞分离剂和方法只要是含有血细胞的样品即可适用，例如可以应用于血液、尿、淋巴液、脑液、体腔液、细胞浸出液、消化液、粪便等。应用的典型的样品是血液，其中包括全血检体(检品)、含肝素等抗凝剂的血液检体，其中全血检体是最典型的样品。

实施例

以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于此。

(重均分子量的测定方法)

予以说明，下述各阳离子性聚合物的重均分子量分别通过以下的方法测定。

含有阴离子性构成单元(b)的阳离子性聚合物(实施例11)的重均分子量(Mw)使用日立L-2000型高效液相色谱，通过凝胶渗透色谱法(GPC法)测定。

洗脱液流路泵采用日立L-2130型泵，检测器采用日立L-2490型RI检测器，色谱柱采用串联连接的两根TOSOH TSKgelα-M(排除极限分子量10,000,000)。样品用洗脱液配制成0.5g/100mL的浓度，使用100μL。洗脱液使用0.15mol/L的硫酸钠、1重量％的醋酸水溶液。在柱温40℃、流速1.0mL/分钟的条件下实施。作为标准物质，使用分子量为5,900、47,300、212,000、788,000的支链淀粉求出校准曲线，基于该校准曲线求出阳离子性聚合物的重均分子量(Mw)。

除此以外的阳离子性聚合物的重均分子量(Mw)使用株式会社日立高科技公司制的Chromas ter(注册商标)5450高速液相色谱，通过凝胶渗透色谱法(GPC法)测定。

检测器采用RI差示折射率检测器，色谱柱采用串联连接的Shodex Asahipak公司制的水系凝胶过滤型柱GS-220HQ(排除极限分子量3,000)和GS-620HQ(排除极限分子量200万)。样品用洗脱液配制成0.5g/100mL的浓度，使用20μL。洗脱液使用0.4mol/L的氯化钠水溶液。在柱温30℃、流速1.0mL/分钟的条件下实施。作为标准物质，使用分子量106、194、440、600、1470、4100、7100、10300、12600、23000等的聚乙二醇求出校准曲线，基于该校准曲线求出阳离子性聚合物的重均分子量(Mw)。

1、血细胞分离剂的制造

通过多点静电相互作用在二氧化硅珠上固相化的阳离子性聚合物的制造

(实施例1)

在粒径为0.3μm的二氧化硅珠(Micromod Part ikel technol igie公司制)25mg中添加500μL调整为1N的NaOH，搅拌30分钟。除去上清后，用蒸馏水反复洗涤直至成为中性。

另一方面，将二烯丙胺盐酸盐二氧化硫共聚物(制品名：PAS-92、日东纺医药株式会社制，胺级数：仲级，聚合物pH：7、重均分子量：5,000、相对于胺的单位分子量：197.68)溶解于纯水中，以10重量％(0.253mmol)的固体成分浓度制备聚合物溶液，通过4N NaOH调节至pH7.0。

接着，向聚合物溶液中添加表氯醇(东京化成工业制)至最终浓度为3体积％(0.19mmol)，将得到的溶液500μL(交联剂与1mol聚合物的摩尔比为0.756)与洗涤后的二氧化硅珠混合，在室温下搅拌1天，将阳离子性聚合物负载到二氧化硅珠上。

将固定有阳离子性聚合物的二氧化硅珠用MES-HEPES缓冲液(20mM MES，20mMHEPES，pH5.0)洗涤、然后用HEPES缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.0)洗涤。然后，在500μL的HEPES缓冲液中悬浮固定有阳离子性聚合物的二氧化硅珠，用作血细胞分离剂。

(实施例2)

向聚合物溶液中添加乙二醇二缩水甘油醚(EGDGE，东京化成工业制)至最终浓度为3体积％(0.19mmol)，将得到的溶液500μL(交联剂与1mol聚合物的摩尔比为0.381)与洗涤后的二氧化硅珠混合，除此以外，与实施例1同样操作，制造血细胞分离剂。

(实施例3)

使用粒径为0.1μm的25mg二氧化硅珠(Micromod Part ikel technol igie公司制)，除此以外，与实施例1同样操作，制造血细胞分离剂。

(实施例4)

使用粒径为0.5μm的25mg二氧化硅珠(Micromod Part ikel technol igie公司制)，除此以外，与实施例1同样操作，制造血细胞分离剂。

(比较例1)

将粒径为0.3μm二氧化硅珠(Micromod Part ikel technol igie公司制)25mg与实施例1同样地洗涤后，不固定阳离子性聚合物，悬浮于500μL的HEPES缓冲液中，用作血细胞分离剂。

(比较例2)

将不含表氯醇(东京化成工业制)的聚合物溶液500μL与洗涤后的二氧化硅珠混合，在室温下搅拌1天，在二氧化硅珠上负载阳离子性聚合物，除此以外，与实施例1同样操作，制造血细胞分离剂。

总结实施例1～4及比较例1和2的血细胞分离剂的制造概要如下所示。

[表1]

[表2]

通过多点静电相互作用而固定在玻璃珠上的各种阳离子性聚合物的制造

(实施例5)

向中心粒径为53～38μm的玻璃珠(Fuj i玻璃珠FGB-320，不二制作所制)5.0g中添加调整为1N的NaOH 5mL，搅拌30分钟。除去上清后，用蒸馏水反复洗涤直至变为中性。

另一方面，将烯丙胺聚合物(制品名：PAA-08，日东纺医药株式会社制，胺级数：伯级，聚合物pH：7，重均分子量：8000，相对于胺的单位分子量：57.09)以10重量％(0.876mmol)的浓度溶解于纯水中，制备聚合物溶液。

向聚合物溶液中添加表氯醇(东京化成工业制)至最终浓度为3体积％(0.19mmol)，将得到的溶液5mL(交联剂相对于1mol聚合物的摩尔比为0.218)与玻璃珠混合，在室温下搅拌4天，将每个阳离子性聚合物固定到玻璃珠中。将固定有阳离子性聚合物的玻璃珠用MES-HEPES缓冲液(20mM MES，20mM HEPES，pH5.0)洗涤，然后用HEPES缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.0)洗涤。然后，用5mL的HEPES缓冲液悬浮固定有阳离子性聚合物的玻璃珠，用作血细胞分离剂。

(实施例6)

将烯丙胺盐酸盐二烯丙胺盐酸盐共聚物(制品名PAA-D11-HCl，日东纺医药株式会社制，胺级数：伯级+仲级，聚合物pH：7，重均分子量：100,000，相对于胺的单位分子量：113.59)以10重量％(4.402mmol)的浓度溶解于纯水中，制备聚合物溶液，向聚合物溶液中添加表氯醇(东京化成工业制)至最终浓度为3体积％(1.91mmol)，将得到的溶液5mL(交联剂相对于1mol聚合物的摩尔比为0.435)与玻璃珠混合，除此以外，与实施例5同样操作，制造血细胞分离剂。

(实施例7)

将烯丙胺盐酸盐二烯丙胺盐酸盐共聚物(制品名PAA-D19-HCl，日东纺医药株式会社制，胺级数：伯级+仲级，聚合物pH：7，重均分子量：40,000，相对于胺的单位分子量：131.62)以10重量％(3.799mmol)的浓度溶解于纯水中，制备聚合物溶液，向聚合物溶液中添加表氯醇(东京化成工业制)至最终浓度为3体积％(1.91mmol)，将得到的溶液5mL(交联剂相对于1mol聚合物的摩尔比为0.504)与玻璃珠混合，除此以外，与实施例5同样操作，制造血细胞分离剂。

(实施例8)

将二烯丙胺聚合物(制品名PAS-21，日东纺医药株式会社制，胺级数：仲级，聚合物pH：7，重均分子量：5,000，相对于胺的单位分子量：97.16)以10重量％(5.146mmol)的浓度溶解于纯水中，制备聚合物溶液，向聚合物溶液中添加表氯醇(东京化成工业制)至最终浓度为3体积％(1.91mmol)，将得到的溶液5mL(交联剂相对于1mol聚合物的摩尔比为0.372)与玻璃珠混合，除此以外，与实施例5同样操作，制造血细胞分离剂。

(实施例9)

将二烯丙胺盐酸盐聚合物(制品名PAS-21CL，日东纺医药株式会社制，胺级数：仲级，聚合物pH：7，重均分子量：50,000，相对于胺的单位分子量：133.62)以10重量％(3.742mmol)的浓度溶解于纯水中，制备聚合物溶液，向聚合物溶液中添加表氯醇(东京化成工业制)至最终浓度为3体积％(1.91mmol)，将得到的溶液5mL(交联剂相对于1mol聚合物的摩尔比为0.511)与玻璃珠混合，除此以外，与实施例5同样操作，制造血细胞分离剂。

(实施例10)

将甲基二烯丙胺盐酸盐聚合物(制品名PAS-M-1L，日东纺医药株式会社制，胺级数：叔级，聚合物pH：9，重均分子量：5,000，相对于胺的单位分子量：147.65)以10重量％(67.728mmol)的浓度溶解于纯水中，制备聚合物溶液，向聚合物溶液中添加1,3-二氯丙烷(东京化成工业制)至最终浓度为3体积％(31.60mmol)，将得到的溶液5mL(交联剂相对于1mol聚合物的摩尔比为0.467)与玻璃珠混合，除此以外，与实施例5同样操作，制造血细胞分离剂。

(实施例11)

将二烯丙胺盐酸盐马来酸共聚物(制品名PAS-411，日东纺医药株式会社制，胺级数：仲级，聚合物pH：7，重均分子量：40,000，相对于胺的单位分子量：172.31)以10重量％(2.902mmol)的浓度溶解于纯水中，制备聚合物溶液，向聚合物溶液中添加表氯醇(东京化成工业制)至最终浓度为3体积％(1.91mmol)，将得到的溶液5mL(交联剂相对于1mol聚合物的摩尔比为0.659)与玻璃珠混合，除此以外，与实施例5同样操作，制造血细胞分离剂。

(实施例12)

将二烯丙胺盐酸盐二氧化硫共聚物(制品名PAS-92，日东纺医药株式会社制，胺级数：仲级，聚合物pH：9，重均分子量：5,000，相对于胺的单位分子量：197.68)以10重量％(2.529mmol)的浓度溶解于纯水中，制备聚合物溶液，向聚合物溶液中添加表氯醇(东京化成工业制)至最终浓度为3体积％(1.91mmol)，将得到的溶液5mL(交联剂相对于1mol聚合物的摩尔比为0.756)与玻璃珠混合，除此以外，与实施例5同样操作，制造血细胞分离剂。

(实施例13)

将二烯丙胺盐酸盐二氧化硫共聚物(制品名PAS-92，日东纺医药株式会社制，胺级数：仲级，聚合物pH：7，重均分子量：5,000，相对于胺的单位分子量：197.68)以2.5重量％(0.632mmol)的浓度溶解于纯水中，制备聚合物溶液，向该聚合物溶液中添加表氯醇(东京化成工业制)至最终浓度为12.5体积％(7.97mmol)，将得到的溶液5mL(交联剂相对于1mol聚合物的摩尔比为12.606)与玻璃珠混合，除此以外，与实施例5同样操作，制造血细胞分离剂。

(比较例3)

将中心粒径为53～38μm的玻璃珠(Fuj i玻璃珠FGB-320，不二制作所制)5.0g与实施例5同样地洗涤后，不固定阳离子性聚合物，悬浮于5mL的HEPES缓冲液中，用作血细胞分离剂。

总结实施例5～13及比较例3的血细胞分离剂的制造概要如下所示。

[表3]

[表4]

通过硅烷偶联而固定在二氧化硅珠上的阳离子性聚合物的制造

(实施例14)

向调整为1.0体积％的醋酸溶液中添加丙烯酸硅烷：KBM-5103(信越化学制)至最终浓度为0.1体积％，搅拌过夜，制造含有硅烷偶联剂的醋酸溶液。向该含有硅烷偶联剂的醋酸溶液500μL中添加粒径为1.5μm的二氧化硅珠(Micromod Part ikel technol igie公司制)25mg，在室温下搅拌1小时，结合硅烷偶联剂后，除去上清，用无水乙醇500μL洗涤，在干燥器中干燥。

另一方面，将二烯丙胺盐酸盐二氧化硫共聚物(制品名PAS-92，日东纺医药株式会社制，胺级数：仲级，聚合物pH：7，重均分子量：5,000，相对于胺的单位分子量197.68)溶解于纯水中，以10重量％(0.253mmol)的浓度制备聚合物溶液，通过4N NaOH调节至pH7.0。

接着，向聚合物溶液中添加表氯醇(东京化成工业制)至最终浓度为3体积％(0.19mmol)，向得到的溶液500μL(交联剂与1mol聚合物的摩尔比为0.756)中添加结合有硅烷偶联剂的二氧化硅珠，在室温下搅拌过夜，合成固定有阳离子性聚合物的二氧化硅珠。将合成的固定有阳离子性聚合物的二氧化硅珠用MES-HEPES缓冲液(20mM MES，20mM HEPES，pH5.0)洗涤，接着用HEPES缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.0)洗涤。然后，用500μL的HEPES缓冲液悬浮固定有阳离子性聚合物的二氧化硅珠，用作血细胞分离剂。

(实施例15)

向调整为1.0体积％的醋酸溶液中添加环氧硅烷：Z6040(东丽·道康宁公司制)至最终浓度为0.1体积％，搅拌过夜，制造含有硅烷偶联剂的醋酸溶液，除此以外，与实施例14同样操作，制造血细胞分离剂。

总结实施例14和15的血细胞分离剂的制造概要如下所示。

[表5]

固定有阳离子性聚合物的二氧化硅珠的血细胞分离

在内径5.7mm、容量1mL的InertSep(注册商标)空储存器(GL科学公司制)的下层铺上保留粒径为1μm的滤纸(桐山制作所制)，在其上填充0.1g网眼尺寸为300以上的滤纸粉末(ADVANTEC公司制)，制作血细胞分离用柱。

向实施例1～4、14和15及比较例2制造的固定有阳离子性聚合物的二氧化硅珠100μL中通过吸量管添加混合全血检体5μL，将混合物全部加入到血细胞分离用柱中。接着，将血细胞分离用柱与注射泵(东京哨子器械制)连接，以0.5mL/分钟的流速输送2mL HEPES缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.0)。作为对照，将比较例1制造的未固定阳离子性聚合物的二氧化硅珠和血液的混合物加入到柱中。血细胞分离能力通过目测，根据下述基准判定。

〇：血细胞层的厚度在离支持体顶部1/4以下的范围，血细胞全部被捕获在柱内

△：血细胞层的厚度在离支持体顶部超过1/4的范围，血细胞全部被捕获在柱内

×：血细胞从柱中漏出

固定有阳离子性聚合物的玻璃珠的血细胞分离

在内径5.7mm、容量1mL的InertSep(注册商标)空储存器(GL科学公司制)的下层铺上保留粒径为1μm的滤纸(桐山制作所制)，在其上填充实施例5～13制造的固定有阳离子性聚合物的玻璃珠500μL，制作血细胞分离用柱。将全血检体5μL加入到血细胞分离用柱后，将血细胞分离用柱与注射泵(东京哨子器械制)连接，以0.5mL/分钟的流速输送2mL HEPES缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.0)。作为对照，使用填充有比较例3制造的未固定阳离子性聚合物的玻璃珠的柱。血细胞分离能力通过目测，根据下述基准判定。

×：血细胞从柱中漏出

根据pH变化的聚合物从载体的脱离

在1.5mL管中分取实施例1～15及比较例1和2的血细胞分离剂50μL，通过离心分离操作除去上清后，用50μL的HEPES缓冲液(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.0)洗涤，回收上清。然后，用50μL的MES-HEPES缓冲液(20mM MES，20mM HEPES，pH5.0)再次洗涤，同样回收上清。

将回收的上清中的1μL点涂在硝基纤维素膜IAB075(ADVANTEC公司制)上，在50℃干燥30分钟后，用可呈红色的丽春红S染色液(Beacle公司制)将阳离子性氨基染色5分钟。然后，用1体积％的醋酸溶液脱色5分钟。

对各实施例和比较例的血细胞分离剂，试验了血细胞分离能力和根据pH变化的聚合物从载体的脱离，结果如表6～9和图1～3所示。

[表6]

[表7]

[表8]

[表9]

由上述试验结果可知，实施例1～15的血细胞分离剂均具有优异的血细胞分离能力，即使在酸性条件下也未观察到聚合物的脱离。与此相比，未进行交联处理的比较例2的血细胞分离剂存在血细胞分离能力降低的倾向(与实施例1和2相比)，在酸性条件下观察到聚合物的脱离。因此证实，通过将特定聚合物在分子间和/或分子内交联，血细胞分离能力提高，即使pH变化，聚合物也不会从无机载体脱落。

另外，由实施例8和9的血细胞分离剂的试验结果可知，着眼于重均分子量时，随着重均分子量增大，血细胞分离能力有增大的倾向。假设可与载体结合的聚合物的数量恒定，通常认为重均分子量越大的聚合物，用于捕捉血细胞的官能团的数量越多，从而血细胞分离能力越高。

Claims

1.血细胞分离剂，其包含：

无机载体、和

含有具有氨基的构成单元的聚合物；

其中，所述氨基的至少一部分是伯氨基、仲氨基或叔氨基，

所述聚合物的至少一部分负载在所述无机载体上，

2.权利要求1所述的血细胞分离剂，其中，所述氨基的至少一部分是仲氨基或叔氨基。

3.权利要求1或2所述的血细胞分离剂，其中，所述交联是通过交联剂实现的，所述交联剂是具有合计至少2个可与所述氨基生成共价键的官能团的化合物。

4.权利要求1～3任一项所述的血细胞分离剂，其中，所述聚合物是(a1)烯丙胺(共)聚合物、(a2)二烯丙胺(共)聚合物、或(a3)聚乙烯亚胺。

5.权利要求4所述的血细胞分离剂，其中，所述聚合物是(a2)二烯丙胺(共)聚合物、或(a3)聚乙烯亚胺。

6.权利要求1～5任一项所述的血细胞分离剂，其中，所述聚合物的重均分子量为3,000～200,000。

7.权利要求1～6任一项所述的血细胞分离剂，其中，所述无机载体是一次粒径为0.05～500μm的无机粒子。

8.权利要求1～7任一项所述的血细胞分离剂，其中，所述聚合物在所述无机载体上的负载是通过利用静电相互作用的吸附实现的。

9.权利要求1～7任一项所述的血细胞分离剂，其中，所述聚合物在所述无机载体上的负载是通过共价键实现的。

10.权利要求9所述的血细胞分离剂，其中，所述共价键通过硅烷偶联形成。

11.血细胞分离方法，其包括使含有血细胞的检体与权利要求1～10任一项所述的血细胞分离剂接触的工序。

12.血细胞分离剂的制造方法，将包括以下工序：将含有具有氨基的构成单元的聚合物负载在无机载体上，在负载于所述无机载体之前或之后，使所述聚合物与交联剂反应，通过交联使聚合物间连接；

其中，所述氨基的至少一部分是伯氨基、仲氨基或叔氨基。

13.权利要求12所述的方法，其中，所述氨基的至少一部分是仲氨基或叔氨基。

14.权利要求12或13所述的方法，其中，所述聚合物是(a1)烯丙胺(共)聚合物、(a2)二烯丙胺(共)聚合物、或(a3)聚乙烯亚胺。

15.权利要求14所述的方法，其中，所述聚合物是(a2)二烯丙胺(共)聚合物、或(a3)聚乙烯亚胺。

16.权利要求12～15任一项的方法，其中，将所述聚合物通过静电相互作用吸附和/或共价键合而负载在所述无机载体上。

17.权利要求16所述的方法，其中，所述聚合物通过硅烷偶联剂共价键合到所述无机载体上。

18.权利要求16所述的方法，其中，所述聚合物在碱溶液中与所述无机载体接触，通过静电相互作用而吸附在所述无机载体上。

19.权利要求12～18任一项所述的方法，其中，所述交联剂是具有合计至少2个可与所述氨基生成共价键的官能团的化合物。