WO2013187512A1 - アルカリ耐性を有するイオン交換温度応答性吸着材、及びその製造方法 - Google Patents

アルカリ耐性を有するイオン交換温度応答性吸着材、及びその製造方法 Download PDF

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敬郎 横山
一郎 小熊
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Definitions

  • the present invention relates to a temperature-responsive adsorbent having alkali resistance and capable of adsorbing and releasing an adsorption target by changing the temperature, and a method for producing the same.
  • Immunoglobulin is a physiologically active substance that controls the immune reaction.
  • the antibody is obtained from blood of the immunized animal or a cell culture solution of cells possessing antibody-producing ability or an ascites culture solution of the animal.
  • blood and culture fluids containing these antibodies include proteins other than antibodies, or complex contaminants derived from the raw material used for cell culture, and in order to separate and purify antibodies from those impurity components A complicated and time-consuming operation is usually necessary.
  • Liquid chromatography is important in antibody separation and purification.
  • Liquid chromatography techniques for separating antibodies include gel filtration chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, and the like, and antibodies are separated and purified by combining these techniques.
  • Ion exchange chromatography is a method of performing separation by reversibly adsorbing counter ions present in a mobile phase using an ion exchange group on the surface of an adsorbent as a stationary phase.
  • the shape of the adsorbent beads, membranes such as flat membranes and hollow fibers are adopted, and those obtained by binding a cation exchange group or an anion exchange group to these carriers are commercially available as adsorbents.
  • the adsorbent having a cation exchange group mainly has a property of adsorbing an antibody and allowing most of other impurities to pass through, and a property of easily concentrating and separating the antibody.
  • the adsorbent having an anion exchange group has a characteristic that it can adsorb physiologically active substances such as albumin and factor 8 and concentrate and separate them.
  • the adsorbed physiologically active substance is generally eluted by increasing the salt concentration of the mobile phase.
  • biologically active substances such as biopharmaceuticals are known to be irreversibly changed (denatured) due to changes in salt concentration (ionic strength) of the mobile phase. Careful attention must be paid to the conditions.
  • most of the physiologically active substances are separated and purified in a place controlled at a low temperature (low temperature chamber).
  • the adsorbed physiologically active substance is eluted using a mobile phase having a high salt concentration, the salt precipitated at a low temperature is used.
  • Patent Document 1 discloses a packing containing a charged copolymer that can change the effective charge density on the surface of the stationary phase according to temperature change, a production method, and a temperature-responsive chromatography method using the same.
  • Patent Document 2 discloses a temperature-responsive chromatographic support in which a polymer whose hydration power changes within a temperature range of 0 to 80 ° C. is immobilized at a high density on the support surface by an atom transfer radical polymerization method.
  • Patent Document 3 discloses a temperature response characterized by causing a growth reaction of a polymer having a charge and changing hydration power within a temperature range of 0 to 80 ° C. by an atom transfer radical method using isopropyl alcohol as a solvent.
  • a method for producing a chromatographic chromatography carrier is disclosed.
  • a high molecular weight physiologically active substance useful in the fields of biology, medicine, pharmaceutics and the like can be separated under a specific condition including an aqueous mobile phase within a temperature range of 0 to 80 ° C.
  • a method for producing a carrier for liquid chromatography coated with a charged polymer with varying hydration power is disclosed.
  • Patent Document 5 production of a temperature-responsive chromatographic carrier characterized by immobilizing an azo polymerization initiator on a polymer carrier using a bonding mode having an amide bond and then graft-polymerizing a temperature-responsive graft chain.
  • a method is disclosed.
  • Non-Patent Document 1 discloses a temperature-responsive chromatography carrier having a carboxyl group prepared by an atom transfer radical polymerization method and a method for producing the same. Among them, a monomer composition optimized for the separation of lysozyme in the monomer composition used in the atom transfer radical polymerization method is disclosed.
  • Ion exchange adsorbents used to separate biologically active substances that are components of biopharmaceuticals must eliminate elution of metal ions from the adsorbents in order to avoid contamination with metal ions. For this reason, the atom transfer radical polymerization method using a metal salt as a catalyst is not preferable as a method for producing an adsorbent for industrial use because it takes a lot of time to remove residual metal ions.
  • ion exchange adsorbents for separating physiologically active substances and the like are generally washed and sterilized with an alkaline solution, alkali resistance is required.
  • the alkali resistance is low when a bonding mode having an amide bond is used even if the carrier is a polymer base material as well as the adsorbent of the silica bead carrier.
  • temperature-responsive adsorption considering alkali resistance such as using silica beads that do not have alkali resistance as a carrier, or using a bonding mode having an amide bond with low alkali resistance. Materials, manufacturing methods, and methods of use thereof are not disclosed.
  • this invention makes it a subject to provide the temperature-responsive adsorbent which has alkali tolerance, and can be manufactured using the conventional radical polymerization initiator, its manufacturing method, and its utilization method.
  • a molecule having an epoxy group at the end is introduced into a carrier having alkali resistance, the epoxy group has any functional group of an amino group, a carboxyl group, and a hydroxyl group at the end, and in the structure Ion-exchange temperature-responsive adsorption with alkali resistance by binding an azo polymerization initiator that does not contain an amide bond and forming a temperature-responsive vinyl copolymer ligand with a charged moiety by surface graft polymerization It was found that the material can be produced.
  • a novel separation system on an industrial scale can be realized by the temperature-responsive adsorbent having alkali resistance according to the present invention, its production method, and its utilization method. If this system is used, useful physiologically active substances such as proteins such as immunoglobulins can be separated and purified on an industrial scale by changing the temperature, and the temperature-responsive adsorbent can be washed and sterilized with an alkaline solution.
  • the temperature-responsive adsorbent having alkali resistance is a charge-responsive temperature-responsive adsorbent, introducing a molecule having an epoxy group at a terminal into a carrier, An amine bond, an ester bond, or an ether bond is bonded to an azo polymerization initiator having an amino group, a carboxyl group, or a hydroxyl group at the terminal and containing no amide bond in the structure.
  • “having alkali resistance” means that when the adsorbent is immersed in a 1M sodium hydroxide aqueous solution for 24 hours, the adsorption performance is 90% or more compared to the case where the adsorbent is not in an alkaline environment. To maintain.
  • a carrier containing a polymer having a hydroxyl group in the side chain is used as the carrier.
  • a polymer having a hydroxyl group in the side chain examples include ethylene-vinyl alcohol copolymer, polyvinyl alcohol, and cellulose.
  • the carrier is preferably a porous carrier from the viewpoint of excellent adsorption performance.
  • the shape of the carrier used in the present embodiment is not particularly limited, and may be, for example, a bead shape, a flat plate shape, or a tubular shape.
  • beads having various particle diameters are available, and are not particularly limited.
  • the diameter is 1 to 300 ⁇ m, preferably 10 to 200 ⁇ m, and more preferably 20 to 150 ⁇ m. If the particle size is 1 ⁇ m or less, consolidation of beads tends to occur in the column, and thus processing at a high flow rate tends to be difficult. On the other hand, when the particle size is 300 ⁇ m or more, the gap between the beads becomes large, and leakage tends to occur when the biopolymer is adsorbed.
  • the carrier used in this embodiment has, for example, a plurality of pores.
  • the pore diameter is not particularly limited, but, for example, 5 to 1000 nm is used, preferably 10 to 700 nm, and more preferably 20 to 500 nm. If the carrier has a pore diameter of 5 nm or less, the molecular weight of the biopolymer that can be separated tends to be low. Further, if the carrier has a pore diameter of 1000 nm or more, the surface area tends to be small and the binding capacity of the biopolymer tends to be small.
  • a molecule having an epoxy group at the end is introduced into the hydroxyl group of the side chain of the carrier.
  • the molecule having an epoxy group at the end is preferably a molecule whose main chain is an alkyl group and one end is halogen in order to impart alkali resistance. Examples of such molecules include epichlorohydrin and epibromohydrin.
  • the method for introducing a molecule having an epoxy group at the terminal is not particularly limited, but as disclosed in JP-A-2002-369881, a molecule having a hydroxyl group, an alkyl group at the main chain, and a halogen at one terminal Can be introduced under alkaline conditions to introduce a molecule having an epoxy group at the end.
  • any one of an amino group, a carboxyl group, and a hydroxyl group at the terminal is added to the epoxy group of the carrier into which the molecule having an epoxy group at the terminal is introduced.
  • An azo polymerization initiator having a functional group and having no amide bond in the structure is bound.
  • the bond between the epoxy group introduced on the carrier and the azo polymerization initiator is Since it becomes any one of an amine bond, an ester bond, and an ether bond, and does not use the bonding mode having an amide bond with low alkali resistance shown in Patent Document 5, it becomes possible to impart alkali resistance. Moreover, it becomes possible to give alkali resistance by not including an amide bond in the structure of the polymerization initiator. Further, the 10-hour half-life temperature of the polymerization initiator is desirably 45 ° C.
  • the temperature is 70 ° C. or lower, more preferably 65 ° C. or lower.
  • Such a polymerization initiator is not limited to the following, but examples of the azo polymerization initiator having an amino group at the terminal include 2,2′-azobis (propane-2-carboamidine), terminal Examples of the azo polymerization initiator having a carboxyl group at the end include 4,4′-azobis (4-cyanovaleric acid), 2,2′-azobis [N- (2-carboxyethyl) -2-methylpropionamidine], terminal Examples of the azo polymerization initiator having a hydroxyl group include 2,2′azobis [2 [1 (2hydroxyethyl) 2imidazolin2yl] propane].
  • 2,2′-azobis (propane-2-carbomidine) dihydrochloric acid which is an azo polymerization initiator having an amino group at the terminal, is reacted with the above carrier under alkaline conditions.
  • 2′-azobis (propane-2-carboamidine) can be bound on the support with an amine bond.
  • 4,4′-azobis (4-cyanovaleric acid) which is an azo polymerization initiator having a carboxyl group at the terminal
  • 2,2′-azobis [N- (2-carboxyethyl) -2-methylpropionamidine By reacting n-hydrate with the above carrier under acidic conditions, 4,4′-azobis (4-cyanovaleric acid) and 2,2′-azobis [N- (2-carboxyethyl) -2 -Methylpropionamidine] can be bound on the support by an ester bond.
  • 2,2′azobis [2 [1 (2hydroxyethyl) 2imidazolin2yl] propane] dihydrochloric acid which is an azo polymerization initiator having a terminal hydroxyl group
  • 2,2′azobis [2 [1 (2hydroxyethyl) 2imidazolin-2-yl] propane] can be bound to the support by an ether bond.
  • the temperature-responsive vinyl copolymer ligand having a charged portion is immobilized on the carrier by radical polymerization starting from the polymerization initiator bonded to the carrier.
  • the structural portion derived from the azo polymerization initiator between the carrier and the temperature-responsive vinyl copolymer ligand is referred to as a residue of the azo polymerization initiator.
  • the solvent used at the time of radical polymerization is not particularly limited as long as the reactive compound can be uniformly dissolved.
  • solvents include alcohols such as ethanol, isopropanol, and t-butyl alcohol, ethers such as diethyl ether and tetrahydrofuran, ketones such as acetone and 2-butanone, water, and mixtures thereof.
  • the temperature-responsive vinyl copolymer ligand having a charged portion includes a skeleton derived from N-isopropylacrylamide and has an ion exchange group.
  • an anion exchange group or a cation exchange group can be used.
  • an anion exchange group a primary amine, a secondary amine, a tertiary amine, a quaternary ammonium salt, etc. can be used, for example.
  • the cation exchange group for example, a carboxyl group or a sulfonic acid group can be used.
  • Poly (N-isopropylacrylamide) is known to have a lower critical temperature at 32 degrees.
  • the carrier having the polymer introduced on the surface greatly changes the hydrophilic / hydrophobic surface properties at the lower critical temperature. Therefore, when poly (N-isopropylacrylamide) is used after being grafted or coated on the surface of a chromatographic filler, the holding force on the sample can be changed depending on the temperature. As a result, the retention behavior can be controlled by temperature without changing the composition of the eluate. In order to set the lower critical temperature to 32 ° C.
  • N-isopropylacrylamide which is a hydrophilic monomer other than isopropylacrylamide, such as acrylamide, methacrylic acid, acrylic acid, dimethylacrylamide, and vinylpyrrolidone, is used as a hydrophilic comonomer. It is possible to adjust by copolymerizing with. When the lower critical temperature is desired to be 32 ° C. or lower, it can be adjusted by copolymerizing a hydrophobic monomer such as styrene, alkyl methacrylate, and alkyl acrylate with N-isopropylacrylamide as a hydrophobic comonomer. Is possible.
  • the method for providing an ion exchange group is not particularly limited, but the first method includes a method of copolymerization including a monomer having an ion exchange group during radical polymerization.
  • Examples of monomer units having primary to tertiary amines or quaternary ammonium salts are allylamine, methylacrylamide, ethylacrylamide, dimethylacrylamide, dimethylaminoethylacrylamide, dimethylaminopropylacrylamide, diethylacrylamide, (3-acrylamidopropyl). ) Trimethylammonium, salts formed by (3-acrylamidopropyl) trimethylammonium, dimethylaminoethyl acrylate, and salts formed by dimethylaminoethyl acrylate.
  • Examples of the monomer unit having a carboxyl group include acrylic acid and methacrylic acid.
  • Examples of the monomer unit having a sulfonic acid group include (meth) acrylamide alkyl sulfonic acid, vinyl sulfonic acid, acrylamide t-butyl sulfonic acid, and styrene sulfonic acid, which are structural units of a polymer having sulfonic acid.
  • a second method for providing an ion exchange group after copolymerization including a monomer having a functional group capable of introducing an ion exchange group, the functional group capable of introducing an ion exchange group is converted into a primary group. Or a method of introducing a tertiary amine, a quaternary ammonium salt, a carboxyl group, or a sulfonic acid group.
  • the monomer having a functional group capable of imparting an ion exchange group include styrene and glycidyl methacrylate.
  • an ion exchange group can be introduced into the aromatic ring of styrene.
  • an epoxy group possessed by glycidyl methacrylate can be opened to introduce an ion exchange group.
  • the temperature-responsive vinyl copolymer ligand having a charged portion causes hydration and dehydration by changing the temperature within a specific temperature range, and the temperature range is, for example, 0. ° C to 80 ° C, preferably 5 ° C to 50 ° C, more preferably 10 ° C to 45 ° C. If the temperature exceeds 80 ° C., the mobile phase is water, and thus evaporation occurs and the workability tends to deteriorate. On the other hand, if it is lower than 0 ° C., the mobile phase tends to freeze.
  • the temperature-responsive adsorbent according to the present embodiment manufactured as described above can adsorb and liberate the adsorption target substance by changing the temperature within a specific temperature range.
  • the temperature is 0 ° C to 80 ° C, preferably 5 ° C to 50 ° C, more preferably 10 ° C to 45 ° C.
  • the temperature-responsive adsorbent according to this embodiment includes a carrier and a temperature-responsive vinyl copolymer ligand having a charged portion and bonded to the surface of the carrier, and the temperature-responsive vinyl copolymer.
  • the coalesced ligand has alkali resistance by being bonded to the surface of the carrier through a bonding mode including any of an amine bond, an ester bond, and an ether bond.
  • alkali resistance means maintaining 90% or more of adsorption performance, for example, even if it is immersed in 1M sodium hydroxide aqueous solution for 24 hours.
  • the temperature-responsive adsorbent according to the present embodiment has a structure represented by the following formula (1).
  • M is a carrier.
  • R 1 or R 2 is —OH, and the other is any of the groups represented by the following formulas (2) to (5).
  • L is a vinyl copolymer ligand.
  • the amine bond is a bond between a secondary amine and a tertiary amine in which the structure of the formula (1) and an azo polymerization initiator having an amino group at the end are bonded.
  • the bond of the formula (1) When either R 1 or R 2 is formula (2), it refers to the secondary amine moiety of C— (NH) —C.
  • the separation method using the temperature-responsive adsorbent of the present embodiment is not particularly limited, but as an example, the target biopolymer is once adsorbed on the obtained temperature-responsive liquid chromatography carrier, Thereafter, a method of utilizing the catch-and-release method, in which the adsorbed biopolymer is released by changing the temperature of the carrier surface by changing the temperature, can be mentioned.
  • the mass to be adsorbed may or may not exceed the amount that can be adsorbed on the carrier.
  • this is a purification method in which the adsorbed solute is released by once adsorbing and then changing the temperature and changing the characteristics of the support surface.
  • separation methods are not particularly limited, but examples include a method in which the temperature at which the characteristics of the carrier surface change is confirmed in advance and impurities are separated while changing the temperature so as to sandwich the temperature.
  • the characteristics of the support surface are greatly changed only by the temperature change, it is expected that a large difference occurs in the time (holding time) in which the signal appears depending on the solute.
  • the chromatography shown in the present embodiment may use a buffer solution as a mobile phase and does not require an organic solvent.
  • the buffer solution is an aqueous solution containing inorganic salts, and specifically includes a phosphate buffer solution, a Tris buffer solution, an acetate buffer solution, and the like. It is not limited.
  • the concentration of the inorganic salt is 1 to 100 mmol / L, preferably 3 to 50 mmol / L, and more preferably 5 to 30 mmol / L. If the concentration of the inorganic salt in the mobile phase is lower than 1 mmol / L, the activity of the physiologically active substance as a solute tends to be impaired.
  • the degree of dissociation of ion-exchange groups on the surface of the temperature-responsive adsorbent increases, and the solute is strongly adsorbed on the surface of the temperature-responsive adsorbent, making it difficult to remove the solute from the surface of the carrier in subsequent operations. There is a tendency.
  • the concentration of inorganic salts is higher than 100 mmol / L, the degree of dissociation of ion-exchange groups on the surface of the temperature-responsive adsorbent becomes low, making it difficult to retain the solute on the surface of the carrier, and finally separating the solute. Tend to be difficult.
  • thermo-responsive adsorbent in the present embodiment described above, it is possible to separate and analyze extremely useful physiologically active substances that can be used for pharmaceuticals and the like. In that case, separation can be achieved only by changing the temperature in the column by a simple operation, and since an organic solvent is not required for separation, the separated physiologically active substance can be obtained without modification.
  • Terminal epoxy group-introduced crosslinked polyvinyl alcohol beads were placed in a 300 mL glass Erlenmeyer flask.
  • 100 mL of dimethylformamide manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 96 mL of pure water 4,4′-azobis (4-cyanovaleric acid)
  • 14.02 g, 1M 4 mL of HCl manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • This reaction solution was reacted with the polymerization initiator-bonded crosslinked polyvinyl alcohol beads in a nitrogen atmosphere, and polymerization was performed at 70 ° C. for 16 hours. After the reaction, ethanol and pure water were washed in this order to wash the monomer and polymer.
  • the reaction was performed at 80 ° C. for 24 hours to convert the epoxy group in the graft chain into a sulfonic acid group.
  • the beads were washed with pure water. Thereafter, the beads were put into 0.5 mol / L sulfuric acid and reacted at 80 ° C. for 2 hours to convert the epoxy group remaining in the graft chain into a diol group. After the reaction, the beads were washed with pure water.
  • the temperature absorption of immunoglobulin was calculated by measuring the UV absorption (280 nm) of the fraction in each step and calculating the immunoglobulin concentration from the following formula.
  • Immunoglobulin concentration (mg / mL) absorbance at 280 nm / 14 ⁇ 10
  • Temperature elution amount (mg / mL) Immunoglobulin concentration of temperature elution fraction x liquid volume of temperature elution fraction / column volume
  • the temperature elution amount of the immunoglobulin was 23.6 mg / mL, indicating that the immunoglobulin can be adsorbed and eluted by the temperature change.
  • the salt elution amount was as low as 1.7 mg / mL.
  • the temperature elution amount of immunoglobulin was 23.9 mg / mL, which was 101.3% compared with that before washing with alkali. Thus, it was shown that immunoglobulin can be similarly adsorbed and eluted by temperature change. When the immunoglobulin remaining on the beads after temperature elution was eluted with a salt buffer, the salt elution amount was 1.6 mg / mL, which was as small as before alkali washing. From the above results, it was shown that the temperature-responsive adsorbent according to Example 1 has alkali resistance and can be used for industrial purification of a physiologically active substance. In the present example, having alkali resistance means maintaining adsorption performance of 90% or more even when immersed in 1M aqueous sodium hydroxide solution for 24 hours.
  • This reaction solution was reacted with the polymerization initiator-bonded crosslinked polyvinyl alcohol beads in a nitrogen atmosphere, and polymerization was performed at 70 ° C. for 16 hours. After the reaction, ethanol and pure water were washed in this order to wash the monomer and polymer.
  • the temperature elution amount of the immunoglobulin was 19.1 mg / mL, which was 101.1% compared with that before the alkali washing. Thus, it was shown that the immunoglobulin can be similarly adsorbed and eluted by the temperature change. When the immunoglobulin remaining on the beads after temperature elution was eluted with a salt buffer, the salt elution amount was 1.3 mg / mL, which was as small as before alkali washing. From the above results, it was shown that the temperature-responsive adsorbent according to Example 2 has alkali resistance and can be used for industrial purification of a physiologically active substance.
  • This reaction solution was reacted with the polymerization initiator-bonded crosslinked polyvinyl alcohol beads in a nitrogen atmosphere, and polymerization was performed at 70 ° C. for 16 hours. After the reaction, ethanol and pure water were washed in this order to wash the monomer and polymer.
  • the temperature elution amount of albumin was 20.5 mg / mL. It was shown that albumin can be adsorbed and eluted by temperature change. When albumin remaining on the beads after temperature elution was eluted with a salt buffer, the salt elution amount was as small as 1.2 mg / mL.
  • the temperature elution amount of albumin was 20.3 mg / mL, which was 99.0% compared with that before alkali washing. Thus, it was shown that albumin can be similarly adsorbed and eluted by temperature change. When albumin remaining on the beads after temperature elution was eluted with a salt buffer, the amount of salt elution was 1.5 mg / mL, which was as small as before alkali washing. From the above results, it was shown that the temperature-responsive adsorbent according to Example 3 has alkali resistance and can be used for industrial purification of a physiologically active substance.
  • the temperature elution amount of the immunoglobulin was 12.7 mg / mL, indicating that the immunoglobulin can be adsorbed and eluted by temperature change.
  • the salt elution amount was as small as 1.2 mg / mL.
  • the temperature elution amount of immunoglobulin is 2.3 mg / mL, which is 18.1% compared with that before alkali washing, indicating that the adsorption and elution of immunoglobulin is lower than that before alkali washing. It was done.
  • the salt elution amount was 0.1 mg / mL, which was smaller than that before alkali washing. From the above results, it was shown that the temperature-responsive adsorbent according to Comparative Example 1 does not have alkali resistance and is difficult to use for industrial purification of a physiologically active substance.
  • the temperature elution amount of the immunoglobulin was 23.5 mg / mL, indicating that the immunoglobulin can be adsorbed and eluted by the temperature change.
  • the salt elution amount was as small as 3.6 mg / mL.
  • the temperature elution amount of immunoglobulin is 15.6 mg / mL, which is 66.4% compared to that before alkali washing, indicating that the adsorption and elution of immunoglobulin is lower than that before alkali washing. It was done.
  • the salt elution amount was 2.3 mg / mL, which was smaller than that before alkali washing. From the above results, it was shown that the temperature-responsive adsorbent according to Comparative Example 2 does not have alkali resistance and is difficult to use for industrial purification of a physiologically active substance.
  • a novel separation system is proposed by the temperature-responsive adsorbent having alkali resistance according to the present embodiment, its production method, and its utilization method. If this system is used, useful physiologically active compounds such as globulins can be fractionated on an industrial scale by temperature change.

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Abstract

荷電を有している温度応答性吸着材であって、高分子を含む担体に、末端にエポキシ基を有する分子を導入し、エポキシ基に、末端にアミノ基、カルボキシル基、及び水酸基のいずれかの官能基を有し、且つ構造中にアミド結合を含まず、且つ１０時間半減期温度が４５℃以上、７０℃以下である、アゾ重合開始剤を結合して、アミン結合、エステル結合、及びエーテル結合のいずれかの結合構造を形成し、アゾ重合開始剤由来の重合開始点を活性化して、荷電を有する部位を有する温度応答性ビニル系共重合体リガンドを形成して製造させた、アルカリ耐性を有する温度応答性吸着材。

Description

アルカリ耐性を有するイオン交換温度応答性吸着材、及びその製造方法
　本発明は、アルカリ耐性を有し、かつ温度を変えることで吸着対象を吸着、遊離させることが可能である温度応答性吸着材、及びその製造方法に関する。
　免疫グロブリン（抗体）は、免疫反応を司る生理活性物質である。近年、医薬品、診断薬或いは対応する抗原タンパク質の分離精製材料等の用途において、その利用価値が高まっている。抗体は免疫した動物の血液あるいは抗体産生能を保有する細胞の細胞培養液又は動物の腹水培養液から取得される。但し、それらの抗体を含有する血液や培養液は、抗体以外のタンパク質、又は細胞培養に用いた原料液に由来する複雑な夾雑成分を包含し、それらの不純物成分から抗体を分離精製するには、煩雑で長時間を要する操作が通常必要である。
　液体クロマトグラフィーは、抗体の分離精製において重要である。抗体を分離するための液体クロマトグラフィー手法として、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー等があり、これらの手法を組み合わせることで抗体が分離精製される。
　イオン交換クロマトグラフィーは、吸着材表面のイオン交換基を固定相として移動相中に存在する対イオンを可逆的に吸着することにより分離を行う方法である。吸着材の形状としては、ビーズや、平膜、中空糸等の膜などが採用されており、これらの担体にカチオン交換基又はアニオン交換基を結合したものが吸着材として市販されている。カチオン交換基を有する吸着材は、主として抗体を吸着し、他の夾雑物の大半を素通りさせる特性を有し、容易に抗体を濃縮分離できる特性を有している。また、アニオン交換基を有する吸着材は、アルブミンや第８因子などの生理活性物質を吸着し、それらを濃縮分離できる特性を有している。
　従来のイオン交換基を有する吸着材では、移動相の塩濃度を高めることにより、吸着させた生理活性物質を溶出させることが一般的に行われている。しかしながら、バイオ医薬品などの成分である生理活性物質は、場合によっては移動相の塩濃度（イオン強度）の変化によって、不可逆的に変化（変性）してしまうことが知られており、これらの溶出条件には細心の注意を払わなければならない。また、生理活性物質の多くは低温に管理された場所（低温室）で分離精製されるが、吸着させた生理活性物質を高塩濃度の移動相を用いて溶出させる場合、低温で析出した塩が、配管やカラムの詰まりを誘発する危険性をはらんでいる。
　そこで、従来のイオン交換基を有する吸着材の問題を解決すべく、吸着した生理活性物質を溶出する際に、移動相の塩濃度を高めるのではなく、表面の有効イオン交換基密度を温度によって変化させ、生理活性物質を溶出することが可能である温度応答性吸着材が提案されている。
　特許文献１では、固定相表面の有効荷電密度を温度変化によって変化させることが可能である、荷電を有する共重合体を含む充填剤、製造方法及びそれを用いた温度応答性クロマトグラフィー法が開示されている。特許文献２では、原子移動ラジカル重合法によって、担体表面に０～８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを高密度に固定化した温度応答性クロマトグラフィー担体が開示されている。特許文献３には、イソプロピルアルコールを溶媒として、原子移動ラジカル法により、荷電を有し、０～８０℃の温度範囲内で水和力が変化するポリマーを成長反応させることを特徴とした温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法が開示されている。特許文献４では、水系移動相を含む特定の条件下で、生物学、医学、薬学等の分野において有用な高分子量の生理活性物質を分離できる、固体表面に０～８０℃の温度範囲内で水和力が変化する荷電ポリマーを被覆した液体クロマトグラフィー用担体の製造方法が開示されている。特許文献５では、高分子担体にアゾ重合開始剤をアミド結合を有する結合様式を用いて固定化した後、温度応答性グラフト鎖をグラフト重合することを特徴とした温度応答性クロマトグラフィー担体の製造方法が開示されている。非特許文献１では、原子移動ラジカル重合法により調製された、カルボキシル基を有する温度応答性クロマトグラフィー担体及びその製造法が開示されている。その中で、原子移動ラジカル重合法に用いるモノマー組成において、リゾチームの分離に最適化されたモノマー組成が開示されている。
国際公開第９９／０６１９０４号パンフレット 特開２００７－６９１９３号公報 特開２００９－８５９３３号公報 国際公開第０１／０７４４８２号パンフレット 特表２０１２－５０２９２４号公報
Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ，Ｊａｐａｎ　Ｖｏｌ．５８，Ｎｏ．２，３Ｔ１－１３（２００９）
　バイオ医薬品の成分である生理活性物質などを分離するために用いられるイオン交換吸着材は、医薬品への金属イオン混入を避けるために、吸着材からの金属イオンの溶出をなくさなければならない。そのため、金属塩を触媒として用いる原子移動ラジカル重合法は、残留金属イオンを除去するために、多くの手間がかかるため、産業利用される吸着材の製造方法としては好ましくない。また、生理活性物質等を分離するためのイオン交換吸着材は、一般的にアルカリ溶液での洗浄・滅菌が行われるため、アルカリ耐性が求められる。本発明者らの研究から、シリカビーズ担体の吸着材はもちろん、担体が高分子基材であっても、アミド結合を有する結合様式を用いていると、アルカリ耐性が低いことが明らかになった。しかし、上述した何れの文献でも、担体としてアルカリ耐性がないシリカビーズを用いている、あるいはアルカリ耐性が低いアミド結合を有する結合様式を用いているなど、アルカリ耐性について考慮された温度応答性の吸着材、製造方法、及びその利用方法は開示されていない。そこで、本発明は、アルカリ耐性を有し、且つ、従来型のラジカル重合開始剤を用いて製造可能な温度応答性吸着材、その製造方法、及びその利用方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、アルカリ耐性を有する担体に、末端にエポキシ基を有する分子を導入し、前記エポキシ基に、末端にアミノ基、カルボキシル基、及び水酸基のいずれかの官能基を有し、且つ構造中にアミド結合を含まないアゾ重合開始剤を結合し、表面グラフト重合法によって、荷電を有する部位を有する温度応答性ビニル系共重合体リガンドを形成することによって、アルカリ耐性を有するイオン交換温度応答性吸着材を作製可能であることを見出した。
　本発明に係るアルカリ耐性を有する温度応答性吸着材、その製造方法、及びその利用方法により、工業規模における新規な分離システムが実現可能である。このシステムを利用すれば、免疫グロブリン等のタンパク質等の有用な生理活性物を温度変化によって工業規模で分離精製すると共に、温度応答性吸着材のアルカリ溶液での洗浄・滅菌ができるようになる。
　以下、本発明の好適な実施形態（以下において、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。
　本実施形態に係るアルカリ耐性を有する温度応答性吸着材は、荷電を有している温度応答性吸着材であって、担体に、末端にエポキシ基を有する分子を導入し、前記エポキシ基に、末端にアミノ基、カルボキシル基、及び水酸基のいずれかの官能基を有し、且つ構造中にアミド結合を含まないアゾ重合開始剤を結合して、アミン結合、エステル結合、及びエーテル結合のいずれかの結合構造を形成し、アゾ重合開始剤由来の重合開始点を活性化して、荷電を有する部位を有する温度応答性ビニル系共重合体リガンドを形成して製造された温度応答性吸着材である。なお、本実施形態において、「アルカリ耐性を有する」とは、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液に吸着剤を２４時間浸漬した際に、アルカリ環境下にない場合と比較して９０％以上の吸着性能を維持することをいう。
　本実施形態において、担体としては、側鎖に水酸基を有する高分子を含む担体を用いる。このような高分子として、例えば、エチレン－ビニルアルコール共重合体、ポリビニルアルコール、及びセルロースが挙げられる。また、担体としては、吸着性能に優れるという観点から、多孔質担体が好ましい。
　本実施形態で使用する担体の形状は、特に限定されず、例えばビーズ状、平板状、及び管状でありうる。ビーズ状の場合、さまざまな粒径のビーズが入手可能であり、特に限定されないが、例えば１～３００μｍであり、好ましくは１０～２００μｍであり、さらに好ましくは２０～１５０μｍである。粒径が１μｍ以下であると、カラム内でビーズの圧密化が起きやすいために、高流速での処理が困難になる傾向にある。また粒径が３００μｍ以上ではビーズ間の隙間が大きくなり、生体高分子を吸着させる際に、漏れが発生する傾向にある。
　本実施形態で使用する担体は、例えば複数の細孔を有する。細孔径は、特に限定されないが、例えば、５～１０００ｎｍのものが用いられ、好ましくは１０～７００ｎｍのものであり、さらに好ましくは２０～５００ｎｍのものである。細孔径が５ｎｍ以下の担体であると、分離できる生体高分子の分子量が低くなる傾向にある。また細孔径が１０００ｎｍ以上の担体であると表面積が少なくなり、生体高分子の結合容量が小さくなる傾向にある。
　本実施形態では、上記担体が有する側鎖の水酸基に、末端にエポキシ基を有する分子を導入する。末端にエポキシ基を有する分子は、アルカリ耐性を持たせるために、主鎖がアルキル基、且つ片末端がハロゲンである分子が好ましい。このような分子として、例えば、エピクロロヒドリンやエピブロモヒドリンが挙げられる。
　末端にエポキシ基を有する分子の導入方法は、特に限定されないが、特開２００２－３６９８８１号公報に示されるように、水酸基を有する担体と、主鎖がアルキル基、且つ片末端がハロゲンである分子を、アルカリ条件下で反応させることで、末端にエポキシ基を有する分子を導入することが可能である。
　本実施形態では、アルカリ耐性の向上を課題の１つとしていることから、末端にエポキシ基を有する分子の導入した上記担体が有するエポキシ基に、末端にアミノ基、カルボキシル基、及び水酸基のいずれかの官能基を有し、且つ構造中にアミド結合を含まないアゾ重合開始剤を結合させる。末端にアミノ基、カルボキシル基、及び水酸基のいずれかの官能基を有するアゾ重合開始剤を用いることで、担体上に導入されていたエポキシ基と、アゾ重合開始剤と、の間の結合が、アミン結合、エステル結合、及びエーテル結合のいずれかの結合になり、特許文献５で示されるアルカリ耐性の低いアミド結合を有する結合様式を用いていないため、アルカリ耐性を持たせることが可能となる。また、重合開始剤の構造中にアミド結合を含まないことで、アルカリ耐性を持たせることが可能となる。さらに、重合開始剤の固定化反応時に重合開始剤が分解しないように、重合開始剤の１０時間半減期温度は、４５℃以上であることが望ましく、ラジカル重合反応時に重合モノマーが副反応を起こさないように好ましくは７０℃以下、より好ましくは６５℃以下であることが望ましい。
　このような重合開始剤としては、下記に限定されるものではないが、例えば、末端にアミノ基を有するアゾ重合開始剤としては、２，２’－アゾビス（プロパン－２－カルボアミジン）、末端にカルボキシル基を有するアゾ重合開始剤としては、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）、２、２’－アゾビス［Ｎ－（２－カルボキシエチル）－２－メチルプロピオンアミジン］、末端に水酸基を有するアゾ重合開始剤としては、２，２’アゾビス［２［１（２ヒドロキシエチル）２イミダゾリン２イル］プロパン］が挙げられる。
　結合の方法としては、例えば末端にアミノ基を有するアゾ重合開始剤である２，２’－アゾビス（プロパン－２－カルボアミジン）二塩酸を、上記担体とアルカリ条件下で反応させることで、２，２’－アゾビス（プロパン－２－カルボアミジン）をアミン結合で担体上に結合させることが可能である。また、末端にカルボキシル基を有するアゾ重合開始剤である４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）や、２、２’－アゾビス［Ｎ－（２－カルボキシエチル）－２－メチルプロピオンアミジン］ｎ水和物を上記担体と酸性条件下で反応させることで、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）や、２、２’－アゾビス［Ｎ－（２－カルボキシエチル）－２－メチルプロピオンアミジン］をエステル結合で担体上に結合させることが可能である。また、末端に水酸基を有するアゾ重合開始剤である２，２’アゾビス［２［１（２ヒドロキシエチル）２イミダゾリン２イル］プロパン］二塩酸を、上記担体とアルカリ条件下で反応させることで、２，２’アゾビス［２［１（２ヒドロキシエチル）２イミダゾリン２イル］プロパン］をエーテル結合で担体上に結合させることが可能である。
　本実施形態では、上記担体に結合させた重合開始剤を起点とするラジカル重合により、荷電を有する部位を有する温度応答性ビニル系共重合体リガンドが担体上に固定化される。このとき、担体と温度応答性ビニル共重合体リガンドとの間にあるアゾ重合開始剤由来の構造部分をアゾ重合開始剤の残基という。
　本実施形態においてラジカル重合時に使用する溶媒は、反応性化合物を均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、エタノールやイソプロパノール、ｔ－ブチルアルコール等のアルコール類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトンや２－ブタノン等のケトン類、水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
　本実施形態において、荷電を有する部位を有する温度応答性ビニル系共重合体リガンドは、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド由来の骨格を含み、イオン交換基を有する。イオン交換基としては、アニオン交換基あるいはカチオン交換基が使用可能である。アニオン交換基としては、例えば、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、及び第４級アンモニウム塩等が使用可能である。カチオン交換基としては、例えば、カルボキシル基あるいはスルホン酸基等が使用可能である。
　ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）は３２度に下限臨界温度を有することが知られている。このポリマーを表面に導入した担体は、下限臨界温度で親水性／疎水性の表面物性を大きく変化させる。そのため、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）をクロマトグラフィーの充填剤の表面にグラフトもしくはコーティングして使用した場合、試料に対する保持力を温度によって変化させることができるようになる。その結果、溶出液の組成を変化させずに保持挙動を温度によって制御することができるようになる。下限臨界温度を３２℃以上にするためには、イソプロピルアクリルアミドよりも親水性のモノマーであるアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、ジメチルアクリルアミド、及びビニルピロリドンなどを、親水性のコモノマーとして、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドと共重合させることによって調整することが可能である。また、下限臨界温度を３２℃以下にしたいときは、疎水性モノマーであるスチレン、アルキルメタクリレート、及びアルキルアクリレートなどを、疎水性のコモノマーとして、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドと共重合させることによって調整することが可能である。
　イオン交換基を与える方法は特に限定されないが、第１の方法として、ラジカル重合する際、イオン交換基を有するモノマーを含めて共重合する方法が挙げられる。
　第１乃至第３級アミンあるいは第４級アンモニウム塩を有するモノマー単位の例として、アリルアミン、メチルアクリルアミド、エチルアクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ジメチルアミノエチルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、ジエチルアクリルアミド、（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム、（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムが形成する塩、ジメチルアミノエチルアクリレート、及びジメチルアミノエチルアクリレートが形成する塩等が挙げられる。
　カルボキシル基を有するモノマー単位の例として、アクリル酸、及びメタクリル酸等が挙げられる。
　スルホン酸基を有するモノマー単位の例として、スルホン酸を有するポリマーの構成単位である（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸、ビニルスルホン酸、アクリルアミドｔ－ブチルスルホン酸、及びスチレンスルホン酸等が挙げられる。
　本実施形態において、イオン交換基を与える第２の方法として、イオン交換基を導入し得る官能基を有するモノマーを含めて共重合した後、イオン交換基を導入し得る官能基に、第１級乃至第３級アミン、第４級アンモニウム塩、カルボキシル基、あるいはスルホン酸基を導入する方法が挙げられる。イオン交換基を付与し得る官能基を有するモノマーとして、スチレン及びグリシジルメタクリレート等が挙げられる。スチレンを共重合した場合、スチレンが有する芳香環に、イオン交換基を導入可能である。また、グリシジルメタクリレートを共重合した場合、グリシジルメタクリレートが有するエポキシ基を開環し、イオン交換基を導入可能である。
　本実施形態において、荷電を有する部位を有する温度応答性ビニル系共重合体リガンドは、特定の温度範囲内で温度を変えることで水和、脱水和を起こすものであり、その温度範囲は例えば０℃～８０℃であり、好ましくは５℃～５０℃であり、さらに好ましくは１０℃～４５℃である。８０℃を越えると移動相が水であるので蒸発等が生じ、作業性が悪くなる傾向にある。また、０℃より低いと移動相が凍結する傾向にある。
　以上説明したように製造された本実施形態に係る温度応答性吸着材は、特定の温度範囲内で温度を変えることで、吸着対象物質を吸着、遊離させ得るものであり、その温度範囲は例えば０℃～８０℃であり、好ましくは５℃～５０℃であり、さらに好ましくは１０℃～４５℃である。本実施形態に係る温度応答性吸着材は、担体と、荷電を有する部位を有する、担体の表面に結合された温度応答性ビニル系共重合体リガンドと、を備え、温度応答性ビニル系共重合体リガンドが、アミン結合、エステル結合、及びエーテル結合のいずれかを含む結合様式を介して担体の表面に結合されていることにより、アルカリ耐性を有している。なお、アルカリ耐性とは、例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に２４時間浸漬しても、９０％以上の吸着性能を維持することをいう。
　例えば本実施形態に係る温度応答性吸着材は、下記式（１）で表される構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　式（１）においてMが担体である。R1、R2のいずれかは－OHであり、他方は下記式（２）乃至（５）で表される基のいずれかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　式（２）乃至（５）において、Lがビニル系共重合体リガンドである。なお、アミン結合とは、式（１）の構造と、末端にアミノ基を有するアゾ重合開始剤とを結合している２級アミン、３級アミンの結合であり、例えば、式（１）のR1、R2のいずれかが式（２）である場合、Ｃ－（ＮＨ）―Ｃの２級アミンの部位を言う。　
　本実施形態の温度応答性吸着材を用いた分離方法は特に限定されるものではないが、一例としては、得られた温度応答性液体クロマトグラフィー担体に目的とする生体高分子を一度吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させることで吸着した生体高分子を遊離させるような、キャッチアンドリリース法に基づいて利用する方法が挙げられる。その際に吸着させる溶質量は担体に吸着しうる量を超えていてもよく、超えていなくてもよい。いずれにせよ一度吸着させ、その後、温度を変えて担体表面の特性を変化させることで吸着した溶質を遊離させる精製法である。
　その他の分離方法は特に限定されるものではないが、あらかじめ担体表面の特性が変わる温度を確認しておき、その温度を挟むようにして温度変化させながら不純物の分離を行う方法が挙げられる。この場合、温度変化だけで担体表面の特性が大きく変わるので、溶質によってはシグナルの出てくる時間（保持時間）に大きな差が生じることが期待される。本実施形態の場合、この担体表面の特性が大きく変わる温度を挟むようにして分離することが最も効果的な利用方法である。
　本実施形態で示されるクロマトグラフィーは移動相として緩衝液を利用すればよく、有機溶媒を必要としないものである。ここで、緩衝液とは無機塩類を含む水溶液であって、具体的には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、及び酢酸緩衝液等が挙げられるが、通常利用される緩衝液であれば特に限定されるものではない。その無機塩類の濃度は１～１００ｍｍｏｌ／Ｌがよく、好ましくは３～５０ｍｍｏｌ／Ｌがよく、さらに好ましくは５～３０ｍｍｏｌ／Ｌがよい。移動相の無機塩類の濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌより低いと、溶質である生理活性物質の活性を損ねる傾向にある。また、温度応答性吸着材表面のイオン交換基の解離度が高くなり、温度応答性吸着材表面へ溶質が強固に吸着してしまい、その後の操作で担体表面から溶質を剥がすことが困難となる傾向にある。逆に、無機塩類の濃度が１００ｍｍｏｌ／Ｌより高くなると温度応答性吸着材表面のイオン交換基の解離度が低くなり、担体表面への溶質の保持が困難となり、最終的に溶質を分離することが困難となる傾向にある。
　以上に示してきた本実施形態における温度応答性吸着材を用いれば、医薬品等に利用できる極めて有用な生理活性物質の分離や分析ができる。その際には、カラム内の温度を変化させるだけで簡便な操作だけで分離が達成でき、分離に有機溶媒を必要としないため分離された生理活性物質も変性なく得られる。
　以下に、本実施形態を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本実施形態を何ら限定するものではない。
　（４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）－スルホン酸基）
　１）末端エポキシ基を有する分子の導入
　架橋ポリビニルアルコールビーズ１ｇ（粒径１００μｍ）を３％の水酸化ナトリウム水溶液１５０ｍＬに分散し、３０℃で撹拌した。５０ｇのエピクロロヒドリン（和光純薬工業（株）製）を加え、３０℃で２時間撹拌した後、純水でろ過液が中性になるまで洗浄し、吸引ろ過により、過剰量の水を切ったゲルを得た。これにより、架橋ポリビニルアルコールビーズ表面に、末端エポキシ基を有するエピクロロヒドリンが導入された。
　２）重合開始剤の固定化
　末端エポキシ基導入架橋ポリビニルアルコールビーズを３００ｍLのガラス製三角フラスコに入れた。三角フラスコに、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業（株）製）１００ｍＬ、純水９６ｍＬ、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）（和光純薬工業（株）製）１４．０２ｇ、１Ｍ　ＨＣｌ（和光純薬工業（株）製）４ｍＬを加え、４０℃で２０時間震とうさせた。反応後、ろ過してから２００ｍＬメタノールで３回洗浄した。これにより、架橋ポリビニルアルコールビーズ表面に重合開始剤である４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）が結合された。
　３）グラフト重合
　イオン交換基の前駆体モノマーであるグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ、東京化成工業（株）製）を含有するモノマー組成物を調整した。具体的には、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＩＰＡＡｍ、和光純薬工業（株）製）１８．４０ｇ、ＧＭＡ０．２３１ｇ、ブチルメタクリレート（ＢＭＡ、東京化成工業（株）製）１．２１７ｇを９０容量％ｔ－ブタノール（ｔ－ＢｕＯＨ）水溶液４２．８ｍＬに溶解させ、３０分間、窒素バブリングした。この反応溶液を窒素雰囲気下で重合開始剤結合架橋ポリビニルアルコールビーズに反応させ、７０℃で１６時間の重合をおこなった。反応後、エタノール、純水の順に洗浄し、モノマー、ポリマーを洗浄した。
　４）スルホン酸基の導入
　ラジカル重合法によりグラフト鎖を導入したビーズを、亜硫酸ナトリウムと、ＩＰＡと、の混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／ＩＰＡ／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）２００ｇに投入し、８０℃で２４時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、このビーズを純水で洗浄した。その後、このビーズを０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。反応後、このビーズを純水で洗浄した。
　５）免疫グロブリンの吸着・溶出量測定
　ビーズを空カラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ５／２０ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）に充填し、クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡ　ＦＰＬＣ、ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）を用いて、温度変化による免疫グロブリン（献血ヴェノグロブリ－ＩＨ、株式会社ベネシス製）の吸着・溶出試験を行った。ビーズを充填したカラムの温度変化操作は、クロマトグラフィーシステムのポンプを一時停止し、カラムを恒温水槽中に浸漬し、その後１０分間以上温置した後にクロマトグラフィーシステムのポンプを再度起動することにより行った。免疫グロブリンの吸着、及び溶出は、以下の条件で行った。
（吸着ステップ）
・免疫グロブリン濃度：２．５ｍｇ／ｍＬ
・吸着バッファー：１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）
・免疫グロブリン溶液ロード量：２０ｍＬ
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・カラム体積：０．５４ｍＬ
・吸着温度：４０℃
（洗浄ステップ）
・洗浄バッファー：１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・洗浄温度：４０℃
（温度溶出ステップ）
・溶出バッファー：１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・流量：２０ｍＬ
・溶出温度：２℃
（塩溶出ステップ）
・溶出バッファー：１ｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）
・流速：０．４ｍＬ／ｍｉｎ
・流量：２０ｍＬ
・溶出温度：２℃
　温度溶出後、温度で溶出しきれない免疫グロブリンを、１ｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー（ｐＨ６．０）で溶出させた。各ステップの分画のＵＶ吸収（２８０ｎｍ）を測定し、下記式より免疫グロブリン濃度を算出することにより、免疫グロブリンの温度溶出量を算出した。
　　　免疫グロブリン濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝２８０ｎｍでの吸光度／１４×１０
　　　温度溶出量（ｍｇ／ｍＬ）＝
　　　　　　温度溶出画分の免疫グロブリン濃度×温度溶出画分の液量／カラム体積
　（結果）
　免疫グロブリンの温度溶出量は２３．６ｍｇ／ｍＬであり、免疫グロブリンを吸着し、温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った免疫グロブリンを塩バッファーで溶出したところ塩溶出量は１．７ｍｇ／ｍＬと少なかった。
　（アルカリ洗浄）
　続いて、ビーズを充填したカラムに１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を５分間通液した後、２４時間放置して浸漬した。その後、免疫グロブリンの吸着・溶出量測定で用いた吸着バッファーを通液して、ｐＨが所定のｐＨになるまで洗浄し、前記免疫グロブリンの吸着・溶出量測定と同様に再度測定を行った。
　（アルカリ洗浄後の結果）
　免疫グロブリンの温度溶出量は２３．９ｍｇ／ｍＬであり、アルカリ洗浄前と比較して１０１．３％であることから、同様に免疫グロブリンを吸着し、温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った免疫グロブリンを塩バッファーで溶出したところ塩溶出量は１．６ｍｇ／ｍＬとアルカリ洗浄前と同様に少なかった。以上の結果から、実施例１に係る温度応答性吸着剤が、アルカリ耐性を有し、且つ生理活性物質の工業的な精製に使用できることが示された。なお、本実施例においても、アルカリ耐性を有するとは、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に２４時間浸漬しても、９０％以上の吸着性能を維持することをいうものとする。
　（２，２’アゾビス［２［１（２ヒドロキシエチル）２イミダゾリン２イル］プロパン］－カルボキシル基）
　１）重合開始剤の固定化
　実施例１の１）と同様に作製した末端エポキシ基導入架橋ポリビニルアルコールビーズを３００ｍＬのガラス製三角フラスコに入れた。三角フラスコに、純水２００ｍＬ、２，２’アゾビス［２［１（２ヒドロキシエチル）２イミダゾリン２イル］プロパン］二塩酸（和光純薬工業（株）製）２０．５７ｇ、水酸化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）４ｇを加え、４０℃で１８時間震とうさせた。反応後、ろ過してから純水で３回洗浄した。これにより、架橋ポリビニルアルコールビーズ表面に重合開始剤である２，２’アゾビス［２［１（２ヒドロキシエチル）２イミダゾリン２イル］プロパン］が結合された。
　２）グラフト重合
　イオン交換基として、カルボキシル基を有するモノマーであるアクリル酸（ＡＡｃ、東京化成工業（株）製）を含有するモノマー組成物を調整した。具体的には、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＩＰＡＡｍ、和光純薬工業（株）製）１８．４０ｇ、ＡＡｃ０．１１７ｇ、ブチルメタクリレート（ＢＭＡ、東京化成工業（株）製）１．２１７ｇを９０容量％ｔ－ブタノール（ｔ－ＢｕＯＨ）水溶液４２．８ｍＬに溶解させ、３０分間、窒素バブリングした。この反応溶液を窒素雰囲気下で重合開始剤結合架橋ポリビニルアルコールビーズに反応させ、７０℃で１６時間の重合をおこなった。反応後、エタノール、純水の順に洗浄し、モノマー、ポリマーを洗浄した。
　３）免疫グロブリンの吸着・溶出量測定
　実施例１の５）と同様に、免疫グロブリンの吸着・溶出試験を行った。
　（結果）
　免疫グロブリンの温度溶出量は１８．９ｍｇ／ｍＬであり、免疫グロブリンを吸着し、温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った免疫グロブリンを塩バッファーで溶出したところ塩溶出量は１．１ｍｇ／ｍＬと少なかった。
　（アルカリ洗浄）
　続いて、ビーズを充填したカラムに１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を５分間通液した後、２４時間放置して浸漬した。その後、免疫グロブリンの吸着・溶出量測定で用いた吸着バッファーを通液して、ｐＨが所定のｐＨになるまで洗浄し、前記免疫グロブリンの吸着・溶出量測定と同様に再度測定を行った。
　（アルカリ洗浄後の結果）
　免疫グロブリンの温度溶出量は１９．１ｍｇ／ｍＬであり、アルカリ洗浄前と比較して１０１．１％であることから、同様に免疫グロブリンを吸着し、温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った免疫グロブリンを塩バッファーで溶出したところ塩溶出量は１．３ｍｇ／ｍＬとアルカリ洗浄前と同様に少なかった。以上の結果から、実施例２に係る温度応答性吸着剤が、アルカリ耐性を有し、且つ生理活性物質の工業的な精製に使用できることが示された。
　（２，２’－アゾビス（プロパン－２－カルボアミジン）－アミノ基）
　１）重合開始剤の固定化
　実施例１の１）と同様に作製した末端エポキシ基導入架橋ポリビニルアルコールビーズを３００ｍLのガラス製三角フラスコに入れた。三角フラスコに、純水２００ｍＬ、２，２’－アゾビス（プロパン－２－カルボアミジン）二塩酸（和光純薬工業（株）製）１３．５６ｇ、水酸化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）４ｇを加え、４０℃で１８時間震とうさせた。反応後、ろ過してから純水で３回洗浄した。これにより、架橋ポリビニルアルコールビーズ表面に重合開始剤である２，２’－アゾビス（プロパン－２－カルボアミジン）が結合された。
　２）グラフト重合
　イオン交換基の前駆体モノマーであるグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ、東京化成工業（株）製）を含有するモノマー組成物を調整した。具体的には、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＩＰＡＡｍ、和光純薬工業（株）製）１８．４０ｇ、ＧＭＡ０．２３１ｇ、ブチルメタクリレート（ＢＭＡ、東京化成工業（株）製）１．２１７ｇを９０容量％ｔ－ブタノール（ｔ－ＢｕＯＨ）水溶液４２．８ｍＬに溶解させ、３０分間、窒素バブリングした。この反応溶液を窒素雰囲気下で重合開始剤結合架橋ポリビニルアルコールビーズに反応させ、７０℃で１６時間の重合をおこなった。反応後、エタノール、純水の順に洗浄し、モノマー、ポリマーを洗浄した。
　３）アミノ基の導入
　ラジカル重合法によりグラフト鎖を導入したビーズを、ジエチルアミンと、純水との混合水溶液（ジエチルアミン／純水＝５０／５０ｗｔ％）２００ｇに投入し、８０℃で２４時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をジエチルアミノ基に変換した。反応後、このビーズを純水で洗浄した。
　４）アルブミンの吸着・溶出量測定
　実施例１の５）と同様に、アルブミン（シグマ－アルドリッチ社製）の吸着・溶出試験を行った。尚、吸着、洗浄、溶出バッファーとして、１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス－塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を用い、塩溶出での溶出バッファーは１ｍｏｌ／Ｌトリス－塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を用いた。アルブミンの２８０ｎｍでの吸光度は、７を用いた。その他の条件は、実施例１の５）と同様で行った。
　（結果）
　アルブミンの温度溶出量は２０．５ｍｇ／ｍＬであり、アルブミンを吸着し、温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残ったアルブミンを塩バッファーで溶出したところ塩溶出量は１．２ｍｇ／ｍＬと少なかった。
　（アルカリ洗浄）
　続いて、ビーズを充填したカラムに１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を５分間通液した後、２４時間放置して浸漬した。その後、前記アルブミンの吸着・溶出量測定で用いた吸着バッファーを通液して、ｐＨが所定のｐＨになるまで洗浄し、前記アルブミンの吸着・溶出量測定と同様に再度測定を行った。
　（アルカリ洗浄後の結果）
　アルブミンの温度溶出量は２０．３ｍｇ／ｍＬであり、アルカリ洗浄前と比較して９９．０％であることから、同様にアルブミンを吸着し、温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残ったアルブミンを塩バッファーで溶出したところ塩溶出量は１．５ｍｇ／ｍＬとアルカリ洗浄前と同様に少なかった。以上の結果から、実施例３に係る温度応答性吸着剤が、アルカリ耐性を有し、且つ生理活性物質の工業的な精製に使用できることが示された。
　（比較例１）
　アミノプロピルシリカビーズを担体として用いた温度応答性吸着材
　１）重合開始剤の固定化
　アミノプロピルシリカビーズ（西尾工業（株）製）１ｇを３００ｍLのガラス製三角フラスコに入れた。三角フラスコに、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業（株）製）２００ｍＬ、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）（和光純薬工業（株）製）４．０１ｇ、１－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（和光純薬工業（株）製）７．４０ｇを加え、２５℃で２４時間震とうさせた。反応後、ろ過してから２００ｍＬメタノールで３回洗浄した。これにより、架橋ポリビニルアルコールビーズ表面に重合開始剤である４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）が結合された。
　２）グラフト重合
　実施例１の３）と同様に、イオン交換基の前駆体モノマーであるグリシジルメタクリレートを含有するモノマー組成物を調整した。反応は実施例１の３）と全て同様に行った。
３）スルホン酸基の導入
　実施例１の４）と同様に、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。
４）免疫グロブリンの吸着・溶出量測定
　実施例１の５）と同様に、免疫グロブリンの吸着・溶出試験を行った。
　（結果）
　免疫グロブリンの温度溶出量は１２．７ｍｇ／ｍＬであり、免疫グロブリンを吸着し、温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った免疫グロブリンを塩バッファーで溶出したところ塩溶出量は１．２ｍｇ／ｍＬと少なかった。
　（アルカリ洗浄）
　続いて、ビーズを充填したカラムに１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を５分間通液した後、２４時間放置して浸漬した。その後、免疫グロブリンの吸着・溶出量測定で用いた吸着バッファーを通液して、ｐＨが所定のｐＨになるまで洗浄し、前記免疫グロブリンの吸着・溶出量測定と同様に再度測定を行った。
　（アルカリ洗浄後の結果）
　免疫グロブリンの温度溶出量は２．３ｍｇ／ｍＬであり、アルカリ洗浄前と比較して１８．１％であることから、アルカリ洗浄前よりも免疫グロブリンの吸着および溶出が低下していることが示された。温度溶出後のビーズに残った免疫グロブリンを塩バッファーで溶出したところ塩溶出量は０．１ｍｇ／ｍＬとアルカリ洗浄前よりも少なかった。以上の結果から、比較例１に係る温度応答性吸着剤は、アルカリ耐性を有しておらず、生理活性物質の工業的な精製には使用し難いことが示された。
　（比較例２）
　結合にアミド結合を用いた温度応答性吸着材
　１）アミノ基の導入
　実施例１の１）と同様に作製した末端エポキシ基導入架橋ポリビニルアルコールビーズを３００ｍＬのポリエチレン製三角フラスコに入れた。三角フラスコに、２５％アンモニア水２００ｍＬを加え、５０℃で３時間震とうさせた。反応後、純水でろ過液が中性になるまで洗浄し、吸引ろ過により、過剰量の水を切ったゲルを得た。これにより、架橋ポリビニルアルコールビーズ表面に、アミノ基が導入された。
　２）重合開始剤の固定化
　アミノ基導入架橋ポリビニルアルコールビーズを３００ｍLのガラス製三角フラスコに入れた。三角フラスコに、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業（株）製）２００ｍＬ、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）（和光純薬工業（株）製）４．０１ｇ、１－エトキシカルボニル－２－エトキシ－１，２－ジヒドロキノリン（和光純薬工業（株）製）７．４０ｇを加え、２５℃で２４時間震とうさせた。反応後、ろ過してから２００ｍＬメタノールで３回洗浄した。これにより、架橋ポリビニルアルコールビーズ表面に重合開始剤である４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）がアミド結合を介して結合された。
　３）グラフト重合
　実施例１の３）と同様に、イオン交換基の前駆体モノマーであるグリシジルメタクリレートを含有するモノマー組成物を調整した。反応は実施例１の３）と全て同様に行った。
　４）スルホン酸基の導入
　実施例１の４）と同様に、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。
　５）免疫グロブリンの吸着・溶出量測定
　実施例１の５）と同様に、免疫グロブリンの吸着・溶出試験を行った。
　（結果）
　免疫グロブリンの温度溶出量は２３．５ｍｇ／ｍＬであり、免疫グロブリンを吸着し、温度変化によって溶出できることが示された。温度溶出後のビーズに残った免疫グロブリンを塩バッファーで溶出したところ塩溶出量は３．６ｍｇ／ｍＬと少なかった。
　（アルカリ洗浄）
　続いて、ビーズを充填したカラムに１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を５分間通液した後、２４時間放置して浸漬した。その後、免疫グロブリンの吸着・溶出量測定で用いた吸着バッファーを通液して、ｐＨが所定のｐＨになるまで洗浄し、前記免疫グロブリンの吸着・溶出量測定と同様に再度測定を行った。
　（アルカリ洗浄後の結果）
　免疫グロブリンの温度溶出量は１５．６ｍｇ／ｍＬであり、アルカリ洗浄前と比較して６６．４％であることから、アルカリ洗浄前よりも免疫グロブリンの吸着および溶出が低下していることが示された。温度溶出後のビーズに残った免疫グロブリンを塩バッファーで溶出したところ塩溶出量は２．３ｍｇ／ｍＬとアルカリ洗浄前よりも少なかった。以上の結果から、比較例２に係る温度応答性吸着剤は、アルカリ耐性を有しておらず、生理活性物質の工業的な精製には使用し難いことが示された。
　以上示した実施例１乃至３及び比較例１及び２の結果を、下記表にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  本実施形態に係るアルカリ耐性を有する温度応答性吸着材、その製造方法、及びその利用方法により、新規な分離システムが提案される。このシステムを利用すれば、グロブリン等の有用な生理活性化合物を温度変化によって工業規模で分取できるようになる。

Claims (32)

  1. 　側鎖に水酸基を有する高分子を含む担体と、
    　荷電を有する部位を有する、前記担体の側鎖に結合された温度応答性ビニル系共重合体 リガンドと、
    　を備え、
    前記温度応答性ビニル系共重合体リガンドが、アミン結合、エステル結合、及びエーテル結合のいずれかを含む結合様式であって、アミド結合を有しない結合様式を介して、前記担体の側鎖に結合されている、
    　アルカリ耐性を有する温度応答性吸着材。
  2. 　１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液に２４時間浸漬した際に、９０％以上の吸着性能を維持する、請求項１に記載の温度応答性吸着材。
  3. 　前記温度応答性ビニル系共重合体リガンドが、アゾ重合開始剤の残基を含む結合様式を介して前記担体の側鎖に結合されている、請求項１又は２に記載の温度応答性吸着材。
  4. 　当該温度応答性吸着材は、下記式（１）で表される構造を有し、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     式（１）においてMが前記担体であり、R1、R2のいずれかは－OHであり、他方は下記式（２）乃至（５）で表される基のいずれかであり、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     　式（２）乃至（５）においてLが前記ビニル系共重合体リガンドである、
    　請求項１乃至３のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材。
  5. 　前記担体が、多孔質担体である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材。
  6. 　前記アミン結合、エステル結合、及びエーテル結合のいずれかが、側鎖に水酸基を有する高分子を含む担体が有していた水酸基に、末端にエポキシ基を有する分子を導入し、前記エポキシ基に、末端にアミノ基、カルボキシル基、及び水酸基のいずれかの官能基を有し、且つ構造中にアミド結合を含まないアゾ重合開始剤を結合して形成された、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材。
  7. 　前記ビニル系共重合体リガンドが、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド由来の骨格を含み、カチオン交換基を有する、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材。
  8. 　前記カチオン交換基が、カルボキシル基又はスルホン酸基である、請求項７に記載の温度応答性吸着材。
  9. 　前記ビニル系共重合体リガンドが、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド由来の骨格を含み、アニオン交換基を有する、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材。
  10. 　前記アニオン交換基が、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、及び第４級アンモニウム塩のいずれかである、請求項９に記載の温度応答性吸着材。
  11. 　側鎖に水酸基を有する高分子を含む担体に、末端にエポキシ基を有する分子を導入し、
    　前記エポキシ基に、末端にアミノ基、カルボキシル基、及び水酸基のいずれかの官能基を有し、且つ構造中にアミド結合を含まないアゾ重合開始剤を結合して、前記エポキシ基を有していた分子と前記アゾ重合開始剤との間に、アミン結合、エステル結合、及びエーテル結合のいずれかの結合構造を形成し、
    　前記アゾ重合開始剤由来の重合開始点を活性化して、荷電を有する部位を有する温度応答性ビニル系共重合体リガンドを形成して製造された、
    　アルカリ耐性を有する温度応答性吸着材。
  12. 　１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に２４時間浸漬した際に、９０％以上の吸着性能を維持する、請求項１１に記載の温度応答性吸着材。
  13. 　前記アゾ重合開始剤の１０時間半減期温度が４５℃以上、７０℃以下である、請求項１１又は１２に記載の温度応答性吸着材。
  14. 　前記アゾ重合開始剤が、２，２’－アゾビス（プロパン－２－カルボアミジン）、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）、２、２’－アゾビス［N－（２－カルボキシエチル）－２－メチルプロピオンアミジン］、及び２，２’アゾビス［２［１（２ヒドロキシエチル）２イミダゾリン２イル］プロパン］のいずれかである、請求項１１乃至１３のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材。
  15. 　前記担体が、多孔質担体である、請求項１１乃至１４のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材。
  16. 　前記側鎖に水酸基を有する高分子が、エチレン－ビニルアルコール共重合体、ポリビニルアルコール、及びセルロースのいずれかである、請求項１１乃至１５のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材。
  17. 　前記末端にエポキシ基を有する分子が、エピクロロヒドリン又はエピブロモヒドリンである、請求項１１乃至１６のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材。
  18. 　前記ビニル系共重合体リガンドが、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド由来の骨格を含み、カチオン交換基を有する、請求項１１乃至１７のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材。
  19. 　前記カチオン交換基が、カルボキシル基又はスルホン酸基である、請求項１８に記載の温度応答性吸着材。
  20. 　前記ビニル系共重合体リガンドが、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド由来の骨格を含み、アニオン交換基を有する、請求項１１乃至１７のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材。
  21. 　前記アニオン交換基が、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、及び第４級アンモニウム塩のいずれかである、請求項２０に記載の温度応答性吸着材。
  22. 　側鎖に水酸基を有する高分子を含む担体に、末端にエポキシ基を有する分子を導入する導入工程と、
    　前記エポキシ基に、末端にアミノ基、カルボキシル基、及び水酸基のいずれかの官能基を有し、且つ構造中にアミド結合を含まないアゾ重合開始剤を結合し、前記エポキシ基を有していた分子と前記アゾ重合開始剤との間に、アミン結合、エステル結合、及びエーテル結合のいずれかの結合構造を形成する結合工程と、
    　前記アゾ重合開始剤由来の重合開始点を活性化して、荷電を有する部位を有する温度応答性ビニル系共重合体リガンドを形成する重合工程と、
    　を含む、アルカリ耐性を有する温度応答性吸着材の製造方法。
  23. 　前記温度応答性吸着材が、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に２４時間浸漬した際に、９０％以上の吸着性能を維持する、請求項２２に記載の温度応答性吸着材の製造方法。
  24. 　前記アゾ重合開始剤の１０時間半減期温度が４５℃以上、７０℃以下である、請求項２２又は２３に記載の温度応答性吸着材の製造方法。
  25. 　前記アゾ重合開始剤が、２，２’－アゾビス（プロパン－２－カルボアミジン）、４，４’－アゾビス（４－シアノ吉草酸）、２、２’－アゾビス［N－（２－カルボキシエチル）－２－メチルプロピオンアミジン］、及び２，２’アゾビス［２［１（２ヒドロキシエチル）２イミダゾリン２イル］プロパン］のいずれかである、請求項２２乃至２４のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材の製造方法。
  26. 　前記担体が、多孔質担体である、請求項２２乃至２５のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材の製造方法。
  27. 　前記側鎖に水酸基を有する高分子が、エチレン－ビニルアルコール共重合体、ポリビニルアルコール、及びセルロースのいずれかである、請求項２２乃至２６のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材の製造方法。
  28. 　前記末端にエポキシ基を有する分子が、エピクロロヒドリン又はエピブロモヒドリンである、請求項２２乃至２７のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材の製造方法。
  29. 　前記ビニル系共重合体リガンドが、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド由来の骨格を含み、カチオン交換基を有する、請求項２２乃至２８のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材の製造方法。
  30. 　前記カチオン交換基が、カルボキシル基又はスルホン酸基である、請求項２９に記載の温度応答性吸着材の製造方法。
  31. 　前記ビニル系共重合体リガンドが、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド由来の骨格を含み、アニオン交換基を有する、請求項２２乃至２８のいずれか１項に記載の温度応答性吸着材の製造方法。
  32. 　前記アニオン交換基が、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、及び第４級アンモニウム塩のいずれかである、請求項３１に記載の温度応答性吸着材の製造方法。
PCT/JP2013/066503 2012-06-15 2013-06-14 アルカリ耐性を有するイオン交換温度応答性吸着材、及びその製造方法 WO2013187512A1 (ja)

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