CN107876017A - 具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质 - Google Patents

具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质 Download PDF

Info

Publication number
CN107876017A
CN107876017A CN201711276392.4A CN201711276392A CN107876017A CN 107876017 A CN107876017 A CN 107876017A CN 201711276392 A CN201711276392 A CN 201711276392A CN 107876017 A CN107876017 A CN 107876017A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino
medium
chromatography
pyrrol
carboxylic acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711276392.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107876017B (zh
Inventor
瞿欢欢
朱至放
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SUZHOU BOJIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
SUZHOU BOJIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SUZHOU BOJIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical SUZHOU BOJIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201711276392.4A priority Critical patent/CN107876017B/zh
Publication of CN107876017A publication Critical patent/CN107876017A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107876017B publication Critical patent/CN107876017B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3861—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36 using an external stimulus
    • B01D15/3885—Using electrical or magnetic means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28011—Other properties, e.g. density, crush strength
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本案涉及一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，包括层析基质和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，所述的配基为3‑吡咯羧酸的羧基和4‑氨基‑2‑羰基嘧啶的氨基反应后形成的双功能配基。本发明以3‑吡咯羧酸和4‑氨基‑2‑羰基嘧啶为双功能配基制备新型的疏水性电荷诱导层析介质，引入双功能基团的概念，优化配基的空间排布，提高抗体结合的选择性，因此具有独特的分离性能。

Description

具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质
技术领域
本发明涉及一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。
背景技术
抗体(antibody)是生物体内最重要的免疫物质之一，参与了机体的免疫过程反应。由于抗体和抗原具有高度的亲和性和特异性，被广泛应用于临床医疗领域。单克隆抗体(简称单抗，monoclonal antibody，mAb)作为一类重要的抗体药物，具有特异性强，亲和力高，毒副作用低等优点，用于癌症等重大疾病治疗和免疫诊断等。分离纯化是抗体生产制备的重要环节，下游过程约占抗体药物生产成本的80％，因此开发高效、低成本的抗体纯化新机制和新方法具有重要的意义。
层析是目前抗体分离的主要方法，包括亲和层析、离子交换层析、疏水相互作用层析以及混合模式层析等。Protein A亲和层析是典型代表，选择性好，分辨率高，一步分离即可获得较高纯度的抗体产品，但也存在一些局限，例如成本较高，处理量有限，洗脱pH较低，在线清洗困难等。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本案提供一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质。
为实现上述目的，本案通过以下技术方案实现：
一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其中，包括层析基质和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，所述的配基为3-吡咯羧酸的羧基和4-氨基-2-羰基嘧啶的氨基反应后形成的双功能配基。
优选的是，所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其中，所述层析基质为经粗化处理的二氧化硅微球。
优选的是，所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其中，所述的配基为经一缩二乙二醇双缩水甘油醚活化后依次偶联的3-吡咯羧酸和4-氨基-2-羰基嘧啶。
一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法，其中，包括如下步骤：
1)将层析基质抽干后，加入0.5-1.5倍层析基质质量的20％v/v二氧六环、0.3-1.6倍层析基质质量的一缩二乙二醇双缩水甘油醚和0.3-0.7倍层析基质质量的氢氧化钠，40℃搅拌反应10-20小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；
2)将活化层析基质和0.1-0.5倍层析基质质量的3-吡咯羧酸以及0.1-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠溶液混合，在50℃下搅拌反应8-16小时，得到3-吡咯羧酸偶联的介质；
3)取3-吡咯羧酸偶联的介质，分别用体积百分比为30％、70％和100％的乙醇溶液清洗，再用二甲基甲酰胺清洗，加入0.6-1.5倍层析基质质量的二甲基甲酰胺、2-氨基-1,3,5-三嗪和N,N-二环己基碳酰亚胺，50℃振荡10-20小时，得到2-氨基-1,3,5-三嗪活化的介质；
4)取2-氨基-1,3,5-三嗪活化的介质，依次用体积百分比为60％和40％的丁酮溶液清洗，去离子水洗涤，加入2-5倍层析基质质量的10mg/ml4-氨基-2-羰基嘧啶溶液，30℃下200rpm水浴摇床中反应12-36小时；最后将介质抽滤，去离子水洗涤，得到具有3-吡咯羧酸和4-氨基-2-羰基嘧啶双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质。
优选的是，所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其中，所述其配基密度为50-150mol/ml。
优选的是，所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其中，所述2-氨基-1,3,5-三嗪浓度为0.1-0.5g/ml，N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.6-1g/ml。
本发明的有益效果是：
本发明以3-吡咯羧酸和4-氨基-2-羰基嘧啶为双功能配基制备新型的疏水性电荷诱导层析介质，引入双功能基团的概念，优化配基的空间排布，提高抗体结合的选择性，因此具有独特的分离性能。采用一缩二乙二醇双缩水甘油醚活化偶联3-吡咯羧酸，并通过酰胺键与4-氨基-2-羰基嘧啶进一步偶联，所得介质性能稳定，清洗再生方便。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
取粗化处理的二氧化硅微球10g，加入5g的20％v/v二氧六环、4g的一缩二乙二醇双缩水甘油醚和3g的氢氧化钠，40℃搅拌反应12小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；将活化层析基质和3g的3-吡咯羧酸以及0.1-0.5mol氢氧化钠溶液混合，在50℃下搅拌反应8-16小时，得到3-吡咯羧酸偶联的介质；取3-吡咯羧酸偶联的介质，分别用体积百分比为30％、70％和100％的乙醇溶液清洗，再用二甲基甲酰胺清洗，加入10g的二甲基甲酰胺、2-氨基-1,3,5-三嗪和N,N-二环己基碳酰亚胺，2-氨基-1,3,5-2-氨基-1,3,5-三嗪浓度为0.1g/ml，N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.6g/ml，50℃振荡12小时，得到2-氨基-1,3,5-2-氨基-1,3,5-三嗪活化的介质；取2-氨基-1,3,5-三嗪活化的介质，依次用体积百分比为60％和40％的丁酮溶液清洗，去离子水洗涤，加入20g的10mg/ml4-氨基-2-羰基嘧啶溶液，30℃下200rpm水浴摇床中反应15小时；最后将介质抽滤，去离子水洗涤，得到具有3-吡咯羧酸和4-氨基-2-羰基嘧啶双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质。配基密度为60mol/ml。
实施例2
取粗化处理的二氧化硅微球10g，加入8g的20％v/v二氧六环、10g的一缩二乙二醇双缩水甘油醚和4g的氢氧化钠，40℃搅拌反应10小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；将活化层析基质和3g的3-吡咯羧酸以及2g的氢氧化钠溶液混合，在50℃下搅拌反应10小时，得到3-吡咯羧酸偶联的介质；取3-吡咯羧酸偶联的介质，分别用体积百分比为30％、70％和100％的乙醇溶液清洗，再用二甲基甲酰胺清洗，加入10g的二甲基甲酰胺、2-氨基-1,3,5-2-氨基-1,3,5-三嗪和N,N-二环己基碳酰亚胺，2-氨基-1,3,5-2-氨基-1,3,5-三嗪浓度为0.2g/ml，N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.8g/ml，50℃振荡17小时，得到2-氨基-1,3,5-2-氨基-1,3,5-三嗪活化的介质；取2-氨基-1,3,5-三嗪活化的介质，依次用体积百分比为60％和40％的丁酮溶液清洗，去离子水洗涤，加入20g的10mg/ml4-氨基-2-羰基嘧啶溶液，30℃下200rpm水浴摇床中反应25小时；最后将介质抽滤，去离子水洗涤，得到具有3-吡咯羧酸和4-氨基-2-羰基嘧啶双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质。配基密度为100mol/ml。
实施例3
取粗化处理的二氧化硅微球10g，加入12g的20％v/v二氧六环、15g的一缩二乙二醇双缩水甘油醚和6g的氢氧化钠，40℃搅拌反应16小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；将活化层析基质和3g的3-吡咯羧酸以及5g的氢氧化钠溶液混合，在50℃下搅拌反应13小时，得到3-吡咯羧酸偶联的介质；取3-吡咯羧酸偶联的介质，分别用体积百分比为30％、70％和100％的乙醇溶液清洗，再用二甲基甲酰胺清洗，加入10g的二甲基甲酰胺、2-氨基-1,3,5-2-氨基-1,3,5-三嗪和N,N-二环己基碳酰亚胺，2-氨基-1,3,5-2-氨基-1,3,5-三嗪浓度为0.5g/ml，N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.6g/ml，50℃振荡20小时，得到2-氨基-1,3,5-三嗪活化的介质；取2-氨基-1,3,5-三嗪活化的介质，依次用体积百分比为60％和40％的丁酮溶液清洗，去离子水洗涤，加入30g的10mg/ml4-氨基-2-羰基嘧啶溶液，30℃下200rpm水浴摇床中反应25小时；最后将介质抽滤，去离子水洗涤，得到具有3-吡咯羧酸和4-氨基-2-羰基嘧啶双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质，配基密度为150mol/ml。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (6)

1.一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其特征在于，包括层析基质和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，所述的配基为3-吡咯羧酸的羧基和4-氨基-2-羰基嘧啶的氨基反应后形成的双功能配基。
2.如权利要求1所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其特征在于，所述层析基质为经粗化处理的二氧化硅微球。
3.如权利要求1所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其特征在于，所述的配基为经一缩二乙二醇双缩水甘油醚活化后依次偶联的3-吡咯羧酸和4-氨基-2-羰基嘧啶。
4.一种如权利要求1所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将层析基质抽干后，加入0.5-1.5倍层析基质质量的20％v/v二氧六环、0.3-1.6倍层析基质质量的一缩二乙二醇双缩水甘油醚和0.3-0.7倍层析基质质量的氢氧化钠，40℃搅拌反应10-20小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；
2)将活化层析基质和0.1-0.5倍层析基质质量的3-吡咯羧酸以及0.1-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠溶液混合，在50℃下搅拌反应8-16小时，得到3-吡咯羧酸偶联的介质；
3)取3-吡咯羧酸偶联的介质，分别用体积百分比为30％、70％和100％的乙醇溶液清洗，再用二甲基甲酰胺清洗，加入0.6-1.5倍层析基质质量的二甲基甲酰胺、2-氨基-1,3,5-三嗪和N,N-二环己基碳酰亚胺，50℃振荡10-20小时，得到2-氨基-1,3,5-三嗪活化的介质；
4)取2-氨基-1,3,5-三嗪活化的介质，依次用体积百分比为60％和40％的丁酮溶液清洗，去离子水洗涤，加入2-5倍层析基质质量的10mg/ml4-氨基-2-羰基嘧啶溶液，30℃下200rpm水浴摇床中反应12-36小时；最后将介质抽滤，去离子水洗涤，得到具有3-吡咯羧酸和4-氨基-2-羰基嘧啶双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质。
5.如权利要求4所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其特征在于，所述其配基密度为50-150mol/ml。
6.如权利要求4所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其特征在于，所述2-氨基-1,3,5-三嗪浓度为0.1-0.5g/ml，N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.6-1g/ml。
CN201711276392.4A 2017-12-06 2017-12-06 具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法 Active CN107876017B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711276392.4A CN107876017B (zh) 2017-12-06 2017-12-06 具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711276392.4A CN107876017B (zh) 2017-12-06 2017-12-06 具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107876017A true CN107876017A (zh) 2018-04-06
CN107876017B CN107876017B (zh) 2020-06-19

Family

ID=61773199

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711276392.4A Active CN107876017B (zh) 2017-12-06 2017-12-06 具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107876017B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109096412A (zh) * 2018-07-26 2018-12-28 武汉汇研生物科技股份有限公司 一种氨基层析介质及其制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101003017A (zh) * 2006-01-20 2007-07-25 中国科学院过程工程研究所 一种琼脂糖疏水层析介质及其在纯化酵母表达HBsAg中的应用
CN102241791A (zh) * 2011-05-16 2011-11-16 江南大学 一种琼脂糖凝胶的n-羟基丁二酰亚胺修饰方法
CN103055825A (zh) * 2013-01-21 2013-04-24 江南大学 肌氨酸氧化酶亲和介质及其合成和纯化肌氨酸氧化酶的方法
WO2013187512A1 (ja) * 2012-06-15 2013-12-19 旭化成メディカル株式会社 アルカリ耐性を有するイオン交換温度応答性吸着材、及びその製造方法
CN103506079A (zh) * 2012-06-19 2014-01-15 汪志友 一种用于分离纯化抗体的介质及其制备方法
CN104117345A (zh) * 2014-05-13 2014-10-29 浙江大学 具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101003017A (zh) * 2006-01-20 2007-07-25 中国科学院过程工程研究所 一种琼脂糖疏水层析介质及其在纯化酵母表达HBsAg中的应用
CN102241791A (zh) * 2011-05-16 2011-11-16 江南大学 一种琼脂糖凝胶的n-羟基丁二酰亚胺修饰方法
WO2013187512A1 (ja) * 2012-06-15 2013-12-19 旭化成メディカル株式会社 アルカリ耐性を有するイオン交換温度応答性吸着材、及びその製造方法
CN103506079A (zh) * 2012-06-19 2014-01-15 汪志友 一种用于分离纯化抗体的介质及其制备方法
CN103055825A (zh) * 2013-01-21 2013-04-24 江南大学 肌氨酸氧化酶亲和介质及其合成和纯化肌氨酸氧化酶的方法
CN104117345A (zh) * 2014-05-13 2014-10-29 浙江大学 具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109096412A (zh) * 2018-07-26 2018-12-28 武汉汇研生物科技股份有限公司 一种氨基层析介质及其制备方法
CN109096412B (zh) * 2018-07-26 2021-10-22 武汉汇研生物科技股份有限公司 一种氨基层析介质及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN107876017B (zh) 2020-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2701695C2 (ru) Мутантные иммуноглобулин-связывающие полипептиды
JP5064225B2 (ja) 抗体精製法
JPH0214325B2 (zh)
CN103269762A (zh) 亲和色谱基质
CN104117345B (zh) 具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法
CN107108701A (zh) 修饰的κ轻链‑结合多肽
TW201204742A (en) Apparatus and process for purification of proteins
CN101185880B (zh) 一种用于抗体清除的血液净化吸附剂及其制备方法
CN107243336B (zh) 一种层析介质及其制备方法和应用
CN109071613A (zh) 分离基质
Naik et al. AbSep—An amino acid based pseudobioaffinity adsorbent for the purification of immunoglobulin G
CN107876017A (zh) 具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质
Hao et al. Rapid and high-capacity loading of IgG monoclonal antibodies by polymer brush and peptides functionalized microspheres
JP2015083558A (ja) 抗体吸着剤ならびにそれを用いた抗体の精製方法および識別方法
CN101185881B (zh) 用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质及其制备方法
CN108059673B (zh) 一种人血清中分离免疫球蛋白IgG的方法
CN107983310A (zh) 具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质
CN107999035A (zh) 以色胺为功能配基的层析介质
WO2019127686A1 (zh) 组合型配基、组合型仿生层析介质及其制备方法和应用
CN113845585A (zh) 使用金属螯合色谱法去除重组人生长激素内毒素的方法
CN101279244B (zh) 一种疏水性电荷诱导型亲硫扩张吸附床介质及其制备方法
CN109772269A (zh) 一种内毒素吸附剂及其制备方法和用途
Khodwe et al. Purification of arginine by ion-exchange chromatographic from cottonseed de-oiled cake
CN108905980A (zh) 一种以苯丙氨酸—酪氨酸—组氨酸—谷氨酸为功能配基的四肽层析介质及其应用
CN107803187B (zh) 以四肽胃泌素为功能配基的亲和层析介质

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant