CN104117345B

CN104117345B - 具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法

Info

Publication number: CN104117345B
Application number: CN201410198979.8A
Authority: CN
Inventors: 林东强; 童红飞; 姚善泾
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-05-13
Filing date: 2014-05-13
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2034-05-13
Also published as: CN104117345A

Abstract

本发明公开了一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法。层析基质依次加入二甲基亚砜和烯丙基溴进行活化；活化基质与N‑溴代丁二酰亚胺反应；将溴代醇化后的基质与色氨酸溶液混合，偶联色氨酸配基；依次用丙酮和二氧六环洗涤，并对色氨酸配基的羧基末端进行活化；活化后依次用丙酮溶液和水洗涤，加入氨基苯并咪唑溶液反应，偶联氨基苯并咪唑配基；最后采用乙醇胺水溶液对未反应的羧基末端进行封闭。本发明所研制的新型层析介质，兼有色氨酸和氨基苯并咪唑两种功能配基，模仿抗体Fc片段特异性结合蛋白的关键位点残基设计，在保留疏水性电荷诱导层析配基的特点上，对抗体的选择性有大幅度提高，可以用于抗体的高效分离。

Description

具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。

背景技术

随着现代生物技术的迅速发展，对生物分离方法也提出了新的要求，越来越多的生物产品需要高效的生物下游技术进行分离和纯化，其中层析技术是目前最有效的生物分离和纯化技术，而层析介质是其中的关键。

抗体是一种重要的生物技术产品，广泛用于疾病治疗、预防和诊断。随着抗体工程的发展，通过免疫方法制备多克隆抗体和动物细胞培养制备单克隆抗体的技术已经越来越成熟，抗体种类不断增多，制备规模也不断扩大，这就要求有高效的抗体分离纯化技术与之相适应。

抗体产品的质量要求通常较高，纯度一般大于90%，同时要求保持生物活性等，传统的分离技术常难以满足要求。常规的离子交换层析和疏水相互作用层析能够分离抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤较多，影响抗体纯度和活性收率。基于蛋白A或蛋白G的亲和层析，是目前抗体分离的通用技术，选择性高，但介质价格昂贵，且蛋白配基易被料液中蛋白酶降解而脱落，增加后续分离的负担，重复使用次数有限，因此操作成本较高，限制其大规模应用。

上世纪80年代Porath等提出了含有砜基和巯基乙醇的亲硫层析（Porath et al. FEBS letters, 1985, 185: 306）用于抗体的分离，但是需要添加无机盐以促进吸附。1998年，Burton和Harding提出了疏水性电荷诱导层析（Hydrophobic charge induction chromatography, HCIC）新方法，配基兼有疏水和离子化基团，中性pH条件下通过疏水作用结合蛋白，调节溶液pH使得蛋白和配基间产生静电排斥，从而实现洗脱（Burton and Harding, J. Chromatogr. A, 1998, 814: 71）。专利（US Patent 5,652,348）描述了HCIC 介质的制备方法。专利（US Patent 5,719,269；US Patent 7,144,743）也报导了HCIC 介质的制备工艺。专利（CN101279243；CN101279244；CN101284224）报道了在HCIC介质空间臂中引入砜基来提高介质对抗体的选择性以及相关制备方法。这些HCIC介质主要采用含巯基的杂环化合物为配基，其功能基团相对单一，抗体的选择性有限，难以满足从复杂料液中直接分离高纯度抗体的要求。因此，优化设计配基结构，开发特异性更强的HCIC介质，对于抗体的经济高效分离有着重要的意义。

本发明在分析抗体Fc片段特异性结合天然配基的基础上，提出双功能基团的概念，设计了基于色氨酸和氨基苯并咪唑的新配基，偶联到多孔微球基质上，制备了新型的疏水性电荷诱导层析介质，改善了疏水基团的空间排布，提高了抗体结合的选择性，有效增强了pH诱导的静电排斥作用，有利于抗体的高效洗脱，新介质显示出良好的抗体分离应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法。

具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质包括层析基质和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，所述的配基为色氨酸的羧基和氨基苯并咪唑的氨基反应后形成的双功能配基，所述的氨基苯并咪唑为2-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑或5-氨基苯并咪唑。

当氨基苯并咪唑为2-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：

，

当氨基苯并咪唑为4-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：

，

当氨基苯并咪唑为5-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：

。

所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球。

所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。

所述的配基为经烯丙基溴活化后依次偶联的色氨酸和氨基苯并咪唑。

所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法包括如下步骤：

1）将层析基质抽干后，加入0.2-1倍层析基质质量的20%（v/v）二甲基亚砜、0.1-1倍层析基质质量的烯丙基溴和0.1-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8-48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；

2）将活化层析基质和0.1-0.5倍层析基质质量的N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1-5小时，抽滤，用去离子水洗涤得到溴代醇化的层析基质；

3）将溴代醇化的层析基质和0.1-0.3倍层析基质质量的色氨酸以及0.5-1M碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的pH为10-12，25℃下150rpm摇床中反应8-24小时，得到色氨酸偶联的介质；

4）取色氨酸偶联的介质，分别用体积百分比为 30%、70%和100%的丙酮溶液清洗，再用二氧六环清洗，加入0.1-1倍层析基质质量的二氧六环、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.1-0.5g/ml，N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.1-0.5g/ml，25℃振荡8-24小时，得到N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质；

5）取N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质，依次用体积百分比为70%和30%的丙酮溶液清洗，去离子水洗涤，加入0.5-2倍层析基质质量的20mg/ml氨基苯并咪唑溶液，25℃下150 rpm水浴摇床中反应8-24小时；最后将介质抽滤，去离子水洗涤，加入到含有1-5倍层析基质质量的乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2-8小时，去离子水洗涤，得到具有色氨酸和氨基苯并咪唑双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质，其配基密度为30-100μmol/ml。

本发明以色氨酸和氨基苯并咪唑为双功能配基制备新型的疏水性电荷诱导层析介质，既保留了传统疏水性电荷诱导层析的优点，又通过仿生学模仿抗体Fc片段特异性结合天然配基关键残基的空间分布，引入双功能基团的概念，优化配基的空间排布，提高抗体结合的选择性，因此具有独特的分离性能。主要特点体现在：首先，抗体吸附量大，特异性高，静态吸附容量可达100mg/ml介质以上，且在较宽的电导率范围（0-100mS/cm）都能保持高吸附容量，显示出非盐依赖的吸附特性，无需对料液进行稀释或加盐处理；其次，仅需调节溶液pH至4-6，借助配基-蛋白间的静电排斥力，就可实现蛋白的快速洗脱；其三，采用烯丙基溴活化偶联色氨酸，并通过酰胺键与氨基苯并咪唑进一步偶联，所得介质性能稳定，清洗再生方便。本发明的关键在于引入了色氨基侧链吲哚基团，与氨基苯并咪唑配基形成空间互补，赋予了新介质独特的双功能基团分布，大大改善了传统单一基团结合选择性有限的缺点，提高了抗体结合的选择性，显示出良好的抗体分离应用前景。

附图说明

图1是实施例1中的层析基质和偶联2-氨基苯并咪唑的层析介质的红外谱图，其中743.1cm^-1为N-H的伸缩峰，1463.2和1638.2 cm^-1为苯环基团的特征峰，表明配基成功偶联；

图2是采用实施例1所得到的层析介质从单克隆抗体细胞培养上清液中分离纯化抗体的电泳分析图，其中洗脱1和洗脱2分别是pH5和pH4.5洗脱得到的抗体样品。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

实施例1

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入2g 20%（v/v）二甲基亚砜、1g烯丙基溴和1g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化的层析基质、1g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代醇化的层析基质和1g 色氨酸以及pH为10的0.5M碳酸钠缓冲液混合，25℃下150rpm摇床中反应8小时，得到色氨酸偶联的介质；取色氨酸偶联后的介质，分别用30%、70%和100%丙酮溶液洗涤，再用100%二氧六环清洗并抽干，加入1g的二氧六环、一定量的N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳酰亚胺，使得其中N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.1g/ml和N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.1g/ml，25℃振荡8小时；取N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质依次用70%和30%丙酮溶液洗涤，然后用大量去离子水清洗干净，加入5g的20mg/ml 2-氨基苯并咪唑溶液，25℃下150 rpm水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到10g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以色氨酸和2-氨基苯并咪唑为双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质，配基密度约为30μmol/ml。

实施例2

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入10g 20%（v/v）二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化的层析基质、5g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代醇化的层析基质和3g 色氨酸以及pH为12的1M碳酸钠缓冲液混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时，得到色氨酸偶联的介质；取色氨酸偶联后的介质，分别用 30%、70%和100%丙酮溶液洗涤，再用100%二氧六环清洗并抽干，加入10g的二氧六环、一定量的N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳酰亚胺，使得其中N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.5g/ml和N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.5g/ml，25℃振荡24小时；取N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质依次用70%和30%丙酮溶液洗涤，然后用大量去离子水清洗干净，加入20g的20mg/ml 2-氨基苯并咪唑溶液，25℃下150 rpm水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到50g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应8小时，去离子水洗涤，得到以色氨酸和2-氨基苯并咪唑为双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质，配基密度约为100μmol/ml。

实施例3

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入2g 20%（v/v）二甲基亚砜、1g烯丙基溴和1g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化的层析基质、1g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代醇化的层析基质和1g 色氨酸以及pH为10的0.5M碳酸钠缓冲液混合，25℃下150rpm摇床中反应8小时，得到色氨酸偶联的介质；取色氨酸偶联后的介质，分别用 30%、70%和100%丙酮溶液洗涤，再用100%二氧六环清洗并抽干，加入1g的二氧六环、一定量的N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳酰亚胺，使得其中NHS浓度为0.1g/ml和N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.1g/ml，25℃振荡8小时；取N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质依次用70%和30%丙酮溶液洗涤，然后用大量去离子水清洗干净，加入5g的20mg/ml 4-氨基苯并咪唑溶液，25℃下150 rpm水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到10ml乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以色氨酸和4-氨基苯并咪唑为双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质，配基密度约为30μmol/ml。

实施例4

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入10g 20%（v/v）二甲基亚砜、10gl烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化的层析基质、5g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代醇化的层析基质和3g 色氨酸以及pH为12的1M碳酸钠缓冲液混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时，得到色氨酸偶联的介质；取色氨酸偶联后的介质，分别用 30%、70%和100%丙酮溶液洗涤，再用100%二氧六环清洗并抽干，加入10g的二氧六环、一定量的N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳酰亚胺，使得其中N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.5g/ml和N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.5g/ml，25℃振荡24小时；取N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质依次用70%和30%丙酮溶液洗涤，然后用大量去离子水清洗干净，加入20g的20mg/ml 4-氨基苯并咪唑溶液，25℃下150 rpm水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到50g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应8小时，去离子水洗涤，得到以色氨酸和4-氨基苯并咪唑为双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质，配基密度约为100μmol/ml。

实施例5

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入2g 20%（v/v）二甲基亚砜、1g烯丙基溴和1g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化的层析基质、1g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代醇化的基质和1g 色氨酸以及pH为10的0.5M碳酸钠缓冲液混合，25℃下150rpm摇床中反应8小时，得到色氨酸偶联的介质；取色氨酸偶联后的介质，分别用 30%、70%和100%丙酮溶液洗涤，再用100%二氧六环清洗并抽干，加入1g的二氧六环、一定量的N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳酰亚胺，使得其中N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.1g/ml和N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.1g/ml，25℃振荡8小时；取N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质依次用70%和30%丙酮溶液洗涤，然后用大量去离子水清洗干净，加入5g的20mg/ml 5-氨基苯并咪唑溶液，25℃下150 rpm水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到10g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以色氨酸和5-氨基苯并咪唑为双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质，配基密度约为30μmol/ml。

实施例6

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入10g 20%（v/v）二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化的层析基质、5g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代醇化的层析基质和3g 色氨酸以及pH为12的1M碳酸钠缓冲液混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时，得到色氨酸偶联的介质；取色氨酸偶联后的介质，分别用 30%、70%和100%丙酮溶液洗涤，再用100%二氧六环清洗并抽干，加入10g的二氧六环、一定量的N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳酰亚胺，使得其中N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.5g/ml和N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.5g/ml，25℃振荡24小时；取N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质依次用70%和30%丙酮溶液洗涤，然后用大量去离子水清洗干净，加入20g的20mg/ml 5-氨基苯并咪唑溶液，25℃下150 rpm水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到50g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应8小时，去离子水洗涤，得到以色氨酸和5-氨基苯并咪唑为双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质，配基密度约为100μmol/ml。

实施例7

取抽干琼脂糖凝胶10g，加入5g 20%（v/v）二甲基亚砜、5g烯丙基溴和2.5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化16小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化的层析基质、2g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应4小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代醇化的层析基质和2g 色氨酸以及pH为12的0.5M碳酸钠缓冲液混合，25℃下150rpm摇床中反应20小时，得到色氨酸偶联的介质；取色氨酸偶联后的介质，分别用 30%、70%和100%丙酮溶液洗涤，再用100%二氧六环清洗并抽干，加入5g的二氧六环、一定量的N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳酰亚胺，使得其中N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.3g/ml和N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.3g/ml，25℃振荡8小时；取N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质依次用70%和30%丙酮溶液洗涤，然后用大量去离子水清洗干净，加入10g的20mg/ml 2-氨基苯并咪唑溶液，25℃下150 rpm水浴摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到5g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应4小时，去离子水洗涤，得到以色氨酸和2-氨基苯并咪唑为双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质，配基密度约为60μmol/ml。

实施例8

取抽干纤维素微球10g，加入6g 20%（v/v）二甲基亚砜、5g烯丙基溴和2.5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化24小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化的层析基质、5g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代醇化的层析基质和2g 色氨酸以及pH为11的1M碳酸钠缓冲液混合，25℃下150rpm摇床中反应16小时，得到偶联色氨酸的介质；取色氨酸偶联后的介质，分别用 30%、70%和100%丙酮溶液洗涤，再用100%二氧六环清洗并抽干，加入8g的二氧六环、一定量的N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳酰亚胺，使得其中N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.2g/ml和N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.3g/ml，25℃振荡24小时；取N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质依次用70%和30%丙酮溶液洗涤，然后用大量去离子水清洗干净，加入15g的20mg/ml 2-氨基苯并咪唑溶液，25℃下150 rpm水浴摇床中反应10小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到8g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以色氨酸和2-氨基苯并咪唑为双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质，配基密度约为75μmol/ml。

实施例9

取抽干纤维素微球10g，加入6g 20%（v/v）二甲基亚砜、5g烯丙基溴和4g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化24小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化的层析基质；然后将活化的层析基质、3g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应4小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代醇化的层析基质和1g 色氨酸以及0.5M碳酸钠缓冲液（pH11）混合，25℃下150rpm摇床中反应15小时，得到色氨酸偶联的介质；取色氨酸偶联后的介质，分别用 30%、70%和100%丙酮溶液洗涤，再用100%二氧六环清洗并抽干，加入10g的二氧六环、一定量的N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳酰亚胺，使得其中N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.3g/ml和N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.3g/ml，25℃振荡6小时；取N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质依次用70%和30%丙酮溶液洗涤，然后用大量去离子水清洗干净，加入12g的20mg/ml 5-氨基苯并咪唑溶液，25℃下150 rpm水浴摇床中反应16小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到10g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应8小时，去离子水洗涤，得到以色氨酸和5-氨基苯并咪唑为双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质，配基密度约为50μmol/ml。

Claims

1.一种具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其特征在于包括层析基质和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，所述的配基为色氨酸的羧基和氨基苯并咪唑的氨基反应后形成的双功能配基，所述的氨基苯并咪唑为4-氨基苯并咪唑或5-氨基苯并咪唑，当氨基苯并咪唑为4-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：

2.根据权利要求1所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其特征在于所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球。

3.根据权利要求1或2所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其特征在于层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。

4.根据权利要求1所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质，其特征在于所述的配基为经烯丙基溴活化后依次偶联的色氨酸和氨基苯并咪唑。

5.一种如权利要求1所述的具有双功能基团的疏水性电荷诱导层析介质的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将层析基质抽干后，加入0.2-1倍层析基质质量的20％v/v二甲基亚砜、0.1-1倍层析基质质量的烯丙基溴和0.1-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8-48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；

2)将活化层析基质和0.1-0.5倍层析基质质量的N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1-5小时，抽滤，用去离子水洗涤得到溴代醇化的层析基质；

3)将溴代醇化的层析基质和0.1-0.3倍层析基质质量的色氨酸以及0.5-1M碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的pH为10-12，25℃下150rpm摇床中反应8-24小时，得到色氨酸偶联的介质；

4)取色氨酸偶联的介质，分别用体积百分比为30％、70％和100％的丙酮溶液清洗，再用二氧六环清洗，加入0.1-1倍层析基质质量的二氧六环、N-羟基琥珀酰亚胺和N,N-二环己基碳酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.1-0.5g/ml，N,N-二环己基碳酰亚胺浓度为0.1-0.5g/ml，25℃振荡8-24小时，得到N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质；

5)取N-羟基琥珀酰亚胺活化的介质，依次用体积百分比为70％和30％的丙酮溶液清洗，去离子水洗涤，加入0.5-2倍层析基质质量的20mg/ml氨基苯并咪唑溶液，25℃下150rpm水浴摇床中反应8-24小时；最后将介质抽滤，去离子水洗涤，加入到含有1-5倍层析基质质量的乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2-8小时，去离子水洗涤，得到具有色氨酸和氨基苯并咪唑双功能配基的疏水性电荷诱导层析介质，其配基密度为30-100μmol/ml。