CN111672486B - 以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质及其应用。以亲水性多孔微球为层析基质，层析基质中依次加入二甲基亚砜和烯丙基溴进行活化；活化的层析基质与N‑溴代丁二酰亚胺反应，进行溴代醇化；将溴代醇化后的层析基质偶联氨基苯(磺)酰胺吡啶配基；最后采用乙醇胺水溶液对未反应的溴代醇化末端进行封闭，得到以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能基团的混合模式层析介质。本发明的新型层析介质可结合IgG型广谱抗体分子，具有抗体吸附容量大、选择性高、非盐依赖吸附的特性，通过改变溶液pH至弱酸性即可实现解吸和回收，制备过程简便，价格低廉，可以用于层析分离广谱的IgG型抗体，包括血液中多克隆抗体和细胞表达的单克隆抗体药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质及其应用，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。
背景技术
抗体产品往往纯度要求较高，同时还必须保持生物活性，因此传统的分离过程往往难以满足要求。蛋白A或蛋白G亲和层析介质能够特异性结合抗体的保守区域，具有广谱的抗体分离能力，但蛋白类亲和配基易被料液中蛋白酶降解脱落，重复使用次数低，洗脱较困难，介质价格昂贵，使用成本极高，限制了规模化应用。传统的离子交换层析和疏水相互作用层析等方法虽然能够结合抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，纯化效果有限。因此，开发具有抗体保守区域结合选择性的非蛋白类配基很重要。
目前报道的针对抗体分离的非蛋白配基较多，有仿生亲和配基Ligand 22/8(J.Chromatogr. B 2000，740：1)、多肽配基TG19318(J.Mol.Recognit.1998，11：128)、D2AAG(J.Chromatogr. A 2012，1225：158)和HWRGWV(J.Chromatogr.A 2009，1216：910)等。这些配基往往过于关注特异性和亲和力，造成抗体洗脱条件较为苛刻或者收率较低。混合模式层析是一种新型的生物分离技术，配基兼有多种功能基团，可以与目标蛋白产生疏水和静电等多种相互作用。混合模式介质的配基密度通常较高，吸附容量大，具有耐盐吸附特性，洗脱条件温和，特别适合于大规模的分离纯化，已在抗体等蛋白的分离纯化中得到应用。专利US 8,129,508 B2 和AU 2012351751B2利用以巯乙基吡啶为配基的混合模式介质MEP HyperCel，从细胞培养液中分重组蛋白或者抗体。专利US 20050272917A1利用MEPHyperCel从人或牛血浆中分离免疫球蛋白G，纯化得到IgG可用于研究、诊断或疾病治疗等领域。专利CN 101284224B、专利CN101279244B、CN101279243B、CN104096544B分别公开了以巯乙基吡啶、巯甲基咪唑、巯基苯并咪唑、氨基苯并咪唑为配基的吸附介质及其制备方法。Luo等(J.Chromatogr.A, 2018,1533:77)采用填充有ABI-4FF和MMI-4FF介质的两步层析，分离血清中IgM，但是少量HSA也会结合到层析介质，影响分离抗体的纯度。Wang等(J.Chromatogr.B,2013,936: 33)采用混合模式介质Bestarose Diamond MMA、BestaroseDiamond MMC、MEP HyperCel 和PPA HyperCel介质从模拟血清中分离IgG，其中BestaroseDiamond MMA介质同时吸附IgG 和HSA，吸附选择性差；Bestarose Diamond MMC和PPAHyperCel介质存在抗体洗脱困难，不利于实际分离应用；MEP HyperCel介质主要吸附IgG，但仍结合少量HSA，IgG的选择性一般。因此，开发性能更优良的混合模式介质，对于抗体的大规模分离纯化有着重要的意义。
混合模式层析的关键是特殊设计的、组合多种相互作用的功能配基，针对广谱的IgG型抗体分离，筛选吡啶类、咪唑类、吲哚类和多芳香环类等小分子化合物配基库，进行了配基和IgG亲和性表征，发现氨基苯磺酰胺吡啶和氨基苯酰胺吡啶类化合物可结合于IgG分子的保守区域，对IgG亲和性高、选择性强、耐盐性好，是潜在的、具有广谱抗体分离能力的新型混合模式配基。
发明内容
本发明的目的是提供一种以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质及其应用。
以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质包括层析基质和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，配基为经烯丙基溴活化后偶联的氨基苯(磺)酰胺吡啶，所述的氨基苯(磺)酰胺吡啶为4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺、3-氨基-N-吡啶-3-甲基苯磺酰胺、 4-氨基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺或3-氨基-N-(3-吡啶甲基)苯甲酰胺中的一种。
当氨基苯(磺)酰胺吡啶为4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺时，层析介质的结构组成为：
当氨基苯(磺)酰胺吡啶为3-氨基-N-吡啶-3-甲基苯磺酰胺时，层析介质的结构组成为：
当氨基苯(磺)酰胺吡啶为4-氨基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺，层析介质的结构组成为：
当氨基苯(磺)酰胺吡啶为3-氨基-N-(3-吡啶甲基)苯甲酰胺时，层析介质的结构组成为：
所述的层析介质的结构组成中仅给出了层析基质和一个配基分子结构，仅仅是示例说明，层析基质的表面和内部孔道表面具有大量的配基分子。
所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球，结构式如下：
结构式仅给出一个-OH，仅仅是示例性说明，其表面具有大量的-OH。
所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。
所述的层析介质的配基密度为40-150μmol/ml。
所述的层析介质可用于分离广谱的IgG型抗体。
所述的层析介质可用于人血清中分离多克隆IgG。
所述的层析介质可用于细胞培养液中分离单克隆抗体。
所述的以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质的制备方法包括如下步骤：
1)将层析基质抽干后，加入0.2-1倍层析基质质量的20％(v/v)二甲基亚砜、0.1-1倍层析基质质量的烯丙基溴和0.1-0.5倍层析基质质量的氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化 8-48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；
2)将活化层析基质和0.1-0.5倍层析基质质量的N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1-5小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的基质；
3)将溴代醇化的基质和0.1-0.3倍层析基质质量的氨基苯(磺)酰胺吡啶以及0.5-1M碳酸钠缓冲液混碳酸钠缓冲液的pH为10-12，25℃下150rpm摇床中反应8-48小时，得到氨基苯(磺)酰胺吡啶偶联后的介质；
4)将氨基苯(磺)酰胺吡啶偶联后的介质抽滤，去离子水洗涤，加入到含有1-5倍层析基质质量的乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2-8小时，去离子水洗涤，得到以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的疏水性电荷诱导层析介质。
本发明研制的以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质，可以用于混合模式层析分离广谱的IgG型抗体，具有以下优点：(1)抗体吸附容量大，不同类型的IgG抗体均可结合，处理能力强，hIgG静态吸附容量可达140mg/ml湿介质；(2)抗体吸附选择性强，对其它蛋白(如人血白蛋白)吸附容量低，分离效果好；(3)吸附过程受盐浓度影响小，在很宽的电导率范围(0-150mS/cm)内，吸附容量基本保持不变，无需对料液进行稀释或加盐处理，可以直接从料液中捕获蛋白，简化分离步骤；(4)洗脱方便，只需调节洗脱液pH至4附近，就可实现完全洗脱，避免过酸、过碱或高盐等对蛋白结构和活性产生不利影响；(5)配基密度高，电荷诱导效应强，通过配基上的伯氨基位点偶联配基，偶联效率高，且该氨基位点也可质子化，可提供辅助的静电排斥作用；(6)介质性质稳定，采用烯丙基溴活化并偶联配基，所得介质的配基稳定，清洗再生方便。本发明所研制的新型混合模式层析介质，以氨基苯(磺) 酰胺吡啶为功能配基，具有显著的混合模式吸附蛋白和层析分离特点，对广谱的IgG型抗体具有很高的吸附能力和选择性，可以用于不同类型抗体的规模化制备，包括血液中多克隆抗体和细胞表达的单克隆抗体药物。
附图说明
图1是实施例2中偶联4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺的层析介质吸附人血来源多克隆IgG 的结合载量分布图。
图2是实施例2中偶联4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺的层析介质吸附人血来源人血白蛋白的结合载量分布图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入2g 20％(v/v)二甲基亚砜、1g烯丙基溴和1g氢氧化钠， 25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、 1g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和2g 4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺以及1M碳酸钠缓冲(pH12) 混合，25℃下150rpm摇床中反应48小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到10g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应12小时，去离子水洗涤，得到以4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为40μmol/ml。
实施例2
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入10g 20％(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应5小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和6g 4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺以及0.5M碳酸钠缓冲(pH 10)混合，25℃下150rpm摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到50g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应48小时，去离子水洗涤，得到以4-氨基-N-(2- 吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为150μmol/ml。在不同pH和NaCl浓度下，测定了介质对人血来源的多克隆免疫球蛋白IgG和人血白蛋白的结合载量，载量分布图分别见图1和图2，横坐标为pH，纵坐标为NaCl浓度，图中颜色和数值代表结合载量，载量单位为mg/ml介质。从图1可以发现，在pH 5.5～9.0和0～500mM NaCl浓度范围内，IgG结合载量均大于120mg/ml介质，最高达到140mg/ml介质，IgG吸附容量大，且对不同类型IgG 均能结合，具有良好的广谱抗体结合能力；0～500mM NaCl范围内，吸附容量基本保持不变，说明IgG吸附过程受盐浓度影响小。从图2可以发现，在pH 5.5～9.0和0～500mM NaCl浓度范围内，人血白蛋白的结合载量均小于40mg/ml介质，说明介质吸附蛋白选择性强，对人血白蛋白结合弱，而对IgG结合能力强，可用于从人血中选择性分离多克隆的免疫球蛋白IgG。
实施例3
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入10g 20％(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和4g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化10小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和5g 4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺以及0.5M碳酸钠缓冲(pH 12)混合，25℃下150rpm摇床中反应16小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到5g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应4小时，去离子水洗涤，得到以4-氨基-N-(2- 吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为95μmol/ml。
实施例4
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入1g 20％(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和1g氢氧化钠， 25℃下150rpm摇床中活化10小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、 5g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和2g 3-氨基-N-吡啶-3-甲基苯磺酰胺以及0.5M碳酸钠缓冲(pH 10)混合，25℃下150rpm摇床中反应16小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到25g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应5小时，去离子水洗涤，得到以3-氨基-N-吡啶-3-甲基苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为85μmol/ml。
实施例5
取抽干琼脂糖凝胶10g，加入5g 20％(v/v)二甲基亚砜、5g烯丙基溴和2.5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化24小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、2g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应4小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和4g 3-氨基-N-吡啶-3-甲基苯磺酰胺以及1M碳酸钠缓冲(pH 10)混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到25g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应4小时，去离子水洗涤，得到以3-氨基-N- 吡啶-3-甲基苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为80μmol/ml。
实施例6
取抽干纤维素微球10g，加入10g 20％(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和6g 4-氨基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺以及0.5M碳酸钠缓冲(pH 10)混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到50g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以4-氨基-N-(2- 吡啶基)苯甲酰胺为配基的层析介质，配基密度为150μmol/ml。
实施例7
取抽干纤维素微球10g，加入2g 20％(v/v)二甲基亚砜、1g烯丙基溴和1g氢氧化钠， 25℃下150rpm摇床中活化48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、 1g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应5小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和1g 3-氨基-N-(3-吡啶甲基)苯甲酰胺以及1M碳酸钠缓冲(pH 12)混合，25℃下150rpm摇床中反应24小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到10g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应8小时，去离子水洗涤，得到以3-氨基-N-(3-吡啶甲基)苯甲酰胺为配基的层析介质，配基密度为40μmol/ml。
实施例8
取抽干纤维素微球10g，加入10g 20％(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和5g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化8小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和6g 3-氨基-N-(3-吡啶甲基)苯甲酰胺以及0.5M碳酸钠缓冲(pH10)混合，25℃下150rpm摇床中反应8小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到50g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以3-氨基-N-(3- 吡啶甲基)苯甲酰胺为配基的层析介质，配基密度为150μmol/ml。
实施例9
取抽干纤维素微球10g，加入8g 20％(v/v)二甲基亚砜、5g烯丙基溴和5g氢氧化钠， 25℃下150rpm摇床中活化24小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、3g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和4g 3-氨基-N-(3-吡啶甲基)苯甲酰胺以及1M碳酸钠缓冲(pH 11)混合，25℃下150rpm摇床中反应36小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到10g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应2小时，去离子水洗涤，得到以3-氨基-N-(3-吡啶甲基)苯甲酰胺为配基的层析介质，配基密度为100μmol/ml。
实施例10
取抽干纤维素微球10g，加入10g 20％(v/v)二甲基亚砜、10g烯丙基溴和4g氢氧化钠，25℃下150rpm摇床中活化10小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、5g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，25℃下150rpm摇床中反应1小时，抽滤，用去离子水洗涤；接着将溴代基质和6g 4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺以及0.5M碳酸钠缓冲(pH 12)混合，25℃下150rpm摇床中反应16小时；最后将介质抽滤，用去离子水洗涤，加入到5g乙醇胺中，25℃下150rpm摇床中反应4小时，去离子水洗涤，得到以4-氨基-N-(2- 吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，配基密度为95μmol/ml。
实施例11
采用实施例2制备的4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，进行人血清中分离纯化多克隆IgG。取1ml介质，装填于Tricorn 5/50层析柱，平衡缓冲液为20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4，添加0.15M NaCl)；人血清上样体积为0.5ml，线性流速为102cm/h，平衡缓冲液冲洗至UV响应接近于零；采用醋酸钠缓冲液(pH 4.0)进行洗脱，流速为1ml/min；0.1M NaOH溶液进行介质清洗和再生，流速为0.3mL/min，最后用平衡缓冲液进行再平衡。人血清料液中含非特异性免疫的多克隆IgG共18mg/ml，含人血白蛋白约60mg/ml。上样过程中，多克隆IgG被吸附，而人血白蛋白基本完全流穿，表明介质具有良好的抗体结合选择性；洗脱液中，hIgG纯度80％，收率约70％。结果表明，制备介质可以从复杂的人血清料液中高效分离多种类型的多克隆IgG，具备高效分离广谱IgG抗体的能力。
实施例12
采用实施例3制备的4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺为配基的层析介质，进行CHO细胞培养液中分离抗CD20单克隆抗体药物。取1ml介质，装填于Tricorn 5/50层析柱，平衡缓冲液为20mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4，添加0.15M NaCl)；CHO细胞培养液中含抗CD20单克隆抗体2mg/ml，上样体积为5ml，线性流速为100cm/h，平衡缓冲液冲洗至UV响应接近于零；采用醋酸钠缓冲液(pH 4.0)进行洗脱，流速为1ml/min；0.1M NaOH溶液进行介质清洗和再生，流速为0.3mL/min，最后用平衡缓冲液进行再平衡。上样过程中，抗CD20单克隆抗体被完全吸附，而杂质组分基本流穿，表明介质具有良好的抗体选择性和结合能力；洗脱液中，抗CD20单克隆抗体纯度达95％，收率约90％。结果表明，制备介质可以从动物细胞培养液中高效分离单克隆抗体，具备高效分离抗体药物的能力。
Claims (4)
1.一种以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质在分离广谱IgG型抗体中的应用，其特征在于，所述的层析介质包括层析基质和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，配基为经烯丙基溴活化后偶联的氨基苯(磺)酰胺吡啶，所述的氨基苯(磺)酰胺吡啶为4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺、3-氨基-N-吡啶-3-甲基苯磺酰胺、4-氨基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺或3-氨基-N-(3-吡啶甲基)苯甲酰胺中的一种；
当氨基苯(磺)酰胺吡啶为4-氨基-N-(2-吡啶基)苯磺酰胺时，层析介质的结构组成为：
当氨基苯(磺)酰胺吡啶为3-氨基-N-吡啶-3-甲基苯磺酰胺时，层析介质的结构组成为：
当氨基苯(磺)酰胺吡啶为4-氨基-N-(2-吡啶基)苯甲酰胺，层析介质的结构组成为：
当氨基苯(磺)酰胺吡啶为3-氨基-N-(3-吡啶甲基)苯甲酰胺时，层析介质的结构组成为：
2.根据权利要求1所述的以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质在分离广谱IgG型抗体中的应用，其特征在于所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球。
3.根据权利要求1所述的以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质在分离广谱IgG型抗体中的应用，其特征在于所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。
4.根据权利要求1所述的以氨基苯(磺)酰胺吡啶为功能配基的层析介质在分离广谱IgG型抗体中的应用，其特征在于所述的层析介质的配基密度为40-150μmol/ml。
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