CN107999035A - 以色胺为功能配基的层析介质 - Google Patents

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Abstract

本案涉及一种以色胺为功能配基的层析介质，包括层析基质和配基，所述的层析基质为亲水性多孔微球，配基为经溴乙酰溴活化后偶联的色胺。本发明抗体吸附容量大，饱和吸附容量可达140mg/ml湿介质，处理能力强；介质性质稳定，采用烯丙基溴活化并偶联配基，所得介质的配基稳定，清洗再生方便。

Description

以色胺为功能配基的层析介质
技术领域
本发明涉及以色胺为功能配基的层析介质，属于生物化工领域中的蛋白层析分离技术。
背景技术
亲和层析是利用生物分子间专一的亲和力而迸行分离的一种层析技术。人们很早就认识到蛋白质、酶等生物大分子物质能和某些相对应的分子专一而可逆的结合，可以用于对生物分子的分离纯化。具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素(或药物)与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配基的方法，所以在实验中没有广泛的应用。直到60年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现，解决了配基固定化的问题，使得亲和层析技术得到了快速的发展。亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，具有很高的分辨率，对分离含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。在生物分离中有广泛的应用。多肽配基在实际应用时，有些与抗体相互作用较强，需要酸性或碱性较强的条件才能洗脱，影响抗体活性；有些配基的耐盐结合能力较弱，料液需要稀释。因此，开发性能更优良的多肽配基亲和介质，缩短肽链长度，提高抗体吸附容量，且具有耐盐吸附特性，洗脱条件温和，对于抗体的规模化制备具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本案提供一种以精氨酸为功能配基的层析介质。
为实现上述目的，本案通过以下技术方案实现：
一种以色胺为功能配基的层析介质，其中，包括层析基质和配基，所述的层析基质为亲水性多孔微球，配基为经溴乙酰溴活化后偶联的色胺。
优选的是，所述的以色胺为功能配基的层析介质，其中，所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球。
优选的是，所述的以色胺为功能配基的层析介质，其中，所述的层析基质以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球为内核，在所述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球表面键合有纤维素分子。
优选的是，所述的以色胺为功能配基的层析介质，其中，所述的层析介质的配基密度为100-150μmol/ml。
以色胺为功能配基的层析介质的制备方法，其中，包括如下步骤：
1)将层析基质抽干后，加入0.2-1倍层析基质质量的体积百分比为25％的二甲基亚砜、0.5-1倍层析基质质量的溴乙酰溴和0.6-1倍层析基质质量的氢氧化钠，30℃下200rpm摇床中活化10-40小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；
2)将活化层析基质和0.3-0.7倍活化层析基质质量的N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下200rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的层析基质；
3)将溴代醇化的层析基质和0.8-1倍溴代醇化的层析基质质量的色胺以及0.5-1M碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的pH为10-12，25℃下200rpm摇床中反应8-24小时，得到色胺偶联后的介质；
4)将色胺偶联后的介质依次用N-甲基吡咯烷酮、无水乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸胺中，25℃下水浴摇床中反应3-5小时，去离子水洗涤，得到以精氨酸为功能基团的亲和层析介质。
本发明的有益效果是：
(1)抗体吸附容量大，饱和吸附容量可达140mg/ml湿介质，处理能力强。
(2)吸附过程不受盐影响，在很宽的电导率范围(60-100mS/cm)内，吸附容量基本保持不变，无需对料液进行稀释或加盐处理，可以直接捕获蛋白，减少了操作步骤；
(3)配基密度高，电荷诱导效应强，通过配基上的伯氨基位点偶联配基，偶联效率高，且该氨基位点也可质子化，可提供辅助的静电排斥作用；
(4)介质性质稳定，采用烯丙基溴活化并偶联配基，所得介质的配基稳定，清洗再生方便。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
取表面键合有纤维素分子的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯层析基质10g，加入10g体积百分比为25％的二甲基亚砜、5g溴乙酰溴和6g氢氧化钠，30℃下200rpm摇床中活化15小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；将活化层析基质和3g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下200rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的层析基质；将溴代醇化的层析基质和10g色胺以及0.5M碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的pH为10，25℃下200rpm摇床中反应10小时，得到精氨酸偶联后的介质；将色胺偶联后的介质依次用N-甲基吡咯烷酮、无水乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸胺中，25℃下水浴摇床中反应3小时，去离子水洗涤，得到以色胺为功能基团的亲和层析介质。配基密度为100μmol/ml。
实施例2
取表面键合有纤维素分子的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯层析基质10g，加入5g体积百分比为25％的二甲基亚砜、8g溴乙酰溴和6g氢氧化钠，30℃下200rpm摇床中活化25小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；将活化层析基质和3g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下200rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的层析基质；将溴代醇化的层析基质和10g色胺以及0.8M碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的pH为12，25℃下200rpm摇床中反应17小时，得到精氨酸偶联后的介质；将色胺偶联后的介质依次用N-甲基吡咯烷酮、无水乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸胺中，25℃下水浴摇床中反应5小时，去离子水洗涤，得到以色胺为功能基团的亲和层析介质。配基密度为110μmol/ml。
实施例3
取表面键合有纤维素分子的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯层析基质10g，加入6g体积百分比为25％的二甲基亚砜、8g溴乙酰溴和7g氢氧化钠，30℃下200rpm摇床中活化26小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；将活化层析基质和6g N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下200rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的层析基质；将溴代醇化的层析基质和10g色胺以及0.5-1M碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的pH为12，25℃下200rpm摇床中反应20小时，得到精氨酸偶联后的介质；将色胺偶联后的介质依次用N-甲基吡咯烷酮、无水乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸胺中，25℃下水浴摇床中反应5小时，去离子水洗涤，得到以色胺为功能基团的亲和层析介质。配基密度为110μmol/ml。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (5)

1.一种以色胺为功能配基的层析介质，其特征在于，包括层析基质和配基，所述的层析基质为亲水性多孔微球，配基为经溴乙酰溴活化后偶联的色胺。
2.如权利要求1所述的以色胺为功能配基的层析介质，其特征在于，所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球。
3.如权利要求1或2所述的以色胺为功能配基的层析介质，其特征在于，所述的层析基质以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球为内核，在所述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球表面键合有纤维素分子。
4.如权利要求1所述的以色胺为功能配基的层析介质，其特征在于，所述的层析介质的配基密度为100-150μmol/ml。
5.一种如权利要求1所述的以色胺为功能配基的层析介质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将层析基质抽干后，加入0.2-1倍层析基质质量的体积百分比为25％的二甲基亚砜、0.5-1倍层析基质质量的溴乙酰溴和0.6-1倍层析基质质量的氢氧化钠，30℃下200rpm摇床中活化10-40小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质；
2)将活化层析基质和0.3-0.7倍活化层析基质质量的N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇化，30℃下200rpm摇床中反应2小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的层析基质；
3)将溴代醇化的层析基质和0.8-1倍溴代醇化的层析基质质量的色胺以及0.5-1M碳酸钠缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的pH为10-12，25℃下200rpm摇床中反应8-24小时，得到精氨酸偶联后的介质；
4)将色胺偶联后的介质依次用N-甲基吡咯烷酮、无水乙醇和去离子水清洗，抽滤，加入到乙酸胺中，25℃下水浴摇床中反应3-5小时，去离子水洗涤，得到以色胺为功能基团的亲和层析介质。
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