CN101284224B - 以巯基乙基吡啶和砜基为配基分离抗体的扩张床吸附介质及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以巯基乙基吡啶和砜基为配基分离抗体的扩张床吸附介质及制备方法。介质组成中基质为纤维素/无机增重剂复合微球，配基为砜基和巯基乙基吡啶。采用反相悬浮热再生法，得到纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；混合抽干基质、二乙烯基砜、碳酸钠缓冲液和二甲基亚砜进行活化；混合抽干的活化基质、巯基乙基吡啶和含有过硫酸铵的氢氧化钠进行偶联，得到以巯基乙基吡啶和砜基为配基分离抗体的扩张床吸附介质。本发明所研制的新型扩张床吸附介质，通过引入砜基，提高巯基乙基吡啶配基对抗体的选择性，对抗体具有很好的吸附分离选择性，可以用于抗体的规模化制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种以巯基乙基吡啶和砜基为配基分离抗体的扩张床吸附介质及制备方法，属于层析分离中扩张床吸附分离蛋白质技术。
背景技术
生物下游技术是生物工业技术产业化中必不可少的重要环节，是生物产品的产量和品质的重要保证，合理设计和优化下游处理技术以及对过程和技术进行集成化，对于实现生物药物大规模生产具有重要的意义。
近年来，针对抗体的分离纯化新技术受到广泛关注。抗体产品往往纯度要求较高，同时还要尽可能保持生物活性，因此传统的分离过程难以满足要求。首先常规的离子交换层析和疏水相互作用层析能够结合抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，影响抗体的活性收率。若干亲和层析介质也能够选择性吸附抗体，但其中的配基易被料液中蛋白酶降解，重复使用次数低，且介质价格昂贵，且操作成本极高，限制了其大规模应用。1985年Porath等提出了含有砜基和巯基乙醇的亲硫色谱(Porath et al.FEBS letters，1985，185：306)用于抗体的分离，但是需要在一定的盐浓度下进行吸附。Boschetti等(Bioseparation 2000，9：211)提出了利用杂环配基与抗体的疏水作用进行吸附分离的新型层析分离技术，结合静电排斥协助洗脱，其专利(US Patent 5,652,348)描述了介质及其制备方法。专利(US Patent 5,719,269；US Patent 7,144,743)也报导了类似介质的制备工艺。其中以巯基乙基吡啶为配基的层析介质已经由Pall Biosepara公司商业化生产。但是这些介质均没有强调亲硫作用，特别是砜基对抗体结合的重要性，因此抗体选择性普遍不高。
扩张床吸附(Expanded Bed Adsorption，EBA)技术形成于20世纪90年代，是一种集固液分离、浓缩和初期纯化于一个操作单元之中的新型蛋白质分离纯化技术。EBA能直接从细胞培养液、细胞破碎液或者组织提取液中捕获目标产物，减少了操作单元数，缩短了处理时间，节约了生产成本，是近十几年来出现的一个新的单元操作，特别适合于生物活性物质的初级分离。因此，本发明将新型配基引入扩张床吸附，以纤维素/无机增重剂复合微球为载体，以巯基乙基吡啶和砜基作为配基，达到巯基乙基吡啶和砜基的协同作用，可以提高抗体结合的选择性，形成一种高效集成化的抗体分离新方法，有效促进抗体分离工艺的改进和分离纯化过程的集成化。
发明内容
本发明的目的是提供一种以巯基乙基吡啶和砜基为配基分离抗体的扩张床吸附介质及制备方法。
以巯基乙基吡啶和砜基为配基分离抗体的扩张床吸附介质：介质的组成中基质为纤维素/无机增重剂复合微球，配基为经二乙烯基砜活化后引入的砜基和偶联后的巯基乙基吡啶，结构组成为：
所述纤维素/无机增重剂复合微球的骨架为纤维素，增重剂为钛白粉、不锈钢粉、镍粉或碳化钨粉，增重剂占湿球的质量百分比含量为16％～61％；纤维素/无机增重剂复合微球的粒径为50～250μm。配基为巯基乙基吡啶，包括4-巯基乙基吡啶、3-巯基乙基吡啶、2-巯基乙基吡啶。配基密度为34～60μmol/ml介质。
以巯基乙基吡啶和砜基为配基分离抗体的扩张床吸附介质的制备方法：首先将纤维素粘胶和无机增重剂充分混合，无机增重剂在混合物中的质量百分含量为16％～61％，加入5倍纤维素粘胶质量的泵油，控制转速500～800rpm，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，筛选50～250μm粒径的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；其次将纤维素/无机增重剂复合微球、二乙烯基砜、0.2～0.5MpH12的碳酸钠缓冲液和二甲基亚砜混合，二乙烯基砜添加的体积量为纤维素/无机增重剂复合微球体积的18％～36％，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、3倍双键摩尔量的巯基乙基吡啶和含25mg/ml过硫酸铵的0.3～0.8M氢氧化钠溶液混合，60℃下180rpm摇床中偶联8小时；最后将微球抽滤，用去离子水洗涤，加入到含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到以巯基乙基吡啶和砜基为配基的扩张床吸附介质。反应过程示意图为：
本发明以巯基乙基吡啶和砜基作为功能配基，达到巯基乙基吡啶和砜基两种功能配基的协同作用，提高抗体结合的选择性，实现抗体的选择性吸附；同时新型配基偶联到纤维素/无机增重剂复合扩张床基质上，形成了新型的、以巯基乙基吡啶和砜基为配基的扩张床吸附介质，用于抗体的扩张床吸附分离，该技术未见任何报导。
附图说明
附图是本发明的介质(配基密度为60μmol/ml)吸附卵黄抗体和牛血清白蛋白的静态吸附等温线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
将50g纤维素粘胶和40g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的4-巯基乙基吡啶和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.81g/ml，配基密度为60μmol/ml。
实施例2
将50g纤维素粘胶和40g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、0.9ml二乙烯基砜、9ml 0.2M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的4-巯基乙基吡啶和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.8M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.81g/ml，配基密度为34μmol/ml。
实施例3
将50g纤维素粘胶和80g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入310g泵油，800rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、1.8ml二乙烯基砜、9ml 0.5M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的4-巯基乙基吡啶和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.3M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为2.40g/ml，配基密度为45μmol/ml。
实施例4
将50g纤维素粘胶和60g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，800rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的4-巯基乙基吡啶和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为2.11g/ml，配基密度为59μmol/ml。
实施例5
将50g纤维素粘胶和12g镍粉在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的4-巯基乙基吡啶和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.42g/ml，配基密度为58μmol/ml。
实施例6
将50g纤维素粘胶和20g不锈钢粉在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的4-巯基乙基吡啶和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.71g/ml，配基密度为60μmol/ml。
实施例7
将50g纤维素粘胶和15g钛白粉在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的4-巯基乙基吡啶和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.39g/ml，配基密度为60μmol/ml。
实施例8
将50g纤维素粘胶和40g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基乙基吡啶和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.81g/ml，配基密度为50μmol/ml。
实施例9
将50g纤维素粘胶和40g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的3-巯基乙基吡啶和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.81g/ml，配基密度为52μmol/ml。
实施例10
以巯基乙基吡啶和砜基为配基的扩张床吸附介质(配基密度为60μmol/ml)吸附卵黄抗体的静态吸附实验，首先将介质用pH7的柠檬酸缓冲液进行平衡；抽滤后分别准确称取0.4g介质于25ml带塞锥形瓶中，加入8ml不同IgY浓度的缓冲溶液；将锥形瓶置于水浴摇床中，25℃下180rpm振荡8h；平衡后取出上清液测定IgY的浓度；根据物料横算求得吸附蛋白的量和平衡溶液IgY浓度，绘制静态吸附等温线，并根据Langmuir吸附方程拟合得到介质的饱和吸附量为124.5mg/ml。以同样方法，测定牛血清白蛋白的静态吸附等温线，并根据Langmuir吸附方程拟合得到介质的饱和吸附量为34.5mg/ml。新型介质对IgY的静态吸附量高达100mg/ml以上，对BSA的吸附量低，说明新型介质具有良好的抗体选择性吸附性能。
Claims (3)
1.一种以巯基乙基吡啶和砜基为配基分离抗体的扩张床吸附介质，其特征在于介质的组成中基质为纤维素/无机增重剂复合微球，配基为经二乙烯基砜活化后引入的砜基和偶联后的巯基乙基吡啶，结构组成为：
具体制备方法为：首先将纤维素粘胶和无机增重剂充分混合，无机增重剂在混合物中的质量百分含量为16％～61％，加入5倍纤维素粘胶质量的泵油，控制转速500～800rpm，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，筛选50～250μm粒径的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；其次将纤维素/无机增重剂复合微球、二乙烯基砜、0.2～0.5M pH12的碳酸钠缓冲液和二甲基亚砜混合，二乙烯基砜添加的体积量为纤维素/无机增重剂复合微球体积的18％～36％，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、3倍双键摩尔量的巯基乙基吡啶和含25mg/ml过硫酸铵的0.3～0.8M氢氧化钠溶液混合，60℃下180rpm摇床中偶联8小时；最后将微球抽滤，用去离子水洗涤，加入到含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到以巯基乙基吡啶和砜基为配基分离抗体的扩张床吸附介质。
2.根据权利要求1所述的一种以巯基乙基吡啶和砜基为配基分离抗体的扩张床吸附介质，其特征在于所述纤维素/无机增重剂复合微球的骨架为纤维素，增重剂为钛白粉、不锈钢粉、镍粉或碳化钨粉。
3.根据权利要求1所述的一种以巯基乙基吡啶和砜基为配基分离抗体的扩张床吸附介质，其特征在于配基密度为34～60μmol/ml介质。
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